JPH0220237B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、グルタミン酸生産性コリネ型細菌
より分離された新規プラスミドpAG3およびその
誘導体、該プラスミドを製造する方法並びに該プ
ラスミドを含有する微生物に関する。グルタミン
酸生産性コリネ型細菌は、大量にＬ−グルタミン
酸を生産することが知られており、またその変異
株は、Ｌ−リジン等のアミノ酸、イノシン酸等の
プリンヌクレオチドを生産することが知られてい
る。

従来の技術 グルタミン酸生産性コリネ型細菌は、産業上極
めて有用な菌類であり、他の産業上有用な微生物
と同様にこの菌種についても、DNA組換え技術
による育種、改良が試みられている。一方、この
DNA組換え技術による育種、改良をおこなうた
めには、この菌種を宿主とするに適したベクター
の取得が必須であり、プラスミドやフアージの検
策がおこなわれている。

現在までに、プラスミドpCG1（特開昭57−
134500）、プラスミドpCG2（特開昭58−35197）、
プラスミドpCG4（特開昭57−183799）プラスミド
pAM286、プラスミドpAM330（特開昭58−
67699）、プラスミドpHM1519（特開昭58−77895）
等のグルタミン酸生産性コリネ型細菌のプラスミ
ドから知られている。

発明が解決しようとする問題点 グルタミン酸生産性コリネ型細菌を宿主とする
より良いベクタープラスミドの作成を行う為に
は、より多くの同菌種のプラスミドを取得し、そ
の中からベクタープラスミドに適した、またはベ
クタープラスミドに加工するに適したプラスミド
を選択する必要がある。しかし現在までには、前
記のプラスミドしか発見されておらず、グルタミ
ン酸生産性コリネ型細菌の新たなプラスミドの発
見及び単離が望まれていた。

問題を解決する為の手段および作用 本発明者らは、グルタミン酸生産性コリネ型細
菌のプラスミドを検策した結果、ベクタープラス
ミドとして用いるのに適したまたはベクタープラ
スミドに加工するのに適したプラスミドpAG3
を、コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecora）22220（微工研
条第559号）から得ることができ、本発明を完成
した。

プラスミドpAG3は、約4.8キロベースの分子量
があり、頻用される制限酵素に対して、後記する
ごとき限定された切断部分を有する。プラスミド
pAG3は、新らたに土壤から単離した菌株22220
から得られた。22220株の菌学的性質は下記の通
りである。

(1) 顕微鏡による所見 通常0.5−1.0×0.8−2.0ミクロンの桿菌で大
小不同のものを含む。スナツピングデイビジヨ
ンによるＶ字状配列と多形性を示す。グラム陽
性、非運動性で、胞子をつくらない。

(2) 培養による所見 ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはつき
りした正円形で、不透明でやや光沢がある。

色は黄色である。寒天斜面上では、接種線に
沿つて線状に旺盛な生育を示し、臭気や培地の
着色はない。寒天穿刺培養では、最上部で旺盛
な生育を示す。液体ブイヨン培地では、均質に
濁り、表面にリングを形成する。

(3) 生理的性質 ａ 温度：25℃−37℃で生育する。

ｂ PH：PH６−PH９で生育可能である。

ｃ 耐熱性：10％スキムミルク中、55℃前後で
15分程度の耐熱性を有する。

ｄ 好気性である。

ｅ ゼラチンを液化しない。

ｆ リトマスミルクを変化させない。

ｇ インドールを生産しない。

ｈ フオーゲス・プロスカウエル試験（Voges
−Proskauer test）に陰性。

ｉ 硫化水素を生成しない。

ｊ メチルレツド試験に陽性。

ｋ 硝酸塩を還元する。

ｌ クエン酸を利用しない。

ｍ デンプンを液化しない。

ｎ ウレアーゼ生成：陽性。

ｏ カタラーゼの生成：陽性。

ｐ 各種炭素水化物からの酸の生成。

グルコース、フラクトース、シユークロー
ス、マルトース、マンノースより酸を生成す
るが、マンニトール、キシロース、アラビノ
ース、ラフイノース、ラクトースからは酸を
生成しない。

ｑ ビチオンを要求する。

ｒ ビチオン制御培地で、または高濃度ビオチ
ン含有培地では界面活性剤により、培地中に
Ｌ−グルタミン酸を著量蓄積する。

上記の菌学的性質を有する22220株についてそ
の分類学上の位置を、バージーズ、マニユアル・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology Eighth Edition）および登録番号
576690の特許を参照し更にコリネバクテリウム・
メラセコラ ATCC 17965
（Corynebacterinmmelasseola ATCC 17965）
をタイプカルチヤーとして比較検討した結果、
22220株はコリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacteriummelassecola）に極めてよく
一致していた。それ故、22220株をコリネバクテ
リウ・メラセコラ（Corynebacterium
melassecla）と同定した。尚、コリネバクテリ
ウム・メラセコラ 22220（Corynebacterium
melassecola 22220）は、微生物工業技術研究所
に微工研条寄第559号として寄託されている。

プラスミドpAG3は、菌体のリゾチウム・SDS
処理、同溶菌液のフエノール・クロロホルム処
理、同処理液のエタノール沈澱処理・同沈澱物質
のエチジウムブロマイドを含む塩化セシウム平衡
密度勾配遠心により、容易に分離精製できる。
（T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.Sanbrook：
Molecular Cloning Ａ Laboratory Manual、
Cold Spring Harbor Laborotory Cold Spring
Harbor N.Y.1982） プラスミドpAG3の特徴 (1) プラスミドpAG3は、分子量約4.8キロベース
のデオキシリボ核酸（DNA）である。

(2) プラスミドpAG3は、下記制限酵素に対し、
次の切断感受性を有する。

酵素＊ 切断部位数 Hind １ PstI １ BamHI １ XbaI １ ＊ 制限酵素の各称は、次の菌種から得られる
制限酵素の略称である。

Hind：ヘモフイラス・インフルエンザ
Rd（Haemophilus influenzae Rd） PstI：プロビデンシア・スチユアーテイ
ー 164（Providencia stuartii164） BamHI：バチルス・アミロリクエフアシエ
ンス Ｈ（Bacillus amyloliquefaciens Ｈ） Xbal：キサントモナス・バドリ
（Xanthomonas badrii） 制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素
存在下でプラスミドpAG3を完全消化し、それら
の消化物を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、
分離可能な断片の数から決定される。

分子量は、アガロースゲルの場合には大腸菌の
ラムダフアージ（λphage）のDNAを制限酵素
Hindで消化して得られる分子量既知の断片
（分子量の大きい順に23130、9419、6557、4371、
2322、2028、564、125 塩基対の大きさを有す
る）の同一アガロースゲル上での泳動距離で描か
れる標準線に基づき、消化プラスミドpAG3の分
子量を算出する。

プラスミドpAG3に対する前記制限酵素の相対
的な切断部位は、複数の制限酵素で完全消化し、
生じたDNA断片をアガロースゲル電気泳動で解
析することにより求めることができる。こうして
得られたプラスミドpAG3の制限酵素地図を第１
図に示す。

プラスミドpAG3の自律複製の機能は、一般の
プラスミドと同様に、プラスミドpAG3の一部に
担われている。従つてプラスミドpAG3の一部領
域を欠失したり、あるいは別のDNAを挿入付加
したようなプラスミド誘導体も同様な機能を有し
ている。それ故、プラスミドpAG3の有用性は、
そのものだけでなく、それより修飾して得られる
DNAにも備わつている。

実施例 (1) コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22220（微工
研条寄第559号）菌体からのプラスミドpAG3
の単離。

コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）22220（微工
研条第559号）を半合成培地〔（NH₄）₂SO₄10
ｇ、尿素３ｇ、K₂HPO₄1ｇ、NaCl50mg、
MgSO₄・7H₂O400mg、MnSO₄・４−6H₂O2
mg、FeSO₄・４−6H₂O2mg、グルコース20ｇ、
ビオチン50μｇ、チアミン塩酸塩200μｇ、酵母
エキス１ｇを純水に溶かして１とし、PH7.2
に調整した培地〕で、32℃、１晩振盪培養を行
い、その種培養８mlを200mlの前記半合成培地
に植菌して、32℃で５時間振盪培養した。

培養液から菌体を集菌し、リゾチウム液〔グ
ルコース50ｍＭ、EDTA10ｍＭ、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン25ｍＭ、リゾチ
ウム10mg／ml、PH8.0〕10mlに懸濁し、42℃で
１時間反応させた。本反応液にアルカリSDS
（Sodium Dodecylsulfata）液（NaOH0.2N
SDS1％）20mlを添加撹拌の後、氷中に５分間
置いた。次に本反応液に氷冷した酢酸カリウム
溶液（5M酢酸カリウム溶液60ml、酢酸11.5ml、
純水28.5mlの混合液）15mlを添加撹拌の後氷中
に10分間置いた。溶菌物の全量を遠心管に移
し、４℃、５分間、12000rpm（13000ｇ）の遠
心分離にかけ上澄液を回収した。これを等量の
フエノール・クロロホルム液（１：１）で抽出
して水層を回収した。これに２培量のエタノー
を添加撹拌して５分間室温に置き、20℃、10分
間、10000rpm（11000ｇ）の遠心分離により、
ペレツトを回収した。このペレツトを70％エタ
ノール水溶液で洗浄の後減圧乾燥して、ふたた
びTE緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン10ｍＭ、EDTA1ｍＭ、PH7.5〕20ml
で溶解した。この液に10mg／mlエチジウムブロ
マイド溶液1.2mlと塩化セシウム23.6ｇを加え
て静かに溶解し、40000rpm（100000ｇ）、15℃
で48時間遠心分離した。プラスミドpAG3は、
紫外線照射により遠心チユーブ中で２本のバン
ド下方として見い出された。このバンドを遠心
チユーブの側面から注射器で抜きとることによ
り、プラスミドpAG3は単離された。つづいて
分画液を等容量のイソプロピルアルコールで４
回抽出してエチジウムブロマイドを除去し、そ
の後にTE緩衝液に対して透析を行つて、DNA
濃度50μｇ／mlのプラスミドpAG3の透析液１
mlを得た。

(2) プラスミドpAG3の制限酵素地図と分子量 実施例１の(1)で調整したプラスミドpAG3の
透析液10μ（プラスミドpAG3のDNA0.5μｇ）
に各々10単位の制限酵素（Hind、PstI、
BamHIはニツポンジ−ン社製、XbaIはベゼス
ダリサーチ・ラボラトリー社製）１種又は２種
以上の組合せを各々の制限酵素の適正緩衝液
20μ中、37℃、２時間で反応させた。消化し
た試料は、１％アガロースゲル電気泳動に供
し、巾１cm当り5Vの一定電圧で４時間泳動を
行つた。泳動の終つたゲルを1μｇ／mlエチジ
ウムブロマイド溶液に浸漬し30分間染色した
後、紫外線をゲルに照射して生成断片の数を判
定し、各断片の泳動距離から各々の分子量を算
出し、プラスミドpAG3の分子量を求めた。
尚、分子量は、同一アガロースゲル上で同時に
泳動したラムダフアージDNAのHind消化断
片の既知分子量に基づいて算出した。消化断片
の大きさと、複数の制限酵素による消化断片の
解析から決定されたプラスミドpAG3の制限酵
素地図を第１図に示す。

発明の効果 コリネバクテリウム・メラセコラ
（Corynebacterium melassecola）に属する微生
物より、グルタミン酸生産性コリネ型細菌のベク
タープラスミドとして利用可能な新らたなプラス
ミドpAG3を得た。

プラスミドpAG3は、制限酵素BamHI、、Hind
、PstI、XbaIに対して、各々単一の切断部位
を有するに極めて特徴のある有用なプラスミドで
ある。

従つて、プラスミドpAG3を用いたり、または
プラスミドpAG3を加工して作成したベクタープ
ラスミドを利用することにより、グルタミン酸生
産性コリネ型細菌の遺伝子操作による菌株改良を
行うことが可能となつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミドpAG3の制限酵
素地図である。プラスミドの分子量は、キロベー
ス（Kb）で表示してある。図中記号は、発明の
詳細な説明中に記した制限酵素であり、プラスミ
ド上のその位置はその制限酵素切断部位を示す。
その横に付記した数字は、Hind切断部位を基
準としたプラスミド上での位置を、キロベースで
表示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 約4.8キロベースの分子量を有し、かつ下図
   に示した制限酵素地図により特徴づけられるプラ
   スミドpAG3。 ２ プラスミドpAG3を含有するコリネバクテリ
   ウム・メラセコラ（Corynebacterium
   melassecola）に属する細菌。