DE69429757T2 - Verfahren zur Herstellung einer Substanz - Google Patents
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Description
- Im Fall der Produktion eines gewünschten Stoffes durch E. coli ist die Züchtung von Zellen bei hoher Dichte sowohl vom Standpunkt des effektiven Betreibens eines Fermentors und der effizienten Gewinnung eines Produkts aus, als auch hinsichtlich der Verbesserung des Ertrags des gewünschten Produkts ein nützliches Mittel. Im Fall von E. coli jedoch war die Züchtung bei hoher Dichte schwierig, da das Wachstum der Zellen in einem Medium mit beträchtlicher Anreicherung von Essigsäure, die aus dem Stoffwechsel von Nährstoffen entsteht, gehemmt wird.
- Um dieses Problem zu lösen, ist ein Dialyse-Züchtungsverfahren [Journal of General Microbiology 103, 345 (1977)] und ein Membran-Zell-Recycling-Züchtungsverfahren [Biotechnology and Bioengineering 36, 330 (1990)] zur Entfernung von Essigsäure aus einem Kultursystem durch Dialyse oder Filtration eines Flüssigmediums bekannt. Es wurde auch von einem Züchtungsverfahren berichtet, bei dem die Bildung von Essigsäure durch Zufuhr von reinem Sauerstoff zur Aufrechterhaltung einer hohen Konzentration von gelöstem Sauerstoff in einem Flüssigmedium verringert wurde [Agricultural and Biological Chemistry 53, 2115 (1989)] sowie von einem Verfahren zur Verringerung der Essigsäure-Anreicherung durch Aufrechterhalten von Glucose in einer geringen Konzentration in einem Flüssigmedium [Journal of Fermentation and Bioengineering 74, 196 (1992)]. Man kann jedoch nicht sagen, dass diese Verfahren industriell von Vorteil sind, auf Grund der Notwendigkeit eines speziellen Apparats und des Problems der komplexen Wartung und Kontrolle eines solchen Apparats.
- Obwohl von einem Verfahren berichtet wurde, die Fähigkeit eines Mikroorganismus, Essigsäure herzustellen, durch Übertragen von Natriumfluoracetat-Resistenz auf den Mikroorganismus zu verringern, so dass die Enzymaktivitäten der Essigsäure-Biosynthese reduziert oder deletiert werden (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 502065/90, Europäische Patentveröffentlichung Nr. 316229), gibt es Nachteile, wie die Anreicherung von Brenztraubensäure und Milchsäure [Biotechnology and Bioengineering 38, 1318 (1991)].
- Es ist bekannt, dass einige Mikroorganismen, die zu den Gattungen Acetobacter und Gluconobacter gehören, essigsäureresistent sind [J. Bacteriology 172, 2096-2104 (1990)]. Es wurde ebenfalls über essigsäureresistente Mikroorganismen berichtet, die zur Gattung Escherichia gehören [Applied Biochem. Biotechnol. 34135, 185-204 (1992); Applied Biochem. Biotechnol. 39/40, 667-685 (1993)]. Jedoch haben diese Mikroorganismen, von denen berichtet wurde, ihre Resistenz durch Transformation erhalten, nicht auf natürliche Weise. Keiner dieser Berichte offenbart die Verwendung von essigsäureresistenten Mikroorganismen als Wirtszellen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion eines Stoffes bereit, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus in einem Medium unter Bedingungen, bei welchen der gewünschte Stoff in der Züchtung angereichert wird, und die Gewinnung des gewünschten Stoffs daraus, wobei der Mikroorganismus eine Transformante ist, die durch die Transformation eines Empfänger-Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einem rekombinanten Plasmid erzeugt wird, wobei das Plasmid ein Gen trägt, welches an der Produktion des gewünschten Stoffes beteiligt ist, und der Empfängerorganismus fähig ist, in Gegenwart von Essigsäure zu wachsen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen für die Transformation geeigneten Mikroorganismus bereit, der zur Gattung Escherichia gehört, und der in der Lage ist, vor der Transformation in Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen.
- Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Produktion einer Transformante bereit, die in der Lage ist, einen Stoff zu produzieren, wobei das Verfahren die Transformation eines Empfänger-Mikroorganismus der Gattung Escherichia umfasst, der fähig ist, in Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen, mit einem rekombinanten Plasmid, welches ein Gen trägt, das an der Produktion des gewünschten Stoffes beteiligt ist.
- Als Empfänger, der in der Erfindung verwendet wird, ist jeder Mikroorganismus geeignet, solange er zur Gattung Escherichia gehört, mit Resistenz gegen Essigsäure und, im Besonderen, fähig, in Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen.
- Der Begriff "Resistenz" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Mikroorganismus bei der Essigsäurekonzentration zu wachsen, bei der der parentale Stamm, von dem der Empfänger- Mikroorganismus stammt, nicht wachsen kann.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen Transformanten, die fähig sind, in Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen, bei welcher Konzentration der parentale Stamm, der verwendet wurde, um den Empfänger-Mikroorganismus herzustellen, von dem die Transformante stammt, nicht wachsen kann.
- Zur Produktion eines solchen essigsäureresistenten Stammes wird ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia für die herkömmliche Verwendung bei der Produktion eines gewünschten Stoffes einer herkömmlich verwendeten Mutationsbehandlung unterworfen, gefolgt vom Ausstreichen auf einem geeigneten Agarplattenmedium, welches Essigsäure in der Konzentration enthält, bei dem der parentale Stamm nicht wachsen kann, und die Mutante, die auf dem Medium wächst, wird dann unter Schütteln in einem geeigneten Flüssigmedium, das Essigsäure enthält, gezüchtet, so dass das Wachstum der Zellen gemessen wird zur Selektion eines essigsäureresistenten Stammes mit höherem Wachstum als dem des parentalen Stammes.
- Als spezifischere Verfahren wird ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia für die herkömmliche Verwendung bei der Produktion eines gewünschten Stoffes einer herkömmlichen Mutationsbehandlung unterzogen, zum Beispiel mit einem Mutagen, wie N- Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin etc. oder durch UV-Strahlung, Bestrahlung mit γ-Strahlen etc., und die behandelten Zellen werden auf eine geeignete Konzentration verdünnt und auf einem geeigneten Agarplattenmedium, welches die Essigsäurekonzentration enthält (150 mM), bei der der parentale Stamm nicht wachsen kann, gezüchtet, um Kolonien zu erhalten, die wiederum als Mutanten getrennt werden.
- Als parentaler Stamm kann jeder Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, für die herkömmliche Verwendung bei der Produktion eines gewünschten Stoffes, vorzugsweise Escherichia coli erwähnt werden. Beispiele sind E. coli-Stämme, wie MM294, MC1000, MC1061, LE392, W3110, JM105, JM109, XL1-Blue, DH1, DH5 α [J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press und T.J. Shilhav, M.L. Berman, L.W. Enquist (1984), Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
- Um die Mutante der vorliegenden Erfindung zu erhalten, werden die entstandenen Mutanten in einem geeigneten Flüssigmedium gezüchtet, und die Mutanten, die, verglichen mit dem parentalen Stamm, abundanter wachsen und eine geringere pH-Abnahme des Kulturmediums verursachen, werden selektiert.
- Als Mutanten, die so erhalten werden, werden der E. coli-Stamm HN0020, der E. coli- Stamm HN0074 und der E. coli-Stamm HN0124 erwähnt. All diese Bakterienstämme sind auf Fluoressigsäure empfindlich. Die Bakterienstämme wurden als FERM BP-4426, FERM BP- 4425 und FERM BP-4427 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 28. September 1993, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
- Sogar unter Kulturbedingungen, die den parentalen Stamm befähigen, eine große Menge an Essigsäure herzustellen, stellt die Mutante der Erfindung eine geringere Menge an Essigsäure her als der parentale Stamm, und der pH-Wert des Kulturmediums der Mutante wird weniger verringert als der des parentalen Stamms. Deshalb wird in Betracht gezogen, dass Brenztraubensäure Lmd Milchsäure in der Kultur in geringeren Mengen angereichert werden. Deshalb können durch die Verwendung der Mutante der Erfindung Zellen bei hohe Dichte leicht gezüchtet werden, ohne dass sie irgendeinen speziellen Kulturapparat oder irgendwelche komplexen Verfahren für die Kontrolle der Kultur benötigen.
- Die so erhaltene Mutante wird dann als Empfänger mit einem rekombinanten Plasmid transformiert, in dem ein Gen, welches bei der Produktion eines gewünschten Stoffes beteiligt ist, in einen Vektor inseriert wurde, und die Transformante kann in einem Medium gezüchtet werden, um den gewünschten Stoff herzustellen.
- Durch die Verwendung eines Mikroorganismus, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das ein cloniertes Gen trägt, das an der Produktion eines gewünschten Stoffes beteiligt ist, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf jeden gewünschten Stoff umfassend angewendet werden. Beispiele für den gewünschten Stoff sind Enzyme, wie Uricase und Acetylpolyaminamid-Hydrolase etc., physiologisch aktive Peptide, wie ¹³Leu-Motilin und menschlicher Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF) etc., Aminosäuren, wie Threonin etc., Nucleinsäureverwandte Substanzen, wie Flavinadenindinucleotid etc., Vitamine, wie Biotin etc. oder Pigmente, wie Carotinoid etc..
- Die Isolierung eines Gens, das bei der Produktion eines gewünschten Stoffes von dem Chromosom eines Mikroorganismus, der fähig ist, den Stoff herzustellen, beteiligt ist, kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren, beschrieben in z. B. Current Topics in Microbiology and Immunology, 96 (1982), durchgeführt werden.
- Das so erhaltene Gen wird in einen geeigneten Vektor für die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids inseriert. Als Vektor ist jeder Vektor geeignet, so lange ein Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, als Empfänger verwendet werden kann.
