JPH06153925A - トランスポゾン、テストベクター、グラム陽性菌の突然変異生成法及びグラム陽性菌 - Google Patents
トランスポゾン、テストベクター、グラム陽性菌の突然変異生成法及びグラム陽性菌Info
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- JPH06153925A JPH06153925A JP3031180A JP3118091A JPH06153925A JP H06153925 A JPH06153925 A JP H06153925A JP 3031180 A JP3031180 A JP 3031180A JP 3118091 A JP3118091 A JP 3118091A JP H06153925 A JPH06153925 A JP H06153925A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 Ｒ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂのフラグメン
トよりなるトランスボゾン、このトランスボゾンを含有
するテストベクター及び突然変異生成法の提供。 【構成】 コリネバクテリウム・キセロシスＤＳＭ５０
２１からのＲ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂのフラグメン
トからなり、組込みのために重要なＤＮＡ−領域がＲ−
プラスミド上の座標３０．４〜４４．８ＫＢの間に存在
し、ＳａｌＩ−切断位置及びＨｉｎｄＩＩＩ−切断位置
により限定され、テトラサイクリン−及びエリスロマイ
シン−耐性に関してコードするＤＮＡ−断片を有する。
トよりなるトランスボゾン、このトランスボゾンを含有
するテストベクター及び突然変異生成法の提供。 【構成】 コリネバクテリウム・キセロシスＤＳＭ５０
２１からのＲ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂのフラグメン
トからなり、組込みのために重要なＤＮＡ−領域がＲ−
プラスミド上の座標３０．４〜４４．８ＫＢの間に存在
し、ＳａｌＩ−切断位置及びＨｉｎｄＩＩＩ−切断位置
により限定され、テトラサイクリン−及びエリスロマイ
シン−耐性に関してコードするＤＮＡ−断片を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｒ−プラスミドｐＣｘ
Ｍ８２Ｂのフラグメントより成るトランスポゾン、この
トランスポゾンを含有するテストベクター及び突然変異
生成法に関する。
Ｍ８２Ｂのフラグメントより成るトランスポゾン、この
トランスポゾンを含有するテストベクター及び突然変異
生成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トランスポゾンは、この要素に非正統的
組換えにより、染色体もしくはプラスミドのＤＮＡ中へ
の非特異的な組込みを可能とする蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列を有する。更に、１個のトランスポゾ
ンは、その使用により細胞内の１個のトランスポゾンの
存在を選択することのできる１個の選択標識（例えば抗
生物質−耐性因子）を有する。
組換えにより、染色体もしくはプラスミドのＤＮＡ中へ
の非特異的な組込みを可能とする蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列を有する。更に、１個のトランスポゾ
ンは、その使用により細胞内の１個のトランスポゾンの
存在を選択することのできる１個の選択標識（例えば抗
生物質−耐性因子）を有する。
【０００３】このことは、組込み変異体の直接的同定及
びゲノム中の当該遺伝子の局在化を可能にする。当該遺
伝子及び挿入されたトランスポゾンを有する制限フラグ
メントの単離は、従来の技術水準により行なうことがで
きる。
びゲノム中の当該遺伝子の局在化を可能にする。当該遺
伝子及び挿入されたトランスポゾンを有する制限フラグ
メントの単離は、従来の技術水準により行なうことがで
きる。
【０００４】これに反し、慣用の突然変異生成法（ヒド
ロキシルアミン突然変異生成もしくはＮＴＧ−突然変異
生成）では、しばしば生物の活力度に負の影響が及ぼさ
れる。突然変異された遺伝子の迅速な局在化は、この方
法では、同様に大きい問題である。
ロキシルアミン突然変異生成もしくはＮＴＧ−突然変異
生成）では、しばしば生物の活力度に負の影響が及ぼさ
れる。突然変異された遺伝子の迅速な局在化は、この方
法では、同様に大きい問題である。
【０００５】トランスポゾン突然変異生成の技術は、グ
ラム陽性菌及びグラム陰性菌において、既に有効に使用
されている。例えば、グラム陽性菌からのプラスミドＲ
１００のトランスポゾンＴｎ１０（９．３Ｋｂ、Ｔ
ｃr）（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ等による１９８１）、プラス
ミドのＴｎ５（５．７Ｋｂ、Ｋｍr）（Ｂｅｒｇ等によ
る１９７５）及びグラム陰性菌からのストレプトコッカ
ス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａ
ｅｃａｌｉｓ）ＤＳ１６のクロモソームからのプラスミ
ドｐＡＤ２のトランスポゾンＴｎ９１７（５．１Ｋｂ、
Ｅｍr）（Ｔｏｍｉｃｈ等による１９８０）及びＴｎ９
１６（１５Ｋｂ、Ｔｃr）が挙げられる。
ラム陽性菌及びグラム陰性菌において、既に有効に使用
されている。例えば、グラム陽性菌からのプラスミドＲ
１００のトランスポゾンＴｎ１０（９．３Ｋｂ、Ｔ
ｃr）（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ等による１９８１）、プラス
ミドのＴｎ５（５．７Ｋｂ、Ｋｍr）（Ｂｅｒｇ等によ
る１９７５）及びグラム陰性菌からのストレプトコッカ
ス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａ
ｅｃａｌｉｓ）ＤＳ１６のクロモソームからのプラスミ
ドｐＡＤ２のトランスポゾンＴｎ９１７（５．１Ｋｂ、
Ｅｍr）（Ｔｏｍｉｃｈ等による１９８０）及びＴｎ９
１６（１５Ｋｂ、Ｔｃr）が挙げられる。
【０００６】このトランスポゾンＴｎ９１７は、バシル
スｓｓｐ．中並びに他のグラム陽性及びグラム陰性の微
生物中で（Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ及びＣａｓａｄａｂａｎ
１９８６）、アミノ酸代謝及びエネルギー代謝の栄養要
求性細胞を得るために有効に使用された（Ｐｅｒｋｉｎ
ｓ及びＹｏｕｎｇｍａｎ、１９８４、Ｖａｎｄｅｙａｒ
及びＺａｈｌｅｒ、１９８６、Ｍｃ Ｌａｎｇｈｌｉｎ
及びＨｕｇｈｅｓ１９８９）。
スｓｓｐ．中並びに他のグラム陽性及びグラム陰性の微
生物中で（Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ及びＣａｓａｄａｂａｎ
１９８６）、アミノ酸代謝及びエネルギー代謝の栄養要
求性細胞を得るために有効に使用された（Ｐｅｒｋｉｎ
ｓ及びＹｏｕｎｇｍａｎ、１９８４、Ｖａｎｄｅｙａｒ
及びＺａｈｌｅｒ、１９８６、Ｍｃ Ｌａｎｇｈｌｉｎ
及びＨｕｇｈｅｓ１９８９）。
【０００７】更に、トランスポゾンは、ゲノム地図記
入、レプリコンの起動化（Ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏ
ｎ）、オペロン融合の達成及び遺伝子の誘導のために使
用された（Ｓｉｍｏｎ等による１９８９）。
入、レプリコンの起動化（Ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏ
ｎ）、オペロン融合の達成及び遺伝子の誘導のために使
用された（Ｓｉｍｏｎ等による１９８９）。
【０００８】しかしながら、公知のトランスポゾン−突
然変異生成系は、コリネ型バクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｆ
ｏｒｍｅｎ Ｂａｋｔｅｒｉｅｎ）殊に、アミノ酸を産
生し、析出するような細菌の遺伝子技術的変更のために
は不適当である。
然変異生成系は、コリネ型バクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｆ
ｏｒｍｅｎ Ｂａｋｔｅｒｉｅｎ）殊に、アミノ酸を産
生し、析出するような細菌の遺伝子技術的変更のために
は不適当である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、殊に
コリネ型菌株の遺伝子技術的分析の可能性を生じるこの
種のトランスポゾン−突然変異生成系を提供することで
ある。
コリネ型菌株の遺伝子技術的分析の可能性を生じるこの
種のトランスポゾン−突然変異生成系を提供することで
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】ところで、Ｒ−プラスミ
ドｐＣｘＭ８２ｂの特定のフラグメントは、トランスポ
ゾン活性を有することが判明した。
ドｐＣｘＭ８２ｂの特定のフラグメントは、トランスポ
ゾン活性を有することが判明した。
【００１１】このＲ−プラスミドは、西ドイツ微生物寄
託局に、ブダペスト条約に依り、コリネバクテリウム・
キセロシスＤＳＭ５０２１として寄託されており、欧州
特許出願第８９１２０４５９．６号（西ドイツ特許出願
Ｐ３８４１４５４．６号に相当）明細書中に記載されて
いる。
託局に、ブダペスト条約に依り、コリネバクテリウム・
キセロシスＤＳＭ５０２１として寄託されており、欧州
特許出願第８９１２０４５９．６号（西ドイツ特許出願
Ｐ３８４１４５４．６号に相当）明細書中に記載されて
いる。
【００１２】円形の制限地図を図１に示す。
【００１３】請求項に記載のフラグメントは、更に他の
特徴も認められる： ａ） 組込みのために重要なＤＮＡ−領域は、Ｒ−プラ
スミド上の座標３０．４〜４４．８Ｋｂの間に存在す
る、 ｂ） このフラグメントは、座標３０．４Ｋｂの所でＳ
ａｌＩ−切断位置により、かつ座標４４．８Ｋｂの所で
ＨｉｎｄＩＩＩ−切断位置により限定される、 ｃ） テトラサイクリン−及びエリスロマイシン耐性に
関してコード化するＤＮＡ−断片を有する。
特徴も認められる： ａ） 組込みのために重要なＤＮＡ−領域は、Ｒ−プラ
スミド上の座標３０．４〜４４．８Ｋｂの間に存在す
る、 ｂ） このフラグメントは、座標３０．４Ｋｂの所でＳ
ａｌＩ−切断位置により、かつ座標４４．８Ｋｂの所で
ＨｉｎｄＩＩＩ−切断位置により限定される、 ｃ） テトラサイクリン−及びエリスロマイシン耐性に
関してコード化するＤＮＡ−断片を有する。
【００１４】トランスポゾン活性は、グラム陽性菌殊に
コリネ型細菌例えばコリネバクテリウム（Ｃ．）グルタ
ミクム、Ｃ．キセロシス、Ｃ．メラッセコラ（ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂ．） フラ
ヴム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、Ｂ．チオゲニタリス（ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉ
ｓ）、Ｂ．ラクトフェルメンツム（Ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ）、Ｂ．ロゼウム（ｒｏｓｅｕｍ）、Ｂ．サ
ッカロリチクム（ｓａｃｃｋａｒｏｌｉｔｉｃｕｍ）、
殊に、ブレビバクテリウム フェルメンツムＤＳＭ２０
４１２、コリネバクテリウム カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｒｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０
４１７、コリネバクテリウム ヘルクリス（ｈｅｒｃｕ
ｌｉｓ）ＤＳＭ２０３０１、ブレビバクテリウム フラ
ヴムＤＳＭ２０４１１、アルトロバクター アルビズス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＤＳＭ２
０１２８中で明らかであり、この際、アミノ酸を産生及
び析出するものが有利である。トランスポゾンは、適当
な担体プラスミドを用いて、形質転換又は接合により受
容菌中に導入される。この担体プラスミドは、受容菌中
で複製できないか又は、低いインキュベーション温度で
のみ複製できる（感温複製）。
コリネ型細菌例えばコリネバクテリウム（Ｃ．）グルタ
ミクム、Ｃ．キセロシス、Ｃ．メラッセコラ（ｍｅｌａ
ｓｓｅｃｏｌａ）、ブレビバクテリウム（Ｂ．） フラ
ヴム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、Ｂ．チオゲニタリス（ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉ
ｓ）、Ｂ．ラクトフェルメンツム（Ｌａｃｔｏｆｅｒｍ
ｅｎｔｕｍ）、Ｂ．ロゼウム（ｒｏｓｅｕｍ）、Ｂ．サ
ッカロリチクム（ｓａｃｃｋａｒｏｌｉｔｉｃｕｍ）、
殊に、ブレビバクテリウム フェルメンツムＤＳＭ２０
４１２、コリネバクテリウム カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｒｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０
４１７、コリネバクテリウム ヘルクリス（ｈｅｒｃｕ
ｌｉｓ）ＤＳＭ２０３０１、ブレビバクテリウム フラ
ヴムＤＳＭ２０４１１、アルトロバクター アルビズス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）ＤＳＭ２
０１２８中で明らかであり、この際、アミノ酸を産生及
び析出するものが有利である。トランスポゾンは、適当
な担体プラスミドを用いて、形質転換又は接合により受
容菌中に導入される。この担体プラスミドは、受容菌中
で複製できないか又は、低いインキュベーション温度で
のみ複製できる（感温複製）。
【００１５】特に、次の組成： ａ） Ｅ．コリー中で機能性のレプリコンを含有するＤ
ＮＡ−セグメント、 ｂ） 起動性−及び転移−機能に関してコード化するＤ
ＮＡ−フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔｅ及びｏｒｉＴ）
を含有する第２のＤＮＡ−セグメント及び ｃ） トランスポゾン より成る、起動性で、非自己転移性のベクター（テスト
ベクター）が好適である。
ＮＡ−セグメント、 ｂ） 起動性−及び転移−機能に関してコード化するＤ
ＮＡ−フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔｅ及びｏｒｉＴ）
を含有する第２のＤＮＡ−セグメント及び ｃ） トランスポゾン より成る、起動性で、非自己転移性のベクター（テスト
ベクター）が好適である。
【００１６】このようなテストベクターの構成のため
に、起動性で非自己転移性のＥ．コリーベクターを使用
する。
に、起動性で非自己転移性のＥ．コリーベクターを使用
する。
【００１７】Ｅ．コリーベクターなる概念には、Ｅ．コ
リー菌株中でのみ独自に複製する、一般に、遺伝子技術
的使用のために必要であることが明らかである、全ての
プラスミドが包含される。
リー菌株中でのみ独自に複製する、一般に、遺伝子技術
的使用のために必要であることが明らかである、全ての
プラスミドが包含される。
【００１８】このようなＥ．コリーベクターの例は次の
ものである：ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＫＢ１１１、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＳＣ１０１。
ものである：ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、
ｐＫＢ１１１、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＳＣ１０１。
【００１９】Ｅ．コリー群の細菌群中でのみ複製するこ
れら及び他のベクターは、広い宿主領域を有するプラス
ミドのＭｏｂ−ｓｉｔｅのグラム陰性バクテリア中への
挿入より変性される。
れら及び他のベクターは、広い宿主領域を有するプラス
ミドのＭｏｂ−ｓｉｔｅのグラム陰性バクテリア中への
挿入より変性される。
【００２０】この目的のために、プラスミドＲＰ４を使
用するのが有利である。１．９Ｋｂの大きさのＲＰ４の
フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔｅ）を有するＥ．コリー
ベクターは、本発明方法で有利に使用できる。
用するのが有利である。１．９Ｋｂの大きさのＲＰ４の
フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔｅ）を有するＥ．コリー
ベクターは、本発明方法で有利に使用できる。
【００２１】起動化菌株（Ｍｏｂｉｌｉｓａｔｏｒｓｔ
ａｅｍｍｅ）としては、プラスミドを、起動化のために
必要な機能を調製することのできる染色体中に組込まれ
て又は遊離して含有する、変性Ｅ．コリー菌株が好適で
ある。
ａｅｍｍｅ）としては、プラスミドを、起動化のために
必要な機能を調製することのできる染色体中に組込まれ
て又は遊離して含有する、変性Ｅ．コリー菌株が好適で
ある。
【００２２】殊に、その染色体中にＲＰ４−誘導体が組
込まれていて、その転移機能が前記ベクターのＭｏｂ−
ｓｉｔｅ上にトランスに作用する菌株が好適である。
込まれていて、その転移機能が前記ベクターのＭｏｂ−
ｓｉｔｅ上にトランスに作用する菌株が好適である。
【００２３】好適なベクター及びＥ．コリー起動化菌株
は、米国特許（ＵＳ−ＰＳ）第４６２６５０４号明細書
から公知であり、ノーザン レジオナル リサーチ セ
ンター（Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている： 菌 株 ＮＲＲＬ−寄託番号 Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ１０１ Ｂ−１５４８４ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０１ Ｂ−１５４８７ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０２ Ｂ−１５４８８ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０３ Ｂ−１５４８９ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ３０１ Ｂ−１５４９２ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ４０１ Ｂ−１５４９４ Ｅ．コリーＳＭ１０ Ｂ−１５４８１ Ｅ．コリーＳ６８−７ Ｂ−１５４８２ Ｅ．コリーＳ１７−１ Ｂ−１５４８３ 他のベクター例えばｐＳＵＰ１０２又はｐＳＵＰ２０５
は、文献から公知であり、類似方法で公知ベクターから
取得される（Ｓｉｍｏｎ等によるＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１８、６４０ｆｆ（１９８
６）及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖｅｍｂｅ
ｒ（１９８２）１。
は、米国特許（ＵＳ−ＰＳ）第４６２６５０４号明細書
から公知であり、ノーザン レジオナル リサーチ セ
ンター（Ｎｏｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている： 菌 株 ＮＲＲＬ−寄託番号 Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ１０１ Ｂ−１５４８４ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０１ Ｂ−１５４８７ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０２ Ｂ−１５４８８ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ２０３ Ｂ−１５４８９ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ３０１ Ｂ−１５４９２ Ｅ．コリーＣＳＨ５２／ｐＳＵＰ４０１ Ｂ−１５４９４ Ｅ．コリーＳＭ１０ Ｂ−１５４８１ Ｅ．コリーＳ６８−７ Ｂ−１５４８２ Ｅ．コリーＳ１７−１ Ｂ−１５４８３ 他のベクター例えばｐＳＵＰ１０２又はｐＳＵＰ２０５
は、文献から公知であり、類似方法で公知ベクターから
取得される（Ｓｉｍｏｎ等によるＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１８、６４０ｆｆ（１９８
６）及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｏｖｅｍｂｅ
ｒ（１９８２）１。
【００２４】前記Ｅ．コリーベクターの使用下に形成さ
れ、トランスポゾンを含有するテストベクターを、Ｅ．
コリー起動化菌株からの接合によりグラム陽性菌中へ、
欧州特許出願第８９１２０４７３．７号（西ドイツ特許
出願第Ｐ３８４１４５３．８号に相当）明細書中に記載
のような方法で転移させる。
れ、トランスポゾンを含有するテストベクターを、Ｅ．
コリー起動化菌株からの接合によりグラム陽性菌中へ、
欧州特許出願第８９１２０４７３．７号（西ドイツ特許
出願第Ｐ３８４１４５３．８号に相当）明細書中に記載
のような方法で転移させる。
【００２５】本発明により形成されたテストベクターｐ
Ｋ１（図２及び図３参照）は、トランスポゾン及びベク
ターｐＳＵＰ１０２のＨｉｎｄＩＩＩ−及びＳａｌＩ−
切断位置により限定されたフラグメンより成り、〜１
９．７Ｋｂの大きさを有する。この場合、グラム陽性菌
の制限欠失細胞を作り、これを自体公知の交叉法により
起動化しうるテストベクター１個を担持しているＥ．コ
リー起動化菌株と混合する。
Ｋ１（図２及び図３参照）は、トランスポゾン及びベク
ターｐＳＵＰ１０２のＨｉｎｄＩＩＩ−及びＳａｌＩ−
切断位置により限定されたフラグメンより成り、〜１
９．７Ｋｂの大きさを有する。この場合、グラム陽性菌
の制限欠失細胞を作り、これを自体公知の交叉法により
起動化しうるテストベクター１個を担持しているＥ．コ
リー起動化菌株と混合する。
【００２６】供与菌は、有利に対数生長期に存在し、受
容菌の状態に関しては、定常生長期が好適であることが
立証された。
容菌の状態に関しては、定常生長期が好適であることが
立証された。
【００２７】供与菌及び受容菌細胞は、一般に、１：１
〜１：１０有利に１：１〜１：６の割合で使用される。
〜１：１０有利に１：１〜１：６の割合で使用される。
【００２８】制限欠失は遺伝子学的に限定することがで
き、例えば、突然変異生成剤（例えばＮＴＧ：メチルニ
トロ−ニトロソキニジン）により得ることができるが、
これは、生理学的にも、例えば熱衝撃によっても限定さ
れうる。
き、例えば、突然変異生成剤（例えばＮＴＧ：メチルニ
トロ−ニトロソキニジン）により得ることができるが、
これは、生理学的にも、例えば熱衝撃によっても限定さ
れうる。
【００２９】交叉結合の直前の受容菌の熱処理が特に有
効であることが立証された。この場合、無傷の又はスフ
ェロプラストの細胞を使用すべきである。
効であることが立証された。この場合、無傷の又はスフ
ェロプラストの細胞を使用すべきである。
【００３０】４５〜５５℃有利に約４９℃での１〜３０
分有利に約９分間にわたる熱衝撃は、それに引続く形質
転換頻度の増加が本発明の課題を満足することを可能と
する。
分有利に約９分間にわたる熱衝撃は、それに引続く形質
転換頻度の増加が本発明の課題を満足することを可能と
する。
【００３１】起動化しうるベクターの形成は、同様に、
欧州特許出願第８９１３０４７３．７号（＝ＥＰ−Ａ−
０３７５８８９号）に記載されている。
欧州特許出願第８９１３０４７３．７号（＝ＥＰ−Ａ−
０３７５８８９号）に記載されている。
【００３２】トランスポゾン活性の試験のために、Ｒ−
プラスミドの〜１４．４Ｋｂ−フラグメントを起動化し
うるベクター中に挿入し、この構成体を接合を介して、
殊にアミノ酸産生性のコリネ型細菌中に導入する。
プラスミドの〜１４．４Ｋｂ−フラグメントを起動化し
うるベクター中に挿入し、この構成体を接合を介して、
殊にアミノ酸産生性のコリネ型細菌中に導入する。
【００３３】コリネバクテリウム グルタミクム（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
を選択するのが有利である。
ｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）
を選択するのが有利である。
【００３４】この細菌中で非複製性の本発明のテストベ
クターは、受容菌内で大部分消失し、かつこれと共に組
込まれたＲ−プラスミドのＤＮＡ−フラグメントも消失
する。 しかしながら、トランスポゾン−テストベクタ
ーは、受容菌としての作用をするコリネ型細菌の染色体
中に著るしく組込まれるかもしくはＲ−プラスミド−Ｄ
ＮＡの特定のＤＮＡ−セグメントは、受容菌の染色体中
に組込まれる（転位）ことをはじめて見出した。この組
込みは、染色体の種々異なる位置で行なわれる。 テス
トベクターｐＫ１（図３）の使用下に得られる組込み突
然変異体を調査すると、ベクターｐＫ１はＥ．コリーか
らＣ．グルタミクムへの移動の後に、非特異的に、受容
菌として選択された菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の染色体内に組み込まれることが明らかである。
クターは、受容菌内で大部分消失し、かつこれと共に組
込まれたＲ−プラスミドのＤＮＡ−フラグメントも消失
する。 しかしながら、トランスポゾン−テストベクタ
ーは、受容菌としての作用をするコリネ型細菌の染色体
中に著るしく組込まれるかもしくはＲ−プラスミド−Ｄ
ＮＡの特定のＤＮＡ−セグメントは、受容菌の染色体中
に組込まれる（転位）ことをはじめて見出した。この組
込みは、染色体の種々異なる位置で行なわれる。 テス
トベクターｐＫ１（図３）の使用下に得られる組込み突
然変異体を調査すると、ベクターｐＫ１はＥ．コリーか
らＣ．グルタミクムへの移動の後に、非特異的に、受容
菌として選択された菌株Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２の染色体内に組み込まれることが明らかである。
【００３５】実施されたトランスポゾン−突然変異生成
バッチにおいて、３種の異なる栄養要求性を有するＣ．
グルタミクム細胞が見出された（ＡＩ Ｌｅｕ-、ＡＺ
Ｔｒｐ-、Ａ３ Ｓｅｒ-）。
バッチにおいて、３種の異なる栄養要求性を有するＣ．
グルタミクム細胞が見出された（ＡＩ Ｌｅｕ-、ＡＺ
Ｔｒｐ-、Ａ３ Ｓｅｒ-）。
【００３６】このような現象に関する必要条件は、テス
トベクター上のトランスポゾンもしくは挿入配列の存在
である。この組み込みにとって重要なＤＮＡ−領域は、
Ｒ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂ（これがこのテストベク
ターの成分である）のＤＮＡ−フラグメント上にある。
トベクター上のトランスポゾンもしくは挿入配列の存在
である。この組み込みにとって重要なＤＮＡ−領域は、
Ｒ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂ（これがこのテストベク
ターの成分である）のＤＮＡ−フラグメント上にある。
【００３７】
１． Ｔｎ−テストベクターｐＫ１の形成 （図２＋図３参照）起動化可能なＥ．コリーベクターｐ
ＳＵＰ１０２（Ｓｉｍｏｎ等による１９８３年）を酵素
ＳａｌＩで線状化した。同様な方法でＥ．コリーベクタ
ーｐＳＡ１Ｅ２［Ｅ．コリーベクターｐＵＣ１９（Ｎｏ
ｒｒａｎｄｅｒ等１９８３）］をＲ−プラスミド−フラ
グメントＳａｌＥ２で前処理した。これらの切断バッチ
を混合し、引続き連結させた（ｌｉｇｉｅｒｔ）。次い
でこの混合物を用いてＥ．コリーＳ１７−１（Ｓｉｍｏ
ｎ等、２９８３）を形質転換させた。この形質転換体か
ら、オキソイド社（Ｔｉｒｍａ Ｏｚｏｉｄ）の抗生物
質−培地Ｎｏ．３の寒天プレート上のクロラムフェニコ
ール（５０μｇ／ｍｌ）及びエリスロマイシン（３０μ
ｇ／ｍｌ）に対する耐性を示すプラスミドを単離するこ
とができた。ｐＫ２と称されるこのプラスミドは、８．
２Ｋｂの長さのＲ−プラスミド−フラグメントＳａｌＥ
２を有するベクターｐＳＵＰ１０２から成る。このプラ
スミドｐＫ２をＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、引続き、再
連結させた（ｒｅｌｉｇｉｅｒｔ）。この連結混合物を
Ｅ．コリーＳ１７−１に形質転換させた。この形質転換
体からプラスミドｐＫ２△Ｈｉ（ＨｉｎｄＩＩＩ−フラ
グメントの欠失を有するベクターｐＫ２）を単離するこ
とができた。このプラスミドｐＫ２△ＨｉをＨｉｎｄＩ
ＩＩで線状化し、同様に処理されたベクターｐ２Ｈｉ４
（Ｒ−プラスミド−フラグメント２Ｈｉ４を有するプラ
スミドＰＵＣ１９）と混合し、連結させた。この連結混
合物を用いてＥ．コリーＳ１７−１を形質転換させた。
この形質転換体からプラスミドｐＫ１（図３）を単離す
ることができた。このプラスミドは、Ｅ．コリーベクタ
ーｐＳＵＰ１０２の１部及びＲ−プラスミドｐＣｘＭ８
２Ｂの〜１４．４Ｋｂ−フラグメントより成り、全長〜
１９．７Ｋｂである。
ＳＵＰ１０２（Ｓｉｍｏｎ等による１９８３年）を酵素
ＳａｌＩで線状化した。同様な方法でＥ．コリーベクタ
ーｐＳＡ１Ｅ２［Ｅ．コリーベクターｐＵＣ１９（Ｎｏ
ｒｒａｎｄｅｒ等１９８３）］をＲ−プラスミド−フラ
グメントＳａｌＥ２で前処理した。これらの切断バッチ
を混合し、引続き連結させた（ｌｉｇｉｅｒｔ）。次い
でこの混合物を用いてＥ．コリーＳ１７−１（Ｓｉｍｏ
ｎ等、２９８３）を形質転換させた。この形質転換体か
ら、オキソイド社（Ｔｉｒｍａ Ｏｚｏｉｄ）の抗生物
質−培地Ｎｏ．３の寒天プレート上のクロラムフェニコ
ール（５０μｇ／ｍｌ）及びエリスロマイシン（３０μ
ｇ／ｍｌ）に対する耐性を示すプラスミドを単離するこ
とができた。ｐＫ２と称されるこのプラスミドは、８．
２Ｋｂの長さのＲ−プラスミド−フラグメントＳａｌＥ
２を有するベクターｐＳＵＰ１０２から成る。このプラ
スミドｐＫ２をＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、引続き、再
連結させた（ｒｅｌｉｇｉｅｒｔ）。この連結混合物を
Ｅ．コリーＳ１７−１に形質転換させた。この形質転換
体からプラスミドｐＫ２△Ｈｉ（ＨｉｎｄＩＩＩ−フラ
グメントの欠失を有するベクターｐＫ２）を単離するこ
とができた。このプラスミドｐＫ２△ＨｉをＨｉｎｄＩ
ＩＩで線状化し、同様に処理されたベクターｐ２Ｈｉ４
（Ｒ−プラスミド−フラグメント２Ｈｉ４を有するプラ
スミドＰＵＣ１９）と混合し、連結させた。この連結混
合物を用いてＥ．コリーＳ１７−１を形質転換させた。
この形質転換体からプラスミドｐＫ１（図３）を単離す
ることができた。このプラスミドは、Ｅ．コリーベクタ
ーｐＳＵＰ１０２の１部及びＲ−プラスミドｐＣｘＭ８
２Ｂの〜１４．４Ｋｂ−フラグメントより成り、全長〜
１９．７Ｋｂである。
【００３８】２． 栄養要求性Ｃ．グルタミクム細胞を
得るための、プラスミドｐＫ１を用いるトランスポゾン
−突然変異生成の実施 供与菌Ｅ．コリーＳ１７−１／ｐＫ１をＬＢＧＥｍ
50（グルコース１ｇ／ｌを有するルリア・ブイヨン；Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ等１９８２）１０ｍｌ中で２０時間培養
する（予備培養）。
得るための、プラスミドｐＫ１を用いるトランスポゾン
−突然変異生成の実施 供与菌Ｅ．コリーＳ１７−１／ｐＫ１をＬＢＧＥｍ
50（グルコース１ｇ／ｌを有するルリア・ブイヨン；Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ等１９８２）１０ｍｌ中で２０時間培養
する（予備培養）。
【００３９】受容菌Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３
２をＬＢＧ１００ｍｌ中で、光学密度５８０＝４．０に
達するまで、夜通し培養する。
２をＬＢＧ１００ｍｌ中で、光学密度５８０＝４．０に
達するまで、夜通し培養する。
【００４０】ＬＢＧｍ50１００ｍｌに供与菌予備培養物
１ｍｌを接種し、光学密度５８０＝１．０になるまで培
養する。
１ｍｌを接種し、光学密度５８０＝１．０になるまで培
養する。
【００４１】受容菌培養物１５ｍｌを４９℃で９分間イ
ンキュベートする。
ンキュベートする。
【００４２】供与菌及び受容菌培養物を別々に遠心分離
し、洗浄する。
し、洗浄する。
【００４３】再懸濁の後に、供与菌細胞及び受容菌細胞
を１：１の割合で混合する。
を１：１の割合で混合する。
【００４４】この交叉混合物（最適量０．２ｍｌ）を、
予めＬＢＧｍ0.2−寒天プレート上に配置されたＮＣ−
フィルター（Ｆｉｒｍａ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社のニト
