JPS60186277A - 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 - Google Patents
新規なプラスミドを保有する新規な微生物Info
- Publication number
- JPS60186277A JPS60186277A JP4336184A JP4336184A JPS60186277A JP S60186277 A JPS60186277 A JP S60186277A JP 4336184 A JP4336184 A JP 4336184A JP 4336184 A JP4336184 A JP 4336184A JP S60186277 A JPS60186277 A JP S60186277A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- anaerobic
- novel
- host
- ypg
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は嫌気性熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベ
クターとして有用なプラスミドを保有する新規な微生物
に関するものであり、より詳しくは分子量が約３．３メ
ガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地図によ
り特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新規なサ
ーモアナエロバクターに関するものである。
クターとして有用なプラスミドを保有する新規な微生物
に関するものであり、より詳しくは分子量が約３．３メ
ガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地図によ
り特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新規なサ
ーモアナエロバクターに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
５０〜８０℃の高温条件下でセルロース、ヘミセルロー
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気正好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行われ
ていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となるべ
きプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気性
好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこで
、本発明者らは嫌気性好熱菌より、選択マーカー（その
プラスミドが宿主内に存在していることを示すマーカー
）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行
った。その結果ネオマイシン耐性を示したサーモアナエ
ロバクターから分子量約３．３メガダルトンのプラスミ
ドを単離することに成功した。
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気正好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行われ
ていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となるべ
きプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気性
好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこで
、本発明者らは嫌気性好熱菌より、選択マーカー（その
プラスミドが宿主内に存在していることを示すマーカー
）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行
った。その結果ネオマイシン耐性を示したサーモアナエ
ロバクターから分子量約３．３メガダルトンのプラスミ
ドを単離することに成功した。
このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
６２と略称する）。
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
６２と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
上ｃｏＲＩはエシャリア・コリ由来の酵素、ＨｐａＩは
ハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｃｌ
ａＩはカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＡｃｃＩは
アネトバクター・カルコアセティカス由来の酵素、Ｂｇ
ｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素をそれぞれ示
している。
ハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｃｌ
ａＩはカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＡｃｃＩは
アネトバクター・カルコアセティカス由来の酵素、Ｂｇ
ｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素をそれぞれ示
している。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌のように、その生育環境が栄養源に乏しくしかも
抗生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場
合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容
易ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティ
ック・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与す
るという方式でベクター開発を行わなければならないで
あろう。その際にｐＳＨ６２を利用すれば、極めて便利
であるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ６
２は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるから
であり、第２には、小さい分子量を有するという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利
点を有しているからである。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌のように、その生育環境が栄養源に乏しくしかも
抗生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場
合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容
易ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティ
ック・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与す
るという方式でベクター開発を行わなければならないで
あろう。その際にｐＳＨ６２を利用すれば、極めて便利
であるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ６
２は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるから
であり、第２には、小さい分子量を有するという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利
点を有しているからである。
更にｐＳＨ６２は図からも明らかなように、ＥｃｏＲＩ
Ｉ、Ｂｇｌ２ＩＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特
定のしかも限られた位置に有している。このことはｐＳ
Ｈ６２をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種
遺伝子の導入部位を有意に保持できるという点で有利で
ある。
Ｉ、Ｂｇｌ２ＩＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特
定のしかも限られた位置に有している。このことはｐＳ
Ｈ６２をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種
遺伝子の導入部位を有意に保持できるという点で有利で
ある。
本プラスミドをベクターとして用いることにより、バイ
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性熱
菌の育種が可能となろう。
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性熱
菌の育種が可能となろう。
ｐＳＨ６２の入手は、本発明者らが土壌中から新たに分
離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．６
２をＹＰＧ倍地（ディフコ・イーストエキストラクト０
．２％ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣｌ０
．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−
システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖後期
迄蔵書て得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって
溶菌させる事によって達せられるが、本プラスミドを保
有する点で本菌株は新規である。
離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．６
２をＹＰＧ倍地（ディフコ・イーストエキストラクト０
．２％ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣｌ０
．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−
システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖後期
迄蔵書て得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって
溶菌させる事によって達せられるが、本プラスミドを保
有する点で本菌株は新規である。
また、サモアナエロバクターＮｏ．６２の菌学的性質を
表に示すがｐＳＨ６２を保有する点では従来には認めら
れない新規な微生物である本菌株はネオマイシン耐性株
として土壌中より分離されたものである。
表に示すがｐＳＨ６２を保有する点では従来には認めら
れない新規な微生物である本菌株はネオマイシン耐性株
として土壌中より分離されたものである。
表
（分類学的性質）
生育至適温度： ６６℃
生育温度範囲： ５０〜７４℃
形態： 周鞭毛を有する稈菌 ０．３〜０．４×１〜４
μｍ胞子形成性： なし グラム染色： 不定 ＧＣ含量： ３４％ 主要生産物： エタノール、酢酸、乳酸糖の利用性：
グルコース、ラクトース、マルトース、マンノース キ
シロース、セロビオース、デンプンなお、本菌株は微工
研菌寄第７４９３号として寄託されている。
μｍ胞子形成性： なし グラム染色： 不定 ＧＣ含量： ３４％ 主要生産物： エタノール、酢酸、乳酸糖の利用性：
グルコース、ラクトース、マルトース、マンノース キ
シロース、セロビオース、デンプンなお、本菌株は微工
研菌寄第７４９３号として寄託されている。
以下、実施例により本発明を具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
茨城県地方の土壌約０．５ｇをＹＰＧ倍地（ディフコ・
イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペプト
ン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、Ｎａ
２Ｃｏ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．
５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃で約
１８時間培養後、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹ
ＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つからサー
