JPH0112477B2 - - Google Patents
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- JPH0112477B2 JPH0112477B2 JP56018101A JP1810181A JPH0112477B2 JP H0112477 B2 JPH0112477 B2 JP H0112477B2 JP 56018101 A JP56018101 A JP 56018101A JP 1810181 A JP1810181 A JP 1810181A JP H0112477 B2 JPH0112477 B2 JP H0112477B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規プラスミドpCG1およびその製造
法に関する。遺伝子工学におけるプラスミドペク
ターの有用性は、遺伝子工学技法の開発された大
腸菌の宿主・ベクター系でよく知られている。遺
伝子工学におけるベクターの役割はレコンビナン
ト・モレスキユルス：インパクト・オン・サイエ
ンス・アンド・ソサイエテイ、マイルス・インタ
ーナシヨナル・シンポジウム・シリーズNo.10
（Recombinant Molecules：Inpact on Science
and Society、Miles International Synposium
SeriesNo.10、edited by R.F.Beers、and E.G.
Basset、Raven Press、New York）に明解に
概説されている。 一方、大腸菌以外の工業的に有用な微生物、例
えば、アミラーゼなどの生産菌である枯草菌、抗
生物質などの生産菌である放線菌および醸造用ア
ルコールの生産菌である酵母などでも組換え
DNA技法を確立しようとの試みがなされている。
組換えDNA技法の導入には、ベクターの取得が
必須であるため、これらの菌種ではプラスミドや
フアージの検策が行われてきた。 我々は、グルタミン酸・リジンなど多くの有用
物質の工業生産に用いられるコリネバクテリウ
ム・グルタミクムならびにそれに類縁の菌種で組
換えDNA技法を確立せんがために、これらの菌
種のベクターとなり得るプラスミドの検策を行な
つてきた。その結果、プラスミドpCG1をコリネ
バクテリウム・グルタミクム225−57から得るこ
とができ、本発明を完成した。 従来コリネバクテリウム属菌において本発明の
ごとき自律複製可能なプラスミドの存在は知られ
ておらず、プラスミドpCG1は本発明者らにより
はじめて見出されたものである。 以下本発明を詳細に説明する。 プラスミドpCG1は約２メガダルトンの分子量
であり、頻用される制限酵素数種に対し後記する
ごとき限定された切断部位を有する。このこと
は、ベクターとして最も重要な機能である自律複
製を損うことなく、所望の遺伝子をプラスミド中
に組み込むことを容易にし、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムおよびその近縁菌種におけるク
ローン化ベクターとして極めて有用であるととも
に、組換えDNA研究用の試薬としても有用であ
ることを示している。 プラスミドpCG1は、新たに土壌から分離され
た菌株225−57から得られる。225−57株の菌学的
性状は下記の通りである。菌学的性質の検討は
“Manual of Microbiological Methods”by the
Society of American Bacteriologist
Committee on Bacteriological Technique
（1957）に記載された方法で行つた。 細胞形態 通常0.7〜1.0×1.0〜3.0ミクロンの楕円或い
は短桿状であるが、培養条件により、複数の細
胞が直鎖状或いはＶ字型に連鎖したような多形
性を示す。グラム陽性、非運動性で胞子をつく
らない。 富栄養培地での生育特性 寒天培地上での単集落は円状で表面は光沢が
なく粗く、色は淡黄色である。スラント上での
生育は同じく淡黄色で不透明である。寒天培地
の穿刺培養では最上部で良く生育し深部では弱
く生育する。液体培養ではわずかに生育し若干
綿状に沈降する。 生理的性質 (1)温度：至適温度は25〜37℃だが、42℃でか
すかに生育する、(2)PH：至適PH７−８だが、PH
６−９でも生育可能である、(3)非熱耐性、(4)好
気性、(5)ゼラチンを液化しない、(6)カゼインを
分解代謝しない、(7)インドール非産性、(8)カタ
ラーゼ陽性、(9)殿粉非同化性、(10)グルコース、
フラクトース、マンノース、マルトースから酸
を生成するが、キシロース、ガラクトース、ラ
クトース及びグリセロースからは酸を生成しな
い、(11)ビオチン要求性、(12)ビオチン量制限培地
では多量のグルタミン酸を産生する、（13）高
濃度ビオチン含有培地では乳酸およびα−ケト
グルタール酸を産生する。以上の結果は、J.
Gen.Appl.Microbiol.、73279−301（1967）に記
載された細菌群と比較すると、単集落の表面性
にわずかな相違点は認められるが、その他の性
状はコリネバクテリウム・グルタミクムに極め
てよく一致している。それ故、225−57株をコ
リネバクテリウム・グルタミクムと同定した。
なお、本菌株は微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、その受託番号は5865である。さらに米国ア
メリカンタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに
ATCCNo.31808として寄託されている。 コリネバクテリウム・グルタミクム225−57の
菌体中からプラスミドpCG1を抽出するためには、
まず培養細胞を溶菌しなければならないが、一般
にコリネバクテリウム属菌種およびその類縁菌種
の単に培養した細胞は細菌細胞壁溶解酵素卵白リ
ゾチームに非感受性であるので、培養細胞は卵白
リゾチームに感受性にしてから用いるとよい。コ
リネバクテリウム・グルタミクム225−57をリゾ
チーム感受性にするには、コリネバクテリウム・
グルタミクムの近縁菌であるプレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタム（特開昭54−28896）
あるいはコリネバクテリウム・グルタミクムと同
様にグラム陽性でもともと卵白リゾチーム非感受
性のストレプトコツカス・フエカリス〔Can.J.
Microbiol.、７、363−373（1961）〕に施される公
知の方法を適用することができる。すなわち、細
胞培養の対数増殖期の中途で、生育を抑制しない
かあるいは半抑制する濃度（通常培養液中0.1〜
10U／mlとなる濃度）のペニシリンを添加し、さ
らに数世代増殖させることによつて目的が達せら
れる。その際用いる培地および培養方法は、一般
にコリネバクテリウム・グルタミクムおよびその
近縁菌種の培養に用いられる液体培地およびその
培養方法が適用できる。このようにペニシリン処
理したコリネバクテリウム・グルタミクム225−
57の培養細胞は、リゾチームにより容易に細胞壁
が溶解される。溶菌物からは、例えばBiochim.
Biophys.Acta、383、457−463（1975）に記載さ
れたような通常用いられる方法により、プラスミ
ドpCG1を容易に濃縮分離できる。 プラスミドpCG1の特徴 (1) プラスミドpCG1は、分子量約２メガダルト
ンのデオキシリポ核酸（DNA）である。 (2) プラスミドpCG1は下記制限酵素に対し、次
の切断感受性を有する。 酵 素※ 切断部位数 EcoR １ Hind ２ Hinc ２ BamH ０ Pst ０ Sal ０ Kpn ０ ※制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限
酵素の略称である。 EcoR1：エシエリヒア・コリ Hind：ヘモフイラス・インフルエンザ BamH：バチルス・アミロリクエフアシエン
ス Pst：プロピデンシア・スチユアーテイー Sal：ストレプトマイセス・アルプス Kpn：クレブシエラ・ニユーモニエ Hinc：ヘモフイラス・インフルエンザ 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素
存在下でプラスミドpCG1を完全消化し、それら
の消化物を0.8％のアガロースゲル電気泳動にか
け、分離可能な断片の数から決定される。分子量
は、大腸菌のラムダフアージのDNAをHindで
消化して得られる分子量既知の断片〔J.Mol.
Biol.、98、551−564（1975）〕の同一アガロース
ゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
消化プラスミドpCG1の各断片の分子量を算出し、
複数の断片を生じる場合は加算して求められる。 プラスミドpCG1の有用性は、アミノ酸、核酸
など有用物質の生産に用いられる、コリネバクテ
リウム・グルタミクムおよびその近縁菌種などの
工業上重要な微生物中で自律複製し得る機能にあ
り、これらの微生物を宿主とするクローン化ペク
ターとなり得る。従つて、コリネバクテリウム・
グルタミクムおよびその近縁菌種あるいはその他
の微生物から、アミノ酸・核酸などの有用物質の
生合成あるいはその調節に関与する遺伝子を取り
出し周知の試験管内DNA組換え技術で、コリネ
バクテリウムやその近縁菌種にクローン化するこ
とを可能ならしめ、ひいては、クローン化された
遺伝情報の増巾に基づく生合成系の強化により有
用物質の生産量を増大せしめる手段を提供するこ
とが可能である。 プラスミドpCG1の自律複製を可能ならしめる
機能は、一般のプラスミドと同様にプラスミド
pCG1の一部分に担われていることが容易に類推
されるので、例えばプラスミドpCG1の一領域を
欠失したりあるいは別のDNAを挿入付加したよ
うなプラスミド誘導体も同様な機能を有するはず
である。それゆえ、プラスミドpCG1の有用性は、
そのものに限定されるものではなく、それにより
修飾して得られるDNAにも適用されべきことは
言うまでもない。 以下に実施例を示す。 実施例 １ (1) コリネバクテリウム・グルタミクム225−57
の培養細胞からのプラスミドpCG1の分離 コリネバクテリウム・グルタミクム225−57
をNB培地（粉末ブイヨン20ｇ、酵母エキス５
ｇを純水１に含み、PH7.2に調整した培地）
で、30℃、18時間振盪培養し、その種培養５ml
を400ml半合成培地〔グルコース20ｇ、
（NH4）2SO410ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、
KH2PO41ｇ、MgCl2・6H2O0.4ｇ、FeSO4・
7H2O10mg、MnSO4・４〜6H2O0.2mg、
ZnSO4・7H2O0.9mg、CuSO4・5H2O0.4mg、
Na2B4O7・10H2O0.09mg、（NH4）6Mo7O24・
4H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミン塩酸
塩１mgを純水１に含み、PH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養する。東京光電
比色計で660nｍにおける吸光度（OD）を測定
し、OD＝0.2になつた時点で、培養液中0.5単
位／mlの濃度になるようにペニシリンＧを添加
する。さらに30℃で培養を継続し、OD約0.6に
なるまで生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液
〔0.03Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（トリス）、0.005MEDTA、0.05M
NaCl：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液（25％
シヨ糖、0.1MNaCl、0.05Mトリス、0.8mg／ml
リゾチーム：PH8.0）で20mlに懸濁し、37℃で
４時間反応させる。反応液に、5MNaCl2.4ml、
0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml、４％ラウリル硫酸
ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4mlを
順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に15
時間置く。溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で
60分間、69400×ｇの遠心にかけ上澄液をとる。
これに重量百分率10％相当のポリエチレングリ
コール6000を加え、静かに混和して溶解後、氷
水中に置く。16時間後、1500×ｇで10分間遠心
してペレツトを回収する。TES緩衝液５mlを
加えて、ペレツトを静かに再溶解してから1.5
mg／mlエチジウムブロマイド2.0mlを添加し、
これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密
度を1.580に合わせる。この溶液を105000×ｇ、
180℃で48時間遠心する。この密度勾配遠心に
より、共有結合で閉じられた環状のDNAは紫
外線ランプを照射することによつて遠心チユー
ブ中下方の密度の高いバンドとして見出され
る。このバンドを注射筒で遠心チユーブの側面
から抜きとることによつてプラスミドpCG1が
分離される。次いで分画液を等容量のイソプロ
ピルアルコール液〔容量百分率90％イソプロピ
ルアルコール、10％TES緩衝液（この混液中
に飽和容解量の塩化セシウムを含む）〕で５回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、
しかる後に、TES緩衝液に対して透析する。 このようにして得られるプラスミドpCG1を
含む透析液１mlに２mlのエタノールを加え、析
出する沈殿を取して−20℃で真空乾燥を行い
50μｇのプラスミドpCG1を得る。 (2) プラスミドpCG1の各種制限酵素による切断
特異性および分子量。 前記で調製したプラスミドpCG10.5μｇを10μ
のTES緩衝液（PH8.0）に溶かし、２倍過剰
量の制限酵素（EcoR、Hind、BamH、
Pst、SalおよびHincは宝酒造社製のも
の、Kpnはベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ース社製のものを使つた）を各々の制限酵素の
適正条件にて反応させた。消化した試料は、常
法に従い、エチジウムブロマイド0.6μｇ／mlを
含有する水平型0.8％アガロースゲルに供給し、
巾１cm当り7Vの一定付加電圧で３〜４時間泳
動を行つた。紫外線ランプをゲル平板上に照射
して生成断片の数を判定し、各断片の泳動距離
から各々の分子量を算出し、それらを加算して
プラスミドpCG1の分子量を求めた。なお、分
子量は、同一アガロースゲル上で同時に泳動し
たランダフアージDNAのHind消化で生成す
る分子量既知の各断片の泳動距離で描かれる標
準線に基づいて算定した。結果を下表に示す。 【表】
法に関する。遺伝子工学におけるプラスミドペク
ターの有用性は、遺伝子工学技法の開発された大
腸菌の宿主・ベクター系でよく知られている。遺
伝子工学におけるベクターの役割はレコンビナン
ト・モレスキユルス：インパクト・オン・サイエ
ンス・アンド・ソサイエテイ、マイルス・インタ
ーナシヨナル・シンポジウム・シリーズNo.10
（Recombinant Molecules：Inpact on Science
and Society、Miles International Synposium
SeriesNo.10、edited by R.F.Beers、and E.G.
Basset、Raven Press、New York）に明解に
概説されている。 一方、大腸菌以外の工業的に有用な微生物、例
えば、アミラーゼなどの生産菌である枯草菌、抗
生物質などの生産菌である放線菌および醸造用ア
ルコールの生産菌である酵母などでも組換え
DNA技法を確立しようとの試みがなされている。
組換えDNA技法の導入には、ベクターの取得が
必須であるため、これらの菌種ではプラスミドや
フアージの検策が行われてきた。 我々は、グルタミン酸・リジンなど多くの有用
物質の工業生産に用いられるコリネバクテリウ
ム・グルタミクムならびにそれに類縁の菌種で組
換えDNA技法を確立せんがために、これらの菌
種のベクターとなり得るプラスミドの検策を行な
つてきた。その結果、プラスミドpCG1をコリネ
バクテリウム・グルタミクム225−57から得るこ
とができ、本発明を完成した。 従来コリネバクテリウム属菌において本発明の
ごとき自律複製可能なプラスミドの存在は知られ
ておらず、プラスミドpCG1は本発明者らにより
はじめて見出されたものである。 以下本発明を詳細に説明する。 プラスミドpCG1は約２メガダルトンの分子量
であり、頻用される制限酵素数種に対し後記する
ごとき限定された切断部位を有する。このこと
は、ベクターとして最も重要な機能である自律複
製を損うことなく、所望の遺伝子をプラスミド中
に組み込むことを容易にし、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムおよびその近縁菌種におけるク
ローン化ベクターとして極めて有用であるととも
に、組換えDNA研究用の試薬としても有用であ
ることを示している。 プラスミドpCG1は、新たに土壌から分離され
た菌株225−57から得られる。225−57株の菌学的
性状は下記の通りである。菌学的性質の検討は
“Manual of Microbiological Methods”by the
Society of American Bacteriologist
Committee on Bacteriological Technique
（1957）に記載された方法で行つた。 細胞形態 通常0.7〜1.0×1.0〜3.0ミクロンの楕円或い
は短桿状であるが、培養条件により、複数の細
胞が直鎖状或いはＶ字型に連鎖したような多形
性を示す。グラム陽性、非運動性で胞子をつく
らない。 富栄養培地での生育特性 寒天培地上での単集落は円状で表面は光沢が
なく粗く、色は淡黄色である。スラント上での
生育は同じく淡黄色で不透明である。寒天培地
の穿刺培養では最上部で良く生育し深部では弱
く生育する。液体培養ではわずかに生育し若干
綿状に沈降する。 生理的性質 (1)温度：至適温度は25〜37℃だが、42℃でか
すかに生育する、(2)PH：至適PH７−８だが、PH
６−９でも生育可能である、(3)非熱耐性、(4)好
気性、(5)ゼラチンを液化しない、(6)カゼインを
分解代謝しない、(7)インドール非産性、(8)カタ
ラーゼ陽性、(9)殿粉非同化性、(10)グルコース、
フラクトース、マンノース、マルトースから酸
を生成するが、キシロース、ガラクトース、ラ
クトース及びグリセロースからは酸を生成しな
い、(11)ビオチン要求性、(12)ビオチン量制限培地
では多量のグルタミン酸を産生する、（13）高
濃度ビオチン含有培地では乳酸およびα−ケト
グルタール酸を産生する。以上の結果は、J.
Gen.Appl.Microbiol.、73279−301（1967）に記
載された細菌群と比較すると、単集落の表面性
にわずかな相違点は認められるが、その他の性
状はコリネバクテリウム・グルタミクムに極め
てよく一致している。それ故、225−57株をコ
リネバクテリウム・グルタミクムと同定した。
なお、本菌株は微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、その受託番号は5865である。さらに米国ア
メリカンタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに
ATCCNo.31808として寄託されている。 コリネバクテリウム・グルタミクム225−57の
菌体中からプラスミドpCG1を抽出するためには、
まず培養細胞を溶菌しなければならないが、一般
にコリネバクテリウム属菌種およびその類縁菌種
の単に培養した細胞は細菌細胞壁溶解酵素卵白リ
ゾチームに非感受性であるので、培養細胞は卵白
リゾチームに感受性にしてから用いるとよい。コ
リネバクテリウム・グルタミクム225−57をリゾ
チーム感受性にするには、コリネバクテリウム・
グルタミクムの近縁菌であるプレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタム（特開昭54−28896）
あるいはコリネバクテリウム・グルタミクムと同
様にグラム陽性でもともと卵白リゾチーム非感受
性のストレプトコツカス・フエカリス〔Can.J.
Microbiol.、７、363−373（1961）〕に施される公
知の方法を適用することができる。すなわち、細
胞培養の対数増殖期の中途で、生育を抑制しない
かあるいは半抑制する濃度（通常培養液中0.1〜
10U／mlとなる濃度）のペニシリンを添加し、さ
らに数世代増殖させることによつて目的が達せら
れる。その際用いる培地および培養方法は、一般
にコリネバクテリウム・グルタミクムおよびその
近縁菌種の培養に用いられる液体培地およびその
培養方法が適用できる。このようにペニシリン処
理したコリネバクテリウム・グルタミクム225−
57の培養細胞は、リゾチームにより容易に細胞壁
が溶解される。溶菌物からは、例えばBiochim.
Biophys.Acta、383、457−463（1975）に記載さ
れたような通常用いられる方法により、プラスミ
ドpCG1を容易に濃縮分離できる。 プラスミドpCG1の特徴 (1) プラスミドpCG1は、分子量約２メガダルト
ンのデオキシリポ核酸（DNA）である。 (2) プラスミドpCG1は下記制限酵素に対し、次
の切断感受性を有する。 酵 素※ 切断部位数 EcoR １ Hind ２ Hinc ２ BamH ０ Pst ０ Sal ０ Kpn ０ ※制限酵素の名称は次の菌種から得られる制限
酵素の略称である。 EcoR1：エシエリヒア・コリ Hind：ヘモフイラス・インフルエンザ BamH：バチルス・アミロリクエフアシエン
ス Pst：プロピデンシア・スチユアーテイー Sal：ストレプトマイセス・アルプス Kpn：クレブシエラ・ニユーモニエ Hinc：ヘモフイラス・インフルエンザ 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素
存在下でプラスミドpCG1を完全消化し、それら
の消化物を0.8％のアガロースゲル電気泳動にか
け、分離可能な断片の数から決定される。分子量
は、大腸菌のラムダフアージのDNAをHindで
消化して得られる分子量既知の断片〔J.Mol.
Biol.、98、551−564（1975）〕の同一アガロース
ゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
消化プラスミドpCG1の各断片の分子量を算出し、
複数の断片を生じる場合は加算して求められる。 プラスミドpCG1の有用性は、アミノ酸、核酸
など有用物質の生産に用いられる、コリネバクテ
リウム・グルタミクムおよびその近縁菌種などの
工業上重要な微生物中で自律複製し得る機能にあ
り、これらの微生物を宿主とするクローン化ペク
ターとなり得る。従つて、コリネバクテリウム・
グルタミクムおよびその近縁菌種あるいはその他
の微生物から、アミノ酸・核酸などの有用物質の
生合成あるいはその調節に関与する遺伝子を取り
出し周知の試験管内DNA組換え技術で、コリネ
バクテリウムやその近縁菌種にクローン化するこ
とを可能ならしめ、ひいては、クローン化された
遺伝情報の増巾に基づく生合成系の強化により有
用物質の生産量を増大せしめる手段を提供するこ
とが可能である。 プラスミドpCG1の自律複製を可能ならしめる
機能は、一般のプラスミドと同様にプラスミド
pCG1の一部分に担われていることが容易に類推
されるので、例えばプラスミドpCG1の一領域を
欠失したりあるいは別のDNAを挿入付加したよ
うなプラスミド誘導体も同様な機能を有するはず
である。それゆえ、プラスミドpCG1の有用性は、
そのものに限定されるものではなく、それにより
修飾して得られるDNAにも適用されべきことは
言うまでもない。 以下に実施例を示す。 実施例 １ (1) コリネバクテリウム・グルタミクム225−57
の培養細胞からのプラスミドpCG1の分離 コリネバクテリウム・グルタミクム225−57
をNB培地（粉末ブイヨン20ｇ、酵母エキス５
ｇを純水１に含み、PH7.2に調整した培地）
で、30℃、18時間振盪培養し、その種培養５ml
を400ml半合成培地〔グルコース20ｇ、
（NH4）2SO410ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、
KH2PO41ｇ、MgCl2・6H2O0.4ｇ、FeSO4・
7H2O10mg、MnSO4・４〜6H2O0.2mg、
ZnSO4・7H2O0.9mg、CuSO4・5H2O0.4mg、
Na2B4O7・10H2O0.09mg、（NH4）6Mo7O24・
4H2O0.04mg、ビオチン30μｇ、サイアミン塩酸
塩１mgを純水１に含み、PH7.2に調整した培
地〕に接種して30℃で振盪培養する。東京光電
比色計で660nｍにおける吸光度（OD）を測定
し、OD＝0.2になつた時点で、培養液中0.5単
位／mlの濃度になるようにペニシリンＧを添加
する。さらに30℃で培養を継続し、OD約0.6に
なるまで生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液
〔0.03Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（トリス）、0.005MEDTA、0.05M
NaCl：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液（25％
シヨ糖、0.1MNaCl、0.05Mトリス、0.8mg／ml
リゾチーム：PH8.0）で20mlに懸濁し、37℃で
４時間反応させる。反応液に、5MNaCl2.4ml、
0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml、４％ラウリル硫酸
ナトリウムと0.7M NaClからなる溶液4.4mlを
順次添加し、緩やかに混和してから氷水中に15
時間置く。溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で
60分間、69400×ｇの遠心にかけ上澄液をとる。
これに重量百分率10％相当のポリエチレングリ
コール6000を加え、静かに混和して溶解後、氷
水中に置く。16時間後、1500×ｇで10分間遠心
してペレツトを回収する。TES緩衝液５mlを
加えて、ペレツトを静かに再溶解してから1.5
mg／mlエチジウムブロマイド2.0mlを添加し、
これに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密
度を1.580に合わせる。この溶液を105000×ｇ、
180℃で48時間遠心する。この密度勾配遠心に
より、共有結合で閉じられた環状のDNAは紫
外線ランプを照射することによつて遠心チユー
ブ中下方の密度の高いバンドとして見出され
る。このバンドを注射筒で遠心チユーブの側面
から抜きとることによつてプラスミドpCG1が
分離される。次いで分画液を等容量のイソプロ
ピルアルコール液〔容量百分率90％イソプロピ
ルアルコール、10％TES緩衝液（この混液中
に飽和容解量の塩化セシウムを含む）〕で５回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、
しかる後に、TES緩衝液に対して透析する。 このようにして得られるプラスミドpCG1を
含む透析液１mlに２mlのエタノールを加え、析
出する沈殿を取して−20℃で真空乾燥を行い
50μｇのプラスミドpCG1を得る。 (2) プラスミドpCG1の各種制限酵素による切断
特異性および分子量。 前記で調製したプラスミドpCG10.5μｇを10μ
のTES緩衝液（PH8.0）に溶かし、２倍過剰
量の制限酵素（EcoR、Hind、BamH、
Pst、SalおよびHincは宝酒造社製のも
の、Kpnはベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ース社製のものを使つた）を各々の制限酵素の
適正条件にて反応させた。消化した試料は、常
法に従い、エチジウムブロマイド0.6μｇ／mlを
含有する水平型0.8％アガロースゲルに供給し、
巾１cm当り7Vの一定付加電圧で３〜４時間泳
動を行つた。紫外線ランプをゲル平板上に照射
して生成断片の数を判定し、各断片の泳動距離
から各々の分子量を算出し、それらを加算して
プラスミドpCG1の分子量を求めた。なお、分
子量は、同一アガロースゲル上で同時に泳動し
たランダフアージDNAのHind消化で生成す
る分子量既知の各断片の泳動距離で描かれる標
準線に基づいて算定した。結果を下表に示す。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約２メガダルトンの分子量を有し、制限酵素
BamHI、PstI、SalI、KpnIによつて切断され
ず、図に示される制限酵素切断地図で特徴づけら
れるコリネバクテリウム属に属する微生物由来の
プラスミドpCG1。 （△印は、隣接した位置での２酵素の切断部位を
示す）
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Family Cites Families (5)
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|---|---|---|---|---|
| US3003925A (en) * | 1956-05-17 | 1961-10-10 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of producing l-glutamic acid by fermentation |
| US3002889A (en) * | 1960-06-20 | 1961-10-03 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Method of producing l-glutamic acid |
| US3220929A (en) * | 1964-02-10 | 1965-11-30 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Microbiological production of amino acid by reductive amination |
| AU542264B2 (en) * | 1979-06-01 | 1985-02-14 | G.D. Searle & Co. | Plasmid vectors |
| JPS57183799A (en) * | 1981-04-17 | 1982-11-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel plasmid |
-
1981
- 1981-02-12 JP JP56018101A patent/JPS57134500A/ja active Granted
-
1982
- 1982-02-10 CA CA000395976A patent/CA1196588A/en not_active Expired
- 1982-02-11 DE DE198282101018T patent/DE58889T1/de active Pending
- 1982-02-11 DE DE8282101018T patent/DE3274561D1/de not_active Expired
- 1982-02-11 EP EP82101018A patent/EP0058889B1/en not_active Expired
-
1984
- 1984-01-25 US US06/573,591 patent/US4617267A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57134500A (en) | 1982-08-19 |
| EP0058889B1 (en) | 1986-12-03 |
| US4617267A (en) | 1986-10-14 |
| CA1196588A (en) | 1985-11-12 |
| DE3274561D1 (en) | 1987-01-15 |
| EP0058889A1 (en) | 1982-09-01 |
| DE58889T1 (de) | 1983-04-14 |
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