- Das Gen wird auf übliche Weise in den Vektor inseriert, zum Beispiel durch Spaltung der chromosomalen DNA und der Vektor-DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und darauffolgende Ligierung beider DNA's durch die Wirkung von DNA-Ligase.
- Als rekombinantes Plasmid wird das rekombinante Plasmid pUTI 18 erwähnt, welches ein Gen trägt, das bei der Produktion von Uricase beteiligt ist (Europäische Patentveröffentlichung Nr. 545688), das rekombinante Plasmid ptrcNMAPH, welches ein Gen trägt, das bei der Produktion von Acetylpolyaminamid-Hydrolase beteiligt ist (Japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 71489/92), das rekombinante Plasmid pMTOI4, welches ein Gen trägt, das bei der Produktion von ¹³Leu-Motilin beteiligt ist (Japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 71195/88) das rekombinante Plasmid pCfBD28, welches ein Gen trägt, das bei der Produktion von G-CSF beteiligt ist (Japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 267292/88) und das rekombinante Plasmid pEthr1, welches ein Gen trägt, das bei der Biosynthese von Threonin beteiligt ist (Japanische veröffentlichte nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr. 30693/85).
- Der Empfänger wird mit einer Vielzahl der entstandenen rekombinanten Plasmide in einem herkömmlichen Verfahren, beschrieben in z. B. Molecular Cloning, 2. Ausgabe, transformiert.
- Als Transformante, die fähig ist, einen gewünschten Stoff herzustellen, können E. coli-Stämme, wie HN0021, HN0027, HN0028, HN0075, HN0125 und HN0310 erwähnt werden.
- Die Transformante kann in einem Medium gezüchtet werden, welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Stoffe etc. enthält, unter aeroben Bedingungen, wobei Temperatur, pH-Wert etc. kontrolliert werden.
- Jede Kohlenstoffquelle kann verwendet werden, solange der Mikroorganismus sie assimilieren kann. Beispiele sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Molassen, Blackstrap-Molassen, Stärke-Hydrolysate etc.; Alkohole, wie Ethanol, Glycerin, Sorbit, etc.; organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure etc.; und Aminosäuren, wie Glycin, Alanin, Glutaminsäure, Asparaginsäure etc.
- Als Stickstoffquelle können Ammoniak, verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat etc.; Stickstoff enthaltende organische Stoffe, wie Harnstoff, Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Casein-Hydrolysate, Fischmehl oder seine Abbauprodukte; sowie verschiedene Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure etc. erwähnt werden.
- Als anorganische Verbindung werden Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumphosphat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Calciumcarbonat etc. erwähnt.
- Wenn von den Mikroorganismen für ihr Wachstum benötigt, werden Nährstoffe, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren, Vitamine etc. in geeigneter Menge zugesetzt.
- Die Züchtung wird bei 25-42ºC 1-48 Stunden lang unter aeroben Bedingungen durchgeführt, zum Beispiel durch Schüttelkultur oder Submerskultur unter Rühren. Der pH- Wert des Mediums wird durch Zusetzen von wässrigem Ammoniak, einer Harnstofflösung, einer Natriumhydroxidlösung etc. vorzugsweise um den Neutralpunkt aufrechterhalten.
- Die Zielsubstanz, die gemäß der oben beschriebenen Züchtung hergestellt wird, wird quantitativ in folgender Weise bestimmt. Am Ende der Kultur werden E. coli-Zellen zum Beispiel durch Zentrifugation gewonnen und in einem geeigneten Puffer suspendiert. Gemäß dem wie bei Laemmli et al. (U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970)) beschriebenen Verfahren wird die Suspension, oder, alternativ, ein daraus hergestellter, zellfreier Extrakt, einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel unterzogen, gefolgt von Färbung mit Coomassie-Brilliantblau R-250, so dass die Zielsubstanz auf einem Chromatoscanner quantitativ bestimmt werden kann. Die Produktion eines zellfreien Extrakts beinhaltet das Aufbrechen der Zellen durch Ultraschall, Mahlbehandlung mit Glaskügelchen, Behandlung mit French-Press etc.. Besitzt die Zielsubstanz eine Aktivität, so kann sie quantitativ durch Messen der Aktivität in dem zellfreien Extrakt bestimmt werden.
- Gemäß dem vorliegenden Verfahren zur Produktion eines gewünschten Stoffes durch eine E. coli-Rekombinante können Zellen bei hoher Dichte leicht zugleich mit einer effizienten Produktion eines gewünschten Stoffes gezüchtet werden.
- Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben.
