JPH06327487A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 医薬、食品、飼料などに有用なＬ−スレオニ
ンを工業的により効率よく、安価に製造する方法を提供
する。 【構成】 メチロバチルス属に属し、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−ロイシンアナログ、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−イ
ソロイシンアナログから選ばれる少なくとも１つに耐性
を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を、
メタノ−ルを主たる炭素源として含有する培地に培養
し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ、該培養
物からＬ−スレオニンを採取することを特徴とするＬ−
スレオニンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬、食品、飼料など
に広く利用されているＬ−スレオニンの製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】メタノールを炭素源として微生物により
Ｌ−スレオニンを製造する方法としてアクロモバクター
属およびシュードモナス属の微生物を用いる方法（特公
昭45-25273号公報) 、プロタミノバクター属またはメタ
ノモナス属の微生物を用いる方法 (特開昭50-25790号公
報) 、およびメチロバチルス属に属し、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−リジンおよびアミノ酸代謝拮抗物質の少なくと
も１つに耐性を有する微生物を用いる方法（特開平4-91
793 号公報) などが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医
薬、食品、飼料などに有用なＬ−スレオニンを工業的に
より効率よく、安価に製造する方法を提供することにあ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、メチロ
バチルス属に属し、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ロイシンアナロ
グ、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−イソロイシンアナロ
グから選ばれる少なくとも１つに耐性を有し、かつＬ−
スレオニン生産能を有する微生物を、メタノールを主た
る炭素源として含有する培地に培養し、培養物中にＬ−
スレオニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−スレオニ
ンを採取することを特徴とする、発酵法によるＬ−スレ
オニンの製造法を提供することができる。

【０００５】以下に、本発明を詳細に説明する。本発明
のＬ−ロイシンアナログとしては、チアゾールアラニン
(β-(2-Thiazolyl)-DL-Alanine)、トリフルオロロイシ
ン(5,5,5-Trifluoro-DL-Leucine)、４−アザロイシン(4
-Aza-DL-Leucine)などが、Ｌ−イソロイシンアナログと
しては、イソロイシンヒドロキサメート (L-Isoleucine
-Hydroxamate) 、Ｄ−アロイソロイシン (D-allo-Isole
ucine)などが、それぞれあげられる。

【０００６】本発明で用いられる微生物は、メチロバチ
ルス属に属し、Ｌ−ロイシン（以下、Ｌ−Ｌｅｕと略記
する。）、Ｌ−ロイシンアナログ、Ｌ−イソロイシン
（以下、Ｌ−Ｉｌｅと略記する。）、およびＬ−イソロ
イシンアナログから選ばれる少くとも１つに耐性を有
し、かつＬ−スレオニン（以下、Ｌ−Ｔｈｒと略記す
る。）生産能を有する微生物であればよい。このような
性質を有する変異株は、親株に紫外線照射、Ｎ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処
理などの通常の変異処理を施して得られる。変異処理
後、その親株が生育できないような濃度のＬ−Ｌｅｕ、
Ｌ−ロイシンアナログ、Ｌ−Ｉｌｅ、およびＬ−イソロ
イシンアナログから選ばれる少なくとも１つを含有する
培地中、または培地上に生育できるような変異株を分離
し、得られた薬剤耐性変異株をＬ−Ｔｈｒ生産用培地で
培養し、Ｌ−Ｔｈｒ生産量が、親株より増大している株
を選択すればよい。

【０００７】これらの菌株の取得方法を示す。親株とし
ては、例えばアクロモバクター・メタノーロフィラ（Ac
hromobactermethanolophila) ＡＴＣＣ２１４５２、シ
ュードモナス・インスエタ（Pseudomonas insueta)ＡＴ
ＣＣ２１２７６、プロタミノバクター・チアミノファー
ガス（Protaminobacter thiaminophagus) ＡＴＣＣ２１
３７２、メタノモナス・メチロボーラ（Methanomonas m
ethylovora)ＡＴＣＣ２１３６９などの野生株を用いる
ことができる。

【０００８】また、メチロバチルス属に属し、Ｌ−Ｔｈ
ｒ生産能を有する菌株、例えばメチロバチルス・グリコ
ゲネスＫ−０３８（ＡＴＣＣ２１９６７）、メチロバチ
ルス・グリコゲネスＤＡ−１９（ＦＥＲＭ ＢＰ−２９
８１）などを親株として用いることもできる。

【０００９】ＡＴＣＣ２１４５２株、ＡＴＣＣ２１２７
６株、ＡＴＣＣ２１３７２株、ＡＴＣＣ２１３６９株、
ＡＴＣＣ２１９６７株、ＦＥＲＭ ＢＰ−２９８１株は
いずれも現在、メチロバチルス・グリコゲネス（Methyl
obacillus glycogenes) に分類されている〔Yordy et a
l. : インターナショナル・ジャーナル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー(International J. Syst
ematic Bacteriology), 27 , 247-255(1977) ; Urakami
et al. : International J. Systematic Bacteriolog
y, 34 , 188-201(1984)〕。

【００１０】以下、本明細書中においては、これらの微
生物をそれぞれメチロバチルス・グリコゲネス種に属す
るものとして記載する。かくして得られる本発明の微生
物の具体例を第１表に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】本発明の微生物によるＬ−Ｔｈｒの生産
は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方
法で行われる。本発明におけるＬ−Ｔｈｒ生産用の培地
は、炭素源、窒素源、無機物および必要に応じてその他
の有機微量成分を含む通常の培地であれば、合成培地ま
たは天然培地のいずれでもよい。

【００１３】炭素源としてはメタノールを主に用い、培
地中に0.０５〜３０％（Ｗ／Ｖ）（以下、同じ。）添加
する。本発明に用いる菌株は、メタノール以外の炭素源
を唯一の炭素源として生育できないが、菌の生育、Ｌ−
Ｔｈｒの生産性が向上する場合には、ピルビン酸、２−
ケトグルタル酸などの有機酸、あるいは、酵母エキス、
ペプトン、コーンスティープリカーなどの天然有機成分
などを0.０１〜４％程度添加する。窒素源としては、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニ
アガス、アンモニア水、尿素などを0.１〜８％培地に添
加して用いる。これらのほかに、通常、リン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。

【００１４】培養は、振盪培養または通気攪拌培養など
の好気的条件下で行われる。温度は２４〜３７℃、培地
のｐＨは５〜９に保持され、培養は通常２４〜１２０時
間で終了する。培養終了後、培養液から菌体などの沈澱
物を除去し、通常の方法、例えばイオン交換処理法、濃
縮法、塩析法などを用いることにより、Ｌ−Ｔｈｒを採
取することができる。

【００１５】以下、本発明の実施例を示す。

【００１６】

【実施例】

実施例１ 変異株の取得（１）メチロバチルス・グリコゲネスＡＴＡ−７６株の
取得 メチロバチルス・グリコゲネスＤＡ−１９株を、カザミ
ノ酸0.１％およびＬ−トリプトファン２０mg／ｌを含有
する下記Ｍ１培地で３０℃、２４時間培養して得られる
菌体を、常法によりＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジンによる変異処理（５００mg／ｌ、３０
℃、３０分）を行った。この菌体をチアゾールアラニン
1 ０００mg／ｌ（シグマ社製）を含有するＭ１寒天培地
（Ｍ１培地に寒天1.５％を加えたもの）に塗布した。こ
れを、３０℃で３〜１４日培養し、生じたコロニーを釣
菌分離した。この様にして得た変異株を、試験管内の３
mlの下記種培地へ植菌し、３０℃で１８時間培養した。
得られた種培養液１mlを、５０ml容太型試験管中の、メ
タノールを２％添加した下記発酵培地１０mlに植菌し
た。培養２４時間後２％量のメタノールをさらに添加
し、３０℃で合計４８時間培養した。培養はいずれも、
振盪培養で行った。

