JPS60186278A - 新規プラスミドを保有する新規微生物 - Google Patents
新規プラスミドを保有する新規微生物Info
- Publication number
- JPS60186278A JPS60186278A JP59043363A JP4336384A JPS60186278A JP S60186278 A JPS60186278 A JP S60186278A JP 59043363 A JP59043363 A JP 59043363A JP 4336384 A JP4336384 A JP 4336384A JP S60186278 A JPS60186278 A JP S60186278A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- anaerobic
- thermoanaerobacter
- novel
- host
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は嫌気性好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験の
ベクターとして有用なプラスミドを保存する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはその分子量が約３
．８メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地
図でより特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新
規なサーモアナエロバクターに関するものである。
ベクターとして有用なプラスミドを保存する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはその分子量が約３
．８メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地
図でより特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新
規なサーモアナエロバクターに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
５０〜８０℃の高温条件下でセルロース、ヘミセルロー
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って嫌気性
好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つ
の、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌の
宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行われて
いない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となるべき
プラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気性好
熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこで、
本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（その
プラスミドが宿主内に存在していることを示すマーカー
）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行
った。その結果ストレプトマイシン耐性を示したサーモ
アナエロバクター〜分子量約３．８メガダルトンのプラ
スミドを単離する事に成功した。
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って嫌気性
好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つ
の、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌の
宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行われて
いない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となるべき
プラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気性好
熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこで、
本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（その
プラスミドが宿主内に存在していることを示すマーカー
）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索を行
った。その結果ストレプトマイシン耐性を示したサーモ
アナエロバクター〜分子量約３．８メガダルトンのプラ
スミドを単離する事に成功した。
このプラスミドは前記の制限酵素開裂地図に示される如
く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断点
を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨと
略称する）。
く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断点
を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨと
略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮｉはバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｈ
ｐａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の
酵素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・プルガリス由来の酵素
をそれぞれ示している。
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮｉはバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、Ｈ
ｐａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の
酵素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・プルガリス由来の酵素
をそれぞれ示している。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ２９を利用すれば、極めて便利で
あるものとが考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ２
９は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるから
であり、第２には、小さい分子量を有するという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利
点を有しているからである。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ２９を利用すれば、極めて便利で
あるものとが考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ２
９は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるから
であり、第２には、小さい分子量を有するという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利
点を有しているからである。
更にｐＳＨ２９は図からも明らかなように、ＥｃｏＲＩ
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ２９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ２９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
本プラスミドをベクターとして用いることにより、バイ
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性熱
菌の育種が可能となろう。
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性熱
菌の育種が可能となろう。
ｐＳＨ２９の入手は、本発明者らが温泉水中から新たに
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
２９をＹＰＧ倍地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって様金させる事によって達せられるが、本プラス
ミドを保有する点で本菌株は新規である。
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
２９をＹＰＧ倍地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって様金させる事によって達せられるが、本プラス
ミドを保有する点で本菌株は新規である。
また、ワームアナエロバクターＮｏ．２６の菌学的性質
を表に示すがｐＳＨ２９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
を表に示すがｐＳＨ２９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
本菌株はストレプトマイシン耐性株として温泉水中より
分離されたものである。
分離されたものである。
表
（分類学的性質）
生育至適温度： ６９℃
生育温度範囲： ５０〜７８℃
形態：周鞭毛を有する桿菌 ０．５〜０．７×２〜１５
μｍ胞子形成： なし グラム染色： 不定 ＧＣ含量： ３４％ 主要生産物： 酢酸、乳酸 糖の利用性： グルコース、ラクトース、マルトース、
キシロース、セロビオース、デンプンなお、本菌株は
微工研菌寄第７４９４号として寄託されている。
μｍ胞子形成： なし グラム染色： 不定 ＧＣ含量： ３４％ 主要生産物： 酢酸、乳酸 糖の利用性： グルコース、ラクトース、マルトース、
キシロース、セロビオース、デンプンなお、本菌株は
微工研菌寄第７４９４号として寄託されている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
静岡県熱川温泉の温泉水約１ｍｌをＹＰＧ倍値（ディフ
コ・イーストエキストラクト０．２％大五栄養ポリベプ
トン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、Ｎ
ａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７
．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃で
約１８時間培養後、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ
を含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つ
からサーもアナエロバクターＮｏ，２９（微工研菌寄第
７４９４号）が得られた。
コ・イーストエキストラクト０．２％大五栄養ポリベプ
トン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、Ｎ
ａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７
．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気条件下、７０℃で
約１８時間培養後、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ
を含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの一つ
からサーもアナエロバクターＮｏ，２９（微工研菌寄第
７４９４号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＳＨ２９のサーモアナエロバクターＮｏ．
２９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌寄第７４
９４号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ倍地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ倍地に接種し、７０
℃嫌気性条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって
集め、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２
０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍ
ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄液、菌体湿重量ｇ当り
アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ籐含有
ＴＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を３ｍｌ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃
２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０
％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌ
のアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）
を加え、０℃に２時間放置する。
２９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌寄第７４
９４号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ倍地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ倍地に接種し、７０
℃嫌気性条件下１２時間培養する。菌体を遠心によって
集め、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２
０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍ
ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄液、菌体湿重量ｇ当り
アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ籐含有
ＴＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を３ｍｌ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃
２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０
％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌ
のアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）
を加え、０℃に２時間放置する。
これを７０００ｐｐｍ、１時間の遠心をおこない上清を
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｐｐｍ、１０分の
遠心で沈殿を得る。この沈殿を５０ｍｌの９５％エタノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｐｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に
透析する事によってプラスミド溶液が得られる。
得る。この上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え
、２時間−２０℃に静置し、７０００ｐｐｍ、１０分の
遠心で沈殿を得る。この沈殿を５０ｍｌの９５％エタノ
ールで洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、
ＣｓＣｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．
５８に調整する。この試料を３８０００ｐｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に
透析する事によってプラスミド溶液が得られる。
ｐＳＨ２９の特性決定の手順
ｐＳＨ２９の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｃｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
ｃｏｉｌｃｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＴＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解片（１３．７、４．７４、
３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｍｄ）、φ×
１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（１４．６、０．
８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．１
９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１２
０、０．０７３、０．４４ｍｄ）を用いた。制限酵素に
よる切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈殿
によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶解して行
なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マンハ
イム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動
は、シーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の
濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃ
ｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＴＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解片（１３．７、４．７４、
３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｍｄ）、φ×
１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（１４．６、０．
８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．１
９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１２
０、０．０７３、０．４４ｍｄ）を用いた。制限酵素に
よる切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈殿
によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶解して行
なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マンハ
イム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動
は、シーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の
濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃ
ｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビルアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビルアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
従来、嫌気性好熱菌においてプラスミドが検出された例
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．２９有する。ｐＳＨ２９は全く新規なプラスミ
ドである。
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．２９有する。ｐＳＨ２９は全く新規なプラスミ
ドである。
図−１はｐＳＨ２９の制限酵素開裂地図を示し、図中の
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはパ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
Ｉはハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、
ＰｖｕＩＩはプロテウス・プルガリス由来の酵素をそれ
それ示している。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはパ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
Ｉはハエモフィルス・パラインフルエンザ由来の酵素、
ＰｖｕＩＩはプロテウス・プルガリス由来の酵素をそれ
それ示している。
Claims (1)
- 分子量が約３．８メガダルトンであり、図に示される制
限酵素開裂地図で特徴づけられるプラスミドを保有する
新規なサーモアナエロバクターＮｏ．２９。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043363A JPS60186278A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規プラスミドを保有する新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043363A JPS60186278A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規プラスミドを保有する新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186278A true JPS60186278A (ja) | 1985-09-21 |
| JPS6221511B2 JPS6221511B2 (ja) | 1987-05-13 |
Family
ID=12661770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59043363A Granted JPS60186278A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 新規プラスミドを保有する新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60186278A (ja) |
-
1984
- 1984-03-07 JP JP59043363A patent/JPS60186278A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6221511B2 (ja) | 1987-05-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |