JPH07163360A - 物質の製造法 - Google Patents
物質の製造法Info
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- JPH07163360A JPH07163360A JP6229728A JP22972894A JPH07163360A JP H07163360 A JPH07163360 A JP H07163360A JP 6229728 A JP6229728 A JP 6229728A JP 22972894 A JP22972894 A JP 22972894A JP H07163360 A JPH07163360 A JP H07163360A
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換え型の大腸菌を用いて効率よく所望の物
質を製造する方法を提供する。 【構成】 所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養
し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物か
ら該物質を採取することを特徴とする物質の製造法にお
いて、微生物として、エッシェリヒア属に属し、酢酸に
対する耐性を有する微生物を所望の物質の生産に関与す
る遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して
得られる形質転換株を用いる。
質を製造する方法を提供する。 【構成】 所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養
し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物か
ら該物質を採取することを特徴とする物質の製造法にお
いて、微生物として、エッシェリヒア属に属し、酢酸に
対する耐性を有する微生物を所望の物質の生産に関与す
る遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して
得られる形質転換株を用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、所望の物質の効率的製
造法を提供するものであり、詳しくはエッシェリヒア属
に属し、酢酸耐性を有する微生物を宿主として用い、そ
こに所望の物質の生産に関与する遺伝情報を導入し、得
られる形質転換株を培養することによる所望の物質の製
造法に関する。
造法を提供するものであり、詳しくはエッシェリヒア属
に属し、酢酸耐性を有する微生物を宿主として用い、そ
こに所望の物質の生産に関与する遺伝情報を導入し、得
られる形質転換株を培養することによる所望の物質の製
造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、大腸菌を用いて所望の物質を生
産する場合には、生産物収量の向上はもとより、発酵槽
の有効な運用や生産物の効率よい回収などの観点から、
高密度で細胞を培養することは有効な手段である。しか
し、大腸菌の場合、栄養物質の代謝に伴って酢酸を生成
し、培養中に酢酸が著量蓄積するにつれて細胞の増殖が
阻害されるため、高密度に培養することは困難であっ
た。これを解決する手段としては、培養液を透析または
濾過することにより培養系から酢酸を除去する透析培養
法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジー(J.Gen.Microbiol.)、103巻、345頁、1977年〕や濾
過培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジ
ニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、36巻、330頁、1990
年〕が知られている。また、純酸素を用いて培養液中の
溶存酸素を高濃度に維持することで、酢酸の生成を抑制
しながら培養する方法〔アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、53
巻、2115頁、1989年〕や、培養液中のグルコース濃度を
低濃度に保つことにより、酢酸の蓄積を抑制する方法
〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・
バイオエンジニアリング(J.Ferment.Bioeng.）、74巻、
196頁、1992年〕などが報告されている。しかしなが
ら、これらの方法は、専用の装置を必要としたり、装置
の維持や管理の複雑化の問題を伴い、工業的には有利と
はいえない。
産する場合には、生産物収量の向上はもとより、発酵槽
の有効な運用や生産物の効率よい回収などの観点から、
高密度で細胞を培養することは有効な手段である。しか
し、大腸菌の場合、栄養物質の代謝に伴って酢酸を生成
し、培養中に酢酸が著量蓄積するにつれて細胞の増殖が
阻害されるため、高密度に培養することは困難であっ
た。これを解決する手段としては、培養液を透析または
濾過することにより培養系から酢酸を除去する透析培養
法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジー(J.Gen.Microbiol.)、103巻、345頁、1977年〕や濾
過培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジ
ニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、36巻、330頁、1990
年〕が知られている。また、純酸素を用いて培養液中の
溶存酸素を高濃度に維持することで、酢酸の生成を抑制
しながら培養する方法〔アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、53
巻、2115頁、1989年〕や、培養液中のグルコース濃度を
低濃度に保つことにより、酢酸の蓄積を抑制する方法
〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・
バイオエンジニアリング(J.Ferment.Bioeng.）、74巻、
196頁、1992年〕などが報告されている。しかしなが
ら、これらの方法は、専用の装置を必要としたり、装置
の維持や管理の複雑化の問題を伴い、工業的には有利と
はいえない。
【０００３】さらにフルオロ酢酸ナトリウムに対する耐
性付与により、酢酸の生合成経路の酵素活性を低下また
は欠失させて酢酸の生成能を低減させる方法（公表特許
公報平２−５０２０６５）も報告されているが、ピルビ
ン酸や乳酸の蓄積が生じる〔バイオテクノロジー・アン
ド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、38
巻、1318頁、1991年〕等の問題がある。
性付与により、酢酸の生合成経路の酵素活性を低下また
は欠失させて酢酸の生成能を低減させる方法（公表特許
公報平２−５０２０６５）も報告されているが、ピルビ
ン酸や乳酸の蓄積が生じる〔バイオテクノロジー・アン
ド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、38
巻、1318頁、1991年〕等の問題がある。
【０００４】酢酸耐性を有する微生物としては、アセト
バクター属に属する微生物及びグルコノバクター属に属
する微生物〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.
Bacteriol.) 、１７２巻、２０９６頁、１９９０年〕が
知られている。しかしながら、エッシェリヒア属に属
し、酢酸耐性を有する微生物及び該微生物を宿主微生物
として用い、所望の物質を製造する方法については知ら
れていない。
バクター属に属する微生物及びグルコノバクター属に属
する微生物〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.
Bacteriol.) 、１７２巻、２０９６頁、１９９０年〕が
知られている。しかしながら、エッシェリヒア属に属
し、酢酸耐性を有する微生物及び該微生物を宿主微生物
として用い、所望の物質を製造する方法については知ら
れていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エッ
シェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物
を宿主微生物として、所望の物質の生産に関与する遺伝
子を保有する組換え体プラスミドを用い、形質転換する
ことにより得られる形質転換株を用いて所望の物質の効
率的な製造法を提供することにある。
シェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物
を宿主微生物として、所望の物質の生産に関与する遺伝
子を保有する組換え体プラスミドを用い、形質転換する
ことにより得られる形質転換株を用いて所望の物質の効
率的な製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、所望の
物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所
望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取す
ることを特徴とする物質の製造法において、微生物とし
て、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有す
る微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有す
る組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換
株を用いることを特徴とする方法および宿主微生物とし
て有用なエッシェリヒア・コリに属し、酢酸に対する耐
性を有する微生物を提供することができる。
物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所
望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取す
ることを特徴とする物質の製造法において、微生物とし
て、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有す
る微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有す
る組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換
株を用いることを特徴とする方法および宿主微生物とし
て有用なエッシェリヒア・コリに属し、酢酸に対する耐
性を有する微生物を提供することができる。
【０００７】本発明で宿主微生物として用いられる微生
物としては、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐
性を有する微生物であればいずれでもよい。耐性とは親
株が生育できない濃度の酢酸の存在下で生育できる能力
をいう。本願明細書に記載の実施例においては親株が生
育できない150mM の酢酸存在下で生育できる変異株が例
示されているが、親株よりも耐性を有する菌株であれば
いずれの菌株でも用いることができる。
物としては、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐
性を有する微生物であればいずれでもよい。耐性とは親
株が生育できない濃度の酢酸の存在下で生育できる能力
をいう。本願明細書に記載の実施例においては親株が生
育できない150mM の酢酸存在下で生育できる変異株が例
示されているが、親株よりも耐性を有する菌株であれば
いずれの菌株でも用いることができる。
【０００８】このような微生物は所望の物質の生産に一
般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に対し
て、通常用いられる変異誘起処理を施した後、親株が生
育できない濃度の酢酸を含有する適当な寒天平板培地上
に塗布し、生育した変異株を取得し、得られた変異株
を、酢酸を含有した適当な培養液で振盪培養し、細胞増
殖量を測定し、親株と比較して生育の良好な菌株を、酢
酸耐性株として選択することにより得られる。
般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に対し
て、通常用いられる変異誘起処理を施した後、親株が生
育できない濃度の酢酸を含有する適当な寒天平板培地上
に塗布し、生育した変異株を取得し、得られた変異株
を、酢酸を含有した適当な培養液で振盪培養し、細胞増
殖量を測定し、親株と比較して生育の良好な菌株を、酢
酸耐性株として選択することにより得られる。
【０００９】より具体的には、まず所望の物質の生産に
一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に通
常の変異誘起処理、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ
照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細
胞を緩衝液で適当に希釈し、親株が生育できない濃度(1
50mM) の酢酸を含んだ適当な寒天平板培地上で培養し、
生じたコロニーを変異株として分離する。
一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に通
常の変異誘起処理、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ
照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細
胞を緩衝液で適当に希釈し、親株が生育できない濃度(1
50mM) の酢酸を含んだ適当な寒天平板培地上で培養し、
生じたコロニーを変異株として分離する。
【００１０】親株としては、所望の物質の生産に一般に
用いられるエッシェリヒア属に属する微生物であればい
ずれでもよく、とくに大腸菌が好ましい。例えば、具体
的には大腸菌(Escherichia coli) ＭＭ２９４株、ＭＣ
１０００株、ＭＣ１０６１株、ＬＥ３９２株、Ｗ３１１
０株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
株、ＤＨ１株、ＤＨ５α株［モレキュラー・クローニン
グ第２版（MolecularCloning 2nd Edition、Ｊ．サムブ
ルック、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｔ．マニアチス著、コール
ドスプリングハーバー出版社、１９８９年）、エクスペ
リメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン(Experiments
With Gene Fusion、Ｔ．Ｊ．シルハリー、Ｍ．Ｌ．バ
ーマン、Ｌ．Ｗ．エンクイスト著、コールドスプリング
ハーバー出版社、１９８４年）］などがあげられる。
用いられるエッシェリヒア属に属する微生物であればい
ずれでもよく、とくに大腸菌が好ましい。例えば、具体
的には大腸菌(Escherichia coli) ＭＭ２９４株、ＭＣ
１０００株、ＭＣ１０６１株、ＬＥ３９２株、Ｗ３１１
０株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
株、ＤＨ１株、ＤＨ５α株［モレキュラー・クローニン
グ第２版（MolecularCloning 2nd Edition、Ｊ．サムブ
ルック、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｔ．マニアチス著、コール
ドスプリングハーバー出版社、１９８９年）、エクスペ
リメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン(Experiments
With Gene Fusion、Ｔ．Ｊ．シルハリー、Ｍ．Ｌ．バ
ーマン、Ｌ．Ｗ．エンクイスト著、コールドスプリング
ハーバー出版社、１９８４年）］などがあげられる。
【００１１】得られた変異株を適当な液体培地で培養
し、親株より生育が良好でかつ培養後のｐＨの低下が少
ない株を本発明の変異株として選択する。このようにし
て得られる変異株の例として、例えば大腸菌(Escherich
ia coli)ＨＮ００２０株、大腸菌(Escherichia coli)
ＨＮ００７４株および大腸菌(Escherichia coli) Ｈ
Ｎ０１２４株があげられる。これらの菌株はいずれもフ
ルオロ酢酸に感受性を示す。該菌株は、平成５年９月２
８日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブダ
ペスト条約に基づいて、ＦＥＲＭ ＢＰ−４４２６、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４４２５およびＦＥＲＭ ＢＰ−４４２
７としてそれぞれ寄託されている。
し、親株より生育が良好でかつ培養後のｐＨの低下が少
ない株を本発明の変異株として選択する。このようにし
て得られる変異株の例として、例えば大腸菌(Escherich
ia coli)ＨＮ００２０株、大腸菌(Escherichia coli)
ＨＮ００７４株および大腸菌(Escherichia coli) Ｈ
Ｎ０１２４株があげられる。これらの菌株はいずれもフ
ルオロ酢酸に感受性を示す。該菌株は、平成５年９月２
８日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブダ
ペスト条約に基づいて、ＦＥＲＭ ＢＰ−４４２６、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４４２５およびＦＥＲＭ ＢＰ−４４２
７としてそれぞれ寄託されている。
【００１２】このような変異株は親株が酢酸を著量生成
する培養条件下においても、酢酸の生成量が親株と比べ
て低減しており、またこの際、変異株の培養終了時にお
ける培養液のｐＨの低下が少ないことから、培養液中へ
のピルビン酸や乳酸の蓄積量も少ないものと考えられ
る。従って、これらの変異株を用いることにより特殊な
培養装置の使用や複雑な培養管理技術を必要とせず、容
易に細胞を高密度に培養できる。
する培養条件下においても、酢酸の生成量が親株と比べ
て低減しており、またこの際、変異株の培養終了時にお
ける培養液のｐＨの低下が少ないことから、培養液中へ
のピルビン酸や乳酸の蓄積量も少ないものと考えられ
る。従って、これらの変異株を用いることにより特殊な
培養装置の使用や複雑な培養管理技術を必要とせず、容
易に細胞を高密度に培養できる。
【００１３】上記のようにして得られる変異株を宿主微
生物として用い、所望の物質の生産に関与する遺伝子を
ベクターに導入して構築される組換え体プラスミドを該
宿主微生物に導入し、得られる形質転換株を培地に培養
することにより所望の物質を生産することができる。本
発明における所望の物質の製造法は、所望の物質を生産
する能力を有する微生物由来の該物質の生産に関与する
遺伝子をクローニングし、構築された該遺伝子を保有す
る組換え体プラスミドを用いることにより、微生物によ
って生産されるいずれの物質の製造にも広く応用でき
る。具体的な物質としては、例えば、ウリカーゼ、アセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼなどの酵素、13Leu-
モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) などの
生理活性ペプチド、スレオニンなどのアミノ酸、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドなどの核酸関連物質、ビオチ
ンなどのビタミン、カロチノイドなどの色素などがあげ
られる。
生物として用い、所望の物質の生産に関与する遺伝子を
ベクターに導入して構築される組換え体プラスミドを該
宿主微生物に導入し、得られる形質転換株を培地に培養
することにより所望の物質を生産することができる。本
発明における所望の物質の製造法は、所望の物質を生産
する能力を有する微生物由来の該物質の生産に関与する
遺伝子をクローニングし、構築された該遺伝子を保有す
る組換え体プラスミドを用いることにより、微生物によ
って生産されるいずれの物質の製造にも広く応用でき
る。具体的な物質としては、例えば、ウリカーゼ、アセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼなどの酵素、13Leu-
モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF) などの
生理活性ペプチド、スレオニンなどのアミノ酸、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドなどの核酸関連物質、ビオチ
ンなどのビタミン、カロチノイドなどの色素などがあげ
られる。
【００１４】所望の物質を生産する能力を有する微生物
の染色体からの該物質の生産に関与する遺伝子の単離
は、常法、例えばカレント・トピックス・イン・マイク
ロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topic
s in Microbiology and Imunrology) 、９６巻、１９８
２年に記載の方法に従っておこなうことができる。得ら
れた遺伝子を適当なベクターに組み込んで組換え体プラ
スミドを構築する。ベクターとしてはエッシェリヒア属
に属する微生物を宿主とすることが可能なベクターであ
ればよい。
の染色体からの該物質の生産に関与する遺伝子の単離
は、常法、例えばカレント・トピックス・イン・マイク
ロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topic
s in Microbiology and Imunrology) 、９６巻、１９８
２年に記載の方法に従っておこなうことができる。得ら
れた遺伝子を適当なベクターに組み込んで組換え体プラ
スミドを構築する。ベクターとしてはエッシェリヒア属
に属する微生物を宿主とすることが可能なベクターであ
ればよい。
【００１５】遺伝子のベクターへの組み込みは、常法に
従って、たとえば染色体及びベクターを適当な制限酵素
で切断し、遺伝子ＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を
調製したのち、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理す
ることによりおこなう。具体的な組換え体プラスミドの
例としては、ウリカーゼの生産に関与する遺伝子を保有
する組換え体プラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４
５６８８）、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの
生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐ
ｔｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）、13Leu-モ
チリンの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラ
スミドｐＭＴＯＩ４（特開昭63−71195 ）、Ｇ−ＣＳＦ
の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミド
ｐＣｆＢＤ28（特開昭63−267292）、スレオニンの生合
成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＥｔｈｒ１
（特開昭６０−３０６９３）などがあげられる。
従って、たとえば染色体及びベクターを適当な制限酵素
で切断し、遺伝子ＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を
調製したのち、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理す
ることによりおこなう。具体的な組換え体プラスミドの
例としては、ウリカーゼの生産に関与する遺伝子を保有
する組換え体プラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４
５６８８）、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの
生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐ
ｔｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）、13Leu-モ
チリンの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラ
スミドｐＭＴＯＩ４（特開昭63−71195 ）、Ｇ−ＣＳＦ
の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミド
ｐＣｆＢＤ28（特開昭63−267292）、スレオニンの生合
成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＥｔｈｒ１
（特開昭６０−３０６９３）などがあげられる。
【００１６】得られた組換え体プラスミドの宿主微生物
への導入は、常法、例えば、モレキュラー・クローニン
グ第２版に記載の方法によって行う。得られる形質転換
株としては、大腸菌（ Escherichia coli）ＨＮ００２
１株、大腸菌ＨＮ００２７株、大腸菌ＨＮ００２８株、
大腸菌ＨＮ００７５株、大腸菌ＨＮ０１２５株があげら
れる。
への導入は、常法、例えば、モレキュラー・クローニン
グ第２版に記載の方法によって行う。得られる形質転換
株としては、大腸菌（ Escherichia coli）ＨＮ００２
１株、大腸菌ＨＮ００２７株、大腸菌ＨＮ００２８株、
大腸菌ＨＮ００７５株、大腸菌ＨＮ０１２５株があげら
れる。
【００１７】上記のようにして得られた形質転換株の培
養は、以下のように行う。すなわち、該微生物を炭素
源、窒素源、無機物等を含有する培地において、好気的
条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えばよ
い。培地に用いる炭素源としては、例えば、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
養は、以下のように行う。すなわち、該微生物を炭素
源、窒素源、無機物等を含有する培地において、好気的
条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えばよ
い。培地に用いる炭素源としては、例えば、グルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
【００１８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
【００１９】無機物としては、リン酸１カリウム、リン
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。用いる微生物
が、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。用いる微生物
が、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
【００２０】培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的条件下、２５〜４２℃で１〜４８時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。上記の方法により培養す
ることにより生成した目的物質の定量は、下記のごとく
行う。すなわち、培養終了後、培養液から大腸菌細胞を
遠心分離などの方法で集め、適当な緩衝液に懸濁する。
この懸濁液、またはこれより調製した無細胞抽出液をレ
ムリら（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、Nature、227巻、680
頁、1970年）の方法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動した後に、クマシーブリリアントブル
ーＲ２５０溶液で染色し、目的物質の生産量を、クロマ
トスキャナーで測定することにより定量する。無細胞抽
出液の調製は、超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理などにより破砕することによ
り行う。また、目的物質がそれぞれの活性を有している
場合には、無細胞抽出液中の物質の活性を測定すること
により、その生産量を定量してもよい。
的条件下、２５〜４２℃で１〜４８時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。上記の方法により培養す
ることにより生成した目的物質の定量は、下記のごとく
行う。すなわち、培養終了後、培養液から大腸菌細胞を
遠心分離などの方法で集め、適当な緩衝液に懸濁する。
