JP2527926B2 - ビオチンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規微生物を用いるビオ
チンの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビオチンは動植物、微生物にとって重要
なビタミンの一種である。従来微生物を用いたビオチン
の製造法としては、バシルス属、クロモバクテリウム
属、シュードモナス属、アースロバクター属等の微生物
を用いる方法が知られている。またこれら野生株に人工
的に突然変異を生起せしめてビオチン生産能を付与する
方法も提案されている（特開昭５８−６０９９６号公
報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら微生物を
用いてビオチンを製造しようとする場合、野生株はビオ
チンによる強力なフィードバック阻害機構の為（Y.Izum
i, K.Ogata, Adv.Appl.Microbial. 22,155〜157, 1977)
ビオチンは極少量しか生成されない。また変異株を用い
る方法でも生成量は必ずしも満足し得るものではなかっ
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記の事情に鑑み、本発
明者等はこれらの手法とは異なる遺伝子操作による育種
に着目し、ビオチン生産能の優れた微生物を得るべく鋭
意研究を重ねた結果、エシェリヒア・コリ野生株を人工
的に変異させることによりビオチンによるフィードバッ
ク阻害が解除された変異株を取得し、該変異株よりビオ
チンの生合成に関与する酵素の遺伝情報を担うＤＮＡを
単離し、次いで該ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込ませ
た組換えＤＮＡを得、該組換えＤＮＡを前記変異株に導
入することに成功するとともに、かくして得られた微生
物が優れたビオチン生産能を有することを見い出し、こ
の知見にもとずいて本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明は、（１）ピメリルＣｏＡ
シンテターゼ活性、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸
シンテターゼ活性、７，８−ジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ活性、デスチオビオチンシンテタ
ーゼ活性、およびデスチオビオチンからビオチンへの変
換に関与する酵素活性を有し、かつビオチンによるフィ
ードバック阻害が解除されたエシェリヒア・コリから取
得したピメリルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸シンテターゼ、７，８−ジアミノペラ
ルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチン
シンテターゼ、およびデスチオビオチンからビオチンへ
の変換に関与する酵素（以下、これらの酵素を単にビオ
チン生合成酵素と略す。）の遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）をベクターＤＮＡに組み込んだ組換え
ＤＮＡを、当該エシェリヒア・コリに含有せしめた微生
物、および（２）該微生物を培養し、培地中に生成蓄積
されたビオチンを採取することを特徴とするビオチンの
製造法である。以下に本発明を詳細に説明する。

【０００６】〔本発明に係る微生物の調整〕まず、ビオ
チン生合成酵素活性を有するエシェリヒア・コリ野生株
（例えばエシェリヒア・コリＪＡ２２１）に変異を誘起
せしめて、ビオチン要求株（以下、ＢＲ変異株と称
す。）およびビオチンによるフィードバック阻害が解除
された変異株（以下、ＤＲ変異株と称す。）を取得す
る。変異の誘起は通常の変異誘起処理により行うことが
でき、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジンのごとき変異誘起剤で処理することにより実
施することができる。ＢＲ変異株の取得は変異誘起処理
して得られた菌体を緩衝液で適当に希釈後、ビオチンを
含む最小培地寒天平板で培養し、適当数（約５０〜２０
０個）のコロニーが出現した平板を選び、ビオチン無添
加の最小培地平板にレプリカして培養後、レプリカ平板
をマスター平板と比較し、レプリカ平板では生育しない
コロニーをマスター平板より釣菌分離することにより行
う。

【０００７】このようにして得られたＢＲ変異株には例
えばエシェリヒア・コリＢＲ−４があげられる。本ＢＲ
変異株はデスチオビオチン添加最小培地でも生育できな
いことより、デスチオビオチンからビオチンへの変換に
関与する酵素が欠損したことがわかる。また公知のＢＲ
変異株としては、例えばJ.Bacteriol., 112 ,830〜839
(1972) に記載のＲ８７６株、Ｒ８７４株、Ｒ８７３
株、Ｒ８７７株、Ｒ８７５株（それぞれピメリルＣｏＡ
シンテターゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シン
テターゼ、７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトラン
スフェラーゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、デスチ
オビオチンからビオチンへの変換に関与する酵素、が欠
損した株）があげられる。

【０００８】一方ＤＲ変異株の取得は変異誘起処理して
得られた菌体を、緩衝液で適当に希釈後、上記のように
して得たＢＲ変異株と２，３，５−トリフェニルテトラ
ゾリウムクロリドとを含むビオチン無添加の最少培地寒
天平板に、一定量のビオチン無添加の最少寒天培地を重
層して作成した平板上で培養し、生じた小コロニーの下
層がピンク色のゾーンを呈した時、生じた小コロニーを
釣菌分離することによりおこなう。この原理はＤＲ変異
株はビオチンを多量に生産し、下層のＢＲ要求株の生育
を助け、その増殖に伴い２，３，５−トリフェニルテト
ラゾリウムクロリドが還元されピンク色のゾーンを呈す
ることにあり、従って変異が誘発されなかった野生株で
はこのような現象は観察されない。このようにして得ら
れたＤＲ変異株としては、例えばエシェリヒア・コリＤ
Ｒ−８５（微工研菌寄第８０９６号）があげられる。

【０００９】次いでビオチン生合成酵素の遺伝情報を担
うＤＮＡ（以下、染色体ＤＮＡと称す。）を上記ＤＲ変
異株から単離精製するには、例えばBiochim.Biophys.Ac
ta72,619〜629(1963) に記載のフェノール法等常法に従
って行うことができる。次に得られた染色体ＤＮＡをベ
クターＤＮＡに組み込んで組換えＤＮＡを調整する。染
色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組み込みは常法に従っ
て行うことができる。例えば、染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断して染色体
ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡ断片を調整したのち、
両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することにより行
うことができる。

【００１０】ここで用いられるベクターＤＮＡとしては
エシェリヒア・コリを宿主とするｐＢＲ３２２プラスミ
ド、コリシン（Ｃｏｌ）Ｅ１プラスミド、ラムダファー
ジなど通常用いられるものが採用されうる。とりわけｐ
ＢＲ３２２プラスミドが好適に用いられる。また制限エ
ンドヌクレアーゼとしては、例えばＨｉｎｄIII ，Ｅｃ
ｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＢａｍＨＩ等があげられるが、制限
エンドヌクレアーゼの操作を浅く、即ちＤＮＡ鎖の切断
が部分切断で止まるようにすれば多くの制限エンドヌク
レアーゼが本実験に使用できる。また２種類の制限エン
ドヌクレアーゼを併用することも可能である。ＤＮＡリ
ガーゼとしては、Ｔ₄ ファージ由来のＤＮＡリガーゼが
好適に用いられる。

【００１１】次に、上記のごとくして得た組換えＤＮＡ
を常法例えば〔Molec.Gen.Genet.,124 ,1〜10(1973)〕
に記載のカルシウム処理法によりＢＲ変異株（例えばエ
シェリヒア・コリＢＲ−４）に導入し、ビオチン無添加
の最少寒天培地で培養することにより生じたコロニーを
釣菌分離してビオチン生産能を有する菌株（即ちビオチ
ン生合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡが組み込まれた組
換えＤＮＡプラスミドを含有している菌株）を採取す
る。次いで、上記方法で得られた組換えＤＮＡプラスミ
ド含有菌株より組換えＤＮＡプラスミドを単離する。組
換えＤＮＡの単離は常法に従って行うことができる。例
えばNucleic acid research,７, 1513〜1523(1979)に記
載のアルカリ抽出法があげられる。

【００１２】このようにして得られた組換えＤＮＡにビ
オチン生合成酵素の遺伝情報を担うＤＮＡが含まれるこ
とは次のようにして確認することができる。即ち各ビオ
チン生合成酵素活性の欠損したエシェリヒア・コリＢＲ
変異株に本組換えＤＮＡを導入することによりビオチン
要求性が解除されることをもって確認するものである。
なお、組換えＤＮＡプラスミドを得る時に用いた制限エ
ンドヌクレアーゼの種類によっては、処理を完全に行っ
た時などは、ビオチン生合成酵素の遺伝情報の全ては含
まない即ち幾つかの遺伝情報が欠落する場合がある。こ
のような時は、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて
得られる幾種かの組換えプラスミドからの再構成を行
い、結果としてビオチン生合成酵素の全遺伝情報を組み
込んだ組換えＤＮＡプラスミドを得ることができる。

【００１３】上記のごとくして得た組換えＤＮＡを前記
のＤＲ変異株に導入すれば、組換えＤＮＡ含有ＤＲ変異
株を調整することができる。組換えＤＮＡ含有ＤＲ変異
株はベクターの持つ形質により、組換えＤＮＡを含有す
る菌のクローンを選択的に生育せしめる培地にて培養し
出現するコロニーとして取得することができる。かくし
て得られたＤＮＡ含有ＤＲ変異株すなわち本発明の新規
微生物の例としては、例えばエシェリヒア・コリＤＲ−
８５（微工研菌寄第８０９７号）があげられる。

【００１４】ビオチンの生産 上記の如くして取得した本発明の微生物を培養すれば培
養液中にビオチンを著量生成蓄積する。本発明に係る微
生物の培養に際して用いられる培地としては、炭素源、
窒素源、無機物を含有する合成培地、または天然培地の
いずれも使用可能である。炭素源としては、グルコー
ス、グリセリン、フラノトース、シュークロース、マル
トース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜など
の炭水化物が使用でき、その使用量は０．５〜５．０％
程度が好ましい。また窒素源としては、アンモニア、塩
化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の
無機および有機アンモニウム塩類あるいは肉エキス、酵
母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解
物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの天然有機窒素
源が使用可能であり、その使用量は０．５〜２．０％程
度が好ましい。

【００１５】天然有機窒素源の多くの場合は、窒素源で
あるとともに炭素源にもなりうる。さらに無機物として
は、燐酸第一水素カリウム、燐酸第二水素カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カ
ルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバ
ルト、モリブデン酸アンモン、硼酸などが使用でき、そ
の使用量は０．００５〜０．５％程度が好ましい。ま
た、造成された微生物に抗菌薬剤耐性が付与されている
場合には、該当する抗菌剤を培地に添加することによっ
て汚染菌の混入を防ぐことができる。

【００１６】培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養など
の好気的条件下で行うのが好ましい。培養温度は２５〜
３７℃が好適であり、培養中の培地のpHは中性付近に維
持することが望ましく、培養期間は通常１６〜４８時間
程度で充分である。培養を終了した後、培養液からのビ
オチンの抽出精製にあたっては、ビオチンの諸性質を利
用して一般の天然物からの抽出精製法が応用できる。す
なわち、培養物から菌体を除き活性炭に吸着させ、しか
るのち溶出させイオン交換樹脂で精製するか、あるいは
培養濾液を直接イオン交換樹脂で処理して精製し、水ま
たはアルコールより再結晶することによりビオチンを取
得することができる。

【００１７】

【実施例】次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるもので
はない。実施例１． （１）ＤＲ変異株の調整 ビオチン生合成酵素活性を有する野生株エシェリヒア・
コリＪＡ２２１をＬ−培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母
エキス５ｇ／ｌ、グルコース１ｇ／ｌ、塩化ナトリウム
５ｇ／ｌ、pH７．２に調整）中３７℃で３時間振盪培養
を行い、対数増殖期の菌体を集洗後、これをＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン１００μｇ／
mlを含有するＴＭ緩衝液（トリス−塩基０．６１％、マ
レイン酸０．５％、pH６．０に調整）に懸濁し、３７℃
３０分間静置し変異処理を行った。

【００１８】菌体を集洗後再懸濁液を、集洗された１０
⁵ cell／mlのＢＲ変異株エシェリヒア・コリＢＲ−４と
５０μｇ／mlの２，３，５−トリフェニルテトラゾリウ
ムクロリドを含む２０mlのビオチン無添加の最少培地寒
天平板（グルコース５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム４ｇ／
ｌ、燐酸第二水素カリウム２ｇ／ｌ、燐酸第一水素カリ
ウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ／
ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．０２ｇ／ｌ、ビタミンフ
リーのカザミノ酸４ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に１５ml
のビオチン無添加最少寒天培地を重層しておいた通常の
大きさのシャーレ上に出現するコロニーが約５０〜２０
０個となるように塗抹した。３７℃４８時間培養後、出
現した小コロニーの下層がピンク色のゾーンを呈した１
株を釣菌分離し、ビオチンによるフィードバック阻害が
解除されたＤＲ変異株エシェリヒア・コリＤＲ−８５
（微工研菌寄第８０９６号）を取得した。

【００１９】（２）染色体ＤＮＡの調整 上記のごとくして得たエシェリヒア・コリＤＲ−８５を
５００mlのＬ−培地中３７℃で３時間振盪培養を行い、
対数増殖期の菌体を集洗後、フェノール法による通常の
ＤＮＡ抽出法によって抽出精製し、２．１mgの染色体Ｄ
ＮＡを得た。

【００２０】（３）ベクターＤＮＡの調整 アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性を有する
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを次のように調整した。
まず、ｐＢＲ３２２をプラスミドとして保有するエシェ
リヒア・コリＫ−１２株の一種を、アンピシリン１５０
μｇ／ml添加したＬ−培地１０００ml中で３７℃で培養
し、対数増殖期に１５０μｇ／mlのクロラムフェニコー
ルを添加してさらに一夜培養した。この操作により細胞
内にプラスミドＤＮＡが多量に生産される。

【００２１】クロラムフェニコール添加後、１５時間目
に菌体を集洗し、リゾチウムおよびソジウムドデシルサ
ルフェートで溶菌させ、ついで３００００ｇで２時間遠
心分離して上清を得た。この上清液からプラスミドＤＮ
Ａを濃縮後、リボ核酸分解酵素で３７℃２時間処理し、
ついでセシウムクロリド−エチジウムブロミド平衡密度
勾配遠心法によって最終５２０μｇのｐＢＲ３２２プラ
スミドＤＮＡを分画採取した。

【００２２】（４）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿
入 （２）で得たＤＮＡ３μｇをとり、制限エンドヌクレア
ーゼｐｓｔＩを与え３０℃で３時間反応させた。また
（３）で調整したベクターＤＮＡ１．５μｇをｐｓｔＩ
で完全に切断した。両反応液を各々６５℃５分間の加熱
処理をした後、両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオ
スレイトール存在下、Ｔ₄ ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼによって１５℃１６時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行っ
た。

【００２３】全く同様の方法で染色体ＤＮＡ３μｇを２
つの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉを用い、同時に３７℃３時間反応させ６５℃５分間の
熱処理後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に切断し
たベクターＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼ反応を１５
℃１６時間行った。反応後は６５℃５分間の熱処理後、
反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応後のＤＮ
Ａを沈澱採取した。

【００２４】（５）ビオチン生合成酵素の遺伝情報を担
った組換えプラスミドによる形質転換 エシェリヒア・コリＪＡ２２１より変異誘導したビオチ
ン要求株エシェリヒア・コリＢＲ−４をＬ−培地１０ml
に接種し、３７℃で４時間振盪培養を行い対数増殖期中
期まで生育させた後集菌し、これを塩化カルシウム５０
mMを含むトリス緩衝液（５０mM、pH７．０）で２回洗浄
後、同じ緩衝液１mlに再懸濁させた。この懸濁液０．２
mlに（４）で得たそれぞれのＤＮＡ溶液を加え、０℃に
３０分保持した後、直ちに４２℃２分間のヒートショッ
クを与え、ＤＮＡを細胞内に取り込ませた。ついでそれ
ぞれの細胞懸濁液の一定量を新たなＬ−培地に摂取し、
３７℃２時間静置培養を行った。

【００２５】それぞれ菌体を集洗後、再懸濁液を最少培
地寒天平板（グルコース５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム４
ｇ／ｌ、燐酸第二水素カリウム２ｇ／ｌ、燐酸第一水素
カリウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１
ｇ／ｌ、ＤＬ−トリプトファン０．０２ｇ／ｌ、ビタミ
ンフリーのカザミノ酸４ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）に塗
抹し、３７℃２日間培養した。生じたコロニーを釣菌
し、その性質を調べたところ制限エンドヌクレアーゼｐ
ｓｔＩを用いて得られた形質転換株エシェリヒア・コリ
ＢＲ−４〔ｐＯＦＳ３〕はテトラサイクリン耐性、アン
ピシリン感受性であり、２つの制限エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて得られた形質転換
株エシェリヒア・コリＢＲ−４〔ｐＢＤＨ１７〕はアン
ピシリン耐性、テトラサイクリン感受性であった。

【００２６】（６）５つのビオチン生合成酵素全ての遺
伝情報を担うＤＮＡを組み込んだベクターの造成 （５）で得られた形質転換株エシェリヒア・コリＢＲ−
４〔ｐＯＦＳ３〕およびエシェリヒア・コリＢＲ−４
〔ｐＢＤＨ１７〕をそれぞれＬ−培地１００ml中で培養
し、（３）と同様にしてクロラムフェニコール処理を行
った。菌体を集洗後、アルカリ法（Nucleic Acids Rese
arch, ７, 1513〜1523, 1979) により、エシェリヒア・
コリＢＲ−４〔ｐＯＦＳ３〕から組換えプラスミドｐＯ
ＦＳ３を、エシェリヒア・コリＢＲ−４〔ｐＢＤＨ１
７〕から組換えプラスミドｐＢＤＨ１７を多量に得た。
これらの組換えプラスミドをJ.Bacteriol., 112 ,830〜
839, 1972 に記載のＢＲ変異株、Ｒ８７６株、Ｒ８７４
株、Ｒ８７３株、Ｒ８７７株、Ｒ８７５株、（それぞれ
ピメリルＣｏＡシンテターゼ、７−ケト−８−アミノペ
ラルゴン酸シンテターゼ、７，８−ジアミノペラルゴン
酸アミノトランスフェラーゼ、デスチオビオチンシンテ
ターゼ、およびデスチオビオチンからビオチンへの変換
に関与する酵素が欠損した株）へ（５）と同様の方法に
より形質転換して、ビオチン要求性が回復するかどうか
を調べた。結果を表１に示した。

【００２７】

【表１】

【００２８】組換えプラスミドｐＯＦＳ３にはデスチオ
ビオチンシンテターゼの遺伝情報の欠如、さらに組換え
プラスミドｐＢＤＨ１７には７，８−ジアミノペラルゴ
ン酸アミノトランスフェラーゼの遺伝情報の欠如が見ら
れた。そこで図１に示すごとく、組換えプラスミドｐＯ
ＦＳ３とｐＢＤＨ１７より、５つのビオチン生合成酵素
全ての遺伝情報を担う組換えプラスミドｐＴＭＲ２２の
造成を行った。

【００２９】組換えプラスミドｐＯＦＳ３とｐＢＤＨ１
７をそれぞれ２μｇとり、ｐＯＦＳ３は制限エンドヌク
レアーゼｐｓｔＩで、ｐＢＤＨ１７は２つの制限エンド
ヌクレアーゼＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩで完全に切断後、そ
れぞれアガロース電気泳動（アガロース１％、７０Ｖ）
にかけ、エチジウムブロミドで染色後、ｐＯＦＳ３から
約５．１kbのｐｓｔＩＤＮＡ断片を、ｐＢＤＨ１７から
は約１．０kbのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片を紫外
線照射下で切り出し、このゲルをそれぞれ透析チューブ
に入れて再度電気泳動を行いゲルよりＤＮＡを抽出し
た。抽出後フェノール処理で残存するアガロースを除去
した後、２倍容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱採取
した。

【００３０】得られた約５．１kbと約１．０kbのＤＮＡ
断片と、別に２つの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ
Ｉ，ＰｓｔＩで切断しアガロース電気泳動後同様の方法
でゲルから回収して得られた約３．６kbのｐＢＲ３２２
ベクターＤＮＡ断片とを混合し、Ｔ₄ ファージ由来のＤ
ＮＡリガーゼで連結反応を行った。次いで６５℃５分間
の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結
反応終了後のＤＮＡを沈澱採取した。

【００３１】得られた組換えプラスミドをＢＲ変異株エ
シェリヒア・コリＢＲ−４株に（５）と同様の方法で形
質転換し、ビオチン無添加の最少寒天培地上で生じたコ
ロニー即ちエシェリヒア・コリＢＲ−４〔ｐＴＭＲ２
２〕を釣菌し、その性質を調べたところ、テトラサイク
リン耐性、アンピシリン感受性であった。この形質転換
株エシェリヒア・コリＢＲ−４〔ｐＴＭＲ２２〕より前
述と同様のアルカリ法で組換えプラスミドを抽出し、得
られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２をさらに前述のビ
オチン生合成酵素の夫々が欠損したＢＲ変異株に（５）
と同様の方法により形質転換した。結果を表２に示し
た。

【００３２】

【表２】

【００３３】表２から明らかなように全てのＢＲ変異株
にビオチン要求性の回復が見られたことより、ここで造
成された組換えプラスミドｐＴＭＲ２２には５つのビオ
チン生合成酵素全ての遺伝情報を担うＤＮＡが含有され
ていることがわかる。

【００３４】（７）ビオチン生合成酵素の遺伝情報を担
う組換えプラスミドのエシェリヒア・コリＤＲ−８５へ
の形質転換 先に得られた組換えプラスミドｐＴＭＲ２２を（５）と
同様の方法でエシェリヒア・コリＤＲ−８５に形質転換
し、テトラサイクリン１０μｇ／mlを含むＬ−培地寒天
平板上で生じたコロニーを分離し、エシェリヒア・コリ
ＤＲ−８５〔ｐＴＭＲ２２〕（微工研菌寄第８０９７
号）を取得した。実施例２．

【００３５】

【表３】 上記組成の培地（pH７．０）に表３に示す菌株を接種
し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後、遠心
分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄積されたビオ
チン量をラクトバシリス・プランタラム（Ｌａｃｔｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ，ＡＴＣＣ８０１
４）による微生物定量法により行った。その結果を表４
に示した。

【００３６】

【表４】 実施例３．

【００３７】

【表５】 上記組成の培地（pH７．０）に表６に示す菌株を接種
し、３７℃で２０時間振盪培養した。培養終了後、遠心
分離により菌体を除去後、培養液に生成蓄積されたビオ
チン量を実施例２と同様の微生物定量法により行った。
その結果を表６に示した。

【００３８】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１の（６）に示す組換えプラスミ
ドｐＴＭＲ２２の造成方法を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂本 哲夫 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株式会社資生堂 研究所内 (72)発明者 柳 光男 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株式会社資生堂 研究所内

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のピメリルＣｏＡシンテター
   ゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンテターゼ、
   ７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
   ゼ、デスチオビオチンシンテターゼ、およびデスチオビ
   オチンからビオチンへの変換に関与する酵素の遺伝情報
   をそれぞれ担うデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のすべてを
   ベクターＤＮＡに組み込んだ組換えＤＮＡをビオチンに
   よるフィードバック阻害が解除されたエシェリヒア・コ
   リに含有せしめてなる微生物を、培地中で培養し、培養
   物からビオチンを採取することを特徴とするビオチンの
   製造法。
2. 【請求項２】 ベクターＤＮＡがｐＢＲ３２２プラスミ
   ドである特許請求の範囲第１項に記載の製造法。