JPH03236786A - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ―スレオニンの製造法

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JPH03236786A JP3117290A JP3117290A JPH03236786A JP H03236786 A JPH03236786 A JP H03236786A JP 3117290 A JP3117290 A JP 3117290A JP 3117290 A JP3117290 A JP 3117290A JP H03236786 A JPH03236786 A JP H03236786A
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純一 高野
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、エシェリヒア属に属し、酢酸生合成活性が欠
失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微
生物を用いるＬ−スレオニンの製造法に関する。Ｌ−ス
レオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品として有用であ
るだけでなく、飼料添加用としても利用できるアミノ酸
である。
従来の技術 従来、Ｌ−スレオニンはエシェリヒア属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属など
に属する微生物を用いた発酵法により、工業的に生産さ
れている。
発酵法によりアミノ酸を製造する際、発酵培地中に、リ
ンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸などの有機酸が生成され
る。これらの有機酸の生成は目的生産物の発酵収率を低
下させ、酢酸においてはＬ−スレオニン生合成を阻害す
るということが知られている。乳酸などの有機酸の生成
を低下させる方法としては、培養液中の乳酸の量がｌＯ
〜２００■／ｄ１になるように通常の空気よりも酸素濃
度を高めた酸素を培地に供給する方法（特開昭６１−２
１６６９７号公報）が開示されているが、培養管理が煩
雑であり工業的生産には必ずしも充分ではない。
本発明の変異株と関連のある変異株については、酢酸を
唯一の炭素源として生育できない株あるいはモノフルオ
ロ酢酸耐性株がジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロ
バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　　１９７７年）１０２巻
、３２７〜３３６頁に既に開示されている。しかし、該
文献中にはその変異株のアミノ酸生産に関する記述はな
い。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、アミノ酸製剤や飼料添加物として有用
なＬ−スレオニンを、工業的により効率よく安価に製造
する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、酢酸生合成活
性が欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有
する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニン
を生成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造
法を提供することができる。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明で用いられる微生物としては、エシェリヒア属に
属する微生物であって、Ｌ−スレオニン生産能を有し、
しかも酢酸生合成活性が欠失または低下した菌株であれ
ばいずれでもよく、公知のＬ−スレオニン生産能を有す
る菌に酢酸生合成活性を欠失または低下させる変異を付
与することによって取得できる。
また、エシェリヒア属に属する微生物における酢酸の生
合成経路と代謝経路は可逆的な関係にあり、「酢酸生合
成活性を欠失または低下させる」ということは「酢酸代
謝活性を欠失または低下させる」ということと同じこと
を表わすので、酢酸代謝活性を欠失または低下させる変
異を付与することによっても取得できる。さらに野生株
から誘導した酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の欠
失または低下した変異株に、ジアミノピメリン酸やメチ
オニンの要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐
性などのＬ−スレオニン生産性を向上させる変異を付与
しても本発明に用いる菌株を得ることができる。本発明
における酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の欠失ま
たは低下した変異株は、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ′
−二トロＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）　、亜硝酸
などの化学処理など、通常用いられる変異処理を施して
得られる変異株から見出すことができる。好適な例とし
てエシェリヒア・コリＨ−７５９６をあげることができ
る。
以下に具体的な菌株の取得方法を示す。
エシェリヒア・コリＨ−４２５８（ＦＢＲＭ　０Ｐ−９
８５゜ジアミノピメリン酸要求性、メチオニン要求性、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファンピシ
ン耐性）にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（ＮＴＧ）による常法の変異処理（０，２ｔａ
ｇ／ｒｄ１．　３０℃、３０分間）をおこなった後、モ
ノフルオロ酢酸ナトリウム（Ｉｇ／ｌ）、を含む最少培
地（ピルビン酸す）　ＩＪウム３ｇ／ｌ、ＮＨ＊ＣＩ　
　２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ＜　２ｇ／ｌ。
Ｍｇ５Ｏｎ−７Ｈ＊ＯＯ，１ｇ／ｌ、Ｆｅｗ（ＳＯ２）