この懸濁液、またはこれより調製した無細胞抽出液をレ
ムリら（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、Nature、227巻、680
頁、1970年）の方法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動した後に、クマシーブリリアントブル
ーＲ２５０溶液で染色し、目的物質の生産量を、クロマ
トスキャナーで測定することにより定量する。無細胞抽
出液の調製は、超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕
処理、フレンチプレス処理などにより破砕することによ
り行う。また、目的物質がそれぞれの活性を有している
場合には、無細胞抽出液中の物質の活性を測定すること
により、その生産量を定量してもよい。
【００２１】以下に本発明の実施例を示す。
【００２２】
実施例１．大腸菌ＭＭ２９４株からの酢酸耐性株の造成 大腸菌ＭＭ２９４株を、３０ｍｌのＬＢ培地（バクトト
リプトン １０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ）を含む３００ｍｌ三
角フラスコに植菌し、３７℃で３時間振盪培養して得ら
れた対数増殖期の細胞を、トミー製冷却遠心機ＲＤ−２
０IV（ローターＮｏ．４）を用いて４℃で１０，０００
ｒｐｍ、１０分間遠心して回収した。これを、Ｎ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン ０．５ｍ
ｇ／ｍｌを含有するＴＭ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（以下トリスと略） ６．０５７ｇ
／ｌ、マレイン酸 ５．８０４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １ｇ／ｌ、ク
エン酸ソーダ ０．５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０〕に懸濁し、
３５℃で６０分間振盪して変異処理を行った。この細胞
を集めて洗浄した後、無菌水で細胞数がおよそ１０5個
／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液を、１．５％
の寒天を含有するＭＣＧＡ培地〔グルコース ５ｇ／
ｌ、酢酸アンモニウム １１．５６２ｇ／ｌ（150mM 酢
酸) 、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １５．１４ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃ
ｌ １ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２４ｇ／
ｌ、カザミノ酸 ５ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍ
ｌ〕からなる平板培地上に０．１ｍｌずつ塗布し、３５
℃で２日間培養し、出現したコロニーを変異株として単
離した。取得した変異株を、１０ｍｌのＭＣＧＡ培地を
含有した試験管（直径２４ｍｍ）に植菌し、３０℃で２
４時間振盪培養して、培養終了後、分光光度計により各
培養液について５５０ｎｍの波長で濁度（ＯＤ550）を
測定した。その結果、親株であるＭＭ２９４株と比較し
て、生育が良好な変異株を選択した。
リプトン １０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト
５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ）を含む３００ｍｌ三
角フラスコに植菌し、３７℃で３時間振盪培養して得ら
れた対数増殖期の細胞を、トミー製冷却遠心機ＲＤ−２
０IV（ローターＮｏ．４）を用いて４℃で１０，０００
ｒｐｍ、１０分間遠心して回収した。これを、Ｎ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン ０．５ｍ
ｇ／ｍｌを含有するＴＭ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（以下トリスと略） ６．０５７ｇ
／ｌ、マレイン酸 ５．８０４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．１ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １ｇ／ｌ、ク
エン酸ソーダ ０．５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０〕に懸濁し、
３５℃で６０分間振盪して変異処理を行った。この細胞
を集めて洗浄した後、無菌水で細胞数がおよそ１０5個
／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液を、１．５％
の寒天を含有するＭＣＧＡ培地〔グルコース ５ｇ／
ｌ、酢酸アンモニウム １１．５６２ｇ／ｌ（150mM 酢
酸) 、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １５．１４ｇ／ｌ、
ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃ
ｌ １ｇ／ｌ 、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２４ｇ／
ｌ、カザミノ酸 ５ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ４μｇ／ｍ
ｌ〕からなる平板培地上に０．１ｍｌずつ塗布し、３５
℃で２日間培養し、出現したコロニーを変異株として単
離した。取得した変異株を、１０ｍｌのＭＣＧＡ培地を
含有した試験管（直径２４ｍｍ）に植菌し、３０℃で２
４時間振盪培養して、培養終了後、分光光度計により各
培養液について５５０ｎｍの波長で濁度（ＯＤ550）を
測定した。その結果、親株であるＭＭ２９４株と比較し
て、生育が良好な変異株を選択した。
【００２３】次に、この変異株を１０mlのＭＣＧ培地
（グルコース １０ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ
１5.１４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
0.２４ｇ／ｌ、カザミノ酸５ｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ４
μｇ／ml) を含有する試験管（直径２４mm) に植え、３
０℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、生育が良好
で、培養液のｐＨの低下が少なかった菌株を選択し、大
腸菌ＨＮ００２０株と命名した。
（グルコース １０ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ
１5.１４ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ
５ｇ／ｌ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
0.２４ｇ／ｌ、カザミノ酸５ｇ／ｌ、ビタミンＢ1 ４
μｇ／ml) を含有する試験管（直径２４mm) に植え、３
０℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、生育が良好
で、培養液のｐＨの低下が少なかった菌株を選択し、大
腸菌ＨＮ００２０株と命名した。
【００２４】第１表に、親株であるＭＭ２９４株とＨＮ
００２０株のＭＣＧＡ液体培地における生育能を比較し
た結果を示すが、ＨＮ００２０株は親株よりも良好な生
育を示した。
００２０株のＭＣＧＡ液体培地における生育能を比較し
た結果を示すが、ＨＮ００２０株は親株よりも良好な生
育を示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】ＨＮ００２０株を、種々の濃度の酢酸を含
むＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生
育を調べた。結果を第２表に示す。ＨＮ００２０株は、
１５０ｍＭの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地でも生育を示
し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
むＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生
育を調べた。結果を第２表に示す。ＨＮ００２０株は、
１５０ｍＭの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地でも生育を示
し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試
験管（直径２４ｍｍ）にＭＭ２９４株とＨＮ００２０株
を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。その後ＨＰ
ＬＣを用い、蓄積した有機酸を調べたところ、酢酸以外
には見いだせず、酢酸の蓄積量も親株に比較して低下し
ていた。酢酸の生成量を比較した結果を第３表に示す
が、ＨＮ００２０株は、親株であるＭＭ２９４株と比較
して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減し
ていた。
験管（直径２４ｍｍ）にＭＭ２９４株とＨＮ００２０株
を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。その後ＨＰ
ＬＣを用い、蓄積した有機酸を調べたところ、酢酸以外
には見いだせず、酢酸の蓄積量も親株に比較して低下し
ていた。酢酸の生成量を比較した結果を第３表に示す
が、ＨＮ００２０株は、親株であるＭＭ２９４株と比較
して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減し
ていた。
【００２９】
【表３】
【００３０】実施例２．酢酸耐性株ＨＮ００２０株を用
いたウリカーゼ生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にウリカーゼ発現
用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４５
６８８）を用いて形質転換した。ＨＮ００２０株のコン