- Der E. coli-Stamm MM294 wurde in 30 ml LB-Medium in einem 30 ml Erlenmeyer- Kolben (10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl) inokuliert und bei 37ºC 3 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, wobei Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase erhalten wurden, die dann durch zehnminütige Zentrifugation bei 4ºC bei 10.000 UpM mit einer Kühlzentrifuge RD-20IV (Rotor Nr. 4), hergestellt von Tommy Seiko Co. Ltd. gewonnen wurden. Für die Mutation wurden die Zellen in TM-Puffer [6,057 g/l Tris(hydroxymethyl)aminomethan (im Folgenden als "Tris" bezeichnet), 5,804 g/l Maleinsäure, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 1 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,5 g/l Natriumcitrat, pH 6,0], welcher 0,5 mg/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin enthält, suspendiert, so dass die Zellen bei 35ºC über 60 Min unter langsamem Schütteln mutiert wurden. Die Zellen wurden gewonnen, gewaschen und in einer Konzentration von etwa 10&sup5; Zellen/ml in sterilisiertem Wasser suspendiert. Diese Suspension, 0,1 ml pro Anwendung, wurde auf ein Plattenmedium, welches aus MCGA-Medium bestand [5 g/l Glucose, 11,562 g/l Ammoniumacetat (150 mM Essigsäure) 15,14 g/l Na&sub2;HPO&sub4;·12 H&sub2;O, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 0,24 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 5 g/l Casaminosäure, 4 ug/ml Vitamin B&sub1;], welche 1,5% Agar enthielt (im Folgenden als "MCGA-Agarmedium" bezeichnet), ausgestrichen, und die Zellen wurden bei 35ºC 2 Tage lang gezüchtet, wobei Kolonien erhalten wurden, die dann als Mutanten isoliert wurden. Die Mutanten wurden auf 10 ml MCGA-Medium in einem Teströhrchen (Durchmesser: 24 mm) inokuliert und dann bei 30ºC unter Schütteln 24 Stunden lang gezüchtet. Am Ende der Züchtung wurde jede Kultur bei einer Wellenlänge von 550 tun mit einem Spektrophotometer auf Trübung (OD&sub5;&sub5;&sub0;) gemessen. Eine Mutante mit höherem Wachstum als dem des parentalen Stamms MM294 wurde selektiert. Dann wurde diese Mutante in 10 ml MCG-Medium (10 g/l Glucose, 15,14 g/l Na&sub2;HPO&sub4;·12 H&sub2;O, 3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 5 g/l NaCl, 1 g/l NH&sub4;Cl, 0,24 g/l MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 5 g/l Casaminosäure, 4 ug/ml Vitamin B&sub1;) in einem Teströhrchen (Durchmesser: 24 mm) inokuliert und bei 30ºC 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Am Ende der Züchtung wurde ein Bakterienstamm, der abundant wuchs und eine geringere Abnahme des pH-Werts des Mediums auslöste, selektiert und als E. coli-Stamm HN0020 bezeichnet.
- Tabelle 1 zeigt die Fähigkeiten des parentalen Stamms MM294 und des Stamms HN0020, in MCGA-Flüssigmedium zu wachsen, und, dass der HN0020-Stamm höheres Wachstum zeigte als der parentale Stamm. Tabelle 1 Wachstum in MCGA-Medium
- Der HN0020-Stamm wurde auf MCGA-Agarmedium ausgestrichen, welches Essigsäure in einer vorbestimmten Konzentration enthielt und bei 33ºC 2 Tage lang für die Wachstumsbestimmung gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der HN0020- Stamm konnte in MCGA-Agarmedium wachsen, selbst wenn es 150 mM Essigsäure enthielt, und zeigte so höhere Essigsäureresistenz als der parentale Stamm. Tabelle 2
- +: wachsend -: nicht wachsend
- Zellwachstum und die Menge an Essigsäure, die in MCG-Medium erzeugt werden, sind in Tabelle 3 aufgeführt.
- Die Stämme MM294 und HN0020 wurden jeweils in 10 ml MCG-Medium in einem Teströhrchen (Durchmesser: 24 mm) inokuliert (geimpft) und bei 30ºC unter Schütteln 24 Stunden gezüchtet. Die Anreicherung organischer Säuren in der Kultur wurde durch HPLC analysiert und, als Ergebnis, wurde keine organische Essigsäure außer Essigsäure gefunden, außerdem war die Anreicherung von Essigsäure durch den HN0020-Stamm geringer als die durch den parentalen Stamm. Wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigte der HN0020-Stamm höheres Wachstum und weniger Erzeugung von Essigsäure als der parentale MM294-Stamm. Tabelle 3 Bildung von Essigsäure in MCG-Medium
- Der in Beispiel 1 gewonnene HN0020-Stamm wurde mit dem rekombinanten Plasmid pUT118 zur Expression von Uricase (EP-A-545688) transformiert. Kompetente Zellen des HN0020-Stamms wurden gemäß dem im Journal of Molecular Biology 166, 557 (1983) beschriebenen Verfahren hergestellt. Für die Transformation wurden 210 ul der kompetenten Zellen mit 1 ul pUT118-Lösung gemischt, dann auf Eis 30 Min lang stehengelassen und 90 Sek. auf 42ºC erhitzt, gefolgt von 2-minütiger Inkubation auf Eis. Dazu wurden 800 ul SOC- Medium (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM MgSO&sub4;, 20 mM Glucose) zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37ºC eine 1 Stunde lang unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen, 100 ul pro Anwendung, wurden auf ein LB-Agarplatten-Medium, welches 50 ul/ml Ampicillin enthielt, ausgestrichen. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die erzeugten Kolonien als Transformanten gewonnen. Dann wurde davon ein Plasmid auf übliche Weise gereinigt. Dieses Plasmid wurde durch Strukturanalyse als pUT118 identifiziert, und das rekombinante E. coli wurde als HN0021-Stamm bezeichnet.
- Der HN0021-Stamm wurde in 30 ml MCG-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer- Kolben inokuliert und bei 33ºC 24 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 10 000 UpM gewonnen. Die Zellen wurden dann in 3 ml PBS-Puffer (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,25 g/l Na&sub2;HPO&sub4;·12 H&sub2;O 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4;) suspendiert und mit einem Ultraschallgerät (Branson Co., LTD., CELL DISRUPTOR 200) aufgebrochen. Die so erhaltene Zelllösung wurde bei 14.000 UpM 15 Min lang zentrifugiert, wobei ein Überstand als zellfreier Extrakt erhalten wurde. Die Produktion von Uricase wurde als die Aktivität von Uricase in dem zellfreien Extrakt bezeichnet.
- Für die Aktivitätsbestimmung von Uricase wurde die Zunahme der UV-Absorption (293 nm) des Substrats Harnsäure auf die folgende Weise überwacht. Der zellfreie Extrakt, der auf 0,15 ug/ml Protein einschließlich Uricase verdünnt war, wurde 3 ml einer Reaktionslösung [50 mM Borpuffer, pH 8,5, 125 uM Harnsäure] zugesetzt, und man ließ das Gemisch bei 25ºC 3 Min lang reagieren. Die Absorptionsänderung (ΔOD) bei 293 nm wurde während der Reaktion überwacht, und seine Uricase-Einheit (U) wird gemäß der folgenden Gleichung berechnet. 1 U bezieht sich auf die Menge an Uricase, mit welcher 1 umol Harnsäure während 1Min unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen abgebaut wird.
- U = (ΔOD · 3 · Verdünnungsgrad der Enzymlösung)/(12,6 · 3)
- 12.6.: Millimolarer molekularer Extinktionskoeffizient von Harnsäure (cm²/umol)
- Wie man in Tabelle 4 sehen kann, führt die Verwendung des HN0020-Stamms als Empfänger zu einer verstärkten Produktion an Zunahme verglichen mit dem MM294-Stamm. Tabelle 4 Wachstum in MCG-Medium und Produktion von Uricase
- Für die Züchtung des Stamms HN0021 in einem Kugelfermentor wird das Hochdichte- Kulturverfahren (Biotechnology and Bioengineering 17, 227 (1975)) bevorzugt verwendet. Für dieses Verfahren wurde jedem Kulturmedium 50 ug/ml Ampicillin für die stabile Aufrechterhaltung eines Plasmids in rekombinantem E. coli zugesetzt. Hochdichte-Kultur wurde auf die folgende Weise durchgeführt. In der Vorkultur wurde der HN0021-Stamm in 100 ml Medium A, welches 1% Glucose enthielt, in einem 1 Liter Erlenmeyer-Kolben inokuliert und bei 30ºC 16 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet.
- Getrennt davon wurde 1,81 Medium A in einen 5 l Fermentor eingeführt und bei 120 ºC 20 Min lang sterilisiert, gefolgt von Zusetzen von 100 ml sterilisierter Lösung, welche 10 % Glucose, 2,4% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O und 0,4% Vitamin B&sub1; enthält, in das der vorgezüchtete HN0021-Stamm dann inokuliert wurde.
- 7.0 g/l Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O
- 4.0 g/l KH&sub2;PO&sub4;
- 4.0 g/l K&sub2;HPO&sub4;
- 1.2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;
- 0.2 g/l NH&sub4;Cl
- 4.0 g/l Bacto-Hefeextrakt
- 40.0 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O
- 40.0 mg/l CaCl&sub2;·2H&sub2;O
- 10.0 mg/l MnSO&sub4;·nH&sub2;O
- 10.0 mg/l AlCl&sub3;·6H&sub2;O
- 4.0 mg/l CoCl&sub2;·6H&sub2;O
- 2.0 mg/l ZnSO&sub4;·7H&sub2;O
- 2.0 mg/l Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O
- 1.0 mg/l CuSO&sub4;·5H&sub2;O
- 0.5 mg/l H&sub3;BO&sub3;
- Die Züchtung wurde bei 33ºC 24 Stunden lang durchgeführt mit Rühren (500 UpM) und Belüftung (2 l/Min), wobei das Medium mit 14%igem wässrigem Ammoniak auf pH 6,8 eingestellt wurde. 70% Glucose wurde nach und nach dem Fermentor zugegeben, um die Glucose im Medium bei 0,5%, 1% beziehungsweise 2% aufrechtzuerhalten. Erreichte die Kultur einen OD&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von 50 an Wachstum, wurde Medium B dem Medium A in einem Verhältnis von 100 ml : 1 Liter zugesetzt.