モアナエロバクターＮｏ．６２（微工研菌寄第７４９３
号）が得られた。
イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペプト
ン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、Ｎａ
２Ｃｏ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．
５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃で約
１８時間培養後、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＹ
ＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つからサー
モアナエロバクターＮｏ．６２（微工研菌寄第７４９３
号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＳＨ６２のサーモアナエロバクターＮｏ．
６２からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．６２（微工研菌寄第７４
９３号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ倍地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ倍地に接種し、７０
℃で嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって
集め、アジ下ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＮａＣｌ、ｐＨ７．５）線状液、菌体湿重量４ｇ当り
アジ化ナトリム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有Ｔ
ＥＳ１０ｍｌに懸濁するリボゾーム（１０ｍｇ／ｍｌ）
を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃２
０分杆放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０％
ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌの
アルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ，０．２Ｎ ＮａＯＨ
）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）を
加え、０℃に２時間放置する。
６２からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．６２（微工研菌寄第７４
９３号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ倍地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ倍地に接種し、７０
℃で嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって
集め、アジ下ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＮａＣｌ、ｐＨ７．５）線状液、菌体湿重量４ｇ当り
アジ化ナトリム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有Ｔ
ＥＳ１０ｍｌに懸濁するリボゾーム（１０ｍｇ／ｍｌ）
を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃２
０分杆放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０％
ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌの
アルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ，０．２Ｎ ＮａＯＨ
）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）を
加え、０℃に２時間放置する。
これを７０００ｐｐｍ、１時間の遠心をおこない上清を
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｐｐｍ、１０分の
遠心で沈殿を得る。この沈殿を５０ｍｌの９５％エタノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムプロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｐｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＦＤＩＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透
析する事によってプラスミド溶液が得られる。
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｐｐｍ、１０分の
遠心で沈殿を得る。この沈殿を５０ｍｌの９５％エタノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムプロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｐｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＦＤＩＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透
析する事によってプラスミド溶液が得られる。
ｐＳＨ６２の特性決定の手順
ｐＳＨ６２の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｄｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｄｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
、ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．
７、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１
３、ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片
（０．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、
０．１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０
．１２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制
限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノ
ール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶
解して行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー
・マンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル
電気泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．
７％の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長
さ１ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なっ
た。
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
、ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．
７、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１
３、ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片
（０．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、
０．１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０
．１２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制
限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノ
ール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶
解して行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー
・マンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル
電気泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．
７％の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長
さ１ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なっ
た。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの低
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの低
電圧によって２〜３時間行った。
従来、嫌気性好熱菌においてプラスミドが検出された例
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．６２の有するｐＳＨ６２は全く新規なプラスミ
ドである。
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．６２の有するｐＳＨ６２は全く新規なプラスミ
ドである。
図−１はｐＳＨ６２の制限酵素開裂地図を示し、図中の
ＥｃｏＲＩはエシャリシア・コリ由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｃ
ｌａＩはカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＡｃｃＩ
はアシネトバクター・カルコアセティカス由来の酵素、
ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素をそれぞ
れ示している。
ＥｃｏＲＩはエシャリシア・コリ由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｃ
ｌａＩはカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＡｃｃＩ
はアシネトバクター・カルコアセティカス由来の酵素、
ＢｇｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素をそれぞ
れ示している。
Claims (1)
- 分子値が約３．３メガダルトンであり、図に示される制
限酵素開裂地図で特徴づけられるプラスミドを保有する
新規なサーモアナエロバクターＮｏ．６２。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4336184A JPS60186277A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4336184A JPS60186277A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186277A true JPS60186277A (ja) | 1985-09-21 |
| JPS6221510B2 JPS6221510B2 (ja) | 1987-05-13 |
Family
ID=12661713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4336184A Granted JPS60186277A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60186277A (ja) |
-
1984
- 1984-03-07 JP JP4336184A patent/JPS60186277A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6221510B2 (ja) | 1987-05-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |