JP2763119B2 - 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 - Google Patents

低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法

Info

Publication number
JP2763119B2
JP2763119B2 JP63508875A JP50887588A JP2763119B2 JP 2763119 B2 JP2763119 B2 JP 2763119B2 JP 63508875 A JP63508875 A JP 63508875A JP 50887588 A JP50887588 A JP 50887588A JP 2763119 B2 JP2763119 B2 JP 2763119B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
escherichia coli
acetic acid
biotin
culture
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63508875A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH02502065A (ja
Inventor
信一郎 土師
欧二 伊福
治郎 岸本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shiseido Co Ltd
Original Assignee
Shiseido Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shiseido Co Ltd filed Critical Shiseido Co Ltd
Publication of JPH02502065A publication Critical patent/JPH02502065A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2763119B2 publication Critical patent/JP2763119B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C12P17/186—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system containing a 2-oxo-thieno[3,4-d]imidazol nucleus, e.g. Biotin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/585—Calcitonins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C21—METALLURGY OF IRON
    • C21B—MANUFACTURE OF IRON OR STEEL
    • C21B13/00—Making spongy iron or liquid steel, by direct processes
    • C21B13/0006—Making spongy iron or liquid steel, by direct processes obtaining iron or steel in a molten state
    • C21B13/0013—Making spongy iron or liquid steel, by direct processes obtaining iron or steel in a molten state introduction of iron oxide into a bath of molten iron containing a carbon reductant
    • C21B13/002—Reduction of iron ores by passing through a heated column of carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P10/00—Technologies related to metal processing
    • Y02P10/10—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions
    • Y02P10/134—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions by avoiding CO2, e.g. using hydrogen

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、新規微生物、特に大腸菌（Escherichia c
oli）で野生型大腸菌に比べて低い酢酸産生能を有する
新規微生物、及び高密度で該微生物を培養することによ
る収率のよい有用物質の製造方法に関する。本明細書で
使用する「酢酸産生能」または「酢酸生産能」などの語
は、適当な培養条件下で大腸菌を培養した場合に、細菌
細胞乾燥重量当りの酢酸蓄積量を意味する。
〔背景技術〕
蛋白質またはビタミンのような有用物質の化学合成
は、複雑な工程を要するため高価である。従って、微生
物を用いる発酵方法によりかかる物質の効率的な製造方
法が開発されてきた。
ビオチンは、動物、植物および微生物などにとって必
須であり、飼料または輪液添加剤として使用することが
できる。ビオチンに関しても発酵方法の開発が、試みら
れており、日本の未審査特許公開、すなわち特開昭61−
202686号および同62−155081号公報、ならびにW087/013
91は、遺伝子工学的技術により改良された大腸菌を使用
するビオチンの製造方法を公表している。
一般に、前記物質を微生物を用いて生産する場合に
は、生産物収量の向上はもとより、発酵槽の有効な運用
や生産物の効率のよい回収の観点から、流加培養などに
より培養液中における微生物の高密度化を達成すること
は有効な手段である。大腸菌、特に遺伝子工学的技術に
より改良された大腸菌を用いる場合には、高密度培養に
より多大な利益を得ることができる。しかしながら、大
腸菌の場合、栄養物質の代謝に伴って酢酸が生成し、培
養液中に著量蓄積するにつれて細胞増殖活性を阻害する
ので、高密度培養を実現することは困難であった。前記
課題を解決し、高密度培養を可能にする手段として、培
養液を透析または濾過することにより培養系から生成す
る酢酸を除去する透析培養法または濾過培養法が知られ
ている。
また、純酸素を使用して培養液中の溶存酸素を高濃度
