JPH06339371A - クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法 - Google Patents
クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法Info
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- JPH06339371A JPH06339371A JP3108203A JP10820391A JPH06339371A JP H06339371 A JPH06339371 A JP H06339371A JP 3108203 A JP3108203 A JP 3108203A JP 10820391 A JP10820391 A JP 10820391A JP H06339371 A JPH06339371 A JP H06339371A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】クレビシエラ属に属する形質転換微生物を提供
し、該微生物を用いたビオチンの効率よい製造方法を提
供する。 【構成】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを取り出し、クレビシエラ属に属
する微生物に移入可能なベクターに該ＤＮＡを組み込ん
で組み換えベクターを構築する。この組み換えベクター
でクレビシエラ属に属する微生物に形質転換させ、クレ
ビシエラ属に属する形質転換微生物を調製する。該微生
物を好気的に培養することによってビオチンを効率よく
製造する。
し、該微生物を用いたビオチンの効率よい製造方法を提
供する。 【構成】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを取り出し、クレビシエラ属に属
する微生物に移入可能なベクターに該ＤＮＡを組み込ん
で組み換えベクターを構築する。この組み換えベクター
でクレビシエラ属に属する微生物に形質転換させ、クレ
ビシエラ属に属する形質転換微生物を調製する。該微生
物を好気的に培養することによってビオチンを効率よく
製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビオチン・シンテター
ゼ遺伝子を組み込んだ微生物とそれを用いたビオチンの
製造方法に関し、さらに詳しくはバチルス属に属する微
生物のデスチオビオチンをビオチンに変換する反応に関
与する酵素をコードするＤＮＡを有する組み換えベクタ
ーで形質転換したクレビシエラ属に属する微生物とその
微生物を培養することを特徴とするビオチンの製造方法
に関する。
ゼ遺伝子を組み込んだ微生物とそれを用いたビオチンの
製造方法に関し、さらに詳しくはバチルス属に属する微
生物のデスチオビオチンをビオチンに変換する反応に関
与する酵素をコードするＤＮＡを有する組み換えベクタ
ーで形質転換したクレビシエラ属に属する微生物とその
微生物を培養することを特徴とするビオチンの製造方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビオチンは、ヒト・動植物にとって不可
欠なビタミンであり、医薬品或いは飼料添加物として重
要なものである。その製造技術として、最近では、遺伝
子組み換え技術の応用が検討されている。
欠なビタミンであり、医薬品或いは飼料添加物として重
要なものである。その製造技術として、最近では、遺伝
子組み換え技術の応用が検討されている。
【０００３】ビオチン合成に関与する遺伝子を組み込む
宿主としては、エシェリヒア属、バチルス属、シュード
モナス属に属する微生物などが知られている（特開昭６
１−１４９０９１号、特開昭６２−１５５０８１号、特
開昭６２−２７５６８４号、特開昭６３−４４８８９
号）。
宿主としては、エシェリヒア属、バチルス属、シュード
モナス属に属する微生物などが知られている（特開昭６
１−１４９０９１号、特開昭６２−１５５０８１号、特
開昭６２−２７５６８４号、特開昭６３−４４８８９
号）。
【０００４】一方、ビオチン合成に関与する遺伝子とし
ては、バチルス属に属する微生物のデスチオビオチン
（以下、ＤＴＢという）をビオチンに変換する反応に関
与する酵素（以下、ビオチン・シンテターゼという）が
知られており（前記特開昭６２−２７５６８４号）、特
に、エシェリヒア属に属する微生物内で高い活性を有す
ることも報告されている（前記特開昭６３−４４８８９
号）。
ては、バチルス属に属する微生物のデスチオビオチン
（以下、ＤＴＢという）をビオチンに変換する反応に関
与する酵素（以下、ビオチン・シンテターゼという）が
知られており（前記特開昭６２−２７５６８４号）、特
に、エシェリヒア属に属する微生物内で高い活性を有す
ることも報告されている（前記特開昭６３−４４８８９
号）。
【０００５】しかし、バチルス属に属する微生物のビオ
チン・シンテターゼをコードするＤＮＡが組み込まれた
その他の微生物でもビオチン・シンテターゼが発現し、
ビオチンを効率よく製造するかどうかわからなかった。
チン・シンテターゼをコードするＤＮＡが組み込まれた
その他の微生物でもビオチン・シンテターゼが発現し、
ビオチンを効率よく製造するかどうかわからなかった。
【０００６】一般に、別の属に属する微生物のＤＮＡを
組み込んだ組み換え微生物が、該ＤＮＡを発現し、発現
したタンパク質が高い活性を示すことを予想することは
困難であるとされている。これは、微生物の属が違う
と、ＤＮＡの相同性が低いことが多いためである。
組み込んだ組み換え微生物が、該ＤＮＡを発現し、発現
したタンパク質が高い活性を示すことを予想することは
困難であるとされている。これは、微生物の属が違う
と、ＤＮＡの相同性が低いことが多いためである。
【０００７】ＤＮＡがビオチン・シンテターゼをコード
するＤＮＡの場合、エシェリヒア属とバチルス属に属す
る微生物のものの塩基配列は、既に知られている（前記
特開昭６３−４４８８９号、特開昭６１−２０２６８６
号）が、これらを比較すると相同性が３２％と計算さ
れ、ビオチン・シンテターゼの塩基配列は属間の差が大
きい。このことから生成するビオチン・シンテターゼの
性質やビオチン・シンテターゼの反応条件も属間で異な
っていると考えられる。
するＤＮＡの場合、エシェリヒア属とバチルス属に属す
る微生物のものの塩基配列は、既に知られている（前記
特開昭６３−４４８８９号、特開昭６１−２０２６８６
号）が、これらを比較すると相同性が３２％と計算さ
れ、ビオチン・シンテターゼの塩基配列は属間の差が大
きい。このことから生成するビオチン・シンテターゼの
性質やビオチン・シンテターゼの反応条件も属間で異な
っていると考えられる。
【０００８】そのため、別の属に属する微生物のビオチ
ン・シンテターゼをコードするＤＮＡをある微生物に組
み込んだとき、必ずしもビオチン・シンテターゼが発現
し、発現したタンパク質が高い活性を示すことができる
かどうかを予測することは困難であった。
ン・シンテターゼをコードするＤＮＡをある微生物に組
み込んだとき、必ずしもビオチン・シンテターゼが発現
し、発現したタンパク質が高い活性を示すことができる
かどうかを予測することは困難であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らはバチルス
属微生物由来のビオチン・シンテターゼをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ、ビオチン高産生能を有する微生物を
得るべく鋭意研究の結果、ビオチン・シンテターゼをコ
ードするＤＮＡ断片をバチルス属に属する微生物から切
り出し、これを組み込んだベクターを用いてクレビシエ
ラ属に属する微生物を形質転換することにより、ビオチ
ン高産生能を有するクレビシエラ属に属する形質転換微
生物を得ることができることを見い出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに到った。
属微生物由来のビオチン・シンテターゼをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ、ビオチン高産生能を有する微生物を
得るべく鋭意研究の結果、ビオチン・シンテターゼをコ
ードするＤＮＡ断片をバチルス属に属する微生物から切
り出し、これを組み込んだベクターを用いてクレビシエ
ラ属に属する微生物を形質転換することにより、ビオチ
ン高産生能を有するクレビシエラ属に属する形質転換微
生物を得ることができることを見い出し、この知見に基
づいて本発明を完成するに到った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、バチルス属に属する微生物のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターで形質
転換したクレビシエラ属に属するビオチン高産生の微生
物、及びそれを用いたビオチンの製造方法が提供され
る。
ば、バチルス属に属する微生物のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターで形質
転換したクレビシエラ属に属するビオチン高産生の微生
物、及びそれを用いたビオチンの製造方法が提供され
る。
【００１１】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテ
ターゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターの
構築 本発明において、ビオチン・シンテターゼをコードする
ＤＮＡの採取に用いられる微生物は、ビオチン産生能を
有するバチルス属であればよく、好ましくはバチルス・
スフェリカスに属するビオチン生産菌である。これらの
微生物はビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを
有しているものである限り、自然界から新たに分離され
たものでも既知のものでもよく、またこれらの微生物を
通常の微生物突然変異誘発法（例えば、紫外線、Ｘ線、
γ線照射などの物理的処理やニトロソグアニジンなどの
薬剤による化学的処理による方法）で処理することによ
って得られたものであっても良い。さらに、ビオチン産
生能を高めるために、これらの微生物にアクチチアジン
酸または５−（２−チエニル）吉草酸のそれぞれ単独、
あるいは双方に対する耐性を付与しても良い。その具体
例としては、例えば、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＩＦＯ３５２５
や、そのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン処理変異株（ＦＥＲＭ Ｐ−６４２２、ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０９８、ＦＥＲＭ Ｐ−６１４３などが例示
される。
ターゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターの
構築 本発明において、ビオチン・シンテターゼをコードする
ＤＮＡの採取に用いられる微生物は、ビオチン産生能を
有するバチルス属であればよく、好ましくはバチルス・
スフェリカスに属するビオチン生産菌である。これらの
微生物はビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを
有しているものである限り、自然界から新たに分離され
たものでも既知のものでもよく、またこれらの微生物を
通常の微生物突然変異誘発法（例えば、紫外線、Ｘ線、
γ線照射などの物理的処理やニトロソグアニジンなどの
薬剤による化学的処理による方法）で処理することによ
って得られたものであっても良い。さらに、ビオチン産
生能を高めるために、これらの微生物にアクチチアジン
酸または５−（２−チエニル）吉草酸のそれぞれ単独、
あるいは双方に対する耐性を付与しても良い。その具体
例としては、例えば、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＩＦＯ３５２５
や、そのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン処理変異株（ＦＥＲＭ Ｐ−６４２２、ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０９８、ＦＥＲＭ Ｐ−６１４３などが例示
される。
【００１２】これら微生物からビオチン・シンテターゼ
をコードするＤＮＡを採取する方法については特に限定
されない。例えば、バチルス属に属する微生物の全ＤＮ
Ａを常法により単離精製し、制限酵素で切断した後、該
制限酵素と同じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限酵
素で切断したプラスミドと酵素的に結合させ、得られた
組み換えプラスミドを用いてデスチオビオチンからのビ
オチン生合成能を欠失したビオチン要求性変異株を形質
転換（または形質導入）し、得られた形質転換株の中か
らビオチン産生能を付与されたものを選択すれば、バチ
ルス属由来のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する形質転換微生物が得られる。次いで、この形
質転換微生物から、該微生物に組み込まれた組み換えプ
ラスミドを常法により取り出し、制限エンドヌクレアー
ゼで処理して、バチルス属由来のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを採取すればよい。
をコードするＤＮＡを採取する方法については特に限定
されない。例えば、バチルス属に属する微生物の全ＤＮ
Ａを常法により単離精製し、制限酵素で切断した後、該
制限酵素と同じ接着末端をＤＮＡに生じさせうる制限酵
素で切断したプラスミドと酵素的に結合させ、得られた
組み換えプラスミドを用いてデスチオビオチンからのビ
オチン生合成能を欠失したビオチン要求性変異株を形質
転換（または形質導入）し、得られた形質転換株の中か
らビオチン産生能を付与されたものを選択すれば、バチ
ルス属由来のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する形質転換微生物が得られる。次いで、この形
質転換微生物から、該微生物に組み込まれた組み換えプ
ラスミドを常法により取り出し、制限エンドヌクレアー
ゼで処理して、バチルス属由来のビオチン・シンテター
ゼをコードするＤＮＡを採取すればよい。
【００１３】なお、該ＤＮＡには、該ＤＮＡと実質的に
同一の機能を有する修飾されたＤＮＡ、即ち、塩基配列
の一部が置換され、挿入され、または欠失されたもので
あっても、同一の機能を有するものも当然含まれる。
同一の機能を有する修飾されたＤＮＡ、即ち、塩基配列
の一部が置換され、挿入され、または欠失されたもので
あっても、同一の機能を有するものも当然含まれる。
【００１４】さらに上記ＤＮＡとしては、シャイン・ダ
ルガノ配列、翻訳開始コドン、翻訳終了コドンを含有し
ているものが好ましく使用される。
ルガノ配列、翻訳開始コドン、翻訳終了コドンを含有し
ているものが好ましく使用される。
【００１５】組み換えベクターを構築するに際しては、
プラスミドベクター、λｇｔ系ファージベクターなどが
使用される。
プラスミドベクター、λｇｔ系ファージベクターなどが
使用される。
【００１６】本発明において組み換えベクターを構築す
るためのベクターとしては、後述のセラチア属に属する
微生物を形質転換（または形質導入）し得るものならど
のようなものでもよく、例えば組み換えベクターの構築
に用いる宿主としてビオチン要求性の大腸菌を用いる場
合は、ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント
型のｐＳＣ１０１、ｐＲＫ３５３、ｐＲＫ６４６、ｐＲ
Ｋ２４８、ｐＤＦ４１など、リラックス型のＣｏｌＥ
１、ｐＶＨ５１、ｐＡＣ１０５、ＲＳＦ２１２４、ｐＣ
Ｒ１、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２４、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、
ｐＫＹ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫＮ８０、ｐＫＣ
７、ｐＫＢ１５８、ｐＭＫ２００４、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９など、λｇｔ系ファージベクタ
ーとしてλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ・λ
Ｃ、λＷＥＳ・λＢ、λＺＪｖｉｒ・λＢ’、λＡＬＯ
・λＢ、λＷＥＳ・Ｔ5６２２、λＤａｍなどが用いら
れる。これらのベクターの中ではプラスミドベクターが
特に好ましい。
るためのベクターとしては、後述のセラチア属に属する
微生物を形質転換（または形質導入）し得るものならど
のようなものでもよく、例えば組み換えベクターの構築
に用いる宿主としてビオチン要求性の大腸菌を用いる場
合は、ＥＫ系プラスミドベクターとしてストリンゼント
型のｐＳＣ１０１、ｐＲＫ３５３、ｐＲＫ６４６、ｐＲ
Ｋ２４８、ｐＤＦ４１など、リラックス型のＣｏｌＥ
１、ｐＶＨ５１、ｐＡＣ１０５、ＲＳＦ２１２４、ｐＣ
Ｒ１、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２４、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、
ｐＫＹ２２８９、ｐＫＹ２７００、ｐＫＮ８０、ｐＫＣ
７、ｐＫＢ１５８、ｐＭＫ２００４、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９など、λｇｔ系ファージベクタ
ーとしてλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、λＷＥＳ・λ
Ｃ、λＷＥＳ・λＢ、λＺＪｖｉｒ・λＢ’、λＡＬＯ
・λＢ、λＷＥＳ・Ｔ5６２２、λＤａｍなどが用いら
れる。これらのベクターの中ではプラスミドベクターが
特に好ましい。
【００１７】また、当該組み換えベクターに含まれるビ
オチン・シンテターゼをコードするＤＮＡは、上述の形
質転換株中で機能するプロモーター配列を有するＤＮＡ
（以下、単にプロモーターという）の支配下で、かつそ
の下流に組み込まれている必要がある。組み換えベクタ
ーの該ＤＮＡの組み込み部位の上流にプロモーターが存
在しない場合は、該ＤＮＡの上流にプロモーターを該Ｄ
ＮＡが支配されるように組み込めばよい。
オチン・シンテターゼをコードするＤＮＡは、上述の形
質転換株中で機能するプロモーター配列を有するＤＮＡ
（以下、単にプロモーターという）の支配下で、かつそ
の下流に組み込まれている必要がある。組み換えベクタ
ーの該ＤＮＡの組み込み部位の上流にプロモーターが存
在しない場合は、該ＤＮＡの上流にプロモーターを該Ｄ
ＮＡが支配されるように組み込めばよい。
【００１８】本発明に使用しうるプロモーターとして
は、クレビシエラ属微生物中で該プロモーターが組み込
まれている組み換えベクターが機能しうるものであれ
ば、天然のものでも人工合成のものでも使用可能であ
る。このようなプロモーターとしては、例えば、グラム
陰性菌由来のものがあり、具体例として、大腸菌由来の
ｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＰLプロモ
ーター、ＰRプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａ
ｃプロモーター、シュードモナス属微生物由来のカテコ
ール−２，３−オキシゲナーゼプロモーターが例示され
る。天然のものとしては、組み換えベクターとして使用
するベクター中に含まれるものをそのまま利用してもよ
い。
は、クレビシエラ属微生物中で該プロモーターが組み込
まれている組み換えベクターが機能しうるものであれ
ば、天然のものでも人工合成のものでも使用可能であ
る。このようなプロモーターとしては、例えば、グラム
陰性菌由来のものがあり、具体例として、大腸菌由来の
ｌａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＰLプロモ
ーター、ＰRプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、Ｔａ
ｃプロモーター、シュードモナス属微生物由来のカテコ
ール−２，３−オキシゲナーゼプロモーターが例示され
る。天然のものとしては、組み換えベクターとして使用
するベクター中に含まれるものをそのまま利用してもよ
い。
【００１９】なお、大腸菌由来のＴｒｐプロモーターを
大腸菌中で用いる場合は、インドールアクリル酸を添加
するとプロモーターの活性が高くなることが知られてい
たが、このプロモーターを他の微生物中に組み込んだ場
合、必ずしもインドールアクリル酸を添加してもプロモ
ーター活性が高くなるとは限らなかった。しかし、クレ
ビシエラ属に属する微生物に組み込んだ場合、インドー
ルアクリル酸の添加によりプロモーター活性が高くな
る。プロモーター活性が高くなれば、そのプロモーター
に支配されている遺伝子の発現量が大きくなるので、本
発明においては、ビオチン産生量が増大する。プロモー
ター活性を高くするためのインドールアクリル酸の添加
量は１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜７５μ
ｇ／ｍｌである。また、誘導開始後に５〜２５時間後に
添加することが好ましく、７〜１２時間後に添加するこ
とがさらに好ましい。
大腸菌中で用いる場合は、インドールアクリル酸を添加
するとプロモーターの活性が高くなることが知られてい
たが、このプロモーターを他の微生物中に組み込んだ場
合、必ずしもインドールアクリル酸を添加してもプロモ
ーター活性が高くなるとは限らなかった。しかし、クレ
ビシエラ属に属する微生物に組み込んだ場合、インドー
ルアクリル酸の添加によりプロモーター活性が高くな
る。プロモーター活性が高くなれば、そのプロモーター
に支配されている遺伝子の発現量が大きくなるので、本
発明においては、ビオチン産生量が増大する。プロモー
ター活性を高くするためのインドールアクリル酸の添加
量は１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１５〜７５μ
ｇ／ｍｌである。また、誘導開始後に５〜２５時間後に
添加することが好ましく、７〜１２時間後に添加するこ
とがさらに好ましい。
【００２０】ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを組み込んだ組み換えベクターを調製し、単離する方
法は、該ベクターがクレビシエラ属に属する微生物の細
胞に移入後、該細胞内でバチルス属微生物由来のビオチ
ン・シンテターゼが発現可能であるようなベクターが調
製できる限り特に限定されない。例えば、組み換えプラ
スミドの調製方法は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば
ＥｃｏＲｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
等）を用いてプラスミドのＤＮＡを切断した後、ＤＮＡ
リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼや大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼ等）で処理するか、或いはその切断末端によって
は、ターミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラー
ゼ等で処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させてビオチ
ン・シンテターゼをコードするＤＮＡを結合する等の常
法（メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８、４１
（１９７９）；遺伝子操作実験法、１３５頁（高木康敬
著、講談社、１９８０年) により実施することができ
る。
Ａを組み込んだ組み換えベクターを調製し、単離する方
法は、該ベクターがクレビシエラ属に属する微生物の細
胞に移入後、該細胞内でバチルス属微生物由来のビオチ
ン・シンテターゼが発現可能であるようなベクターが調
製できる限り特に限定されない。例えば、組み換えプラ
スミドの調製方法は、制限エンドヌクレアーゼ（例えば
ＥｃｏＲｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ
等）を用いてプラスミドのＤＮＡを切断した後、ＤＮＡ
リガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼや大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼ等）で処理するか、或いはその切断末端によって
は、ターミナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラー
ゼ等で処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させてビオチ
ン・シンテターゼをコードするＤＮＡを結合する等の常
法（メソッズ・イン・エンザイモロジー、６８、４１
（１９７９）；遺伝子操作実験法、１３５頁（高木康敬
著、講談社、１９８０年) により実施することができ
る。
【００２１】また、ビオチン・シンテターゼをコードす
るＤＮＡを有する組み換えベクターを選択する方法は、
例えば、次の手順によって行われる。
るＤＮＡを有する組み換えベクターを選択する方法は、
例えば、次の手順によって行われる。
【００２２】まず、ビオチン・シンテターゼをコードす
るＤＮＡを有する組み換えプラスミドを用いて、制限エ
ンドヌクレアーゼ欠損性でかつビオチン要求性のエシェ
リヒア・コリの変異株、例えばエシェリヒア・コリＣ６
００〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス・イン・ＵＳＡ、７１ ４５９７（１
９７４）〕を、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー９
４ １９３０（１９６７）記載の方法に準じて変異誘導
処理して得られるデスチオビオチンからビオチンへの生
合成能の欠如した微生物、例えば、エシェリヒア・コリ
Ｋ３（ｐＳＢ０１）ＦＥＲＭ−１０９９（特開昭６２−
４４８８９）をキュアリングして得られるエシェリヒア
・コリＫ３等を形質転換する。次いで得られる形質転換
処理細胞を、上記のビオチン要求性のエシェリヒア・コ
リの変異株が生育可能な培地からビオチンを除去した寒
天平板培地に塗布した後、２７〜３７℃で２〜４日間培
養し、得られるコロニーを釣金分離する。この際、形質
転換方法は、特に限定されず、例えば低温下で細胞を塩
化カルシウム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増大
させ、組み換えプラスミドを宿主中に取り込ませる方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、５
３、１５９（１９７０）など〕により形質転換を行うこ
とができる。次いで、得られた形質転換株の一部の細胞
から迅速法〔モレキュラー・クローニング、３６５頁
〔マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、（１９８２年）〕等の方法で抽出した
プラスミドＤＮＡにより、ビオチン要求性のエシェリヒ
ア・コリの変異株の細胞を形質転換して得られる微生物
がビオチン非要求性であることを確認した後、残りの該
形質転換株から、クリヤード・ライセイト法〔遺伝子操
作実験法１２５頁（高木康敬著、講談社、１９８０
年）〕等により、プラスミドを抽出することによって組
み換えプラスミドを単離することができる。このような
組み換えプラスミドとして好ましいものは、例えばｐＳ
Ｂ３０１（特開昭６３−４４８８９号）等がある。
るＤＮＡを有する組み換えプラスミドを用いて、制限エ
ンドヌクレアーゼ欠損性でかつビオチン要求性のエシェ
リヒア・コリの変異株、例えばエシェリヒア・コリＣ６
００〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ック・サイエンス・イン・ＵＳＡ、７１ ４５９７（１
９７４）〕を、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー９
４ １９３０（１９６７）記載の方法に準じて変異誘導
処理して得られるデスチオビオチンからビオチンへの生
合成能の欠如した微生物、例えば、エシェリヒア・コリ
Ｋ３（ｐＳＢ０１）ＦＥＲＭ−１０９９（特開昭６２−
４４８８９）をキュアリングして得られるエシェリヒア
・コリＫ３等を形質転換する。次いで得られる形質転換
処理細胞を、上記のビオチン要求性のエシェリヒア・コ
リの変異株が生育可能な培地からビオチンを除去した寒
天平板培地に塗布した後、２７〜３７℃で２〜４日間培
養し、得られるコロニーを釣金分離する。この際、形質
転換方法は、特に限定されず、例えば低温下で細胞を塩
化カルシウム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増大
させ、組み換えプラスミドを宿主中に取り込ませる方法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、５
３、１５９（１９７０）など〕により形質転換を行うこ
とができる。次いで、得られた形質転換株の一部の細胞
から迅速法〔モレキュラー・クローニング、３６５頁
〔マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、（１９８２年）〕等の方法で抽出した
プラスミドＤＮＡにより、ビオチン要求性のエシェリヒ
ア・コリの変異株の細胞を形質転換して得られる微生物
がビオチン非要求性であることを確認した後、残りの該
形質転換株から、クリヤード・ライセイト法〔遺伝子操
作実験法１２５頁（高木康敬著、講談社、１９８０
年）〕等により、プラスミドを抽出することによって組
み換えプラスミドを単離することができる。このような
組み換えプラスミドとして好ましいものは、例えばｐＳ
Ｂ３０１（特開昭６３−４４８８９号）等がある。
【００２３】ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有するベクターを用いたクレビシエラ属に属する形
質転換微生物の構築 本発明に用いられる微生物は、クレビシエラ属に属する
微生物であり、好ましくはクレビシエラ・ニューモニエ
に属する微生物である。これらの微生物は、微生物菌株
保存機関から分釀される既知のものであっても、自然界
から新たに分離されるものであっても良く、例えばクレ
ビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７（財団法人醗酵
研究所にて保存されている微生物）があげられる。ま
た、これらの微生物は、ビオチン産生能を有しているも
のであっても、ビオチン産生能を有していないものであ
っても構わない。
Ａを有するベクターを用いたクレビシエラ属に属する形
質転換微生物の構築 本発明に用いられる微生物は、クレビシエラ属に属する
微生物であり、好ましくはクレビシエラ・ニューモニエ
に属する微生物である。これらの微生物は、微生物菌株
保存機関から分釀される既知のものであっても、自然界
から新たに分離されるものであっても良く、例えばクレ
ビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７（財団法人醗酵
研究所にて保存されている微生物）があげられる。ま
た、これらの微生物は、ビオチン産生能を有しているも
のであっても、ビオチン産生能を有していないものであ
っても構わない。
【００２４】クレビシエラ属に属する微生物以外の微生
物、例えば、エンテロバクター属やシトロバクター属に
属する微生物では、ビオチンの産生能の高い形質転換微
生物を得ることはできない。
物、例えば、エンテロバクター属やシトロバクター属に
属する微生物では、ビオチンの産生能の高い形質転換微
生物を得ることはできない。
【００２５】ビオチン産生能を有するバチルス属微生物
から採取したビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する組み換えベクターによりクレビシエラ属に属
する微生物を形質転換する方法は、該組み換えベクター
がクレビシエラ属に属する微生物中に導入され、発現し
さえすれば特に限定されない。例えば塩化カルシウムで
菌体を処理して組み換えプラスミドを導入する方法〔例
えば、エリックら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー、１３３、２０５３−２０５７（１
９８７）〕等が挙げられる。具体例としては、以下の方
法が挙げられる。
から採取したビオチン・シンテターゼをコードするＤＮ
Ａを有する組み換えベクターによりクレビシエラ属に属
する微生物を形質転換する方法は、該組み換えベクター
がクレビシエラ属に属する微生物中に導入され、発現し
さえすれば特に限定されない。例えば塩化カルシウムで
菌体を処理して組み換えプラスミドを導入する方法〔例
えば、エリックら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー、１３３、２０５３−２０５７（１
９８７）〕等が挙げられる。具体例としては、以下の方
法が挙げられる。
【００２６】まずビオチン・シンテターゼをコードする
ＤＮＡを有する組み換えプラスミドを例えばクレビシエ
ラ・ニューモニエの野生株（例えばクレビシエラ・ニュ
ーモニエＩＦＯ１２６４８株）の細胞にメリックとポス
トゲイトらの方法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー、１３３、２０５３−２０５７（１
９８７）〕により取り込ませ、薬剤耐性のコロニーを釣
菌分離することにより形質転換株を得る。かくすること
により本発明の微生物、即ちビオチン産生能を有するバ
チルス属微生物から採取したビオチン・シンテターゼを
コードするＤＮＡを有する組み換えプラスミドでクレビ
シエラ属に属する微生物を形質転換した組み換え微生物
を得ることができる。
ＤＮＡを有する組み換えプラスミドを例えばクレビシエ
ラ・ニューモニエの野生株（例えばクレビシエラ・ニュ
ーモニエＩＦＯ１２６４８株）の細胞にメリックとポス
トゲイトらの方法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー、１３３、２０５３−２０５７（１
９８７）〕により取り込ませ、薬剤耐性のコロニーを釣
菌分離することにより形質転換株を得る。かくすること
により本発明の微生物、即ちビオチン産生能を有するバ
チルス属微生物から採取したビオチン・シンテターゼを
コードするＤＮＡを有する組み換えプラスミドでクレビ
シエラ属に属する微生物を形質転換した組み換え微生物
を得ることができる。
【００２７】かくすることにより本発明の微生物、即ち
ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する組
み換えベクターにより形質転換したクレビシエラ属に属
する微生物を得る事ができる。
ビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する組
み換えベクターにより形質転換したクレビシエラ属に属
する微生物を得る事ができる。
【００２８】クレビシエラ属に属する形質転換微生物を
用いたビオチンの製造 上述のクレビシエラ属に属する形質転換微生物を以下の
方法で培養し、ビオチンを製造することができる。
用いたビオチンの製造 上述のクレビシエラ属に属する形質転換微生物を以下の
方法で培養し、ビオチンを製造することができる。
【００２９】本発明において培養条件は、増殖させよう
とする微生物が増殖する限り、あるいはビオチンを産生
させようとする微生物がビオチンを産生する限り、特に
限定されない。例えば、培地は、炭素源、窒素源、無機
物を含有する合成培地、または天然培地のいずれでも使
用可能である。炭素源としては、グルコース、グリセリ
ン、フラクトース、シュークロース、マンノース、澱
粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物が使用でき
る。また窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウムなどの各種の無機及び有機アンモニウム塩類、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆粕やその消化物などの天然有機
窒素源などが使用可能である。天然有機窒素源の多くの
場合は、窒素源であるとともに炭素にもなりうる。さら
に無機物としては、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、硫酸な
どが使用できる。
とする微生物が増殖する限り、あるいはビオチンを産生
させようとする微生物がビオチンを産生する限り、特に
限定されない。例えば、培地は、炭素源、窒素源、無機
物を含有する合成培地、または天然培地のいずれでも使
用可能である。炭素源としては、グルコース、グリセリ
ン、フラクトース、シュークロース、マンノース、澱
粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物が使用でき
る。また窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウムなどの各種の無機及び有機アンモニウム塩類、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆粕やその消化物などの天然有機
窒素源などが使用可能である。天然有機窒素源の多くの
場合は、窒素源であるとともに炭素にもなりうる。さら
に無機物としては、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、硫酸な
どが使用できる。
【００３０】更に培地のpHを６〜８に保つため炭酸カル
シウムを、或いは必要に応じアンモニア等を添加しても
よい。また、本発明においては、必要に応じて培地にデ
スチオビオチンを添加することができる。デスチオビオ
チンの添加量はとくに制限されず、形質転換株のビオチ
ン産生能に応じて適宜選択すればよい。
シウムを、或いは必要に応じアンモニア等を添加しても
よい。また、本発明においては、必要に応じて培地にデ
スチオビオチンを添加することができる。デスチオビオ
チンの添加量はとくに制限されず、形質転換株のビオチ
ン産生能に応じて適宜選択すればよい。
【００３１】また、このような培地に、本発明の微生物
を接種し、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的
条件下、１８〜３７℃、好ましくは２０〜３５℃、さら
に好ましくは、２５〜３２℃で、２日以上、好ましくは
３日以上で培養することにより、培地中にビオチンを著
量蓄積させることができる。ときに、培養時間が長すぎ
ると、培地中のビオチン量が減少することがある。
を接種し、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的
条件下、１８〜３７℃、好ましくは２０〜３５℃、さら
に好ましくは、２５〜３２℃で、２日以上、好ましくは
３日以上で培養することにより、培地中にビオチンを著
量蓄積させることができる。ときに、培養時間が長すぎ
ると、培地中のビオチン量が減少することがある。
【００３２】こうして培養した細胞あるいは培養液から
のビオチンの回収は特に限定されない。例えば、培養濾
液を活性炭に吸着させ、溶出させ、イオン交換樹脂で精
製すればよい。
のビオチンの回収は特に限定されない。例えば、培養濾
液を活性炭に吸着させ、溶出させ、イオン交換樹脂で精
製すればよい。
【００３３】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例中、ビオチンの定量はラクト
バチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂｕｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）による微生物定量法〔ビタミン学
実験法、ＩＩ巻、４８６頁（日本ビタミン学会編、東京
化学同人、1985年）〕により定量した。
に説明する。なお、実施例中、ビオチンの定量はラクト
バチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂｕｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）による微生物定量法〔ビタミン学
実験法、ＩＩ巻、４８６頁（日本ビタミン学会編、東京
化学同人、1985年）〕により定量した。
【００３４】（実施例１） （１）プラスミドの脱落 エシェリヒア・コリＫ３（ｐＳＢ０１）（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１０９９、特開昭６３−４４８８９号参照）からｐ
ＳＢ０１を脱落させるため、この株をアクリジン・オレ
ンジを１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃
で１５時間振盪培養した。培養終了後、培養液を１０5
倍希釈した溶液１００μｌを、ＬＢ平板寒天培地に塗抹
し、３７℃で２４時間培養した。２４時間培養後、出現
したコロニーをアンピシリンを５０ｍｇ／ｌ含むＬＢ平
板寒天培地にレプリカし、３７℃で１５時間培養し、生
育しない株を選択した。１５時間培養後、ＬＢ平板寒天
培地では生育するが、アンピシリンを含むＬＢ平板寒天
培地では生育しない株エシェリヒア・コリＫ３−１を選
択した。
Ｐ−１０９９、特開昭６３−４４８８９号参照）からｐ
ＳＢ０１を脱落させるため、この株をアクリジン・オレ
ンジを１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃
で１５時間振盪培養した。培養終了後、培養液を１０5
倍希釈した溶液１００μｌを、ＬＢ平板寒天培地に塗抹
し、３７℃で２４時間培養した。２４時間培養後、出現
したコロニーをアンピシリンを５０ｍｇ／ｌ含むＬＢ平
板寒天培地にレプリカし、３７℃で１５時間培養し、生
育しない株を選択した。１５時間培養後、ＬＢ平板寒天
培地では生育するが、アンピシリンを含むＬＢ平板寒天
培地では生育しない株エシェリヒア・コリＫ３−１を選
択した。
【００３５】（２）ｐＳＢ０１の回収 エシェリヒア・コリＫ３（ｐＳＢ０１）（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１０９９）を用いてビルンボイム（Ｂｉｒｕｎｂｏ
ｉｍ）とドーリー（Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイック・
アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）、７、１５１３（１９７９）〕の方法で全
鎖長約１２．５ｋｂのプラスミドｐＳＢ０１を回収し
た。プラスミドｐＳＢ０１はバチルス属に属する微生物
のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する
プラスミドである。その制限エンドヌクレアーゼ切断地
図を図１に示す。
Ｐ−１０９９）を用いてビルンボイム（Ｂｉｒｕｎｂｏ
ｉｍ）とドーリー（Ｄｏｌｙ）の方法〔ヌクレイック・
アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）、７、１５１３（１９７９）〕の方法で全
鎖長約１２．５ｋｂのプラスミドｐＳＢ０１を回収し
た。プラスミドｐＳＢ０１はバチルス属に属する微生物
のビオチン・シンテターゼをコードするＤＮＡを有する
プラスミドである。その制限エンドヌクレアーゼ切断地
図を図１に示す。
【００３６】（実施例２） ハイブリッドプラスミドｐ
ＳＢ０３の構築と解析 （１）ハイブリッドプラスミドの構築 実施例１の（２）で得たｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡ１
μｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に分解
し、得られた３種のＤＮＡ断片の混合物１μｇを１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭデチオ
スレイトールｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応
させることにより再結合を行った。
ＳＢ０３の構築と解析 （１）ハイブリッドプラスミドの構築 実施例１の（２）で得たｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡ１
μｇを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に分解
し、得られた３種のＤＮＡ断片の混合物１μｇを１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭデチオ
スレイトールｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し、４℃で一晩反応
させることにより再結合を行った。
【００３７】（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換と
ビオチン産生能を有する形質転換微生物の選択 実施例１の（１）で得たエシェリヒア・コリＫ３−１を
１００ｍｌのＬＢ培地中３７℃で２時間半振盪培養し、
対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体を
クシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ）の方法〔ジェネティック
・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ）ｐ．１７、１９７８年〕により許容細胞とし
た。
ビオチン産生能を有する形質転換微生物の選択 実施例１の（１）で得たエシェリヒア・コリＫ３−１を
１００ｍｌのＬＢ培地中３７℃で２時間半振盪培養し、
対数増殖期に菌体を遠心分離により集めた。この菌体を
クシュナー（Ｋｕｓｈｎｅｒ）の方法〔ジェネティック
・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ）ｐ．１７、１９７８年〕により許容細胞とし
た。
【００３８】次に（１）で得たＴ４ＤＮＡリガーゼによ
る反応混合物０．１μｇを上記許容細胞懸濁液０．２ｍ
ｌに加えて０℃で３０分間静置培養した。４３．５℃で
３０秒間保った後、ＬＢ培地１．８ｍｌを加えて３７℃
で１時間培養した。これを遠心分離して集菌した。この
菌体を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した後、
０．８５％ＮａＣｌ水溶液１ｍｌに懸濁した。次に菌体
懸濁液０．１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＣＡ培地［グリセリン２％、カザミノ酸（ビタミンフリ
ー）１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００５％、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
０．００１％、チアミン塩酸塩０．００００１％］の
１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて二晩培養した。
生じたコロニーはアンピシリン耐性、ビオチン非要求性
であり、かくして目的とするビオチンの生合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだハイブリッドプラ
スミドによる形質転換株を得た。 ＄（３）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ０３の解析 実施例２の（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養
して遠心分離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法
によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出
したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長約
８．８ｋｂであり、ｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡから約
３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片が欠落したものであっ
た。このハイブリッドプラスミドをｐＳＢ０３と命名
し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を図２に示
す。
る反応混合物０．１μｇを上記許容細胞懸濁液０．２ｍ
ｌに加えて０℃で３０分間静置培養した。４３．５℃で
３０秒間保った後、ＬＢ培地１．８ｍｌを加えて３７℃
で１時間培養した。これを遠心分離して集菌した。この
菌体を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄した後、
０．８５％ＮａＣｌ水溶液１ｍｌに懸濁した。次に菌体
懸濁液０．１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む
ＣＡ培地［グリセリン２％、カザミノ酸（ビタミンフリ
ー）１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．２％、ＫＨ2ＰＯ4 ０．１
％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００５％、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ
０．００１％、チアミン塩酸塩０．００００１％］の
１．５％寒天培地に塗抹し、３７℃にて二晩培養した。
生じたコロニーはアンピシリン耐性、ビオチン非要求性
であり、かくして目的とするビオチンの生合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだハイブリッドプラ
スミドによる形質転換株を得た。 ＄（３）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ０３の解析 実施例２の（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養
して遠心分離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法
によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出
したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全鎖長約
８．８ｋｂであり、ｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡから約
３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片が欠落したものであっ
た。このハイブリッドプラスミドをｐＳＢ０３と命名
し、その制限エンドヌクレアーゼ切断地図を図２に示
す。
【００３９】（実施例３） ハイブリッドプラスミドｐ
ＳＢ１０３の構築と解析 （１）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ１０３の構築 実施例２で得たｐＳＢ０３プラスミドＤＮＡ３μｇを制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解し
た。これとは別にｐＵＣ９ １μｇを制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解した。次いでｐＳＢ
０３を切断して得られた３種のＤＮＡ断片の混合物（１
μｇ）と開裂されたｐＵＣ９（１μｇ）を１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭデチオスレイ
トールを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し反応混合物を調製
した。これを各々４℃で一晩反応させることによってハ
イブリッドプラスミドを得た。
ＳＢ１０３の構築と解析 （１）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ１０３の構築 実施例２で得たｐＳＢ０３プラスミドＤＮＡ３μｇを制
限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解し
た。これとは別にｐＵＣ９ １μｇを制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解した。次いでｐＳＢ
０３を切断して得られた３種のＤＮＡ断片の混合物（１
μｇ）と開裂されたｐＵＣ９（１μｇ）を１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2 、１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭデチオスレイ
トールを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ
４ＤＮＡリガーゼ３単位と共に混合し反応混合物を調製
した。これを各々４℃で一晩反応させることによってハ
イブリッドプラスミドを得た。
【００４０】（２）ビオチン要求性大腸菌の形質転換 上記実施例３の（１）の反応混合物１μｇを用いること
以外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラ
スミドによる形質転換株を得た。
以外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラ
スミドによる形質転換株を得た。
【００４１】（３）ハイブリッドプラスミドｐＳＢ１０
３の解析 実施例３の（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養
して遠心分離で集菌後、前述のビルンボイムとドーリー
の方法によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出し
た。抽出したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全
鎖長約６．２ｋｂであった。このプラスミドはｐＳＢ０
３プラスミドＤＮＡの約２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切
断断片が挿入されたものでありｐＳＢ１０３と命名し
た。
３の解析 実施例３の（２）で得られた形質転換株を５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリンを含むＣＡ培地５ｍｌ中で一晩振盪培養
して遠心分離で集菌後、前述のビルンボイムとドーリー
の方法によりハイブリッドプラスミドＤＮＡを抽出し
た。抽出したプラスミドＤＮＡのうち最小のものは、全
鎖長約６．２ｋｂであった。このプラスミドはｐＳＢ０
３プラスミドＤＮＡの約２．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切
断断片が挿入されたものでありｐＳＢ１０３と命名し
た。
【００４２】この挿入断片中に含まれるバチルス・スフ
ェリカスＩＦＯ０３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩ
からＨｉｎｄＩＩＩまでの約１．５ｋｂであり、その詳
細な制限エンドヌクレアーゼ切断地図は図３に示すとお
りである。
ェリカスＩＦＯ０３５２５由来のＤＮＡ断片はＭｂｏＩ
からＨｉｎｄＩＩＩまでの約１．５ｋｂであり、その詳
細な制限エンドヌクレアーゼ切断地図は図３に示すとお
りである。
【００４３】（実施例４） ハイブリッドプラスミドｐ
ＳＢ３０１の構築（図４参照） Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペロン領域にビオチン
・シンテターゼ遺伝子を直結するために以下の操作を行
った。ｐＳＢ１０３を制限エンドヌクレアーゼＭａｅＩ
で完全分解せしめた後、分解したＤＮＡ断片（２．０μ
ｇ）を３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、２５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、５％グリセロー
ル中でＳ１ヌクレアーゼ１単位と混合し、３７℃、３０
分間反応させることによってＤＮＡ断片の両末端を平滑
にした。次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にか
け、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
ＳＢ３０１の構築（図４参照） Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペロン領域にビオチン
・シンテターゼ遺伝子を直結するために以下の操作を行
った。ｐＳＢ１０３を制限エンドヌクレアーゼＭａｅＩ
で完全分解せしめた後、分解したＤＮＡ断片（２．０μ
ｇ）を３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、２５０
ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、５％グリセロー
ル中でＳ１ヌクレアーゼ１単位と混合し、３７℃、３０
分間反応させることによってＤＮＡ断片の両末端を平滑
にした。次いで反応物をアガロースゲル電気泳動にか
け、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
【００４４】一方Ｔｒｐオペロンのプロモーターオペレ
ーターを含み、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつ
ｐＤＲ７２０（ファルマシア社製）を制限エンドヌクレ
アーゼＳｍａＩで完全分解せしめたの後、アルカリホス
ファターゼで処理した。
ーターを含み、アンピシリン耐性をマーカーとしてもつ
ｐＤＲ７２０（ファルマシア社製）を制限エンドヌクレ
アーゼＳｍａＩで完全分解せしめたの後、アルカリホス
ファターゼで処理した。
【００４５】アガロースゲルより回収した約２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片（０．１μｇ）と開裂されたｐＤＲ７２０
（０．１μｇ）を１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＡＴ
Ｐおよび１０ｍＭデチオスレイトールを含むｐＨ７．４
の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位
と共に混合し、１５℃で４時間反応させることによって
ハイブリッドプラスミドを含む反応混合物を得た。
のＤＮＡ断片（０．１μｇ）と開裂されたｐＤＲ７２０
（０．１μｇ）を１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＡＴ
Ｐおよび１０ｍＭデチオスレイトールを含むｐＨ７．４
の５０ｍＭトリス−塩酸中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位
と共に混合し、１５℃で４時間反応させることによって
ハイブリッドプラスミドを含む反応混合物を得た。
【００４６】この反応混合物０．２μｇを用いること以
外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラス
ミドによる形質転換株を得た。
外は実施例２の（２）と同様にしてハイブリッドプラス
ミドによる形質転換株を得た。
【００４７】得られた形質転換株を５０μｇ／ｍｌアン
ピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で一晩培養して遠心分
離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法によりハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラス
ミドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長約６．１ｋｂであ
った。このプラスミドはＴｒｐプロモーターの転写開示
部位の約７０塩基下流からバチルス・スフェリカス由来
のビオチン合成酵素遺伝子の翻訳開始コドンＧＴＧが始
まっていた。これをｐＳＢ３０１と命名した。
ピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌ中で一晩培養して遠心分
離で集菌後、ビルンボイムとドーリーの方法によりハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラス
ミドＤＮＡのうち最小のものは全鎖長約６．１ｋｂであ
った。このプラスミドはＴｒｐプロモーターの転写開示
部位の約７０塩基下流からバチルス・スフェリカス由来
のビオチン合成酵素遺伝子の翻訳開始コドンＧＴＧが始
まっていた。これをｐＳＢ３０１と命名した。
【００４８】（実施例５） ビオチン生合成に関与する
遺伝子を導入したプラスミドにより形質転換したクレビ
シエラ属に属する微生物の取得 ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来のビオチン
・シンテターゼをコードしたＤＮＡを組み込んだ組換え
プラスミドｐＳＢ３０１（特開昭６２−２７５６８４
号）のＤＮＡとクレビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３
１７とを用い、メリックとポストゲイトの方法によりア
ンピシリン耐性で形質転換株を得た。即ち、クレビシエ
ラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７株をＬＢ培地（バクト
トリプトン１０ｇ、バクトイーストイクストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを純水に溶かし１リットル、ｐＨ
７．５にし、滅菌したもの）で２８℃で１５時間前培養
した培養液５０μｌを直ちにＬＢ培地５ｍｌに加え、３
２℃で３時間振盪培養した。この菌体培養液５ｍｌを１
６００×Ｇで１０分間遠心して集菌した。この菌体を５
０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液２．５ｍｌに懸濁し、０℃で１
０分間静置した後再度１６００×Ｇで１０分間遠心分離
により集菌した。得られた菌体を５０ｍＭ ＣａＣｌ2
溶液０．４ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間静置してコン
ピテント細胞とした。このコンピテント細胞懸濁液０．
２ｍｌにビオチン・シンテターゼ発現プラスミドｐＳＢ
３０１ １μｇを加えて０℃で１０分間静置する。次に
液体窒素中で１分間冷凍した後、直ちに３２℃で解凍さ
せ、ＤＮＡを細胞内に取り込ませた。次にＬＢ培地５ｍ
ｌを加えて、３２℃で２時間振盪培養を行い、この培養
液をアンピシリン５００ｍｇ／ｌを含むＬＢ平板寒天培
地に塗末し２８℃で２４時間培養後、生育して来たコロ
ニーを釣菌分離することにより形質転換株クレビシエラ
・ニューモニエＩＦＯ３３１７（ｐＳＢ３０１）を得
た。この形質転換株の含有するプラスミドＤＮＡがｐＳ
Ｂ３０１である事を制限エンドヌクレアーゼの切断部位
を利用する方法で確認した。
遺伝子を導入したプラスミドにより形質転換したクレビ
シエラ属に属する微生物の取得 ビオチン産生能を有するバチルス属細菌由来のビオチン
・シンテターゼをコードしたＤＮＡを組み込んだ組換え
プラスミドｐＳＢ３０１（特開昭６２−２７５６８４
号）のＤＮＡとクレビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３
１７とを用い、メリックとポストゲイトの方法によりア
ンピシリン耐性で形質転換株を得た。即ち、クレビシエ
ラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７株をＬＢ培地（バクト
トリプトン１０ｇ、バクトイーストイクストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを純水に溶かし１リットル、ｐＨ
７．５にし、滅菌したもの）で２８℃で１５時間前培養
した培養液５０μｌを直ちにＬＢ培地５ｍｌに加え、３
２℃で３時間振盪培養した。この菌体培養液５ｍｌを１
６００×Ｇで１０分間遠心して集菌した。この菌体を５
０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液２．５ｍｌに懸濁し、０℃で１
０分間静置した後再度１６００×Ｇで１０分間遠心分離
により集菌した。得られた菌体を５０ｍＭ ＣａＣｌ2
溶液０．４ｍｌに懸濁し、０℃で１０分間静置してコン
ピテント細胞とした。このコンピテント細胞懸濁液０．
２ｍｌにビオチン・シンテターゼ発現プラスミドｐＳＢ
３０１ １μｇを加えて０℃で１０分間静置する。次に
液体窒素中で１分間冷凍した後、直ちに３２℃で解凍さ
せ、ＤＮＡを細胞内に取り込ませた。次にＬＢ培地５ｍ
ｌを加えて、３２℃で２時間振盪培養を行い、この培養
液をアンピシリン５００ｍｇ／ｌを含むＬＢ平板寒天培
地に塗末し２８℃で２４時間培養後、生育して来たコロ
ニーを釣菌分離することにより形質転換株クレビシエラ
・ニューモニエＩＦＯ３３１７（ｐＳＢ３０１）を得
た。この形質転換株の含有するプラスミドＤＮＡがｐＳ
Ｂ３０１である事を制限エンドヌクレアーゼの切断部位
を利用する方法で確認した。
【００４９】（実施例６）ビオチンの製造 実施例１で得られたクレビシエラ・ニューモニエＩＦＯ
３３１７（ｐＳＢ３０１）、並びに、対照株としてクレ
ビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７をそれぞれアン
ピシリン１００ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地に接種し、
２８℃で一夜前培養を行った。アンピシリン１００ｍｇ
／ｌとＤＴＢ７５０μｇ／ｍｌを添加した醗酵培地（シ
ョ糖１０％、尿素１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０
１％、ＣａＣＯ3 １％、ｐＨ７．０、特公平２−２７
９８０号記載）を滅菌したもの２ｍｌに、前培養液０．
１ｍｌをそれぞれ植菌し、２８℃で１２０時間振盪培養
した。また、同時に実施例１で得られたクレビシエラ・
ニューモニエＩＦＯ３３１７（ｐＳＢ３０１）を同培地
中で培養し、培養開始から８時間後の培養液にインドー
ルアクリル酸を最終濃度２０μｇ／ｍｌになる様に添加
し、ｐＳＢ３０１のトリプトファン・プロモーターの誘
導を行った。それぞれの培養開始から１２０時間培養後
のビオチン生成蓄積量は表１の通りである。
３３１７（ｐＳＢ３０１）、並びに、対照株としてクレ
ビシエラ・ニューモニエＩＦＯ３３１７をそれぞれアン
ピシリン１００ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地に接種し、
２８℃で一夜前培養を行った。アンピシリン１００ｍｇ
／ｌとＤＴＢ７５０μｇ／ｍｌを添加した醗酵培地（シ
ョ糖１０％、尿素１％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ０．１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０
１％、ＣａＣＯ3 １％、ｐＨ７．０、特公平２−２７
９８０号記載）を滅菌したもの２ｍｌに、前培養液０．
１ｍｌをそれぞれ植菌し、２８℃で１２０時間振盪培養
した。また、同時に実施例１で得られたクレビシエラ・
ニューモニエＩＦＯ３３１７（ｐＳＢ３０１）を同培地
中で培養し、培養開始から８時間後の培養液にインドー
ルアクリル酸を最終濃度２０μｇ／ｍｌになる様に添加
し、ｐＳＢ３０１のトリプトファン・プロモーターの誘
導を行った。それぞれの培養開始から１２０時間培養後
のビオチン生成蓄積量は表１の通りである。
【００５０】
【表１】
【００５１】比較例１ シトロバクター・フレウンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＩＦＯ１３５４４にプラスミ
ドｐＳＢ３０１を導入せしめたＩＦＯ１３５４４（ｐＳ
Ｂ３０１）、エンテロバクター・クロアクエ（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅａ）ＩＦＯ１２９３５
にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめたＩＦＯ１２３
９５（ｐＳＢ３０１）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）エアロゲネＩＦ
Ｏ１２０１０にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめた
ＩＦＯ１２０１０（ｐＳＢ３０１）を用いて、ＩＡＡを
添加した実施例２に記載の方法でＤＴＢからゼオチンを
産生せしめ、さらにエシェリヒア・コリＭＣ１６９にプ
ラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめたエシェリヒア・コ
リＭＣ１６９（ｐＳＢ３０１）を５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンと５００μｇ／ｍｌのＤＴＢを含むＰＣ培地
（グリセリン２％、プロテオースペプトン５％、カザミ
ノ酸２％、Ｋ2ＨＰＯ4 １％、ＫＣｌ ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2
Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．００１％、
ｐＨ７．０）の１．２倍濃度培地３ｍｌに植菌し、３７
℃で１時間振盪培養後、Ｔｒｐプロモーターを誘導する
ために、インドールアクリル酸を１６．７μｇ／ｍｌと
なるように添加し、さらに３７℃で１晩振盪培養した。
ｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＩＦＯ１３５４４にプラスミ
ドｐＳＢ３０１を導入せしめたＩＦＯ１３５４４（ｐＳ
Ｂ３０１）、エンテロバクター・クロアクエ（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅａ）ＩＦＯ１２９３５
にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめたＩＦＯ１２３
９５（ｐＳＢ３０１）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒ
ｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）エアロゲネＩＦ
Ｏ１２０１０にプラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめた
ＩＦＯ１２０１０（ｐＳＢ３０１）を用いて、ＩＡＡを
添加した実施例２に記載の方法でＤＴＢからゼオチンを
産生せしめ、さらにエシェリヒア・コリＭＣ１６９にプ
ラスミドｐＳＢ３０１を導入せしめたエシェリヒア・コ
リＭＣ１６９（ｐＳＢ３０１）を５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンと５００μｇ／ｍｌのＤＴＢを含むＰＣ培地
（グリセリン２％、プロテオースペプトン５％、カザミ
ノ酸２％、Ｋ2ＨＰＯ4 １％、ＫＣｌ ０．０５％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2
Ｏ ０．００１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．００１％、
ｐＨ７．０）の１．２倍濃度培地３ｍｌに植菌し、３７
℃で１時間振盪培養後、Ｔｒｐプロモーターを誘導する
ために、インドールアクリル酸を１６．７μｇ／ｍｌと
なるように添加し、さらに３７℃で１晩振盪培養した。
【００５２】それぞれの菌株のビオチン産生量は表２に
示す。
示す。
【００５３】
【表２】
【００５４】
【発明の効果】かくして本発明によれば、ビオチン産生
能を有するバチルス属微生物由来のビオチン・シンテタ
ーゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターによ
りクレビシエラ属に属する微生物に形質転換せしめるこ
とにより、デスチオビオチンからビオチンへの産生能に
優れた微生物を得ることができ、さらにそれら該微生物
を培養して効率よくビオチンを製造する方法が提供され
ることになる。
能を有するバチルス属微生物由来のビオチン・シンテタ
ーゼをコードするＤＮＡを有する組み換えベクターによ
りクレビシエラ属に属する微生物に形質転換せしめるこ
とにより、デスチオビオチンからビオチンへの産生能に
優れた微生物を得ることができ、さらにそれら該微生物
を培養して効率よくビオチンを製造する方法が提供され
ることになる。
【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＳＢ０１プラスミドＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断地図である。
レアーゼ切断地図である。
【図２】ｐＳＢ０３プラスミドＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断地図である。
レアーゼ切断地図である。
【図３】バチルス属微生物由来のビオチン・シンテター
ゼＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
ゼＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断地図である。
【図４】ｐＳＢ３０１プラスミドＤＮＡの調製方法であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:22）
Claims (2)
- 【請求項１】 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属す
る微生物のデスチオビオチンをビオチンに変換する反応
に関与する酵素をコードするＤＮＡを有する組み換えベ
クターで形質転換したクレビシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ）属に属する微生物。 - 【請求項２】 請求項１記載の微生物を好気的条件下で
培養した後、培地からビオチンを回収することを特徴と
したビオチンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3108203A JPH06339371A (ja) | 1991-04-15 | 1991-04-15 | クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3108203A JPH06339371A (ja) | 1991-04-15 | 1991-04-15 | クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339371A true JPH06339371A (ja) | 1994-12-13 |
Family
ID=14478637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3108203A Pending JPH06339371A (ja) | 1991-04-15 | 1991-04-15 | クレビシエラ属に属する形質転換微生物及びそれを用いたビオチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06339371A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806479A1 (en) * | 1996-05-06 | 1997-11-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fermentative production of biotin |
-
1991
- 1991-04-15 JP JP3108203A patent/JPH06339371A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0806479A1 (en) * | 1996-05-06 | 1997-11-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fermentative production of biotin |
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