KR0150465B1

KR0150465B1 - 발효법에 의한 아미노산의 제조법

Info

Publication number: KR0150465B1
Application number: KR1019910013441A
Authority: KR
Inventors: 히데하루 아나자와; 히로아끼 모또야마; 사다오 데시바
Original assignee: 가또 미끼오; 교오와학꼬고오교 가부시끼가이샤
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1991-08-02
Publication date: 1998-08-17
Also published as: US5217883A; KR920004579A; MX174307B; HUT61599A; ATE144792T1; DE69122931T2; EP0472947A1; CA2048271A1; JPH0491793A; AU8155591A; CA2048271C; AU636996B2; HU209842B; JP3046332B2; DE69122931D1; EP0472947B1; HU912566D0

Abstract

본 발명은 메틸로바실루스 (Methylobacillus) 속에 속하며 항생물질 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 감수성이 향상 된 균주를 친주로하여 변이 처리에 의해 수득되고, L - 트레오닌, L - 리신 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 내성을 가지며 또한 아미노산 생산능력을 갖는 미생물을, 메탄올로 주된 탄소원으로서 함유하는 배지에 배양하고, 배양물중에 아미노산을 생성 축적시켜 이 배양물에서 아미노산을 채취함을 특징으로 하는 발효법에 의한 아미노산의 제조법에 관한 것이다.

Description

발효법에 의한 아미노산의 제조법

L - 트레오닌이나 L - 리신 등의 아미노산은 의약, 식품, 사료 등에 널리 이용되고 있는 중요한 물질이다.

종래 싼 값에 대량으로 입수 가능한 발효원료인 메탄올로 아미노산을 제조하는 방법으로서는 아크로모박터 속 및 슈도모나스 속(특공서 45 - 25273 호 공보), 프로타미노박터 속 (특개소 49 - 125590 호 공보), 프로타미노박터 속 및 메타노모나스 속 (특개소 50 - 25790 호 공보), 미크로사이크라스 속 (특개소 52 - 18886 호 공보 ) 등에 속하는 미생물을 사용하는 방법이 알려져 있다. 그러나 어느 경우나 아미노산의 생산량이 적어 만족할만한 것은 아니다.

본 발명의 목적은 의약, 식품, 사료 등에 유용한 L - 트레오닌이나 L - 리신 등의 아미노산을 공업적으로 보다 효율 좋게 싼 값에 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 따르면, 메틸로바실루스 속에 속하며, 항생물질 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 감수성이 향상된 균주를 친주로 하여 변이 처리에 의해 수득할 수 있고, L - 트레오닌, L - 리신 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 내성을 가지며 또한 아미노산 생산능력을 갖는 미생물을, 메탄올을 주된 탄소원으로서 함유하는 배지에 배양하여 배양물중에 아미노산을 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 아미노산을 채취함을 특징으로 하는 발효법에 의한 아미노산이 제조법을 제공할 수 있다.

이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 메틸로바실루스 속에 속하며 항생물질 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 감수성이 향상된 균주를 친주로하여 변이 처리에 의해 수득할 수 있고, L - 트레오닌(이하, L - Thr 라고 약기한다. ), L - 리신(이하, L - Lys 라고 약기한다. ) 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 내성을 가지며 메탄올을 주된 탄소원으로서 함유하는 배지에 생육시킬 수 있고, 또한 아미노산 특히 L - Thr 이나 L - Lys 의 생산능력을 갖는 미생물이 된다. 이러한 성질을 갖는 변이주는 친주에 자외선 조사, N - 메틸 - N' - 니트로 - N - 니트로소구아니딘(NTG) 처리 등에 의한 통상의 변이 처리를 하여 수득된다.

항생물질로서는 카나마이신, 암피실린, 스트렙토마이신 등을 들 수 있다.

아미노산 대사 길항 물질로서는, α - 아미노 - β - 히드록시발레르산(이하, AHV 라고 약기한다.), S - 2 - 아미노에틸 - L - 시스테인 (이하, AEC 라고 약기한다. ) 및 DL - 4, 5 - 트랜스데히드로리신 (이하, DHL 이라고 약기한다)등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 미생물의 구체예를 제1표에 나타낸다.