ロセルロースフィルター）上に滴加する。
予めＬＢＧｍ0.2−寒天プレート上に配置されたＮＣ−
フィルター（Ｆｉｒｍａ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社のニト
ロセルロースフィルター）上に滴加する。
【００４５】この交叉混合物をふ卵器中、３７℃で約２
０時間恒温保持する。
０時間恒温保持する。
【００４６】この恒温保持の後に、この交叉混合物の選
択をＬＢＧＮｘ20Ｅｍ25上で行なう。このプレートの３
０℃で２日間恒温保持の後に、エリスロマイシン耐性コ
ロニーはＬＢＧＥｍ50、ＭＭＥｍ50（ＭＭ＝最小培地；
Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓｅｎ等１９８９）、ＬＢＧＴｃ10
及びＬＢＧＣｍ10上に移動することができる。
択をＬＢＧＮｘ20Ｅｍ25上で行なう。このプレートの３
０℃で２日間恒温保持の後に、エリスロマイシン耐性コ
ロニーはＬＢＧＥｍ50、ＭＭＥｍ50（ＭＭ＝最小培地；
Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓｅｎ等１９８９）、ＬＢＧＴｃ10
及びＬＢＧＣｍ10上に移動することができる。
【００４７】結果 この組み込み突然変異体の９９％は、Ｅｍ、Ｔｃ及びＣ
ｍに対して耐性であり（ベクターｐＫ１の耐性因子；Ｅ
ｍr及びＴｃrはＲ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂの耐性因
子；ＣｍrはベクターｐＳＵＰ１０２の耐性因子であ
る）、これらのトランス接合体において、ベクターｐＫ
１はその染色体中に組込まれている。このトランス接合
体の１％では、エリスロマイシンに対する耐性のみが確
認できる（ここでは、Ｒ−プラスミド−ＤＮＡの１部分
がこの染色体中に組込まれており、Ｒ−プラスミドｐＣ
ｘＭ８２ＢのこのＤＮＡ−領域上にはＥｍ−耐性因子が
存在する）。ベクターｐＫ１もしくはこのベクターの１
部のＣ．グルタミクムの染色体内への非特異的組込み
は、組込み体の染色体ＤＮＡとジゴキシゲニン−ｄＵＴ
Ｐ−標識されたＲ−プラスミド−ＤＮＡとのハイブリド
形成により立証することができた。
ｍに対して耐性であり（ベクターｐＫ１の耐性因子；Ｅ
ｍr及びＴｃrはＲ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂの耐性因
子；ＣｍrはベクターｐＳＵＰ１０２の耐性因子であ
る）、これらのトランス接合体において、ベクターｐＫ
１はその染色体中に組込まれている。このトランス接合
体の１％では、エリスロマイシンに対する耐性のみが確
認できる（ここでは、Ｒ−プラスミド−ＤＮＡの１部分
がこの染色体中に組込まれており、Ｒ−プラスミドｐＣ
ｘＭ８２ＢのこのＤＮＡ−領域上にはＥｍ−耐性因子が
存在する）。ベクターｐＫ１もしくはこのベクターの１
部のＣ．グルタミクムの染色体内への非特異的組込み
は、組込み体の染色体ＤＮＡとジゴキシゲニン−ｄＵＴ
Ｐ−標識されたＲ−プラスミド−ＤＮＡとのハイブリド
形成により立証することができた。
【００４８】このＤＮＡ−標識付けは、ベーリンガー・
マンハイム社のＤＮＡラベリング・アンド・デテクティ
ング・キットを用いて実施した。この実施はこの製造者
の指示に従がい行なった。ＤＮＡ−転移はサザン法（１
９７５）により行なった。
マンハイム社のＤＮＡラベリング・アンド・デテクティ
ング・キットを用いて実施した。この実施はこの製造者
の指示に従がい行なった。ＤＮＡ−転移はサザン法（１
９７５）により行なった。
【００４９】交叉バッチ１個当り、前記条件下で転移接
合体（Ｔｒａｎｓｋｏｎｊｕｇａｎｔｅｎ）約１３０〜
１５０個が得られる。栄養要求性細胞がこの転移接合体
の下で０．５〜１％の頻度で認められる。
合体（Ｔｒａｎｓｋｏｎｊｕｇａｎｔｅｎ）約１３０〜
１５０個が得られる。栄養要求性細胞がこの転移接合体
の下で０．５〜１％の頻度で認められる。
【００５０】従来実施されたトランスポゾン−突然変異
生成バッチでは、３種の栄養要求性Ｃ．グルタミクム細
胞（ａ１Ｌｅｕ-、Ａ２Ｔｒｐ-、Ａ３Ｓｅｒ-）が単離
された。これらの細胞は、ＭＭＥｍ50上では生長しな
い。栄養要求性の確認のために、これらの細胞をホリデ
ィの方法（Ｍｅｔｈｏｄｅ ｖｏｎ Ｈｏｌｌｉｄａ
ｙ；１９５６）により補足した。
生成バッチでは、３種の栄養要求性Ｃ．グルタミクム細
胞（ａ１Ｌｅｕ-、Ａ２Ｔｒｐ-、Ａ３Ｓｅｒ-）が単離
された。これらの細胞は、ＭＭＥｍ50上では生長しな
い。栄養要求性の確認のために、これらの細胞をホリデ
ィの方法（Ｍｅｔｈｏｄｅ ｖｏｎ Ｈｏｌｌｉｄａ
ｙ；１９５６）により補足した。
【００５１】これにより、ベクターｐＫ１は、Ｅ．コリ
ーのＣ．グルタミクムへの移動の後に、非特異的に、
Ｃ．グルタミクムの染色体中に組込まれることが判っ
た。染色体中へのこのＲ−プラスミド−フラグメントの
非特異的組込みは、挿入体の全−ＤＮＡと標識付きＲ−
プラスミド−ＤＮＡとのハイブリド形成により立証され
た。この非特異性組込みの可能性は、〜１４．４Ｋｂの
Ｒ−プラスミド−フラグメントの存在に結びついてお
り、トランスポゾンもしくは挿入配列の存在により説明
される。
ーのＣ．グルタミクムへの移動の後に、非特異的に、
Ｃ．グルタミクムの染色体中に組込まれることが判っ
た。染色体中へのこのＲ−プラスミド−フラグメントの
非特異的組込みは、挿入体の全−ＤＮＡと標識付きＲ−
プラスミド−ＤＮＡとのハイブリド形成により立証され
た。この非特異性組込みの可能性は、〜１４．４Ｋｂの
Ｒ−プラスミド−フラグメントの存在に結びついてお
り、トランスポゾンもしくは挿入配列の存在により説明
される。
【００５２】本明細書中の略字を次に示す： Ｃ．グルタミクム＝コリネバクテリウム・グルタミクム Ｃｍ＝クロラムフェニコール、 Ｅ．コリー＝エシェリシア・コリー、 Ｅｍ＝エリスロマイシン、 Ｅｍ25＝培地１ｍｌ当りエリスロマイシン２５μｇ、 Ｋｍ＝カナマイシン、 Ｋｅｕ-＝ロイシン−栄養要求性 ＬＢＧ＝グルコース１ｇを含有するルリア・ブイヨン μｇ＝マイクログラム、 Ｎｘ＝ナリジキシン酸、 Ｎｘ50＝培地１ｍｌ当りナリジキシン酸５０μｇ、 Ｎｃ＝ニトロセルロースフィルター、 ｐＣｘＭ８２Ｂ＝菌株コリネバクテリウム・キセロシス
Ｍ８２Ｂからのプラスミド、 ｐＫ２△Ｈｉ＝内部ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントの失
欠を有するプラスミドｐＫ２、 Ｒ−プラスミド＝耐性プラスミド、 Ｓｅｒ-＝セリン−栄養要求性、 Ｔｃ＝テトラサイクリン、 Ｔｎ＝トランスポゾン、 Ｔｒｐ-＝トリプトファン−栄養要求性。
Ｍ８２Ｂからのプラスミド、 ｐＫ２△Ｈｉ＝内部ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントの失
欠を有するプラスミドｐＫ２、 Ｒ−プラスミド＝耐性プラスミド、 Ｓｅｒ-＝セリン−栄養要求性、 Ｔｃ＝テトラサイクリン、 Ｔｎ＝トランスポゾン、 Ｔｒｐ-＝トリプトファン−栄養要求性。
【００５３】参照文献： Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９７５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳ７２、３６２８以降、 Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９Ａ
ｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１、２３８以降、 Ｈｏｌｌｉｄａｙ、１９５６ Ｎａｔｕｒｅ ４５４
０、９８７、 Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８１ Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５、３４１以降、 Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ ａｎｄ Ｃａｓａｄａｄａｎ、１
９８６、Ｊ．Ｂａｃｔ．１６７、７１１以降、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｍａｒｉａ ｄｏ Ｃａｒｍｏ ｄｅ Ｆｒｅｉｒｅ
Ｂａｓｔｏｓ ａｎｄＥｌｌｅｎ Ｍｕｒｐｈｙ、１９
８８ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ ｌ７、２９３５以降、 Ｍｃ Ｌａｕｇｈｌｉｎ ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ、１９
８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５、２
３２９以降、 Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｇｅｎ
ｅ２６、１０１以降、 Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ、１９８
４、Ｐｌａｓｍｉｓｄ１２、１１９以降、 Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １；１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８、６４１−６５９、Ｓｉｍ
ｏｎ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｇｅｎｅ ８０、１６１
以降、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９８、５０３以降、 Ｔｏｍｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９８０ Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１４１、１３６６以降、 Ｖａｎｄｅｙａｒ ａｎ
ｄ Ｚａｈｌｅｒ、１９８６ Ｊ．Ｂａｃｔ．１６７、
５３０以降。
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳ７２、３６２８以降、 Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９Ａ
ｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１、２３８以降、 Ｈｏｌｌｉｄａｙ、１９５６ Ｎａｔｕｒｅ ４５４
０、９８７、 Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８１ Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５、３４１以降、 Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ ａｎｄ Ｃａｓａｄａｄａｎ、１
９８６、Ｊ．Ｂａｃｔ．１６７、７１１以降、 Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｍａｒｉａ ｄｏ Ｃａｒｍｏ ｄｅ Ｆｒｅｉｒｅ
Ｂａｓｔｏｓ ａｎｄＥｌｌｅｎ Ｍｕｒｐｈｙ、１９
８８ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ ｌ７、２９３５以降、 Ｍｃ Ｌａｕｇｈｌｉｎ ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ、１９
８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５、２
３２９以降、 Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｇｅｎ
ｅ２６、１０１以降、 Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇｍａｎ、１９８
４、Ｐｌａｓｍｉｓｄ１２、１１９以降、 Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ、１９８３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １；１９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１８、６４１−６５９、Ｓｉｍ
ｏｎ ｅｔ ａｌ、１９８９、Ｇｅｎｅ ８０、１６１
以降、 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９８、５０３以降、 Ｔｏｍｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９８０ Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１４１、１３６６以降、 Ｖａｎｄｅｙａｒ ａｎ
ｄ Ｚａｈｌｅｒ、１９８６ Ｊ．Ｂａｃｔ．１６７、
５３０以降。
【図１】Ｒ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂの制限地図であ
る
る
【図２】ベクターｐＳＵＰ１０２からプラスミドｐＫ２
を得る経過を示す図である。
を得る経過を示す図である。
【図３】プラスミドｐＫ２からベクターｐＫ１を得る経
過を示す図である。
過を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス シェーファー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ビュンデルシュトラーセ 33 (72)発明者 イェルン カリノヴスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ドレーゲシュトラーセ 25 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト 15 アム ヴァルトシュレスヒェン ２
Claims (11)
- 【請求項１】 コリネバクテリウム・キセロシスＤＳＭ
５０２１中に含有されるＲ−プラスミドｐＣｘＭ８２Ｂ
の〜１４．４ＫＢのフラグメントより成り、組込みのた
めに重要なＤＮＡ−領域がＲ−プラスミド上の座標３
０．４〜４４．８ＫＢの間に存在するトランスポゾンに
おいて、これは、ＳａｌＩ−切断位置（座標３０．４Ｋ
ｂ）及びＨｉｎｄＩＩＩ−切断位置（座標４４．８Ｋ
ｂ）により限定され、テトラサイクリン−及びエリスロ
マイシン耐性に関してコードするＤＮＡ−断片を有する
ことを特徴とする、トランスポゾン。 - 【請求項２】ａ） Ｅ．コリー中で機能性のレプリコン
１個を有するＤＮＡ−セグメント ｂ） 起動性−及び転移性機能に関してコードするＤＮ
Ａ−フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔｅ及びｏｒｉｔ）を
有する第２のＤＮＡ−フラグメント及び ｃ） 請求項１によるトランスポゾン より成る、起動性で、非自己転移性のベクター（テスト
ベクター）。 - 【請求項３】 ベクターが１．９Ｋｂの大きさのプラス
ミドＲＰ４のＤＮＡ−フラグメント（Ｍｏｂ−ｓｉｔ
ｅ）を有する、請求項１記載のテストベクター。 - 【請求項４】 Ｅ．コリーベクターをｐＳＵＰ１０１、
ｐＳＵ１０２、ｐＳＵ２０１、ｐＳＵ２０２、ｐＳＵ２
０３、ｐＳＵ３０１、ｐＳＵ４０１の群から選択する、
請求項２又は３記載のテストベクター。 - 【請求項５】 〜１９．７Ｋｂの大きさを有し、トラン
スポゾン及びＨｉｎｄＩＩＩ−及びＳａｌＩ−切断位置
により限定された長さ〜５．３ＫｂのベクターｐＳＵ１
０２のフラグメントより成る、請求項４記載のテストベ
クターｐＫ１。 - 【請求項６】 グラム陽性菌を突然変異させるために、
トランスポゾンを担体プラスミドを用いて形質転換によ
り受容菌内に導入し、この際、担体プラスミドはそこで
複製しないか又は低いインキュベーション温度でのみ複
製することを特徴とする、グラム陽性菌の突然変異生成
法。 - 【請求項７】 Ｅ．コリー起動体菌株からの起動性ベク
ターの接合的転移によりグラム陽性菌を突然変異させる
方法において、グラム陽性菌の制限欠失細胞を製造し、
これを、公知方法により、中にトランスポゾンを含有す
る起動性ベクターを担持しているＥ．コリー菌株と交叉
させることを特徴とする、グラム陽性菌の突然変異生成
法。 - 【請求項８】 テストベクターｐＫ１を使用する、請求
項７記載の方法。 - 【請求項９】 トランスポゾンを担持しているテストベ
クターにより形質転換されたグラム陽性菌。 - 【請求項１０】 テストベクターｐＫ１により形質転換
された、グラム陽性菌。 - 【請求項１１】 形質転換により得られた栄養要求性を
有する、請求項１０記載のグラム陽性菌。
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|---|---|---|---|
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| DE (2) | DE4006637A1 (ja) |
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| FR2688515B1 (fr) * | 1992-03-13 | 1995-03-31 | Institut Rech Agronomique | Plasmide thermosensible. |
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| CA2180202A1 (en) * | 1995-06-30 | 1996-12-31 | Mika Moriya | Method of amplifying gene using artificial transposon |
| US20030234468A1 (en) * | 1997-01-17 | 2003-12-25 | Krishnakumar Rangachari | Soft, absorbent material for use in absorbent articles and process for making the material |
| US20010031358A1 (en) * | 1997-01-17 | 2001-10-18 | Erol Tan | Soft, strong, absorbent material for use in absorbent articles |
| GB0115894D0 (en) * | 2001-06-28 | 2001-08-22 | Plant Bioscience Ltd | Methods and materials for generating genetic disruptions in bacterial cells |
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| UA100692C2 (ru) | 2007-05-02 | 2013-01-25 | Мериал Лимитед | Днк-плазмиды, имеющие повышенную экспрессию и стабильность |
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- 1990-12-05 EP EP90123263A patent/EP0445385B1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1991-02-27 JP JP03118091A patent/JP3148262B2/ja not_active Expired - Fee Related
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