JPS5928392B2 - テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 - Google Patents
テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物Info
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- JPS5928392B2 JPS5928392B2 JP57157367A JP15736782A JPS5928392B2 JP S5928392 B2 JPS5928392 B2 JP S5928392B2 JP 57157367 A JP57157367 A JP 57157367A JP 15736782 A JP15736782 A JP 15736782A JP S5928392 B2 JPS5928392 B2 JP S5928392B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベクタ
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはテトラサイクリン
耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約２．８メガ
ダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地図により
特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新規なバチ
ルス・ステアロサ７−モフイルスに関するものである。
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはテトラサイクリン
耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約２．８メガ
ダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地図により
特徴づけられる新規なプラスミドを保有する新規なバチ
ルス・ステアロサ７−モフイルスに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究かおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
系で広く研究かおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
大腸菌の宿主−ベクター系はほぼ完成されており、また
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系か
開発され応用への道か検討されつつある。
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系か
開発され応用への道か検討されつつある。
しかし、上記の菌はいずれも生育温度か３０℃〜３７℃
の中温菌である点に問題かある。
の中温菌である点に問題かある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度か５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度か７５℃以上である
高温好熱菌とに大別されるか、いずれについても、その
有する酵素、生体成分か耐熱性、耐溶媒性に優れている
事か知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
の応用という点から注目を集めている。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度か７５℃以上である
高温好熱菌とに大別されるか、いずれについても、その
有する酵素、生体成分か耐熱性、耐溶媒性に優れている
事か知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
の応用という点から注目を集めている。
従って、好熱性細菌の育種か重畳と考えられろが、その
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられろプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられろプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、アンド サカグチ。
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、アンド サカグチ。
Ｋ−Ｊ −Ｇ ｅｎ−Ｍ １ｃｒｏｂ、 、 １０４．
１９３−１９９（１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、Ａ
、Ｈ，Ａ、 、ブルドン、Ｃ，Ｊ。
１９３−１９９（１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、Ａ
、Ｈ，Ａ、 、ブルドン、Ｃ，Ｊ。
アンド アトキンソン、Ｔ。
Ｊ−Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂ−２１１４，４０１−４０８
（１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
ミドｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハ
ム、 Ａ、Ｈ，Ａ、 、ブルドン、Ｃ，Ｊ。
（１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
ミドｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハ
ム、 Ａ、Ｈ，Ａ、 、ブルドン、Ｃ，Ｊ。
アンド アトキンソン、Ｔ。
Ｊ−Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂ−２ｌ１９．１０９−１１５
（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ０Ｍ、アンド アイバ。
（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ０Ｍ、アンド アイバ。
Ｓ−Ｊ−Ｂａｃｔ−、１４６（３）、 １０９１−１０
９７（１９８１）（５）サーマス・サーモフィルスから
単離されたプラスミド（ｐＴＴｌ）の物理的性状 エベルハー￥Ｍ、Ｄ、、バスクエズＩ Ｃ’ ｊ バレ
ンズエラ、Ｐ、、ビキュナ、Ｒ，アンド ユデレビツク
、Ａ−Ｐｌａｓｍｉｄ、６．１−６（１９８１）（６）
プラスミドＤＮＡによるバチルス・ステアロサーモ
フィルスの形質転換及びバチルス・ステアロサーモフィ
ルス、バチルス・ズブチルス間共用ベクターの訃質 イマナカ、Ｔ、、フジイ０Ｍ、、アラモリ、■。
９７（１９８１）（５）サーマス・サーモフィルスから
単離されたプラスミド（ｐＴＴｌ）の物理的性状 エベルハー￥Ｍ、Ｄ、、バスクエズＩ Ｃ’ ｊ バレ
ンズエラ、Ｐ、、ビキュナ、Ｒ，アンド ユデレビツク
、Ａ−Ｐｌａｓｍｉｄ、６．１−６（１９８１）（６）
プラスミドＤＮＡによるバチルス・ステアロサーモ
フィルスの形質転換及びバチルス・ステアロサーモフィ
ルス、バチルス・ズブチルス間共用ベクターの訃質 イマナカ、Ｔ、、フジイ０Ｍ、、アラモリ、■。
アンド ア不バ、Ｓ。
Ｊ−Ｂａｃｔ−，１４９（３）−８２４−８３０（１９
８２）そこで、本発明者らは、その宿主か好熱性の微生
物であって、その内部にテトラサイクリン耐性の遺伝子
を備えた微生物を自然界より検索した結果、バチルス菌
に属する一菌株から新規なプラスミドを得ることに成功
した。
８２）そこで、本発明者らは、その宿主か好熱性の微生
物であって、その内部にテトラサイクリン耐性の遺伝子
を備えた微生物を自然界より検索した結果、バチルス菌
に属する一菌株から新規なプラスミドを得ることに成功
した。
このプラスミドは前記の制限酵素開裂地図に示され、分
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子をプラ
スミドＤＮＡ上に有している。
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子をプラ
スミドＤＮＡ上に有している。
（以下、本プラスミドをｒｐＴＨＴ１５Ｊと略称する。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
（１）Ｃ１ａＩはカリオファノン・ラツム由来の酵素（