に維持することで、酢酸の生成量を抑制する加圧培養法
が提案されている（松井ら、昭和61年度日本醗酵工学会
大会講演要旨集、206頁）。
しかしながら、透析培養や濾過培養は専用の装置を必
要としたり、装置の維持管理の複雑化等の問題を伴い、
経済的、実用的なものとはいえない。さらに、大腸菌に
より生成蓄積される特定の有用物質（例えば、ビオチ
ン）は、培養液から酢酸と共に透析または濾過されるの
で、有用物質の回収工程で低濃度の有用物質含有液を多
量に処理することが必要となり、高密度培養を実施する
ことで得られる利点が著しく損われる。加圧培養法を用
いる大腸菌の高密度培養は、培養操作や培養条件の複雑
な制御を必要とし、大腸菌の高密度培養が容易には達成
できない。
〔発明の開示〕
本発明者らは、従来技術の観点と異なる（すなわち、
大腸菌を遺伝的に改良する）観点に立ち、前記課題を改
善すべく鋭意研究を重ねた結果、野生型の大腸菌株の人
工的変異により低酢酸産生能（野生型大腸菌の酢酸産生
能の多くて1/5）を示す変異菌株を得ることに成功し
た。これらの変異菌株を有用物質の製造に使用する場
合、透析培養法、濾過培養法または加圧培養法などの特
殊な培養法を使用しなくとも、生成する酢酸による増殖
活性阻害を受けることなく、高密度培養が容易に遂行で
きることを本発明者らは見出した。さらに本発明者ら
は、これらの変異菌株が有用物質産生に関与する遺伝情
報を担う組換えプラスミドにより形質転換され得ること
を見出した。例えば、ビオチンオペロンを含有する組換
えプラスミドを変異菌株に導入し、得られる菌株を培養
する場合には、酢酸による増殖活性の阻害を伴うことな
く菌株細胞が高密度に達するばかりでなく、増殖活性が
維持されるので、常法ではビオチンの生合成中間体とし
てデスチオビオチンが残存蓄積されていたのにもかかわ
らず、中間体デスチオビオチンは効率良くビオチンまで
代謝され、ビオチンの収量は著しく増加する。またさら
に、本発明者らは、培養液に所定量のアラニンを添加す
ることによりデスチオビオチンおよびビオチンの産生量
が著しく増加することを見出した。
従って、本発明は、酢酸産生能が野生型大腸菌のそれ
の多くて1/5であることを特徴とする大腸菌に関する。
さらに、本発明は、野生型大腸菌の多くて1/5の酢酸
産生能を有する大腸菌であって有用物質産生に関与する
遺伝情報を担う組換えプラスミドを含む大腸菌にも関す
る。
さらにまた、本発明は、野生型大腸菌の多くて1/5の
酢酸産生能を有する大腸菌であって、有用物質産生に関
与する遺伝情報を担う組換えプラスミドを含む大腸菌を
高密度で培養し、次いで生成する有用物質を採取するこ
とを特徴とする有用物質の製造方法に関する。
〔図面の簡単な説明〕
第１図は、例１で詳述されるようなプラスミドpXBA31
2の作成手順の説明図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明の微生物の調製 酢酸産生能が野生型大腸菌の多くて1/5の大腸菌（以
下AD変異株と称する）を取得するには、野生型大腸菌に
通常用いられる変異誘起処理を施し、得られた細菌細胞
を適当な培養液で振盪培養し、培地中に蓄積した酢酸量
および細菌細胞濃度を定量し、次いで野生型菌株に比べ
て酢酸の生成量が多くて1/5に低下したAD変異株を選択
すればよい。より好ましい方法としては、変異誘起処理
後の細菌細胞の中からフルオロ酢酸ナトリウムに対して
耐性を有する大腸菌（以下、FR変異株と称する）を取得
し、次いで該FR変異株の中から酢酸産生能が野生株に比
して低下した株を選択するのが好ましい。なぜなら、酢
酸産生能の低い大腸菌はFR変異株の中に多く見出せるか
らである。
より具体的には、まず、野生型大腸菌に通常の変異誘
起処理、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンのごとき変異誘起剤で処理を行ない、得ら
れた細胞を緩衝液で適当に希釈し、フルオロ酢酸ナトリ
ウムを含んだプロリンを単一炭素源とする最少培地寒天
平板上で培養し、生じたコロニーをFR変異株として釣菌
分離する。次に、分離したFR変異株を適当な液体培地で
振盪培養し、培地中に蓄積した酢酸量を液体クロマトグ
ラフィーや酵素反応を利用したアッセイキット（Ｆキッ
ト：べーリンガーマンハイム山之内）などを用いて定量
し、野生型菌株に比べて酢酸の生成量が多くて1/5に低
下したAD変異株を選択、取得する。このようにして得た
株は、酢酸産生能が低く、かつフルオロ酢酸ナトリウム
耐性をも有する。すなわち、通常の培地を用いて溶存酸
素が不足しないような条件下で培養した場合、培養液中
の細菌細胞乾燥重量当りの酢酸蓄積量が野生型大腸菌で
は0.5〜1.5であるのに対して、本発明のAD変異株は0.1
以下である。細菌細胞乾燥重量当りの酢酸蓄積量は、酢
酸蓄積量（g/）を前記細胞濃度（g/）で割った商で
ある。
野生型大腸菌のかわりに、ビオチンによるフィードバ
ック阻害が解除された変異株（以下、DR変異株と称す
る）、例えば、大腸菌DRK−332〔微工研条寄第2113号；
なお、「微工研条寄」として本明細で記載されるすべて
の数字は、ブタペスト条約に基づく国際寄託当局として
の微生物工業技術研究所（FRI）の寄託番号を示し、こ
の菌株は、日本国における国内寄託当局としてのFRIに
原寄託された微工研菌寄第8585号から内部移管されてい
る。また、「微工研菌寄」として本明細書に記載される
すべての数字は、国内寄託当局としてのFRIの寄託番号
を示す〕を親株として用いて同様の変異誘起処理をすれ
ば、酢酸産生能が低く、フルオロ酢酸ナトリウム耐性を
有し、かつビオチンによるフィードバック阻害が解除さ
れた変異株を得ることができる。このようにして得られ
るAD変異株としては、例えば大腸菌DRK−3323（微工菌
条寄第2116号：微工研菌寄第9675号）があげられる。
ビオチン産生能を有する大腸菌から単離されるビオチ
ンオペロンをベクターDNAに挿入することにより調製さ
れる組換えプラスミドは、特開昭62−155081号公報に記
載された方法により取得することができ、例えば、pKHN
31があげられる。また、このようにして得られた組換え
プラスミドのベクターの持つ形質をテトラサイクリン耐
性にすることにより、その後の高密度培養を通じてプラ
スミドが脱落されない安定な組換えプラスミドを取得す
ることができる。
別法として、組換えプラスミド含有AD変異株の取得
は、前記のごとくして得た組換えプラスミドを、常法、
例えば、Mandel M.,ら、J.Mol.Biol.,53,109（1970）に
記載のカルシウム処理法によりAD変異株（例えば、大腸
菌DRK−3323）に導入し、ベクターの持つ形質により、
組換えプラスミドを含有する細菌細胞のクローンが選択
的に生育し得る寒天培地プレートにて培養し、そして出
現するコロニーを釣菌することにより得ることができ
る。
かくして得られた組換えプラスミド含有AD変異株の例
としては、例えば大腸菌DRK−3323［pXBA312］（微工研
条寄第2117号：微工研菌寄第9676号）があげられる。
有用物質としてヒトカルシトニン（以下、hCTと称す
る）が望まれる場合には、対応する組換えプラスミドを
含有するAD変換株を調製してもよい。例えば、コラゲナ
ーゼ切断部位を含むhCTとβ−ガラクトシダーゼとの融
合蛋白質をコードする遺伝子およびtacプロモーターを
有する組換えプラスミド含有の大腸菌M15［pZT32］（微
工研条寄与第2115号：微工研菌寄第9266号）からプラス
ミドpZT32を単離し、次いで大腸菌NA−75（微工研条寄
第2105号）のようなAD変異株に導入して大腸菌NA−75
［pZT32］を得ることができる。
他の有用な物質が望まれる場合には、組換えDNAを目
的物質産生に関与する遺伝子とベクターDNAから調製
し、次いでAD変異株に導入して目的微生物を得ることが
できる。
高密度培養方法 前記のごとくして調製される本発明の大腸菌を培養す
れば酢酸による増殖活性の阻害を受けることなく容易に
高密度にすることができる。
本発明の大腸菌の培養に際して用いられる培地として
は、炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培地、およ
びまたは天然培地のいずれも使用可能である。炭素源と
しては、グルコース、グリセリン、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解液または
糖蜜などの炭水化物が使用できる。窒素源としては、ア
ンモニアまたは塩化アンモニウム、燐酸アンモニウムも
しくは硫酸アンモニウムなどの各種の無機または有機ア
ンモニウム塩類、あるいは肉エキス、酵母エキス、コー
ンスティープリカー、カゼイン加水分解物、脱脂大豆粕
もしくはその消化物などの天然有機窒素源が使用可能で
ある。天然有機窒素源の多くは、窒素源であるとともに
炭素源にもなりうる。無機物としては、燐酸第一水素カ
リウム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜
鉛、硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバルト、モリブデン
酸アンモンまたはほう酸などが使用できる。
造成された微生物に抗菌薬剤耐性が付与されている場
合には、該当する抗菌剤を培地に添加するうことによっ
て汚染を防ぐことができる。
これらの栄養物質類は、培養開始前に必要量を全量培
地として加えてよい。ある種の栄養物質は、全必要量が
一度に加えられると、大腸菌の増殖活性などの低下を引
き起こす。かかる栄養物質を使用する場合には、栄養開
始時に培地へその栄養物質の一部を添加し、次いで培養
期間を通じて増殖による消費量に対応する量ずつ残りを
流加するのが好ましい。
本発明の微生物を用いてビオチンを製造する場合に
は、培地にアラニンを添加することでビオチンの収量を
増加し得る。使用されるアラニンは、Ｄ体、Ｌ体、DL体
のいずれを用いてもほぼ同等の効果が得られる。価格を
考慮すると、DL体が好適である。培地に添加するアラニ
ン濃度は、１〜10g/、更に好ましくは３〜7g/であ
る。10g/を越えて添加するとアラニンが細胞の増殖阻
害を起し、特にビオチンの生産性の低下を招く。アラニ
ンは培養開始時に全てを一度に添加するか、培養期間を
通じて少量ずつ分割して添加してもよい。
本発明の微生物は、通気撹拌条件の影響を受けること
なく低い酢酸産生能を示す。従って、従来技術のように
酢酸の蓄積を防ぐ目的で、培地中の溶存酸素濃度を高く
維持する必要はない。しかしながら、栄養物質を効率良
く代謝させるためには、溶存酸素濃度を３〜6ppmに維持
することが好ましい。培養温度は、25〜38℃であり、培
養期間中のpHは中性付近に維持することが好ましい。培
養時間は通常16〜48時間程度で十分であり、培養終了時
点における細胞濃度は乾燥重量で50g/以上になる。
ビオチンの生産 ビオチンオペロンをベクターDNAに組み込むことで調
製される組換えプラスミドを含有する本発明の大腸菌
を、上記の如く高密度培養すれば培養液中にビオチンを
著量生成蓄積することができる。培養を終了した後、培
養液からのビオチンの抽出精製にあたっては、ビオチン
の諸性質を利用して、天然物から物質を抽出精製する方
法に類似の抽出精製方法が応用できる。培養物から細菌
細胞を除いた後、活性炭にビオチンを吸着させ、しかる
のち溶出させ、次いでイオン交換樹脂で精製することが
できる。あるいは、培養濾液を直接イオン交換樹脂で処
理することにより精製してもよい。水またはアルコール
より再結晶することにより精製ビオチンを取得すること
ができる。
〔実施例〕
次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ AD変異株の調製 大腸菌W3110株（IFO12713）を、Ｌ−培地（ペプトン1
0g/、酵母エキス5g/、グルコース1g/、塩化ナト
リウム5g/、pH7.2に調整）中37℃で３時間振盪培養を
行った。対数増殖期の細菌細胞を集め洗浄した後、これ
をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
100μg/mlを含有するTM緩衝液（トリス−塩基0.61％、
マレイン酸0.5％、pH6.0に調整）に懸濁し、37℃で30分
間静置し変異処理を行った。この細胞を集め洗浄した
後、Ｌ−培地に移して37℃で３時間回復培養を行った。
再び細胞を集め洗浄して無菌水で細胞数がおよそ107個/
mlとなるように懸濁した。この懸濁液を、フルオロ酢酸
ナトリウムを5g/含むプロリン最少培地寒天平板（プ
ロリン1g/、硫酸アンモニウム4g/、燐酸第二水素カ
リウム2g/、燐酸第一水素カリウム1g/、硫酸マグネ
シウム・７水和物0.1g/、塩化ナトリウム5g/、寒天
15g/）にシャーレ１枚当たり0.1mlづつ塗末し、37℃
で48時間培養した。出現したコロニーをFR変異株として
釣菌単離した。耐性を獲得した機構の違いから、FR変異
株には親株に比べて酢酸産生能が低下したAD変異株と、
酢酸産生能が親株と同じで変化していない株が含まれて
いる。
単離したFR変異株と親株W3110の酢酸産生性を比較す
るため、それぞれの細胞を、酢酸産生能試験用培地（硫
酸アンモニウム5g/、燐酸第二水素ナトリウム・12水
和物13.2g/、燐酸第一水素カリウム1.8g/、硫酸マ
グネシウム・７水和物1g/、ペプトン10g/、酵母エ
キス10g/、グルコース10g/）50mlを含有する500ml
坂口フラスコ中で37℃、24時間振盪培養した。振盪速度
は、120ストローク／分であった。培養終了後、分光光
度計により各培養ブロスについて波長660nmにおける光
学濃度（OD660）を測定し、次いで乾燥細胞重量とOD660
との間で作成した標準曲線に基づき、細胞濃度（g/）
に換算した。細胞を遠心分離した後、各培養上澄液中の
酢酸量を酵素反応を用いる定量分析キット（Ｆキット：
ベーリンガーマンハイム山之内）により定量した。親株
に比べて酢酸産生能が1/5以下に低下したAD変異株NA−7
5（微工研条寄第2105号）を取得した。親株W3110とAD変
異株NA−75との酢酸産生能を比較した結果を第１表に示
す。
実施例２ ビオチンによるフィードバック阻害が解除されている大
腸菌からAD変異株の調整 ビオチンによるフィードバック阻害が解除されている
大腸菌DRK−332（微工研条寄第2113号）を、Ｌ−培地
（ペプトン10g/、酵母エキス5g/、グルコース1g/
、塩化ナトリウム5g/、pH7.2に調整）中で37℃、３
時間振盪培養した。対数増殖期の細菌細胞を集めて洗浄
した後、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン100μg
/mlを含有するTM緩衝液（トリス−塩基0.61％、マレイ
ン酸0.5％、pH6.0に調整）に懸濁し、37℃で30分間静置
し変異処理を行った。この細胞を集めて洗浄した後、Ｌ
−培地に移して37℃で３時間回復培養を行った。再び細
胞を集めて洗浄し、無菌水で細胞数がおよそ107個/mlと
なるように懸濁した。この懸濁液を、フルオロ酢酸ナト
リウムを5g/含むプロリン最少培地寒天平板（プロリ
ン1g/、硫酸アンモニウム4g/、燐酸第二水素カリウ
ム2g/、燐酸第一水素カリウム1g/、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.1g/、塩化ナトリウム5g/、寒天15g/
）にシャーレ１枚当たり0.1mlづつ塗末し、37℃で48
時間培養した。出現したコロニーをFR変異株として釣菌
単離した。耐性を獲得した機構の違いから、FR変異株に
は親株に比べて酢酸産生能が低下したAD変異株と、酢酸
産生能が親株と同じで変化していない株が含まれてい
る。
単離したFR変異株と親株DRK−332の酢酸産生性を比較
するため、それぞれの細胞を、酢酸産生能試験用培地
（硫酸アンモニウム5g/、燐酸第二水素ナトリウム・1
2水和物13.2g/、燐酸第一水素カリウム1.8g/、硫酸
マグネシウム・７水和物1g/、ペプトン10g/、酵母
エキス10g/、グルコース10g/）50mlを含有する500m
l坂口フラスコ中で37℃、24時間振盪培養した。振盪速
度は、120ストローク／分であった。通気条件は、２種
の培地量（10mlまたは100ml）とすることにより変化さ
せた。培養終了後、分光光度計により、各培養ブロスに
ついて波長660nmにおける光学濃度（OD660）を測定し、
次いで乾燥細胞重量とOD660との間で作成した標準曲線
に基づき、細胞濃度（g/）に換算した。細胞を遠心分
離した後、各培養上澄液中の酢酸量を酵素反応を用いる
定量分析キット（Ｆキット：ベーリンガーマンハイム山
之内）により定量した。親株に比べて酢酸産生能が多く
て1/5に低下したAD変異株DRK−3323（微工研条寄第2116
号）を取得した。親株DRK−332とAD変異株DRK−3323と
の間の酢酸産生能を比較した結果を第２表に示す。AD変
異株DRK−3323は、通気条件の影響を受けず、溶存酸素
が十分に存在しない低通気条件下でさえも菌体乾燥重量
当りの酢酸蓄積量は、0.25以下であった。
実施例３ ビオチンオペロンを担う組換えプラスミドを含有するAD
変異株の調製 （１）ベクターDNAの調製 プラスミドpBR322（Peden,K.,Gene,22,277,1983）を
含有する大腸菌Ｋ−12株の一種を、アンピシリン50μg/
mlを添加したLB培地〔バクトトリプトン（ディフコ社
製）１％、バクト酵母エキス（ディフコ社製）0.5％、
塩化ナトリウム１％、水酸化ナトリウムでpH7.2に調
整〕中、37℃で一昼夜振盪培養して細胞を得、アルカリ
抽出法（Birnboim,H.C.など、Hucl.Acid Res.,7,1513,1
979）を用いてプラスミドDNA pBR322を採取した。
第１図に図示するように、得られたプラスミドDNA pB
R322（１μｇ）をとり、二つの制限エンドヌクレアーゼ
Pvu IIおよびBal Iで切断し、１％の低温ゲルアガロー
ス（シグマ社製タイプVII）で電気泳動を行ない、エチ
ジウムブロミドで染色後、DNA断片（約3.7kb）を切り取
り、70℃で５分間加熱後にTE緩衝液（10mMトリス塩酸緩
衝液、pH8.0、1mM EDTA）飽和フェノールをほぼ同量加
え、よく混合し、遠心分離により水相を得た。この水相
に２倍容のエタノールを加えて沈澱採取したベクターDN
A断片を、DNAライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて連結させた。
得られた組換えDNA溶液を用いて、大腸菌M15株（Δ
［lac−Pro］,thi,φ80d,lacZM15,ara,rpsL,recA,）
［ファルマシア社より購入］を形質転換した。形質転換
は、カルシウム法に準じて行った。50μg/mlのアンピシ
リンを含むLB培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）
１％、バクト酵母エキス（ディフコ社製）0.5％、塩化
ナトリウム１％、寒天1.5％、水酸化ナトリウムでPH7.2
に調製〕プレート上で生育した形質転換株大腸菌M15［p
BRR−B4］を得た。
大腸菌M15［pBRR−B4］を、アンピシリン50μg/ml含
むLB培地で培養し、前述のアルカリ抽出法を用いてプラ
スミドpBRR−B4を採取した。
得られたプラスミドpBRR−B4（１μｇ）を、２つの制
限エンドヌクレアーゼEcor１および、Pst Iで切断し、
低温ゲルアガロースを用いた１％アガロース電気泳動に
よるDNA断片（約3.0kb）を前述の方法により分離採取し
た。
一方、プラスミドDNA pUC13（ファルマシア社より購
入）２μｇを２つの制限エンドヌクレアーゼEcoR1およ
びPst Iで切断し、15％ポリアクリルアミドゲル（半井
社製）電気泳動を行ない、エチジウムブロミドで染色
後、約40bのDNA断片を切り取り、ダウンスホモジナイザ
ー（wheaton Scientific社製）を用いてホモジナイズ
し、0.5M酢酸アンモニウム（1mM EDTAを含む）及び同
量のTE緩衝液飽和フェノール溶液を加えてよく混合し、
遠心分離により水相を得た。この水相に２倍容のエタノ
ールを加えて遠心分離後、DNA断片を沈澱採取した。
