JPH0634725B2 - 好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミド - Google Patents
好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミドInfo
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- JPH0634725B2 JPH0634725B2 JP60212199A JP21219985A JPH0634725B2 JP H0634725 B2 JPH0634725 B2 JP H0634725B2 JP 60212199 A JP60212199 A JP 60212199A JP 21219985 A JP21219985 A JP 21219985A JP H0634725 B2 JPH0634725 B2 JP H0634725B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、宿主細胞に保持させ、温度変化を与えるこ
とにより該宿主細胞の染色体に組み込まれる性質を有す
る変異プラスミドに関し、さらに詳細には、目的の遺伝
子を担うべく作成された組換プラスミドでは宿主細胞内
での維持が不安定である等の遺伝子を有利に宿主細胞に
導入しうる変異プラスミドに関するものである。
とにより該宿主細胞の染色体に組み込まれる性質を有す
る変異プラスミドに関し、さらに詳細には、目的の遺伝
子を担うべく作成された組換プラスミドでは宿主細胞内
での維持が不安定である等の遺伝子を有利に宿主細胞に
導入しうる変異プラスミドに関するものである。
従来の技術 生体細胞内で特定の遺伝情報を増幅したり、また外来の
異種遺伝情報を発現する方法としては、目的の遺伝子を
ベクター・プラスミドに担わせ、その組換えプラスミド
を細胞質因子として機能させる試みがなされている。し
かし、かかる組換えプラスミドの中には、その遺伝子産
物あるいは発現系による必須細胞成分の飽和等のため、
宿主細胞内での維持が不安定、かつ困難な場合がある。
異種遺伝情報を発現する方法としては、目的の遺伝子を
ベクター・プラスミドに担わせ、その組換えプラスミド
を細胞質因子として機能させる試みがなされている。し
かし、かかる組換えプラスミドの中には、その遺伝子産
物あるいは発現系による必須細胞成分の飽和等のため、
宿主細胞内での維持が不安定、かつ困難な場合がある。
この問題点を解決する手段としては、溶原性バクテリオ
ファージもしくはトランスポゾンを利用し、または染色
体DNAをプラスミドに組込み、染色体との相同なDNA配列
間の組換えにより目的の遺伝子を宿主細胞の染色体に組
み込む方法が提案されている（特開昭59-205983号公報
参照）。
ファージもしくはトランスポゾンを利用し、または染色
体DNAをプラスミドに組込み、染色体との相同なDNA配列
間の組換えにより目的の遺伝子を宿主細胞の染色体に組
み込む方法が提案されている（特開昭59-205983号公報
参照）。
発明が解決しようとする問題点 上述のごとく、本発明もまた細胞質因子としての組換え
プラスミドの状態では該プラスミドが宿主細胞内で安定
に維持できない場合等の解決手段を提供するものであ
る。
プラスミドの状態では該プラスミドが宿主細胞内で安定
に維持できない場合等の解決手段を提供するものであ
る。
すなわち、本発明者らは既存のプラスミドの各種機能を
高めるべく、プラスミドを保持する宿主について、常法
による変異手段を施したときのプラスミドへの影響につ
いて精査したところ、ある種の変異プラスミドがその形
質転換体の培養温度を調節することにより、宿主細胞の
染色体上に組み込まれることを見い出し、本発明を完成
したのである。
高めるべく、プラスミドを保持する宿主について、常法
による変異手段を施したときのプラスミドへの影響につ
いて精査したところ、ある種の変異プラスミドがその形
質転換体の培養温度を調節することにより、宿主細胞の
染色体上に組み込まれることを見い出し、本発明を完成
したのである。
問題点を解決するための手段 すなわち、本発明によれば、宿主細胞に保持させ、その
培養温度を変化させることにより、該宿主細胞の染色体
に組み込まれる性質を有する変異プラスミドが提供され
る。そのため、本発明の変異プラスミドに目的の遺伝子
を組換えた後、その組換えプラスミドを保持する宿主を
培養するに際し、その培養温度を調節することにより、
容易に目的の遺伝子を染色体に埋め込むことができ、該
遺伝子の安定な発現が図れるのである。
培養温度を変化させることにより、該宿主細胞の染色体
に組み込まれる性質を有する変異プラスミドが提供され
る。そのため、本発明の変異プラスミドに目的の遺伝子
を組換えた後、その組換えプラスミドを保持する宿主を
培養するに際し、その培養温度を調節することにより、
容易に目的の遺伝子を染色体に埋め込むことができ、該
遺伝子の安定な発現が図れるのである。
本発明にいう、宿主細胞は本発明の効果を奏するもので