- 12.0 g/l KH&sub2;PO&sub4;
- 12.0 g/l K&sub2;HPO&sub4;
- 4.0 g/l Bacto-Hefeextrakt
- 2.6 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O
- 186.0 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O
- 186.0 mg/l CaCl&sub2;·2H&sub2;O
- 66.0 mg/l MnSO&sub4;·nH&sub2;O
- 28.0 mg/l ZnSO&sub4;·7H&sub2;O
- 14.0 mg/l CoCl&sub2;·6H&sub2;O
- 5.0 mg/l CuSO&sub4;·5H&sub2;O
- 4.2 mg/l Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O
- Für die quantitative Bestimmung der im Medium erzeugten Essigsäure wurde die Kultur durch Zentrifugation zentrifugiert und der Kulturüberstand wurde durch Gaschromatographie (Hitachi 236-50-Typ, Säule: PEG-6000 (SUPPORT: Chromosorb WAW), Säulenlänge: 1 m, Säulentemperatur: 170ºC, Trägergas: Helium, Durchflussrate: 60 ml/Min, und Detektor: FID) analysiert.
- Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse von 4 Stunden Züchtung. Wo der parentale MM294- Stamm als Empfänger verwendet wurde, wurde eine große Menge an Essigsäure gebildet. Auf der anderen Seite wurde im Fall von Stamm HN0021 in jeder Glucosekonzentration weniger Essigsäure gebildet, wobei der Stamm HN0020 als Empfänger verwendet wurde, und die Zellen konnten bei höherer Dichte gezüchtet werden. Als Empfänger brachte der Stamm HN0020 eine höhere Uricaseproduktion hervor als der Stamm MM294. Auf Grund der Verwendung eines solchen essigsäureresistenten Stamms als Empfänger ist es deshalb 1 möglich, nicht nur die Züchtung von Zellen bei höherer Dichte durchzuführen, ohne eine komplizierte Kontrolle der Glucosekonzentration während der Züchtung, sondern auch eine größere Menge an Uricase in der Züchtung effizient zu produzieren. Tabelle 7 Wachstum von Zellen und Produktion von Uricase
- Der in Beispiel 1 erhaltene HN0020-Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit dem rekombinanten Plasmid ptrcNMAPH zur Expression von Acetylpolyaminamid-Hydrolase (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 71489/92) transformiert. Ein Plasmid wurde von der Transformante isoliert und gereinigt, und dieses Plasmid wurde als ptrcNMAPH durch Strukturanalyse identifiziert. Das rekombinante E. coli wurde als HN0027-Stamm bezeichnet.
- Der HN0027-Stamm wurde in 30 ml MCG-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer- Kolben inokuliert und bei 28ºC 24 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 10.000 UpM gewonnen. Nachdem die Proteinkonzentration des zellfreien Extrakts unter Verwendung eines Protein-Test-Kits (Bio- Rad) bestimmt war, wurde der Extrakt auf 0,2 mg/ml eingestellt. Diese Probe wurde dem gleichen Volumen einer Proben-Behandlungslösung [20 ml wässrige Lösung, welche 0,92 g SDS, 2 ml β-Mercaptoethanol, 4,0 g Glycerin, 0,3 g Tris und 2 ml 0,1% (W/V) Bromphenolblau enthält und mit Salzsäure auf pH 6,8 eingestellt ist], zugesetzt und man ließ die Probenlösung bei 100ºC 2 Min lang stehen. Dann wurden 10 ul der Probenlösung auf ein 14%iges Polyacrylamidgel (14 cm · 11 em) geladen und bei 40 mA 2 Stunden lang elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 3 Stunden lang in einer gelfärbenden Lösung (0,25 g Coomassie-Brilliantblau R250, 125 ml Methanol, 25 ml Essigsäure, 100 ml Wasser) gefärbt und dann 12 Stunden in einer entfärbenden Lösung (100 ml Methanol, 100 ml Essigsäure, 800 ml Wasser) entfärbt. Nach der Entfärbung wurde das Polyacrylamidgel mit einem Chromatoscanner CS-930 (Shimadzu) auf Absorption bei 560 nm überwacht, wobei der Gehalt an Acetylpolyaminamid-Hydrolase im zellfreien Extrakt bestimmt wurde.
- Wie in Tabelle 8 gezeigt, führt die Verwendung des HN0020-Stamms zu einer verstärkten Produktion von Acetylpolyaminamid-Hydrolase verglichen mit dem MH294- Stamm. Tabelle 8 Wachstum von Zellen und Produktion von Acetylpolyacrylaminamid-Hydrolase in MCG- Medium
- 1) APH: Acetylpolyaminamid-Hydrolase
- 2) Gesamtproteingehalt des zellfreien Extrakts
- Der in Beispiel 1 erhaltene HN0020-Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit dem rekombinanten Plasmid pmTOI4 zur Expression von ¹³Leu-Motilin (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 71195/88) transformiert. Ein Plasmid wurde von der Transformante isoliert und gereinigt, und dieses Plasmid wurde als pMTOI4 durch Strukturanalyse identifiziert. Das rekombinante E. coli wurde als HN0028- Stamm bezeichnet.
- Der HN0028-Stamm wurde in 30 ml MCG-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer- Kolben inokuliert und bei 35ºC 24 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 10.000 UpM gewonnen.
- Die so erhaltenen Zellen wurden bei einer Trübung (OD&sub5;&sub5;&sub0;) von 8,5 in einem PBS- Puffer suspendiert und dann wurde der Mikroorganismus durch Beschallung aufgebrochen. Eine Probe, die von der Lösung der aufgebrochenen Mikroorganismen hergestellt wurde, wurde auf einem 14%igen Polyacrylamidgel elektrophoresiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel gefärbt, so dass der Gehalt an ¹³Leu-Motilin im Gesamtprotein der Mikroorganismen mit dem Chromatoscanner bestimmt wurde.
- Wie in Tabelle 9 gezeigt, führte die Verwendung des HN0020-Stamms als Empfänger zu einer verstärkten Produktion von ¹³Leu-Motilin verglichen mit dem MM294-Stamm. Tabelle 9 Wachstum und Produktion von ¹³Leu-Motilin in MCG-Medium
- 1) Gehalt an ¹³Leu-Motilin in den gesamten bakteriellen Proteinen
- In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde eine Mutante vom E. coli-Stamm MC 1000 gewonnen und als HN0074-Stamm bezeichnet.
- Der HN0074-Stamm wurde auf MCGA-Agarmedium, welches Essigsäure in einer vorher bestimmten Konzentration enthielt, inokuliert und bei 33ºC 2 Tage lang gezüchtet. Der HN0074-Stamm konnte in MCGA-Medium wachsen, selbst wenn es 150 mM Essigsäure enthielt, und zeigte somit höhere Essigsäureresistenz als der parentale Stamm. Tabelle 10
- +: wachsend -: nicht wachsend
- Die Stämme MC1000 und HN0074 wurden jeweils in 10 ml MCG-Medium in einem Teströhrchen (Durchmesser: 24 mm) inokuliert und bei 30ºC 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet, und die Mengen an produzierter Essigsäure wurden miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Der essigsäureresistente HN0074-Stamm zeigte höheres Wachstum mit weniger Erzeugung von Essigsäure als der parentale MC100-Stamm. Tabelle 11 Bildung von Essigsäure in MCG-Medium
- Der in Beispiel 5 erhaltene HN0074-Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit dem rekombinanten Plasmid pUT118 zur Expression von Uricase transformiert. Ein Plasmid wurde von der Transformante isoliert und gereinigt, und dieses Plasmid wurde als pUT11B durch Strukturanalyse identifiziert. Das rekombinante E. coli wurde als HN0075-Stamm bezeichnet.
- Der HN0075-Stamm wurde in 30 ml MCG-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer- Kolben inokuliert und bei 33ºC 24 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 10.000 UpM gewonnen. Von den Zellen wurde ein zellfreier Extrakt gewonnen und die Uricaseproduktion bestimmt. Wie in Tabelle 12 gezeigt, war das Wachstum des HN0075-Stammes höher als das des rekombinanten E. coli vom MC1000-Stamm als Empfänger, außerdem führte die Verwendung des HN0074-Stamms als Empfänger zu einer verstärkten Produktion von Uricase verglichen mit dem MC1000- Stamm. Tabelle 12 Wachstum von Zellen und Produktion von Uricase in MCG-Medium
- In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde eine Mutante vom E. coli-Stamm NY49 gewonnen und als EN0124-Stamm bezeichnet.
- Der HN0124-Stamm wurde auf MCGA-Agarmedium, welches eine vorher bestimmte Konzentration enthielt, inokuliert und bei 33ºC 2 Tage lang für die Wachstumsbestimmung gezüchtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt. Der HN0124-Stamm konnte in MCGA- Medium wachsen, selbst wenn es 150 mM Essigsäure enthielt, und zeigte somit höhere Essigsäureresistenz als der parentale Stamm. Tabelle 13
- +: wachsend -: nicht wachsend
- Die Stämme NY49 und HN0124 wurden jeweils in 10 ml MCG-Medium in einem Teströhrchen (Durchmesser: 24 mm) inokuliert und bei 30ºC 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet, und die Mengen an darin gebildeter Essigsäure wurden miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt. Der essigsäureresistente HN0124-Stamm wuchs abundanter und verursachte weniger Essigsäurebildung als der parentale NY49-Stamm. Tabelle 14 Bildung von Essigsäure in MCG-Medium
- Der in Beispiel 7 erhaltene HN0124-Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit dem rekombinanten Plasmid pCfBD28 zur Expression von menschlichem Granulozyten-koloniestimulierendem Faktor (G-CSF) (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 267292/88) transformiert. Ein Plasmid wurde von der Transformante isoliert und gereinigt, und dieses Plasmid wurde durch Strukturanalyse als pCfBD28 identifiziert. Das rekombinante E. coli wurde als HN0125-Stamm bezeichnet.