ｓ２０ｍ１ｇ／　Ｊ！、　シフ　ミ／　ヒｌ　ＩＪ　：
／１５０ｓｇ／　１、ＤＬ−メチオニン５０■／１、寒
天２０ｇ／ｌ、ｐ　Ｈ７，２）に塗布した。３０℃で２
〜６日間培養し、生育してくる耐性株のコロニーを釣菌
分離する。得られたモノフルオロ酢酸耐性株の中から酢
酸を唯一の炭素源として生育できない株を分離し、Ｌ−
スレオニン生産試験にかけ、培地中の酢酸生成量がＨ−
４２５８株より減少した株を取得し、エシェリヒア・コ
リＨ−７５９６と命名した。この菌株はブダペスト条約
に基づき、平成１年上２月２１日付で工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第２６９７号（Ｆ［！ＲＭ
　０Ｐ−２６９７）として寄託されている。
本発明の微生物は、通常の培養法で培養することができ
る。使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物その他
使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するも
のならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能で
ある。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、糖蜜、澱粉または粗糖の加水分解物などの炭水化物
、ピルビン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸などの有機
酸が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウムな
どの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、アミ
ン類、その信金窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキ
ス、コーン・ステイープ・リカー、カゼイン加水分解物
、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物な
どが用いられる。
無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウム
、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ムなどが用いられる。
培養は振とう培養または深部通気攪拌などの好気的条件
下、温度２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、ｐＨ
５〜９の範囲、好ましくは中性付近に保持しておこなわ
れ、通常２〜７日で完了する。培地のｐＨ調整は炭酸カ
ルシウム、無機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモ
ニア、ｐＨ緩衝液などによっておこなわれる。
培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物を除去し、イ
オン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することに
より、培養液からＬ−スレオニンを回収することができ
る。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ エシェリヒア・コリＨ−７５９６株および親株であるＨ
−４２５８株を、グルコース２０ｇ／ｌ、ペプトン１０
ｇ／Ｒ，酵母エキスｌＯｇ／ｌ、ＮａＣｌ２　２．５ｇ
／ｌ、ジアミノピメリン＃０．５ｇ　／　Ｒの組成から
なる種培地（ｐＨ７，４）に植菌し、３０℃、１６時時
間上う培養した。得られた種培養液１００−を１１の下
記発酵培地を含む２１の発酵槽に植菌し、攪拌数８０　
Ｏｒｐｍ、　３０℃、通気ＩＩＩ！／ｍｉｎ、で培養し
た。培養中のｐＨＩ！Ｉ整および窒素源の供給はアンモ
ニア水でおこない、ｐＨは約６．５に維持した。グルコ
ースを適宜供給しつつ、８０時間培養をおこなった。そ
の際のしスレオニンの生産量と酢酸生成量を高速液体ク
ロマトグラフィー法により定量し、結果を第１表にまと
めた。
発酵培地の組成は以下の通りである。
グルコース４０ｇ／Ｌ　　（ＮＨ４）２５０４　１２ｇ
／ｊ！−ＫＨｘＰ０４２ｇ／１２．ＭｇＳ○１７Ｈ３○
１ｇ／ｆ１ジアミノピメリン酸０．９ｇ／ｌ、ＤＬメチ
オニン０．３　ｇ　／　Ｒ、コーン・スチーブ・りカー
５ｇ／Ｉｌ　（ｐＨ７，４） 第　　　１　　　表 Ｈ−７５９６３７，３ ）１−４２５８　　　　　３５．９ 実施例２ 実施例１の培養条件で攪拌数を８０　Ｏｒｐｍから６０
　Ｏｒｐｍに変えた以外は、実施例１と同様におこなっ
た。結果を第２表に示した。
Ｈ−７５９６株を用いて得られたし一スレオニン含有培
養液１１を遠心分離（３０００ｒｐｍ、　１０分）にか
け菌体その他の不純物を除去した。得られた上澄液を強
酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン５ＫＩ（Ｈ型）のカ
ラムに通し、Ｌ−スレオニンを吸着させ、水洗後０．５
規定のアンモニア水で溶出して、Ｌ−スレオニン画分を
集めた。集めた両分を濃縮し、エタノールを加えて冷却
下で保存することにより、純度９８％以上のＬ−スレオ
ニンの結晶が２７ｇ得られた。
第　　　２　　　表 菌株　　Ｌ−スレオニン（ｇ　／　１　）　　酢酸（ｇ
／１））１−７５９６　　　　３３．８　　　　　　　
　２．１Ｈ−４２５８＆　８　　　　　　　４２．４発
明の効果 本発明によれば、アミノ酸製剤や飼料添加物として有゛
用なＬ−スレオニンを、効率よく安価に製造することが
できる。また、副生のアミノ酸が少ない。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 　エシェリヒア属に属し、酢酸生合成活性が欠失または
    低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培
    地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生成蓄積させ
    、該培養物よりＬ−スレオニンを採取することを特徴と
    する発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。
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