이들 균주는 취득 방법을 나타낸다.

메틸로바실루스속 세균의 야생주는 아미노산 대사 길항물질에 대한 감수성이 낮아 야생주에 아미노산 대사 길항물질에 대한 내성을 부여하고 대사제어 변이주를 분리시키는 것이 어렵다. 아미노산 대사 길항물질에 대한 감수성이 낮은 것은 여러 가지 약제에 대한 막투과성이 나쁜 것이 원인으로 생각된다. 그래서 야생주로부터 야미노산 누출형 변이주를 유도하여 수득된 변이주 중에서 여러 가지 약제에 대한 감수성이 향상되고, 약제의 투과성이 향상되었다고 생각되는 주를 친주로서 취득한다.

친주로서는 베틸로바실루스 속에 속하고, 카나마이신, 암피실린, 스트렙토마이신 등의 항생물질, α - 아미노 - β - 히드록시발레르산, S - 2 - 아미노에틸 - L - 시스테인 등의 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 감수성이 향상된 것이 사용된다. 구체적으로는 이미 공지된 균주나 아크로모박터·메탄올로필라 (Achromobacter methanolophila) ATCC 21452 주, 슈도모나스·인슈에타 (Pseudomonas insueta) ATCC 21276 주, 프로타미노박터·티아미노파거스 (Protaminobactor thaminophagus) ATCC 21371 주, 메타노모나스·메틸로보라 (Methanomonas methylovora) ATCC 21369 주 등의 야생주의, 상기한 바와 같은 약제에 대한 감수성을 향상시킨 변이주가 바람직하다. 이미 공지된 균주로서는 슈도모나스·인슈에타 K - 015 (ATCC 21966 주), 슈도모나스·인슈에타 K - 038 (ATCC 21967 주), 프로타미노막터·티아미노파거스 K-224 (ATCC 21969 주) 등을 들 수 있다.

ATCC 21452 주, ATCC 21276 주, ATCC 21371 주, ATCC 21369 주, ATCC 21966 주, ATCC 21967 주 및 ATCC 21969 주는 모두 현재 메틸로바실루스(Methylobacillus) 속에 분류되어 있는 것이 인터내셔날·저널·시스테매틱·박테리올로지 (International J. Systematic Bacteriology), 27, p247 - 255, 1977 ; 34, p188 - 201, 1984 에 기재되어 있다.

그래서, 본 명세서 중에서는 ATCC 21452 주, ATCC 21276 주, ATCC 21371주, ATCC 21369 주, ATCC 21966 주, ATCC 21967 주 및 ATCC 21969 를 각각 메틸로바실루스·에스피 1001, 1011, 1006, 1003, K - 105, K - 038 및 K - 224 주라고 호칭한다.

메틸로바실루스·에스피 1001 주, 1011 주, 1006 주 및 1003 주 등의 야생주의 약제에 대한 감수성을 향상시키기 위해서는 상기한 바와 같은 야생주에 NTG 처리 등의 통상이 변이 처리를 한다. 구체적인 균주로서는 메틸로바실루스·에스피 iA111 주 등을 들 수 있다. 이하에 iA111 주의 취득 방법을 나타낸다.

메틸로바실루스·에스피 1011 주를 하기 조성으로 이루어진 M1 배지에서 30℃, 24시간 배양한다. 수득된 균체를 통상법에 따라 NTG 처리(500mg/ℓ, 30℃ 에서 30 분)하고, 카사미노산 (디프코사제) 0.1 % 및 L - 트립토판 200mg/ℓ 을 함유하는 M1 한천배지 (M1 배지 + 한천 1.5%)에 도포한다. 이것을 30℃에서 3∼14일 배양하여, 생긴 콜로니를 조균 분리한다. 이렇게 해서 수득된 변이주를 시험관 내의 3ml의 종배지에 식균하고, 30℃에서 18시간 배양한다. 수득된 종배양액 1ml 를 50ml 들이 대형 시험관중의 메탄올을 2% 첨가한 발효배지 10ml 에 식균하고, 배양 24 시간 후에 2%량의 메탄올을 다시 첨가하여 30℃에서 합계 48 시간 배양한다. 배양은 모두 진탕 배양으로 수행한다.