- Der rekombinante E. coli-Stamm HN0125 wurde in 30 ml MCG-Medium in einem 300 ml Erlenmeyer-Kolben inokuliert und bei 33ºC 24 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und die Zellen wurden durch zehnminütige Zentrifugation bei 10.000 UpM gewonnen. Von den Zellen wurde ein zellfreier Extrakt gewonnen und die Menge an menschlichem Granulozyten-koloniestimulierendem Faktor darin wurde bestimmt. Wie in Tabelle 15 gezeigt, war das Wachstum des HN0125-Stammes höher als das des rekombinanten E. coli vom NY49-Stamm als Empfänger, und die Verwendung des HN0124-Stamms als Empfänger führte zu einer verstärkten Produktion von menschlichem Granulozytenkoloniestimulierendem Faktor verglichen mit dem NY49-Stamm. Tabelle 15 Wachstum von Zellen und Produktion von Granulozyten-koloniestimulierendem Faktor in
- 1) Gesamter Proteingehalt des zellfreien Extrakts
- Der in Beispiel 1 erhaltene HN0020-Stamm wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 mit dem rekombinanten Plasmid pEthrl, welches ein von E. coli abgeleitetes Gen trägt, das bei der Biosynthese von L-Threonin beteiligt ist (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 30693/85) transformiert. Ein Plasmid wurde von der Transformante auf die übliche Weise isoliert und gereinigt, und dieses Plasmid wurde als pEthrl durch Strukturanalyse identifiziert. Das rekombinante E. coli wurde als HN0310- Stamm bezeichnet.
- Der HN0310-Stamm wurde mit 30 ml MCGG-Medium in einen 300 ml Erlenmeyer- Kolben platziert, wobei die Glucosekonzentration in der Zusammensetzung des MCG- Mediums auf 20 g/l erhöht war. Der Mikroorganismus wurde bei 35ºC 48 Stunden lang unter Schütteln gezüchtet, und dann bei 10.000 UpM 10 Min lang zentrifugiert, um einen Kulturüberstand zu erhalten.
- Für die quantitative Bestimmung des produzierten L-Threonins wurde der Kulturüberstand mit einem Aminosäure-Analysator (ein Produkt von Nippon Bunko Co., Ltd., Aminosäure-Analysesystem durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie) analysiert.
- Wie in Tabelle 16 gezeigt, führte die Verwendung des HN0020-Stamms als Empfänger zu einer verstärkten Produktion von Uricase verglichen mit dem MM294-Stamm. Tabelle 16 Wachstum von Zellen und Produktion von L-Threonin in MCGG-Medium
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung eines Stoffes, umfassend die Züchtung eines
Mikroorganismus in einem Medium unter Bedingungen, bei welchen der
gewünschte Stoff in der Kultur angesammelt wird, und die Gewinnung des
gewünschten Stoffes aus der Kultur, wobei der Mikroorganismus eine
Transformante ist, die durch die Transformation eines Empfänger-
Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einem rekombinanten
Plasmid erzeugt wird, wobei das Plasmid ein Gen trägt, welches an der
Produktion des gewünschten Stoffes beteiligt ist, und der
Empfängermikroorganismus fähig ist, in Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der gewünschte Stoff ein Enzym, ein
physiologisch aktives Peptid, eine Aminosäure, eine
Nucleinsäureverwandte Substanz, ein Vitamin oder ein Pigment ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der gewünschte Stoff Uricase,
Acetylpolyaminamid-Hydrolase, ¹³Leu-Motilin, menschlicher
Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, Threonin, Flavinadenindinucleotid, Biotin oder
ein Carotinoid ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der
Empfängermikroorganismus Escherichia coli FERM BP-4425, Escherichia
coli FERM BP-4426 oder Escherichia coli FERM BP-4427 ist.
5. Mikroorganismus, der sich für eine Transformation eignet, welcher zur
Gattung Escherichia gehört und welcher vor der Transformation fähig ist, in
Gegenwart von 150 mM Essigsäure zu wachsen.
6. Mikroorganismus nach Anspruch 5, welcher Escherichia coli FERM BP-
4425, Escherichia coli FERM BP-4426 oder Escherichia coli FERM BP-
4427 ist.
7. Verfahren zur Herstellung einer Transformante, die fähig ist, einen Stoff zu
produzieren, wobei das Verfahren die Transformation eines
Empfängerorganismus nach Anspruch 1 oder 4 mit einem rekombinanten
Plasmid umfasst, das ein Gen trägt, welches an der Produktion des
gewünschten Stoffes beteiligt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der gewünschte Stoff ein Enzym, ein
physiologisch aktives Peptid, eine Aminosäure, ein
Nucleinsäureverwandter Stoff, ein Vitamin oder ein Pigment ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der gewünschte Stoff Uricase,
Acetylpolyaminamid-Hydrolase, ¹³Leu-Motilin, menschlicher
Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor, Threonin, Flavinadenindinucleotid, Biotin oder
ein Carotinoid ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die resultierende
Transformante gezüchtet wird, um den gewünschten Stoff zu prodzieren.
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