これらの処理により得られた２つのDNA断片をDNAライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。
こうして得られたライゲーション反応液を用いて、大
腸菌M15株を前述のカルシウム法で形質転換した。テト
ラサイクリン10μg/mlを含むLB固形培地上で生育したコ
ロニーを、テトラサイクリン10μg/mlを添加したLB培地
で十分に生育させ、前述と同様のアルカリ抽出法により
pBM16プラスミドDNAを得た。
（２）ビオチンオペロンを担う組換えプラスミドの造成 特開昭62−155081号公報に記載されたビオチンオペロ
ンをベクターDNAに組み込むことにより調製した組換え
プラスミドを含む大腸菌DRK332［pKHN31］（微工研条寄
第2114号：微工研菌寄第8586号）を、アンピシリン50μ
g/mlを添加したLB培地で充分に生育させ、前述のアルカ
リ抽出法でプラスミドDNA pKHN31を採取した。
得られたプラスミドDNA pKHN31（１μｇ）を制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIで切断し、65℃で10分間の熱処
理を行ない、エタノール沈澱によりDNAを回収した。
得られたDNA断片を、大腸菌DNAポリメラーゼ緩衝液
（500mMトリス塩酸pH7.5、67mM MgCl2、10mMメルカプト
エタノール）中、それぞれ500μＭのdCTP,dATP,dTTP,dG
TP、および大腸菌DNAポリメラーゼクレノーフラグメン
トを加え、37℃で30分反応させた。次に、65℃で10分間
加熱することにより反応を停止し、エタノール沈澱によ
りDNAを回収した。得られたDNAの末端に５′−リン酸化
Xba Iリンカー（ファルマシア社から購入）をDNAライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させ、次い
でエタノール沈澱によりDNAを回収した。こうして得ら
れたDNAを、制限エンドヌクレアーゼXba Iで切断し、低
温ゲルアガロースを用いた１％アガロースゲル電気泳動
を行ない、エチジウムブロミドで染色後DNA断片（約6.0
kb）を前述の方法により分離採取した。
一方、ベクターDNA pBM16（１μｇ）を制限エンドヌ
クレアーゼXba Iで切断し、65℃で10分間の熱処理を行
った後、エタノール沈澱によりDNAを回収した。
以上の処理により得られた２種のDNA断片をDNAライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。こう
して得られたライゲーション反応液を用い、特開昭62−
155081号公報に記載の大腸菌JA221（recA,hsdM,hsdR,lc
uB,trpΔE,lacY）由来の変異誘導したビオチン要求大腸
菌BR−４に形質転換した。ビオチン無添加の最少寒天培
地（グリコース0.5％、硫酸アンモニウム0.4％、燐酸第
二水素カリウム0.2％、燐酸第一水素カリウム0.01％、
ビタミンフリーのカザミノ酸0.4％、寒天1.5％）プレー
ト上で生育したコロニーを、テトラサイクリン10μg/ml
を添加したLB培地で充分に生育させ、前述のアルカリ抽
出法によりpXBA312プラスミドDNAを得た。
（３）ビオチンオペロンを含む組換えプラスミドによる
大腸菌AD変異株の形質転換 先に得られた組換えプラスミドpXBA312を用いて前述
と同様のカルシウム法により大腸菌DRK−3323を形質転
換した。テトラサイクリン10μg/mlを含むLB寒天培地プ
レート上で生じたコロニーを単離し、大腸菌DRK−3323
［pXBA312］（微工研条寄第2117号）を得た。
実施例４ 第３表に示す菌株を、まず前培養としてＬ−培地（ペ
プトン10μg/、酵母エキス5g/、グルコース1g/、
塩化ナトリウム5g/、pH7.0に調整；組換えプラスミド
を含有する菌株の場合は、さらにテトラサイクリン20μ
g/mlを添加）に寒天保存培地から一白金耳植菌し、37℃
で８〜12時間培養した。得られた前培養液50mlを、下記
組成の1700mlの培地−Ａを含むミニジャーファーメンタ
ー（丸菱バイオエンジMD−300型、５容量）に植菌
し、37℃で本培養を行った。pHコントローラーを用い12
％アンモニア水でpHを７に制御した。アンモニア水の添
加は無機窒素源の供給を兼ねて行った。溶存酸素電極で
培養液中の溶存酸素濃度を測定し、溶存酸素濃度が3ppm
以下にならないように純酸素を通気用空気に混合して調
整した。撹拌は500rpm、通気量は1v.v.m.とした。培養
液中のグルコース濃度がほぼゼロとなったときに溶存酸
素濃度が急激に増加する現象を指標として、下記組成の
流加用グルコース溶液−Ａを培養液中のグルコース濃度
が１〜5g/となるように流加した。24時間培養を行っ
た結果を第３表に示す。
培地−Ａ （g/） リン酸二ナトリウム（12水和物） 17.6 リン酸一カリウム 2.4 硫酸アンモニウム 1.0 酵母エキス 10.0 ペプトン 10.0 硫酸第一鉄（７水和物） 0.1 塩化カルシウム（２水和物） 0.05 塩化マンガン（４水和物） 0.05 硫酸マグネシウム（７水和物） 0.1 グルコース 5.0 流加用グルコース溶液−Ａ （g/） グルコース 750.0 硫酸マグネシウム（７水和物） 5.0 実施例５ 前培養として、第４表に示す菌株を、Ｌ−培地（ペプ
トン10g/、酵母エキス5g/、グルコース1g/、塩化
ナトリウム5g/、テトラサイクリン20mg/、pH7.0に
調整）に寒天保存培地から一白金耳植菌し、37℃で８〜
12時間培養した。次に、得られた前培養液50mlを下記組
成の1700mlの培地−Ｂを含むミニジャーファメンター
（丸菱バイオエンジMD−300型、５容量）に植菌し、
次いで37℃で本培養を行った。pHコントローラーを用い
12％アンモニア水でpHを７に制御した。溶存酸素濃度が
3ppm以下にならないように純酸素を通気用空気に混合し
て調整した。撹拌は500rpm、通気は1v.v.m.とした。培
養液中のグルコースがほぼゼロとなった時に溶存酸素濃
度が急激に増加する現象を指標にして下記組成の添加用
グルコース溶液−Ｂを培養液中のグルコース濃度が１〜
5g/となるよう添加した。24時間培養の結果を第４表
に示した。培養液中のビオチンとデスチオビオチンは、
ラクトバシリス・プランタラム〔Lactobacillus plant
arum（ATCC8014）〕およびサッカロミセス・セレビシェ
〔Saccharomyces cerevisiae（ATCC7754）〕を用いた
バイオアッセイ法、およびアビジンを用いた比色定量法
（Methodsin Enzymology vol.X VIII p.419）により定
量した。第４表から明らかなように、親株DRK−332をプ
ラスミドpXBA312で形質転換したDRK−332［pXBA312］で