이하에 각각의 배치 조성을 나타낸다. M1 배지 조성 : 메탄올 0.5%, 황산 암모늄 0.2%, 인산 - 칼륨 0.1%, 인산이칼륨 0.7%, 염화나트륨 0.01%, 티오우레아 0.01%, 황산마그네슘 0.05%, 황산제일철 10mg/ℓ, 황산망간 8 mg/ℓ, 티아민 1mg/ℓ, 비오틴 0.01mg/ℓ, pH 7.0 종배지 (이하, 종배지 a라고 한다) 조성 : 분말 브이욘(교꾸또 세이야꾸사제) 2%, 효모 엑키스 S( 다이고 세이야꾸사제) 0.5%, 메탄올 1%, pH 7.0

발효배지 (이하, 발효배지 b 라고 한다)조성 : 황산 암모늄 0.8%, 인산 - 칼륨 0.1 %, 인산이칼륨 0.7%, 염화나트륨 0.1%, 황산 마그네슘 0.04%, 황산제일철 10mg/ℓ, 황산망간 10mg/ℓ, 비오틴 0.05mg/ℓ, 티아민 0.2mg/ℓ, 판토텐산 칼슘 0.5mg/ℓ, 니코틴산 0.5mg/ℓ, 콘·스틸·리커(corn steep liquor) 0.3%, 카사미노산 0.05%, 탄산칼슘 2%, pH 7.0 (pH는 수산화 나트륨 또는 염산을 사용해서 조정한다. 어느 배지에 있어서나 메탄올 이외의 성분을 용해시키고, 120℃, 15분간의 증기 멸균을 한 뒤 멘브덴필터(밀포아사제, 0.45㎛)로 제균한 메탄올을 각각 량 첨가한다.]

배양종료후, 균체 및 탄산 칼슘과 배양 상청액을 원심분리한다. 배양 상청액중에 함유된 아미노산을 아미노산 분석계(닛뽕 분꼬사제, 고속 액체 크로마토그래피, 아미노산 분석 시스템)으로 분석한다. 글루탐산, 아스파라긴산, 발린, 알라닌 등의 아미노산이 배양 상청액에 검출되어 있는 균주를 아미노산 누출형 변이주로서 취득한다.

다음에 이렇게 해서 수득된 아미노산 누출형 변이주의 약제 감수성의 검정을 수행한다. 카나마이신 황산염 [km] ( 메이지 세이까사제 ), 암피실린 [Ap](시그마사제), 스트렙토 마이신 황산염 [Sm](한세이 세이야꾸사제), α - 아미노 - β - 히드록시 발레르산 [AHV](시그마사제), S - 2 - 아미노에틸 - L - 시스테인 [AEC] (시그마사제)를 여러 가지 농도로 첨가한 M1 한천배지에 상기에서 분리한 아미노산 누출형 변이주를 도포하고, 30℃에서 2∼5일 배양해서 생육 유무를 조사하여 친주보다 약제 감수성이 향상된 균주를 고른다.

메틸로바실루스·에스피 1011 주를 친주로 하고, 이 친주보다 약제 감수성이 향상된 균주를 메틸로바실루스·에피스 iA11 주라고 명명한다.

제2표에 대표적인 균주의 생육이 저지되는 최초의 약제농도 (최소 저지 농도)를 나타낸다(단, K - 224 주의 경우는 페닐 알라닌 50mg/ℓ를 함유하는 M1 한천배지를 사용해서 약제에 대한 최소 저지 농도를 측정했다.

다음에 본 발명에서 사용되는 미생물의 구체적인 취득방법을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 상기한 바와 같은 메틸로바실루스 속에 속하는 균주에 L - Thr, L - Lys 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대해 내성을 부여한 변이주이다. 이러한 변이주는 NTG 처리등의 통상의 변이 처리에 의해 수득된다. 변이처리후 그 친주가 생육할 수 없는 농도의 L - Thr, L - Lys 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나를 함유하는 배지중 또는 배지 위에 생육할 수 있는 변이주를 분리시키면 된다.

이하에 본 발명의 변이주 취득 방법을 구체적으로 나타낸다.

(1) 메틸로바실루스·에스피 TA - 47 주의 취득 방법

메틸로바실루스·에스피 iA11 주를 카사미노산 0.1% 및 L - 트립토판 20mg/ℓ을 함유하는 M1 배지에서 30℃, 24 시간 배양한다. 수득된 균체를 상법에 따라 NTG 처리 (500mg/ℓ, 30℃에서 30 분)하고, L - Thr 5000mg/ℓ을 첨가한 M1 한천배지에 도포한다. 이것을 30℃에서 3∼14일 배양하여 생긴 콜로니를 조균 분리하고, L - Thr 내성주를 취득하여 L - Thr 및 L - Lys 생산시험에 가한다. 친주보다 L - Thr 및 L - Lys 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 TA - 47 주라고 명명한다.

(2) 메틸로바실루스·에스피 DA - 19 주의 취득 방법

L - Thr 5000mg/ℓ 대신에 L - Lys 1000mg/ℓ 및 AHV 1000mg/ℓ를 M1 한천배지에 첨가한 것을 제외하고는 상기 (Ⅰ) 과 동일한 방법으로 처리하여 L - Lys 및 AHV에 내성인 변이주를 취득했다. 친주보다 L - Thr 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 DA - 19주라고 명명한다.

(3) 메틸로바실루스·에스피 DA - 35 주의 취득 방법

L - Thr 5000mg/ℓ 대신에 DHL 5000mg/ℓ 를 M1 한천 배지에 첨가한 것을 제외하고는 상기 (Ⅰ)과 동일한 방법으로 처리하여 DHL 내성주를 취득했다. 친주보다 L - Lys 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 DA - 35 주라고 명명한다.

DHL 은 저널·오브·바이오케미스트리 (Journal of Biochemistry, 1986년), 100 권, 21∼25 면에 기재된 방법에 따라 저널·오브·더·아메리칸 케미칼·소사이어티(Journal of the American Chemical Society, 1961년), 83권, 2279 ∼ 2281 면의 기재를 참고로 합성하여 97%이상 순도의 목표품을 정제해서 사용했다.

(4) 메틸로바실루스·에스피 AL - 76 주의 취득 방법

L - Thr 5000mg/ℓ 대신에 AHV 2000mg/ℓ 및 L - Lys 5000mg/ℓ 를 M1 한천배지에 첨가한 것을 제외하고는 상기 (Ⅰ)과 동일한 방법으로 처리하여 AHV 및 L - Lys 에 내성인 변이주를 취득했다. 친주보다 L - Lys 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 AL - 76 주라고 명명한다.

(5) 메틸로바실루스·에스피 TR - 26 주의 취득 방법

iA111 주 대신에 K - 224 주를 친주로서 사용하고, L - Thr 5000mg/ℓ 대신에 L - Thr 1000mg/ℓ 을, 페닐 알라닌 50mg/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에 첨가한 것을 제외하고는 상기 (Ⅰ)과 동일한 방법으로 처리하여 L - Thr 내성주를 취득했다. 친주보다 L - Thr 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 TR - 26 주라고 명명한다.

(6) 메틸로바실루스·에스피 ATR - 89 주의 취득 방법

iA111 주 대신에 K - 224 주를 친주로서 사용하고, L - Thr 5000mg/ℓ 대신에 L - Thr 1000mg/ℓ 및 AEC 1000mg/ℓ를, 페닐알라닌 50mg/ℓ 함유하는 M1 한천배지에 첨가한 것을 제외하고는 상기 (Ⅰ)과 동일한 방법으로 처리하여 L - Thr 및 AEC 에 내성인 변이주를 취득했다. 친주보다 L - Thr 생산능력이 향상된 균주를 골라 메틸로바실루스·에스피 ATR - 89 주라고 명명한다.

수득된 변이주는 각각 부다페스트 조약에 의거하여 평성 2년 6월 22일자로 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 기탁하여 있다. 각각의 균주의 기탁번호를 제3표에 나타낸다.