【００１７】以下に、それぞれの培地組成を示す。Ｍ１培地 メタノール0.５％、硫酸アンモニウム0.２％、リン酸一
カリウム0.１％、リン酸二カリウム0.７％、塩化ナトリ
ウム0.０１％、チオウレア0.０１％、硫酸マグネシウム
0.０５％、硫酸第一鉄１０mg／ｌ、硫酸マンガン８mg／
ｌ、チアミン１mg／ｌ、ビオチン0.０１mg／ｌ（ｐＨ7.
０）種培地 粉末ブイヨン（極東製薬社製）２％、酵母エキスＳ（大
五製薬社製）0.５％、メタノール１％（ｐＨ7.０）発酵培地 硫酸アンモニウム0.８％、リン酸一カリウム0.１％、リ
ン酸二カリウム0.７％、塩化ナトリウム0.１％、硫酸マ
グネシウム0.０４％、硫酸第一鉄１０mg／ｌ、硫酸マン
ガン１０mg／ｌ、ビオチン0.０５mg／ｌ、チアミン0.２
mg／ｌ、パントテン酸カルシウム0.５mg／ｌ、ニコチン
酸0.５mg／ｌ、コーンスティープリカー0.３％、カザミ
ノ酸0.０５％、炭酸カルシウム２％（ｐＨ7.０） 〔ｐＨは水酸化ナトリウム水溶液または塩酸で調整し
た。いずれの培地においても、メタノール以外の成分を
溶解し、１２０℃、１５分間の蒸気滅菌を行った後、メ
ンブレンフィルター（ミリポア社製、0.４５μｍ）で除
菌したメタノールを添加した。〕

【００１８】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
分離で除去し、得られた培養液上清に含まれるＬ−Ｔｈ
ｒをアミノ酸分析計（日本分光社製、高速液体クロマト
グラフィー、アミノ酸分析システム）で分析した。親株
ＤＡ−１９株に比較して、Ｌ−Ｔｈｒの生産量が向上し
た菌株を選び、ＡＴＡ−７６株と命名した。

【００１９】（２）Ｌ−３４株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＫ−０３８株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりにＬ−Ｌｅｕ２０
０００mg／ｌを用いる以外は（１）と同様の変異処理を
行いＬ−Ｌｅｕ耐性変異株を分離した。その中から、親
株Ｋ−０３８株に比較してＬ−Ｔｈｒの生産量が向上し
た菌株を選び、Ｌ−３４株と命名した。 （３）ＡＡＬ−１２９株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＫ−０３８株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりにＤ−アロイソロ
イシン（シグマ社製）１０００mg／ｌを用いる以外は
（１）と同様の変異処理を行い、Ｄ−アロイソロイシン
耐性変異株を分離した。その中から、親株Ｋ−０３８株
に比較して、Ｌ−Ｔｈｒの生産量が向上した菌株を選
び、ＡＡＬ−１２９株と命名した。

【００２０】（４）Ｉ−１０９株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＤＡ−１９株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりにＬ−Ｉｌｅ５０
００mg／ｌを用いる以外は（１）と同様の変異処理を行
い、Ｌ−Ｉｌｅ耐性変異株を分離した。その中から、親
株ＤＡ−１９株に比較して、Ｌ−Ｔｈｒの生産量が向上
した菌株を選び、Ｉ−１０９株と命名した。（５）ＡＦ−１１６株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＤＡ−１９株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりにトリフルオロロ
イシン（フェアフィールド ケミカル社製）３０００mg
／ｌを用いる以外は（１）と同様の変異処理を行い、ト
リフルオロロイシン耐性変異株を分離した。その中か
ら、親株ＤＡ−１９株に比較して、Ｌ−Ｔｈｒの生産量
が向上した菌株を選び、ＡＦ−１１６株と命名した。（６）ＡＩＨ−２９株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＤＡ−１９株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりにイソロイシンヒ
ドロキサメート（シグマ社製）１０００mg／ｌを用いる
以外は（１）と同様の変異処理を行い、イソロイシンヒ
ドロキサメート耐性変異株を分離した。その中から、親
株ＤＡ−１９株に比較して、Ｌ−Ｔｈｒの生産量が向上
した菌株を選び、ＡＩＨ−２９株と命名した。（７）ＡＬＺ−９株の取得 メチロバチルス・グリコゲネスＤＡ−１９株に、チアゾ
ールアラニン１０００mg／ｌの代わりに４−アザロイシ
ン（シグマ社製）５０００mg／ｌを用いる以外は（１）
と同様の変異処理を行い、４−アザロイシン耐性変異株
を分離した。その中から、親株ＤＡ−１９株に比較し
て、Ｌ−Ｔｈｒの生産量が向上した菌株を選び、ＡＬＺ
−９株と命名した。