は、酢酸が著量蓄積し、菌体収量が低く、ビオチン収量
は40ml/で、中間代謝産物のデスチオビオチンが83ml/
蓄積したのに対し、本発明のDRK−3323（pXBA312］で
は酢酸蓄積量が6g/と低く、菌体収量65g/となり、
さらにデスチオビオチンが効率よくビオチンにまで代謝
されて、ビオチン収量は105ml/に達した。
培地−Ｂ （g/） リン酸二ナトリウム（12水和物） 17.6 リン酸一カリウム 2.4 硫酸アンモニウム 1.0 酵母エキス 10.0 ペプトン 10.0 dl−アラニン 3.0 硫酸第一鉄（７水和物） 0.1 塩化カルシウム（２水和物） 0.05 塩化マンガン（４水和物） 0.05 硫酸マグネシウム（７水和物） 0.1 グルコース 5.0 流加用グルコース溶液−Ｂ （g/） グルコース 750.0 硫酸マグネシウム（７水和物） 5.0 dl−アラニン 7.0 実施例６ hCT−lac′Ｚ融合遺伝子を担う組換えプラスミドを含有
するAD変異株の調製 融合蛋白質（コラゲナーゼ切断部位を含むhCTペプチ
ド−β−ガラクトシダーゼ）〔特開昭63−226288号公報
記載〕および発現プロモーターとしてプラスミドpKK233
−３由来のtacプロモーターを担う組換えプラスミドを
含有する大腸菌M15［pZT32］（微工研条寄第2115号）
を、アンピシリン50μg/ml含むLB培地で十分に育成し、
次に前述のアルカリ抽出法でプラスミドDNA pZT32を単
離した。前述のカルシウム法により得られたプラスミド
DNA pZT32で大腸菌NA75を形質転換した。アンピシリン5
0μg/mlを添加したLB寒天プレート上で増殖したコロニ
ーを単離して大腸菌NA75［pZT32］を得た。
実施例７ 前培養として、第５表に示す菌体を、Ｌ−培地（ペプ
トン10g/、酵母エキス5g/、グルコース1g/、塩化
ナトリウム5g/、テトラサイクリン20mg/、pH7.0に
調整）に寒天保存培地から一白金耳植菌し、37℃で８〜
12時間培養した。次に、得られた前培養液50mlを前記組
成の1700mlの培地−Ａを含むミニジャーファメンター
（丸菱バイオエンジMD−300型、５容量）に植菌し、
次いで37℃で本培養を行った。pHコントローラーを用い
12％アンモニア水でpHを７に制御した。溶存酸素濃度が
3ppm以下にならないように純酸素を通気用空気に混合し
て調整した。撹拌は500rpm、通気は1v.v.m.とした。培
養液中のグルコースがほぼゼロとなった時に溶存酸素濃
度が急激に増加する現象を指標にして前記組成の流加用
グルコース溶液−Ａを培養液中のグルコース濃度が１〜
5g/となるよう流加した。培養経過中、培養液中の酢
酸蓄積量が３〜4g/になったとき、すなわち細菌細胞
の増殖活性が低下し始めたとき、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（IPTG）を0.25g/添加する
ことによりhCT−lac′Ｚ融合遺伝子を発現させた。IPTG
は大腸菌M15［pZT32］株の培養開始後、９時間で添加す
るか、大腸菌NA75［pZT32］株については14時間で添加
した。さらに培養を続け24時間後に培養を終了した。遠
心分離により細胞を培養液から採取し、無菌水で洗浄
し、1mMのEDTAと0.1mMのDTTを含む10mMトリス塩酸（pH
8.0）で懸濁し、次いでＸ−プレス（AB BIOX製）により
破砕した。遠心分離により得られた上澄を細胞抽出物と
して使用した。
細胞抽出物に対する定量分析試験は、次のように実施
した。
（１）ヒトカルシトニンの定量 定量は、カルシトニンキット「第一」（第一ラジオア
イソトープ研究所製）を使用して行った。操作手順は、
キット用の説明書に準じて行った。
（２）β−ガラクトシダーゼの定量 本酵素は、基質としてｏ−ニトロフェニルガラクトピ
ラノシド（ONPG）を用いるミラー（Miller）法（Mille
r,J.H:,Exp.Mol.Gen.Cold Spring Harbor Lab.Cold Spr
ing Harbor発行、N.Y.352頁、1972）に準じて定量し
た。28℃、１分間で1n moleのONPGを分解するのに必要
な酵素活性を１単位として示した。
（３）蛋白質の定量 ローリー法（Lowry,O.H.,J.Riol.Chem.,193,265,195
1）を使用し、検量線はウシ血清アルブミン（シグマ
製、フラクションＶ）を用いて作成した。
結果を第５表に示す。
生成蓄積した融合蛋白質（コラゲナーゼ切断部位を含
むhCT−β−ガラクトシダーゼ）は、β−ガラクトシダ
ーゼの活性を指標として、蛋白質精製の常法に準じて精
製し、次いで特開昭63−226288号公報に記載の方法でケ
ラゲナーゼ切断した。Ｃ−末端グリシンを有するhCTはH
PLCで分取した。Ｃ−末端グリシンを有するhCTは、Ｃ−
末端アミド化酵素の反応により容易にhCTへ転換するこ
とができる（Bradury,A.F.ら、Nature,298,686,198
2）。転換されたhCTは、医薬として有効に使用すること
ができる。
〔産業上の可能性〕
本発明の新規微生物は、野生型の多くて1/5の低酢酸
産生能を示し、細菌細胞の増殖が酢酸によりほとんど阻
害されないので、高密度で細胞を培養することができ、
それ故に、著しく高収量で有用物質を得ることができ
る。
本発明の微生物を使用する発酵法でビオチンを製造す
る場合、従来技術に比し著しくビオチンの収量が増加す
る。また、アラニンを含む培地で培養することによりそ
の収量はさらに増加する。
本発明は、特定の態様を引用して記載しているが、当
業者にとって自明な変更は、本発明の精神、範囲および
概念内に包含されるものとみなす。
〔寄託微生物への言及〕
国際寄託当局：通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所 住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号 305） 寄託番号および寄託日 1. 微工研条寄第2105号:1988年10月17日 2. 微工研条寄第2113号:1985年12月26日（1985年12月2
6日付寄託の微工研菌寄第8585号から移管） 3. 微工研寄条第2114号:1985年12月26日（1985年12月2
6日付寄託の微工研菌寄第8586号から移管） 4. 微工研条寄第2115号:1987年３月12日（1987年３月1
2日付寄託の微工研菌寄第9266号から移管） 5. 微工研条寄第2116号:1987年10月28日（1987年10月2
8日付寄託の微工研菌寄第9675号から移管） 6. 微工研条寄第2117号:1987年10月28日（1987年10月2
8日付寄託の微工研菌寄第9676号から移管）