수득된 변이주와 친주를 상기한 약제를 함유하는 M1 한천배지상에서 30℃, 48시간 배양했을때의 생육도 정도를 비교한 결과를 제4표에 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 통상 메탄올 자화성 미생물의 배양에 사용되는 방법으로 배양된다.

본 발명에 있어서의 아미노산 생산용 배지는 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요에 따라 그 밖의 유기 미량 성분을 함유하는 배지라면 천연배지, 합성 배지 어느 것이나 사용된다.

탄소원으로서는 메탄올을 주로 사용하고, 배지 중에 0.05 ∼ 30% 첨가한다. 균의 생육, L - Thr 이나 L - Lys의 생산성이 향상될 경우에는, 피루브산, 2 - 케토글루타르산 등의 유기산, 효모엑키스, 펩톤, 콘·스틸, 리커 등의 천연 유기 성분 등을 0.1 ∼ 4% 배지에 첨가해도 무방하다. 질소원으로서는 황산 암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 질산암모늄, 인산암모늄, 암모니아 가스, 암모니아수, 요소 등을 0.1∼8% 배지에 첨가해서 사용한다. 이들 외에 통상 인산 칼륨, 인산나트륨, 황산마그네슘, 황산제일철, 황산망간 등의 미량 성분이 소량 첨가된다.

배양은 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하, pH 5 ∼ 9, 온도 24 ∼ 37℃로 유지시켜 수행되고, 통상 24 ∼ 120 시간으로 종료된다.

배양물에서 L - Thr 이나 L - Lys 등의 아미노산을 채취하기 위해서는 배양물에서 균체 등의 침전물을 제거하고, 수득된 배양액을 통상의 방법 예를 들면 이온 교환 처리법, 농축법, 염석법 등으로 처리함으로써 아미노산을 채취할 수 있다. 예를 들면 L - Thr 을 채취하기 위해서는 균체를 제거한 배양 상청액을 염산으로 pH 2 로 조정한 뒤, 강산성 양이온 교환수지에 통액후 묽은 암모니아수로 흡착성분을 용출해 내고, 탈암모니아후 농축시킨다. 여기에 알코올을 첨가하고, 냉각보존하에서 생성된 결정을 수거함으로써 L - Thr 을 수득할 수 있다.

또 L - Lys 를 채취하기 위해서는 균체를 제거한 배양 상청액을 수산화 나트륨 수용액으로 pH 7.0 으로 조정한 뒤 양이온 교환수지에 통액후 묽은 염산으로 흡착성분을 용출해 내고, L - Lys 에 상당하는 분획을 모아 농축시킨다. 여기서 알코올을 첨가하고, 냉각 보존하에서 생성된 결정을 모음으로써 L - Lys 를 수득할 수 있다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타낸다.

[실시예 1]

L - Thr 의 제조

메틸로바실루스·에스피 TA - 47 주를 시험관 내의 3ml의 종배지 a에 식균하고, 30℃에서 18시간 배양했다. 수득된 매양액 1ml 를, 50ml 들이 대형 시험관중의 메탄올을 2% 첨가한 발효배지 b 10ml 에 가하고, 배양 24 시간 후에 2% 량의 메탄올을 다시 첨가하여 30℃에서 합계 48 시간 배양했다. 배양은 모두 진탕배양으로 수행했다.

배양종료후 균체, 탄화칼슘을 원심으로 제거하고, 배양 상청액중에 함유되어 있는 L - Thr 농도를 아미노산 분석계 (닛뽕 분꼬사제, 고속액체 크로마토그래피, 아미노산 분석 시스템)로 측량했다.

TA - 47 주 대신에 1011 주, 1006 주, iA111 주, K - 224 주, DA - 19 주, TR - 26주 및 ATR - 89 주를 각각 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 배양하여 배양 상청액중에 함유된 L - Thr 농도를 정량했다.

결과를 제5표에 나타낸다.