あればその種類を問わないが、特にバチルス(Bacillus)
属に属する細菌であって、就中、好熱性細菌に属するバ
チルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearother
mophilus)が具体的に好適なものとして挙げられる。
あればその種類を問わないが、特にバチルス(Bacillus)
属に属する細菌であって、就中、好熱性細菌に属するバ
チルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearother
mophilus)が具体的に好適なものとして挙げられる。
また、温度変化とは本発明のプラスミドを保持する宿主
細胞を培養する場合の培養温度を変化させることを意味
し、該プラスミドが細胞質因子以外として存在できるよ
うに温度を高めて培養することをいう。宿主として、上
記バチルス・ステアロサーモフィラスを用いる場合にあ
っては、約48℃程度の培養温度（この場合は、プラスミ
ドが細胞質に存在する）を約63℃程度の温度で培養する
ことをいう。
細胞を培養する場合の培養温度を変化させることを意味
し、該プラスミドが細胞質因子以外として存在できるよ
うに温度を高めて培養することをいう。宿主として、上
記バチルス・ステアロサーモフィラスを用いる場合にあ
っては、約48℃程度の培養温度（この場合は、プラスミ
ドが細胞質に存在する）を約63℃程度の温度で培養する
ことをいう。
次に、本発明の変異プラスミドの原料プラスミドとして
は、上記バチルス属に属する細菌を宿主として、安定に
自律的増殖できる野生型または適当な選択マーカー等を
付すべく処理された各種組換えプラスミドを用いること
ができる。その具体的なものとしては、本発明者らによ
って提案されたプラスミドpTB系のものを挙げることが
できるが（例えば特開昭59-196092号公報参照）、好適
なものとしては、pTB90にペリシリナーゼ遺伝子を組込
んだpLP11（制限酵素地図は本発明の変異プラスミドの
一例を示すpTRA117（添付図面を参照）と同一に表わさ
れる）を挙げることができる。
は、上記バチルス属に属する細菌を宿主として、安定に
自律的増殖できる野生型または適当な選択マーカー等を
付すべく処理された各種組換えプラスミドを用いること
ができる。その具体的なものとしては、本発明者らによ
って提案されたプラスミドpTB系のものを挙げることが
できるが（例えば特開昭59-196092号公報参照）、好適
なものとしては、pTB90にペリシリナーゼ遺伝子を組込
んだpLP11（制限酵素地図は本発明の変異プラスミドの
一例を示すpTRA117（添付図面を参照）と同一に表わさ
れる）を挙げることができる。
また、変異とは各種微生物の変異手段としての常法であ
るＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
(NTG)や紫外線などの変異源を用いて処理することをい
う。
るＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
(NTG)や紫外線などの変異源を用いて処理することをい
う。
かくして、本発明により提供される変異プラスミドの具
体的なものとしては、プラスミドpTRA117を挙げること
ができるが、このプラスミドは昭和60年９月25日付で工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8456号と
して寄託した微生物から常法により採取することができ
る。
体的なものとしては、プラスミドpTRA117を挙げること
ができるが、このプラスミドは昭和60年９月25日付で工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8456号と
して寄託した微生物から常法により採取することができ
る。
以下に本発明の変異プラスミドの作成法を実施例により
説明する。
説明する。
実施例 プラスミドpTTB42(JOURNAL OF Bacteriology 147,3.P.7
76〜786(1981))とpTB90より構築されたプラスミドpLP11
を保持するバチルス・ステアロサーモフィラスCU21株
（実質的にはATCC12980の寄託菌と同じ）の細胞を10μg
/mlのNTG溶液中に懸濁させ、15分間NTGと接触させた。
76〜786(1981))とpTB90より構築されたプラスミドpLP11
を保持するバチルス・ステアロサーモフィラスCU21株
（実質的にはATCC12980の寄託菌と同じ）の細胞を10μg
/mlのNTG溶液中に懸濁させ、15分間NTGと接触させた。
NTGとの接触を経験した細胞を500μg/mlのカナマイシン
を含むＬ寒天培地上に展開し、60℃で一晩培養した。
を含むＬ寒天培地上に展開し、60℃で一晩培養した。
上記Ｌ寒天培地上で生育形成されたコロニーを500μg/m
lカナマイシン、0.75%(w/v)ポリビニルアルコールを含
むＬ寒天培地にレプリカし、48℃一晩培養し、再びコロ
ニーを形成させた後、0.8NI、0.32NKI、1%(w/v)NaB4O7の
溶液で寒天培地を染色した。この上に20,000V/mlのペニ
シリン溶液を展開し、各コロニーの周囲にハローの現わ
れないものは棄却した。
lカナマイシン、0.75%(w/v)ポリビニルアルコールを含
むＬ寒天培地にレプリカし、48℃一晩培養し、再びコロ
ニーを形成させた後、0.8NI、0.32NKI、1%(w/v)NaB4O7の
溶液で寒天培地を染色した。この上に20,000V/mlのペニ
シリン溶液を展開し、各コロニーの周囲にハローの現わ
れないものは棄却した。
残った各コロニー中の細胞を100μg/mlのカナマイシン
を含むＬ培地で、63℃で培養し増殖を示さないものは棄
却した。
を含むＬ培地で、63℃で培養し増殖を示さないものは棄
却した。
上で増殖を示した各株を、100μg/mlのカナマイシンを
含むＬ培地で48℃で一晩培養し、それぞれの株の中から
プラスミドを調製した。調製したプラスミドそれぞれを
用いCU21株を形質転換した。
含むＬ培地で48℃で一晩培養し、それぞれの株の中から
プラスミドを調製した。調製したプラスミドそれぞれを
用いCU21株を形質転換した。
各候補プラスミドによる形質転換株を500μg/mlのカナ
マイシンを含むＬ寒天培地に植菌し、60℃一晩培養し、
コロニー形成をしない形質転換株を与えた候補プラスミ
ドは除外した。
マイシンを含むＬ寒天培地に植菌し、60℃一晩培養し、
コロニー形成をしない形質転換株を与えた候補プラスミ
ドは除外した。
ここで、コロニー形成を示した株について再度上記の50
0μg/mlカナマイシン、0.75%(w/v)ポリビニルアルコー
ルを含むＬ培地で培養する操作を施し、それぞれの選択
基準を満足しない形質転換株を与える候補プラスミドは
棄却した。
0μg/mlカナマイシン、0.75%(w/v)ポリビニルアルコー
ルを含むＬ培地で培養する操作を施し、それぞれの選択
基準を満足しない形質転換株を与える候補プラスミドは
棄却した。
残った候補プラスミドによる形質転換株を、100μg/ml
のカナマイシンを含むＬ培地で、48℃及び63℃のそれぞ
れで培養し、培養菌体より細胞質因子としての状態で存
在するプラスミドだけを抽出することのできる方法（ア
ルカリ抽出法）でもって、それぞれの培養菌体からプラ
スミドを抽出し、48℃培養では細胞質にプラスミドが存
在し、63℃培養では細胞質にはプラスミドとしては存在
しないという特性を持つプラスミドを検索選択した。
のカナマイシンを含むＬ培地で、48℃及び63℃のそれぞ
れで培養し、培養菌体より細胞質因子としての状態で存
在するプラスミドだけを抽出することのできる方法（ア
ルカリ抽出法）でもって、それぞれの培養菌体からプラ
スミドを抽出し、48℃培養では細胞質にプラスミドが存
在し、63℃培養では細胞質にはプラスミドとしては存在
しないという特性を持つプラスミドを検索選択した。
さらに上記により検索選択されたプラスミドによる形質
転換株を63℃で100μg/mlのカナマイシンを含むＬ培地
で培養し、培養菌体から全DNAを抽出した。抽出したDNA
をCsCl-EtBr密度勾配遠心により、染色体画分のみに精
製した。精製した染色体DNAを制限酵素XbaＩにより分解
し、分解物を0.8%アガロース電気泳動にかけた。電気泳
動により分解後の断片の大きさに従ってアガロースゲル
内に分画され保持されている各断片を、それぞれの相対
位置を保つようにサザン(Southern)の方法により、ニト
ロセルロースフィルタに吸着させた。各断片を吸着保持
するニトロセルロースフィルターに、原プラスミドpLP1
1とDNAの塩基配列において相同性のあるpTTB42プラスミ
ドのシトシン塩基をニックトランスレーション法により
〔α−32P〕dCTPと置き換えラベルしたプローブDNAを含
む溶液に浸し、サザン・ハイブリダイゼーション(South
ern hybridization)実験を行った。プローブDNAとのハ
イブリダイゼーションの後、ニトロセルロースフィルタ
ーのラジオオートグラフ(radioautograph)を作成した。
でき上ったラジオオートグラフ上に、候補プラスミドの
XbaＩ分解後の大きさとは異なる分画位置（アガロース
ゲル中の）に在るDNA断片とプローブDNAがハイブリダイ
ズし、その結果ラジオオートグラフを感光させる染色体
DNAを持つようになった形質転換株を与える候補プラス
ミドを選択した（上記の結果を与えるにはプラスミドが
染色体に組み込まれなければならないからである）。
転換株を63℃で100μg/mlのカナマイシンを含むＬ培地
で培養し、培養菌体から全DNAを抽出した。抽出したDNA
をCsCl-EtBr密度勾配遠心により、染色体画分のみに精
製した。精製した染色体DNAを制限酵素XbaＩにより分解
し、分解物を0.8%アガロース電気泳動にかけた。電気泳
動により分解後の断片の大きさに従ってアガロースゲル
内に分画され保持されている各断片を、それぞれの相対
位置を保つようにサザン(Southern)の方法により、ニト
ロセルロースフィルタに吸着させた。各断片を吸着保持
するニトロセルロースフィルターに、原プラスミドpLP1
1とDNAの塩基配列において相同性のあるpTTB42プラスミ
ドのシトシン塩基をニックトランスレーション法により
〔α−32P〕dCTPと置き換えラベルしたプローブDNAを含
む溶液に浸し、サザン・ハイブリダイゼーション(South
ern hybridization)実験を行った。プローブDNAとのハ
イブリダイゼーションの後、ニトロセルロースフィルタ
ーのラジオオートグラフ(radioautograph)を作成した。
でき上ったラジオオートグラフ上に、候補プラスミドの
XbaＩ分解後の大きさとは異なる分画位置（アガロース
ゲル中の）に在るDNA断片とプローブDNAがハイブリダイ
ズし、その結果ラジオオートグラフを感光させる染色体
DNAを持つようになった形質転換株を与える候補プラス
ミドを選択した（上記の結果を与えるにはプラスミドが
染色体に組み込まれなければならないからである）。
以上により得られた候補プラスミドの一つをpTRA117と
命名した（制限酵素地図を添付図面に示す）。
命名した（制限酵素地図を添付図面に示す）。
効果 pTRA117で形質転換したバチルス・ステアロサーモフィ
ラスは、その培養温度を63℃にシフトすることで宿主菌
の染色体に組み込まれていた。
ラスは、その培養温度を63℃にシフトすることで宿主菌
の染色体に組み込まれていた。
以下に、本発明の変異プラスミドの効果を原料プラスミ
ドとの比較において具体的実験例を挙げさらに説明す
る。
ドとの比較において具体的実験例を挙げさらに説明す
る。
実施例 pLP11及びpTRA117をそれぞれ保持するバチルス・ステア
ロサーモフィラスCU21の形質転換株を所定の温度で、５
μg/mlのカナマイシンを含むＬ培地で対数増殖後期まで
培養する。
ロサーモフィラスCU21の形質転換株を所定の温度で、５
μg/mlのカナマイシンを含むＬ培地で対数増殖後期まで
培養する。
培養液をそれぞれ一白金耳Ｌ寒天培地に展開し、48℃一
晩培養し、単一細胞に由来するコロニーを形成させる。
晩培養し、単一細胞に由来するコロニーを形成させる。
それぞれの培養液から得た単一コロニー100ケの表現型
(KmrかKms，ペニシリナーゼポジティブ(PCase+)かネガ
ティブ(PCase-)か）をそれぞれ調べ、KmrかつPCase+の
表現型を示すコロニーの全体に対する割合をもとめた。
(KmrかKms，ペニシリナーゼポジティブ(PCase+)かネガ
ティブ(PCase-)か）をそれぞれ調べ、KmrかつPCase+の
表現型を示すコロニーの全体に対する割合をもとめた。
その結果を下記表にまとめる。
以上より、本発明の変異プラスミドは63℃なる培養温度
において、完全に維持されていることがわかる。
において、完全に維持されていることがわかる。
図は、本発明の変異プラスミドの一つであるpTRA117の
制限酵素地図を示す。
制限酵素地図を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】宿主細胞であるバチルス・ステアロサーモ
フィラス(Bacillus stearothermophilus)に保持させ、
温度変化を与えることにより該宿主細胞の染色体に組み
込まれる性質を有するプラスミドであって、分子量が約
9.5メガダルトン(Md)であり、かつ、下記の制限酵素地
図で特徴づけられる変異プラスミドpTRA117。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60212199A JPH0634725B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60212199A JPH0634725B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62181783A JPS62181783A (ja) | 1987-08-10 |
| JPH0634725B2 true JPH0634725B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=16618559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60212199A Expired - Lifetime JPH0634725B2 (ja) | 1985-09-27 | 1985-09-27 | 好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634725B2 (ja) |
-
1985
- 1985-09-27 JP JP60212199A patent/JPH0634725B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62181783A (ja) | 1987-08-10 |
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