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２１１７ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/20 - 1/21 C12P 17/00 - 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酢酸産生能が野生型大腸菌（Escherichia
    coli）の多くて1/5であることを特徴とする大腸菌。
  2. 【請求項２】有用物質産生に関与する遺伝情報を担う組
    換えプラスミドを含有する請求項１記載の大腸菌。
  3. 【請求項３】ビオチンによるフィードバック阻害が解除
    された請求項１記載の大腸菌。
  4. 【請求項４】ビオチン産生能を有する大腸菌由来のビオ
    チンオペロンを担う組換えプラスミドを含有する請求項
    １記載の大腸菌。
  5. 【請求項５】ビオチン産生能を有する大腸菌由来のビオ
    チンオペロンを担う組換えプラスミドを含有する請求項
    ３記載の大腸菌。
  6. 【請求項６】野生型大腸菌の多くて1/5の酢酸産生能を
    有する大腸菌であって、有用物質産生に関与する遺伝情
    報を担う組換えプラスミド含む大腸菌を、高密度培養し
    て生成した有用物質を採取することを特徴とする有用物
    質の製造方法。
  7. 【請求項７】前記有用物質がビオチンまたはデスチオビ
    オチンである請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】前記大腸菌がビオチンによるフィードバッ
    ク阻害が解除された大腸菌である請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】前記大腸菌をアラニン１〜10g/含む培地
    で培養する請求項８記載の方法。
JP63508875A 1987-11-07 1988-11-07 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 Expired - Lifetime JP2763119B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP62-281826 1987-11-07
JP28182687 1987-11-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02502065A JPH02502065A (ja) 1990-07-12
JP2763119B2 true JP2763119B2 (ja) 1998-06-11

Family

ID=17644538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63508875A Expired - Lifetime JP2763119B2 (ja) 1987-11-07 1988-11-07 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5919662A (ja)
EP (1) EP0316229B1 (ja)
JP (1) JP2763119B2 (ja)
KR (1) KR910005626B1 (ja)
CN (1) CN1024809C (ja)
AU (1) AU602274B2 (ja)
CA (1) CA1322735C (ja)
DE (1) DE3888789T2 (ja)
ES (1) ES2061711T3 (ja)
NZ (1) NZ226875A (ja)
WO (1) WO1989004365A1 (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1053217C (zh) * 1990-03-27 2000-06-07 资生堂株式会社 新的微生物以及利用这些微生物生产生物素同效维生素的方法
JP3006847B2 (ja) * 1990-03-27 2000-02-07 株式会社資生堂 新規微生物およびそれを用いるビオチン類の製造方法
KR100250692B1 (ko) * 1991-09-13 2000-04-01 후쿠하라 요시하루 바이오틴 오페론
WO1993014094A1 (en) * 1992-01-17 1993-07-22 Universal Foods Corporation Method for recovering biotin
JP3428078B2 (ja) * 1992-09-10 2003-07-22 住友化学工業株式会社 ビオチンの製造方法および使用される微生物
CZ285533B6 (cs) * 1992-10-02 1999-08-11 Lonza Ag DNA-fragmenty, plasmidy a mikroorganismy obsahující tyto DNA-fragmenty a plasmidy a způsob biotechnologické výroby biotinu
US6277609B1 (en) 1993-01-06 2001-08-21 Basf Aktiengesellschaft Method to produce biotin
JP3629290B2 (ja) * 1993-10-01 2005-03-16 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
KR0151534B1 (ko) * 1995-10-30 1998-08-17 이종호 유기산 생성이 억제된 대장균 변이주
JP4386641B2 (ja) * 2001-03-16 2009-12-16 キアゲン ゲーエムベーハー 分解に対して安定化した核酸
WO2004085613A2 (en) * 2003-03-19 2004-10-07 Stratagene Electrocompetent host cells
JP4700357B2 (ja) * 2005-01-26 2011-06-15 中部電力株式会社 開閉器用ブッシングにおける端子カバー支持部材の固定構造体
TWI389645B (zh) * 2005-05-25 2013-03-21 Suntory Holdings Ltd The method of treating raw beans with controlled pH
EP2119789A1 (en) 2008-05-16 2009-11-18 Université Libre de Bruxelles Hyperproliferative recombinant cell
JP5599171B2 (ja) * 2009-08-07 2014-10-01 花王株式会社 ドデカヒドロ−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フラン合成中間体高生産性変異微生物