[실시예 2]

L - Thr 의 채취

실시예 1에 나타낸 바와 동일한 방법으로 TA - 47 주를 배양했다. 배양 상청액 800ml 를 수거하여 염산으로 pH 2 로 조정한 뒤 강 양이온 교환 수지 다이어 이온 SK1B (H 형)의 칼럼에 통과시켰다. 칼럼을 수세후 2N 암모니아수로 칼럼의 흡착성분을 용출해내고, L - Thr 분획을 모아 감압 농축시켰다. 여기에 에탄올을 가하여 4℃ 로 냉각시키고, 생성된 결정을 모아 건조시킨 결과 순도 98 % 이상의 L - Thr 결정이 1.25g 수득되었다.

[실시예 3]

L - Lys 의 제조

메틸로바실루스·에스피 1011 주, iA111 주, TA - 47 주, DA - 35 주, AL - 76 주, 1006주, K224 주 및 ATR - 89 주를 사용하고, 실시예 1 과 동일한 방법으로 각각 배양했다.

배양 종료 후 배양 상청액중에 함유되어 있는 L - Lys 농도를 아미노산 분석계로 정량했다. 결과를 제6표에 나타낸다.

[실시예 4]

L - Lys 의 제조

메틸로바실루스·에스피 AL - 76 주를 종배지 a 25ml 가 든 300ml 들이 삼각 플라스크에 2백금이량(白金耳量) 식균하여 30℃, 18 시간 진탕 배양했다. 수득된 종배양액 전부를 종배지 a 225ml 가 든 2ℓ들이 삼각 플라스크에 가하고, 다시 30℃, 18 시간 진탕 배양했다.

다음에 5ℓ 들이 배양조 (미쯔와 바이오 시스템사제)에 발효배지 b 2.25ℓ를 조제하고, 상기 250ml 의 종배양액 전부를 식균하여 20℃, 2.5ℓ/분의 통기량, 600rpm 의 조건으로 교반하면서 배양했다. 또 배양중 배양액의 pH 를 6N NH₄OH 액으로 6.9 로 자동 조절했다. 메탄올은 배양 개시시에 0.5 % 첨가한 다음에 0.5 % 를 초가하지 않는 양의 메탄올을 페리스타 펌프(아토사제)로 연속적으로 첨가했다.

그 결과 배양 72 시간으로 L - Lys 가 배지 중에 3.02g/ℓ축적되었다.

[실시예 5]

L - Lys 의 채취

실시예 1 에서 나타낸 방법으로 AL - 76 주를 배양했다. 배양 상청액 120ml를 원심분리로 모아 수산화나트륨으로 pH 7.0 로 조정한 뒤 강 양이온 교환 수지 다이아이온 SK1B ( NH형)의 칼럼에 통과시켰다. 칼럼을 수세후 1N 염산으로 칼럼의 흡착성분을 용출해내고, L - Lys 에 상당하는 분획을 모아 감압 농축시켰다. 여기에 에탄올을 가하여 4℃로 냉각시키고, 정제한 결정을 모아 건조시킨 결과 순도 96% 이상의 L - Lys 결정을 염산염으로써 1.88g 수득했다.

본 발명의 방법에 따르면 L - Thr 이나 L - Lys 등의 아미노산을 값싼 원료로 효율좋게 생산할 수 있다.

Claims

메틸로바실루스 (Methylobacillus) 속에 속하며 항생물질 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 감수성이 향상된 균주를 친주로 하여 변이 처리에 의해 수득되고, L-트레오닌, L-리신 및 아미노산 대사 길항물질에서 선택되는 적어도 하나에 대한 내성을 가지면서 L-트레오닌 및 L-리신의 생산능을 가진 미생물을, 메탄올을 주된 탄소원으로서 함유하는 배지에 배양하고, 배양물중에 L-트레오닌 및 L-리신을 생성 축적시켜 이 배양물에서 L-트레오닌 및 L-리신을 채취함을 특징으로 하는 발효법에 의한 L-트레오닌 및 L-리신의 제조법.
제1항에 있어서, 항생물질이 카나마이신, 암피실린 및 스트렙토마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발효법에 의한 아미노산의 제조법.
제1항에 있어서, 아미노산 대사 길항물질이 α-아미노-β-히드록시발레르산, S-2-아미노에틸-L-시스테인 및 DL-4,5-트랜스데히드로리신에서 선택되는 물질인 발효법에 의한 아미노산의 제조법.