【００２１】これらの変異株は、各々ブダペスト条約に
基づいて平成５年５月１９日付で工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。各々の菌株の寄託番号
を第２表に示す。

【００２２】

【表２】

【００２３】実施例２ Ｌ−Ｔｈｒの製造 メチロバチルス・グリコゲネスＡＴＡ−７６株を、３ml
の種培地へ植菌し、３０℃で１８時間培養した。得られ
た種培養液１mlを、５０ml容太型試験管中の、メタノー
ルを２％添加した発酵培地１０mlに植菌した。培養２４
時間後に2％量のメタノールをさらに添加し、３０℃で
合計４８時間培養した。培養は、いずれも振盪培養で行
った。

【００２４】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
分離で除去し、得られた培養液上清に含まれるＬ−Ｔｈ
ｒの濃度をアミノ酸分析計で定量した。また、Ｋ−０３
８株、Ｌ−３４株、ＡＡＬ−１２９株、ＤＡ−１９株、
Ｉ−１０９株、ＡＦ−１１６株、ＡＩＨ−２９株、ＡＬ
Ｚ−９株を各々上記と同様の方法で培養し、培養液上清
に含まれるＬ−Ｔｈｒの濃度を定量した。結果を第３表
に示す。

【００２５】

【表３】

【００２６】実施例３ Ｌ−Ｔｈｒの採取 メチロバチルス・グリコゲネスＡＦ−１１６株を種培地
２５mlの入った３００ml容三角フラスコに２白金耳量植
菌し、３０℃、１６時間培養した。得られた種培養液全
量を種培地２２５ml入った２Ｌ容三角フラスコに加え、
さらに、３０℃、１８時間培養した。

【００２７】つぎに、発酵培地2.２５Ｌの入った５Ｌ容
培養槽（ミツワバイオシステム社製）に得られた種培養
液２５０ml全量を植菌し、３０℃、2.５Ｌ／分の通気
量、攪拌６００rpm の条件で培養した。なお、培養中、
培養液のpHは６Ｎアンモニア水でｐＨ6.８に自動調節し
た。メタノールは培養開始時に、0.５％添加し、その後
0.５％を越えない量のメタノールをペリスタポンプ（ア
トー社製）で連続的に添加した。

【００２８】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを遠心
分離で除去し、得られた培養液上清に含まれるＬ−Ｔｈ
ｒの濃度をアミノ酸分析計で定量した。その結果、培養
７２時間でＬ−Ｔｈｒが培養液上清中に１2.５ｇ／ｌ蓄
積した。得られた培養液上清２０００mlを塩酸でｐＨ2.
０に調整した後、強カチオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ
１Ｂ（Ｈ型) のカラムに通した。カラムを水洗後、２Ｎ
アンモニア水でカラムの吸着成分を溶出し、Ｌ−Ｔｈｒ
に相当する画分を集めて減圧濃縮した。これにエタノー
ルを加え、４℃に冷却し、生成した結晶を集めて乾燥し
た結果、純度９８％以上のＬ−Ｔｈｒの結晶を１5.３３
ｇ得た。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−Ｔｈｒを、安価な
原料であるメタノールから、より効率よく生産すること
が可能となる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メチロバチルス（Methylobacillus)属に
   属し、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ロイシンアナログ、Ｌ−イソ
   ロイシン、およびＬ−イソロイシンアナログから選ばれ
   る少なくとも１つに耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
   産能を有する微生物を、メタノールを主たる炭素源とし
   て含有する培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを
   生成蓄積させ、該培養物からＬ−スレオニンを採取する
   ことを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。