WO2011144739A1 (en) 2010-05-20 2011-11-24 Universite Libre De Bruxelles Hyperproliferative recombinant cell
EP3147368A4 (en) * 2014-05-21 2018-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing fibroin-like protein
EP3382031B1 (en) 2015-11-25 2023-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing fibroin-like protein

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0740922B2 (ja) * 1985-03-05 1995-05-10 株式会社資生堂 ビオチン生産性微生物
JPH07110232B2 (ja) * 1985-10-14 1995-11-29 株式会社日立製作所 遺伝子組換え大腸菌の遺伝子生産物を採取する方法および装置
JPS62155081A (ja) * 1985-12-27 1987-07-10 Shiseido Co Ltd 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0316229A1 (en) 1989-05-17
ES2061711T3 (es) 1994-12-16
KR890701724A (ko) 1989-12-21
JPH02502065A (ja) 1990-07-12
US5919662A (en) 1999-07-06
DE3888789D1 (de) 1994-05-05
CN1033646A (zh) 1989-07-05
DE3888789T2 (de) 1994-08-18
NZ226875A (en) 1990-09-26
KR910005626B1 (ko) 1991-08-01
WO1989004365A1 (en) 1989-05-18
AU2614688A (en) 1989-06-01
AU602274B2 (en) 1990-10-04
CN1024809C (zh) 1994-06-01
CA1322735C (en) 1993-10-05
EP0316229B1 (en) 1994-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2763119B2 (ja) 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法
AU602364B2 (en) Plasmids which resistance to spectinomycin & streptomycin which replicate in corynebacterium and brevibacterium
Frost et al. Dehydroquinate synthetase from Escherichia coli: purification, cloning, and construction of overproducers of the enzyme
KR900004426B1 (ko) L-티로신의 제조방법
KR970001238B1 (ko) L-트립토판의 제조방법
JPH08501694A (ja) ビオチンの生物工学的製造方法
KR920009500B1 (ko) L-트립토판의 제조방법
FR2559781A1 (fr) Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation
CA2209889C (en) Process for producing trans-4-hydroxy-l-proline
EP0604060B1 (en) A process for producing riboflavin
US5374554A (en) Microorganism and process for preparing D-biotin using the same
JPH0740922B2 (ja) ビオチン生産性微生物
EP0385415B1 (en) Process for producing NADH oxidase
EP0071486A2 (en) Novel microorganisms of the genus Eschericia, hybrid DNA for use in their production and the use of the microorganisms in the preparation of glutathione
US5217880A (en) L-fucose dehydrogenase gene, microorganism having said gene and production of l-fucose dehydrogenase by the use of said microorganism
CN115851632B (zh) 一种漆酶突变体及其应用
JP3001694B2 (ja) ベンゼンジオキシゲナーゼ遺伝子
JP3169928B2 (ja) 水素光産生効率を改良したロドバクタースフェロイデスＲＶの取り込み型ヒドロゲナーゼ（Ｈｕｐ）欠損株の単離
JP3060019B2 (ja) マルトテトラオース生成酵素遺伝子を含有するプラスミド及び該プラスミドを有する微生物並びに該微生物を用いるマルトテトラオース生成酵素の製造法
JP2527926B2 (ja) ビオチンの製造方法
CA2133017C (en) Process for producing desired substance using acetic acid-resistant recombinant escherichia microorganism
JPH07177895A (ja) ビオチンの製造法
JP3169927B2 (ja) 水素光産生収率を向上したロドバクタースフェロイデスＲＶのポリヒドロキシアルカノイン酸類（ＰＨＡｓ）欠損株の単離
JPH0787963A (ja) ビオチン高産生微生物およびその育種方法
JPH06339371A (ja) クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090327

Year of fee payment: 11

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090327

Year of fee payment: 11