ピテントセルは、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（J.of Molecular Biology）、１６６巻、５
５７頁、１９８３年に記載の方法に従って調製した。形
質転換は、ｐＵＴ１１８を含む溶液１μｌと２１０μｌ
のコンピテントセルを混合し、氷上に３０分静置後、４
２℃で９０秒熱処理をし、その後、氷中に２分間保っ
た。これに８００μｌのＳＯＣ培地（２％ バクトトリ
プトン、０．５％ バクトイーストエキストラクト、１
０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ グルコー
ス）を加えて、３７℃で１時間振盪培養した後に、これ
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培
地上に１００μｌずつ塗布した。これを３７℃で１晩培
養することにより生じたコロニーを、形質転換体として
取得した。これらの形質転換体から常法によりプラスミ
ドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８で
あることを確認して、この組換え型大腸菌をＨＮ００２
１株と命名した。 （１）ＨＮ００２１株のフラスコ培養 ＨＮ００２１株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００
ｍｌ三角フラスコに植菌し、３３℃で２４時間振盪培養
を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により
細胞を回収した。得られた細胞を、３ｍｌのＰＢＳ緩衝
液（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ2
ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １．２５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２ｇ／ｌ）に懸濁し、超音波破砕機（ブランソン
社、ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２００）にて細胞を
破砕した。破砕液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心
し、回収した上清を、無細胞抽出液とした。
いたウリカーゼ生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にウリカーゼ発現
用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４５
６８８）を用いて形質転換した。ＨＮ００２０株のコン
ピテントセルは、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（J.of Molecular Biology）、１６６巻、５
５７頁、１９８３年に記載の方法に従って調製した。形
質転換は、ｐＵＴ１１８を含む溶液１μｌと２１０μｌ
のコンピテントセルを混合し、氷上に３０分静置後、４
２℃で９０秒熱処理をし、その後、氷中に２分間保っ
た。これに８００μｌのＳＯＣ培地（２％ バクトトリ
プトン、０．５％ バクトイーストエキストラクト、１
０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ グルコー
ス）を加えて、３７℃で１時間振盪培養した後に、これ
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培
地上に１００μｌずつ塗布した。これを３７℃で１晩培
養することにより生じたコロニーを、形質転換体として
取得した。これらの形質転換体から常法によりプラスミ
ドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８で
あることを確認して、この組換え型大腸菌をＨＮ００２
１株と命名した。 （１）ＨＮ００２１株のフラスコ培養 ＨＮ００２１株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００
ｍｌ三角フラスコに植菌し、３３℃で２４時間振盪培養
を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により
細胞を回収した。得られた細胞を、３ｍｌのＰＢＳ緩衝
液（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ2
ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １．２５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２ｇ／ｌ）に懸濁し、超音波破砕機（ブランソン
社、ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２００）にて細胞を
破砕した。破砕液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心
し、回収した上清を、無細胞抽出液とした。
【００３１】なお、本発明において、ウリカーゼの生産
量は無細胞抽出液中のウリカーゼ活性として示した。ウ
リカーゼ活性は、基質となる尿酸の紫外部吸収（２９３
ｎｍ）の吸光度の減少量を測定し、これに基づいて算出
した。具体的には、３ｍｌの反応液〔５０ｍＭ ほう酸
緩衝液（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸〕中に、ウリ
カーゼを含む０．１５μｇ／ｍｌの蛋白質濃度の無細胞
抽出液を添加し、２５℃で３分間反応させた。本反応中
の２９３ｎｍの吸光度の変化（ΔＯＤ）を測定し、次式
によりウリカーゼの単位（Ｕ）を算出した。上記条件下
で、１分間に１μｍｏｌｅの尿酸を分解する酵素量を１
Ｕとする。
量は無細胞抽出液中のウリカーゼ活性として示した。ウ
リカーゼ活性は、基質となる尿酸の紫外部吸収（２９３
ｎｍ）の吸光度の減少量を測定し、これに基づいて算出
した。具体的には、３ｍｌの反応液〔５０ｍＭ ほう酸
緩衝液（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸〕中に、ウリ
カーゼを含む０．１５μｇ／ｍｌの蛋白質濃度の無細胞
抽出液を添加し、２５℃で３分間反応させた。本反応中
の２９３ｎｍの吸光度の変化（ΔＯＤ）を測定し、次式
によりウリカーゼの単位（Ｕ）を算出した。上記条件下
で、１分間に１μｍｏｌｅの尿酸を分解する酵素量を１
Ｕとする。
【００３２】
【数１】
【００３３】その結果、第４表に示すように、ＭＭ２９
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【００３４】
【表４】
【００３５】（２）ＨＮ００２１株のジャーファーメン
ターを用いた培養 得られたＨＮ００２１株をジャーファーメンターを用い
て培養する場合には、高密度培養法〔バイオテクノロジ
ー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioe
ng.)、17巻、227頁、1975年〕が好適であり、以下のよ
うに行った。なお、下記のいずれの培地においても、プ
ラスミドを安定に組換え型大腸菌中に保持させるため
に、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
前培養として、ＨＮ００２１株を１％のグルコースを含
有する１００ｍｌの培地Ａを含む１リットルの三角フラ
スコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。
ターを用いた培養 得られたＨＮ００２１株をジャーファーメンターを用い
て培養する場合には、高密度培養法〔バイオテクノロジ
ー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioe
ng.)、17巻、227頁、1975年〕が好適であり、以下のよ
うに行った。なお、下記のいずれの培地においても、プ
ラスミドを安定に組換え型大腸菌中に保持させるため
に、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
前培養として、ＨＮ００２１株を１％のグルコースを含
有する１００ｍｌの培地Ａを含む１リットルの三角フラ
スコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。
【００３６】次に、５リットル容量の発酵槽に、１．８
リットルの培地Ａを封入し、１２０℃で２０分間蒸煮滅
菌した。その後、滅菌した１０％ グルコース、２．４
％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４％ ビタミンＢ１を含む
溶液１００ｍｌを発酵槽に添加した後、ＨＮ００２１株
を培養した前記培養物を植菌した。
リットルの培地Ａを封入し、１２０℃で２０分間蒸煮滅
菌した。その後、滅菌した１０％ グルコース、２．４
％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．４％ ビタミンＢ１を含む
溶液１００ｍｌを発酵槽に添加した後、ＨＮ００２１株
を培養した前記培養物を植菌した。
【００３７】
【表５】
【００３８】培養は１４％アンモニア水を用いてｐＨ
６．８に調整しつつ、攪拌（５００ｒｐｍ）、通気（２
リットル／ｍｉｎ）し、３３℃で２４時間行った。ま
た、７０％グルコース溶液を連続的に発酵槽に添加する
ことにより、培養液中のグルコース濃度がそれぞれ０．
５％、１％、２％になるように保った。さらに、生育に
ともない、ＯＤ550が５０になった時に、培地Ｂを、１
リットルの培地Ａに対して１００ｍｌの割合で添加し
た。
６．８に調整しつつ、攪拌（５００ｒｐｍ）、通気（２
リットル／ｍｉｎ）し、３３℃で２４時間行った。ま
た、７０％グルコース溶液を連続的に発酵槽に添加する
ことにより、培養液中のグルコース濃度がそれぞれ０．
５％、１％、２％になるように保った。さらに、生育に
ともない、ＯＤ550が５０になった時に、培地Ｂを、１
リットルの培地Ａに対して１００ｍｌの割合で添加し
た。
【００３９】
【表６】
【００４０】なお、本発明において、培地中の酢酸の生
成量は、細胞を遠心分離により除いた後、培養上清をガ
スクロマトグラフィー法（日立２３６−５０型、カラ
ム；ＰＥＧ−６０００（ＳＵＰＰＯＲＴ：Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂ ＷＡＷ）、カラム長；１ｍ、カラム温度；１
７０℃、キャリアガス；ヘリウム、流量；６０ｍｌ／
分、検出器；ＦＩＤ）により定量した。
成量は、細胞を遠心分離により除いた後、培養上清をガ
スクロマトグラフィー法（日立２３６−５０型、カラ
ム；ＰＥＧ−６０００（ＳＵＰＰＯＲＴ：Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｒｂ ＷＡＷ）、カラム長；１ｍ、カラム温度；１
７０℃、キャリアガス；ヘリウム、流量；６０ｍｌ／
分、検出器；ＦＩＤ）により定量した。
【００４１】第７表にそれぞれのグルコース濃度におけ
る、培養開始２４時間後の菌株の生育量、酢酸蓄積量お
よびウリカーゼ生産量の結果を示すが、親株であるＭＭ
２９４株を宿主として用いた場合には、高濃度の酢酸の
蓄積が認められるが、ＨＮ００２０株を宿主として用い
たＨＮ００２１株の場合には、いずれの糖濃度での培養
においても、親株と比較して酢酸の蓄積量が低減し、細
胞をより高密度に培養することが可能であった。さら
に、ウリカーゼの生産量は、ＨＮ００２０株を宿主とし
た場合は、ＭＭ２９４株を用いた場合よりも増大した。
従って、酢酸耐性株を宿主として利用することにより、
培養中に煩雑な糖濃度の制御を必要としなくとも、細胞
を高密度に培養できるだけでなく、培養液当たりのウリ
カーゼ生産量も高く、効率良くウリカーゼを生産させる
ことが可能である。
る、培養開始２４時間後の菌株の生育量、酢酸蓄積量お
よびウリカーゼ生産量の結果を示すが、親株であるＭＭ
２９４株を宿主として用いた場合には、高濃度の酢酸の
蓄積が認められるが、ＨＮ００２０株を宿主として用い
たＨＮ００２１株の場合には、いずれの糖濃度での培養
においても、親株と比較して酢酸の蓄積量が低減し、細
胞をより高密度に培養することが可能であった。さら
に、ウリカーゼの生産量は、ＨＮ００２０株を宿主とし
た場合は、ＭＭ２９４株を用いた場合よりも増大した。
従って、酢酸耐性株を宿主として利用することにより、
培養中に煩雑な糖濃度の制御を必要としなくとも、細胞
を高密度に培養できるだけでなく、培養液当たりのウリ
カーゼ生産量も高く、効率良くウリカーゼを生産させる
ことが可能である。
【００４２】
【表７】
【００４３】実施例３ ＨＮ００２０株を用いたアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ発現用の組換えプラスミドｐｔ
ｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）を実施例２に
記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法により
プラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐｔｒ
ｃＮＭＡＰＨであることを確認して、この組換え型大腸
菌をＨＮ００２７株と命名した。
ルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ発現用の組換えプラスミドｐｔ
ｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）を実施例２に
記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法により
プラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐｔｒ
ｃＮＭＡＰＨであることを確認して、この組換え型大腸
菌をＨＮ００２７株と命名した。
【００４４】ＨＮ００２７株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、２８℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から無細
胞抽出液を取得し、プロテインアッセイキット（バイオ
ラッド）を用いて、蛋白質濃度が０．２ｍｇ／ｍｌにな
るように調製した。サンプル処理液〔ＳＤＳ ０．９２
ｇ、β−メルカプトエタノール ２ｍｌ、グリセロール
４．０ｇ、トリス ０．３ｇおよび０．１％（Ｗ／
Ｖ）ブロモフェノールブルー溶液 ２ｍｌを水に溶解し
て、塩酸でｐＨ６．８に調製し、全量を２０ｍｌにす
る〕と等量混合し、１００℃で２分間処理した後、１４
％ポリアクリルアミドゲル（１４ｃｍ×１１ｃｍ）に１
０μｌをのせて、４０ｍＡで２時間泳動した。泳動後、
ゲルを染色液（クマシーブリリアントブルー Ｒ２５０
０．２５ｇ、メタノール １２５ｍｌ、酢酸 ２５ｍ
ｌ、水１００ｍｌ）に浸し、３時間染色した後、脱色液
（メタノール １００ｍｌ、酢酸 １００ｍｌ、水 ８
００ｍｌ）に浸し、１２時間脱色した。染色後のポリア
クリルアミドゲルをクロマトスキャナー（島津製作所、
クロマトスキャナーＣＳ−９３０）を用い、５６０ｎｍ
の波長を測定することにより、無細胞抽出液中の総蛋白
質量に対するアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの
含量を測定した。
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、２８℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から無細
胞抽出液を取得し、プロテインアッセイキット（バイオ
ラッド）を用いて、蛋白質濃度が０．２ｍｇ／ｍｌにな
るように調製した。サンプル処理液〔ＳＤＳ ０．９２
ｇ、β−メルカプトエタノール ２ｍｌ、グリセロール
４．０ｇ、トリス ０．３ｇおよび０．１％（Ｗ／
Ｖ）ブロモフェノールブルー溶液 ２ｍｌを水に溶解し
て、塩酸でｐＨ６．８に調製し、全量を２０ｍｌにす
る〕と等量混合し、１００℃で２分間処理した後、１４
％ポリアクリルアミドゲル（１４ｃｍ×１１ｃｍ）に１
０μｌをのせて、４０ｍＡで２時間泳動した。泳動後、
ゲルを染色液（クマシーブリリアントブルー Ｒ２５０
０．２５ｇ、メタノール １２５ｍｌ、酢酸 ２５ｍ
ｌ、水１００ｍｌ）に浸し、３時間染色した後、脱色液
（メタノール １００ｍｌ、酢酸 １００ｍｌ、水 ８
００ｍｌ）に浸し、１２時間脱色した。染色後のポリア
クリルアミドゲルをクロマトスキャナー（島津製作所、
クロマトスキャナーＣＳ−９３０）を用い、５６０ｎｍ
の波長を測定することにより、無細胞抽出液中の総蛋白
質量に対するアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの
含量を測定した。
【００４５】その結果、第８表に示すように、ＭＭ２９
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、アセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼの生産量が増大した。
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、アセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼの生産量が増大した。
【００４６】
【表８】
【００４７】実施例４ ＨＮ００２０株を用いた13Leu-
モチリンの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に13Leu-モチリン
発現用の組換えプラスミドｐＭＴＯＩ４（特開昭６３−
７１１９５）を実施例２に記載の方法に従って導入し、
形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、そ
の構造解析を行い、ｐＭＴＯＩ４であることを確認し
て、得られた組換え型大腸菌をＨＮ００２８株と命名し
た。
モチリンの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に13Leu-モチリン
発現用の組換えプラスミドｐＭＴＯＩ４（特開昭６３−
７１１９５）を実施例２に記載の方法に従って導入し、
形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、そ
の構造解析を行い、ｐＭＴＯＩ４であることを確認し
て、得られた組換え型大腸菌をＨＮ００２８株と命名し
た。
【００４８】ＨＮ００２８株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を、濁度
（ＯＤ550）が８．５になるようにＰＢＳ緩衝液に懸濁
し、超音波処理により菌体を破砕した。この菌体破砕物
から調整した試料を、１４％ポリアクリルアミドゲルで
泳動し、泳動後のゲルを染色して、クロマトスキャナー
を用いて、全菌体蛋白質量に対する13Leu-モチリンの含
量を測定した。
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を、濁度
（ＯＤ550）が８．５になるようにＰＢＳ緩衝液に懸濁
し、超音波処理により菌体を破砕した。この菌体破砕物
から調整した試料を、１４％ポリアクリルアミドゲルで
泳動し、泳動後のゲルを染色して、クロマトスキャナー
を用いて、全菌体蛋白質量に対する13Leu-モチリンの含
量を測定した。
【００４９】その結果、第９表に示すように、ＭＭ２９
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、13Leu-モチリンの生産量が増大した。
４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主と
した場合の方が、13Leu-モチリンの生産量が増大した。
【００５０】
【表９】
【００５１】実施例５ 大腸菌ＭＣ１０００株からの酢
酸耐性株の造成 大腸菌ＭＣ１０００株から、実施例１に記載した方法と
同様の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ００７４株と
命名した。ＨＮ００７４株を、種々の濃度の酢酸を含む
ＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育
を調べた。
酸耐性株の造成 大腸菌ＭＣ１０００株から、実施例１に記載した方法と
同様の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ００７４株と
命名した。ＨＮ００７４株を、種々の濃度の酢酸を含む
ＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育
を調べた。
【００５２】その結果、第１０表に示すように、ＨＮ０
０７４株は、１５０mMの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地で
も生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
０７４株は、１５０mMの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地で
も生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００５３】
【表１０】
【００５４】また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試
験管（直径２４ｍｍ）にＭＣ１０００株とＨＮ００７４
株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成
量を比較した。その結果、第１１表に示すように、酢酸
耐性株ＨＮ００７４株は、親株であるＭＣ１０００株と
比較して、良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が
低減した。
験管（直径２４ｍｍ）にＭＣ１０００株とＨＮ００７４
株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成
量を比較した。その結果、第１１表に示すように、酢酸
耐性株ＨＮ００７４株は、親株であるＭＣ１０００株と
比較して、良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が
低減した。
【００５５】
【表１１】
【００５６】実施例６ ＨＮ００７４株を用いたウリカ
ーゼの生産 実施例５で取得した、ＨＮ００７４株にウリカーゼ発現
用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８を実施例２に記載の
方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラス
ミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８
であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ
００７５株と命名した。
ーゼの生産 実施例５で取得した、ＨＮ００７４株にウリカーゼ発現
用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８を実施例２に記載の
方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラス
ミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８
であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ
００７５株と命名した。
【００５７】ＨＮ００７５株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３３℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から、無
細胞抽出液を取得し、培養液当たりのウリカーゼ生産量
を測定した。その結果、第１２表に示すように、ＨＮ０
０７５株は、ＭＣ１０００株を宿主とした組換え型大腸
菌よりも生育が良好であった。さらに、ＭＣ１０００株
を宿主とした場合よりも、ＨＮ００７４株を宿主とした
場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３３℃で２
４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の
遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から、無
細胞抽出液を取得し、培養液当たりのウリカーゼ生産量
を測定した。その結果、第１２表に示すように、ＨＮ０
０７５株は、ＭＣ１０００株を宿主とした組換え型大腸
菌よりも生育が良好であった。さらに、ＭＣ１０００株
を宿主とした場合よりも、ＨＮ００７４株を宿主とした
場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【００５８】
【表１２】
【００５９】実施例７ 大腸菌ＮＹ４９株からの酢酸耐
性株の造成 大腸菌ＮＹ４９株から、実施例１に記載した方法と同様
の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ０１２４株と命名
した。ＨＮ０１２４株を、種々の濃度の酢酸を含むＭＣ
ＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育を調
べた。
性株の造成 大腸菌ＮＹ４９株から、実施例１に記載した方法と同様
の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ０１２４株と命名
した。ＨＮ０１２４株を、種々の濃度の酢酸を含むＭＣ
ＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育を調
べた。
【００６０】その結果、第１３表に示すように、ＨＮ０
１２４株は、１５０mMの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地で
も生育を示し親株より高い酢酸耐性度を示した。
１２４株は、１５０mMの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地で
も生育を示し親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００６１】
【表１３】
【００６２】また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試
験管（直径２４ｍｍ）にＮＹ４９株とＨＮ０１２４株を
植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成量を
比較した。その結果、第１４表に示すように、酢酸耐性
株ＨＮ０１２４株は、親株であるＮＹ４９株と比較して
良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
験管（直径２４ｍｍ）にＮＹ４９株とＨＮ０１２４株を
植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成量を
比較した。その結果、第１４表に示すように、酢酸耐性
株ＨＮ０１２４株は、親株であるＮＹ４９株と比較して
良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
【００６３】
【表１４】
【００６４】実施例８ ＨＮ０１２４株を用いたヒト顆
粒球コロニー刺激因子の生産 実施例７で取得した、ＨＮ０１２４株に顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）発現用の組換えプラスミドｐＣ
ｆＢＤ２８（特開昭63−267292）を実施例２に記載の方
法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミ
ドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＣｆＢＤ２８
であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ
０１２５株と命名した。
粒球コロニー刺激因子の生産 実施例７で取得した、ＨＮ０１２４株に顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）発現用の組換えプラスミドｐＣ
ｆＢＤ２８（特開昭63−267292）を実施例２に記載の方
法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミ
ドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＣｆＢＤ２８
であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ
０１２５株と命名した。
【００６５】組換え型大腸菌ＨＮ０１２５株を、３０ｍ
ｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌
し、３３℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒ
ｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。得られ
た細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりの顆
粒球コロニー刺激因子の生産量を測定した。
ｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌
し、３３℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒ
ｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。得られ
た細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりの顆
粒球コロニー刺激因子の生産量を測定した。
【００６６】その結果、第１５表に示すように、ＨＮ０
１２５株は、ＮＹ４９株を宿主とした組換え型大腸菌よ
りも生育が良好であった。さらに、ＮＹ４９株を宿主と
した場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ０１２５株を宿主とし
た場合の方が、顆粒球コロニー刺激因子の生産量が増大
した。
１２５株は、ＮＹ４９株を宿主とした組換え型大腸菌よ
りも生育が良好であった。さらに、ＮＹ４９株を宿主と
した場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ０１２５株を宿主とし
た場合の方が、顆粒球コロニー刺激因子の生産量が増大
した。
【００６７】
【表１５】
【００６８】実施例９ ＨＮ００２０株を用いたＬ−ス
レオニンの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に大腸菌のＬ−ス
レオニン生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐ
Ｅｔｈｒ１（特開昭６０−３０６９３）を実施例２に記
載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプ
ラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＥｔｈ
ｒ１であることを確認して、得られた組換え型大腸菌を
ＨＮ０３１０株と命名した。
レオニンの生産 実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に大腸菌のＬ−ス
レオニン生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐ
Ｅｔｈｒ１（特開昭６０−３０６９３）を実施例２に記
載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプ
ラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＥｔｈ
ｒ１であることを確認して、得られた組換え型大腸菌を
ＨＮ０３１０株と命名した。
【００６９】ＨＮ０３１０株を、ＭＣＧ培地組成中グル
コース濃度を２０ｇ／ｌに増強したＭＣＧＧ培地３０ｍ
ｌを含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で
４８時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分
の遠心分離により培養液上清を得た。得られた培養液上
清をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグ
ラフィーアミノ酸分析システム）で分析し、生成したＬ
−スレオニンの量を定量した。
コース濃度を２０ｇ／ｌに増強したＭＣＧＧ培地３０ｍ
ｌを含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で
４８時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分
の遠心分離により培養液上清を得た。得られた培養液上
清をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグ
ラフィーアミノ酸分析システム）で分析し、生成したＬ
−スレオニンの量を定量した。
【００７０】その結果、第１６表に示すように、ＨＮ０
３１０株は、ＭＭ２９４株を宿主とした組換え型大腸菌
よりも生育が良好であった。さらに、ＭＭ２９４株を宿
主とした場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ００２０株を宿主
とした場合の方が、スレオニンの生産量が増大した。
３１０株は、ＭＭ２９４株を宿主とした組換え型大腸菌
よりも生育が良好であった。さらに、ＭＭ２９４株を宿
主とした場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ００２０株を宿主
とした場合の方が、スレオニンの生産量が増大した。
【００７１】
【表１６】
【００７２】
【発明の効果】本発明によれば、組換え型大腸菌による
所望の物質の生産において、容易に高密度に細胞を培養
することができると同時に効率よく所望の物質を製造す
ることができる。
所望の物質の生産において、容易に高密度に細胞を培養
することができると同時に効率よく所望の物質を製造す
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ 2121−4Ｂ 21/00 Ｈ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 所望の物質を生成しえる微生物を培地に
培養し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養
物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造法
において、微生物として、エッシェリヒア属に属し、酢
酸に対する耐性を有する微生物を所望の物質の生産に関
与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換
して得られる形質転換株を用いることを特徴とする方
法。 - 【請求項２】 所望の物質が、酵素、生理活性ペプチ
ド、アミノ酸、核酸関連物質、ビタミンまたは色素であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 所望の物質が、ウリカーゼ、アセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼ、13Leu-モチリン、ヒト顆
粒球コロニー刺激因子、スレオニン、フラビンアデニン
ジヌクレオチド、ビオチンまたは色素である請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 エッシェリヒア・コリに属し、酢酸に対
する耐性を有する微生物。 - 【請求項５】 エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−
４４２５、エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−４４
２６およびエッシェリヒア・コリＦＥＲＭ ＢＰ−４４
２７から選ばれる請求項３記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22972894A JP3629290B2 (ja) | 1993-10-01 | 1994-09-26 | 物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-246478 | 1993-10-01 | ||
| JP24647893 | 1993-10-01 | ||
| JP22972894A JP3629290B2 (ja) | 1993-10-01 | 1994-09-26 | 物質の製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163360A true JPH07163360A (ja) | 1995-06-27 |
| JP3629290B2 JP3629290B2 (ja) | 2005-03-16 |
Family
ID=17148999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22972894A Expired - Fee Related JP3629290B2 (ja) | 1993-10-01 | 1994-09-26 | 物質の製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5750368A (ja) |
| EP (1) | EP0646645B1 (ja) |
| JP (1) | JP3629290B2 (ja) |
| AT (1) | ATE212669T1 (ja) |
| CA (1) | CA2133017C (ja) |
| DE (1) | DE69429757T2 (ja) |
| DK (1) | DK0646645T3 (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149695A (ja) * | 1982-02-26 | 1983-09-06 | Nippon Oil Co Ltd | 醗酵法ビタミンｂ↓１↓２の製法 |
| JPH02502065A (ja) * | 1987-11-07 | 1990-07-12 | 株式会社資生堂 | 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 |
| JPH03236786A (ja) * | 1990-02-09 | 1991-10-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
| JPH05502366A (ja) * | 1988-08-31 | 1993-04-28 | ユニバーシティー オブ フロリダ | 遺伝子工学処理した大腸菌菌株によるエタノール製造 |
| JPH05199867A (ja) * | 1992-01-24 | 1993-08-10 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 |
-
1994
- 1994-09-26 JP JP22972894A patent/JP3629290B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-27 CA CA002133017A patent/CA2133017C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-29 DE DE69429757T patent/DE69429757T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 EP EP94307133A patent/EP0646645B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-29 AT AT94307133T patent/ATE212669T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-29 DK DK94307133T patent/DK0646645T3/da active
-
1996
- 1996-09-19 US US08/715,249 patent/US5750368A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58149695A (ja) * | 1982-02-26 | 1983-09-06 | Nippon Oil Co Ltd | 醗酵法ビタミンｂ↓１↓２の製法 |
| JPH02502065A (ja) * | 1987-11-07 | 1990-07-12 | 株式会社資生堂 | 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 |
| JPH05502366A (ja) * | 1988-08-31 | 1993-04-28 | ユニバーシティー オブ フロリダ | 遺伝子工学処理した大腸菌菌株によるエタノール製造 |
| JPH03236786A (ja) * | 1990-02-09 | 1991-10-22 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
| JPH05199867A (ja) * | 1992-01-24 | 1993-08-10 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0646645A3 (en) | 1995-08-02 |
| ATE212669T1 (de) | 2002-02-15 |
| US5750368A (en) | 1998-05-12 |
| DK0646645T3 (da) | 2002-03-11 |
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