２）ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素（３）
ＨｈａＩはハエモフイルス・ハエモリティカス由来
の酵素 （４）Ｈｐａ■はハエモフイルス・パラインフルエンザ
工由来の酵素 （５） ＨｐａＩＩはハエモフイルス・パラインフル
エンザエ由来の酵素 （６） Ｔ ａｑ Ｉはサーマス・アクアティカス由
来の酵゛素を示す。
２）ＥｃｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素（３）
ＨｈａＩはハエモフイルス・ハエモリティカス由来
の酵素 （４）Ｈｐａ■はハエモフイルス・パラインフルエンザ
工由来の酵素 （５） ＨｐａＩＩはハエモフイルス・パラインフル
エンザエ由来の酵素 （６） Ｔ ａｑ Ｉはサーマス・アクアティカス由
来の酵゛素を示す。
以下、テトラサイクリン耐性を有する既知の好熱菌由来
のプラスミドとの相違点を表に示す。
のプラスミドとの相違点を表に示す。
表から明らかなように、ｐＴＨＴ１５は既知のプラスミ
ドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明ら
かに異なっており、新規なプラスミドであることが認め
られる。
ドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明ら
かに異なっており、新規なプラスミドであることが認め
られる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＴ１５
は好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びテトラサイク
リン耐性という極めて選択に有利なマーカーを有してい
る。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＴ１５
は好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びテトラサイク
リン耐性という極めて選択に有利なマーカーを有してい
る。
更にｐＴＨＴ］５は図からも明らかなように、Ｃ１ａＩ
、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、Ｈｐａｌｌなどの制限酵素
による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有してい
る。
、ＥｃｏＲＩ、ＨｐａＩ、Ｈｐａｌｌなどの制限酵素
による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有してい
る。
このことはｐＴＨＴ１５をベクターとして利用する際に
、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できろ
という点で有利である。
、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できろ
という点で有利である。
また、ｐＴＨＴ１５は枯草菌でも好熱菌でもベクターと
して利用できる点で有利である。
して利用できる点で有利である。
従って、ｐＴＨＴ１５をベクターとして用いろことによ
り異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化する
ことも可能である。
り異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化する
ことも可能である。
また、枯草菌とｐＴＨＴ１５の分離源である好熱菌、バ
チルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に
属するという共通点を有するため近縁性から既に枯草菌
で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現される可
能性が高いものと考えられる。
チルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に
属するという共通点を有するため近縁性から既に枯草菌
で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現される可
能性が高いものと考えられる。
そこで、既に枯草菌にクローン化されている遺伝子を、
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、発酵工業における冷却コストの節減か、好熱菌によ
る発酵生産によって達成される事となる。
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、発酵工業における冷却コストの節減か、好熱菌によ
る発酵生産によって達成される事となる。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用か可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用か可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
ｐＴＨＴ１５の入手は、本発明者らか土壌中から新たに
分離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスＴ１５株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖さ
せて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌
させる事によって達せられる。
分離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィ
ルスＴ１５株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖さ
せて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌
させる事によって達せられる。
また、バチルス・ステアロサーモフィルス株は好気性の
有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度か約
５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨＴ１
５を保有する点では従来には認められない新規な微生物
である。
有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度か約
５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨＴ１
５を保有する点では従来には認められない新規な微生物
である。
本菌株はテ 、トラサイクリンに対して耐性を示したの
みならずクロラムフェニコール、エリスロマイシンに対
シても耐性を示し、アンピシリン、カナマイシン、ネオ
マイシン、ストレプトマイシンには感受性を示した。
みならずクロラムフェニコール、エリスロマイシンに対
シても耐性を示し、アンピシリン、カナマイシン、ネオ
マイシン、ストレプトマイシンには感受性を示した。
なお、本菌株は微工研菌寄第６６６１号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例 １
（菌株のスクリーニング）
茨城県筑波郡谷田部町の土壌サンプル約１９をＴＹＳ培
地（ディフコ・トリプトン２係、ディフコ・イースト・
エキストラクト１係、ＮａＣ１１％）１００ｍｌに加え
５５°Ｃで約８時間振盪培養後、テトラサイクリン（２
０μｇ／１ｒＬｌ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育した
コロニーの一つからバチルス・ステアロサーモフィルス
Ｔ１５株（微工研菌寄第６６６１号）か得られた。
地（ディフコ・トリプトン２係、ディフコ・イースト・
エキストラクト１係、ＮａＣ１１％）１００ｍｌに加え
５５°Ｃで約８時間振盪培養後、テトラサイクリン（２
０μｇ／１ｒＬｌ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育した
コロニーの一つからバチルス・ステアロサーモフィルス
Ｔ１５株（微工研菌寄第６６６１号）か得られた。
実施例 ２
プラスミドｐＴＨＴ１５のバチルス・ステアロサーモフ
ィルスＴ１５株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＴ１５株（微工研菌
寄第６６６１号）の生物学的に純粋な培養基から１００
ｍ１のテトラサイクリン２０μｇ／ｒＩＬｌを含むＴＹ
Ｓ培地（ディフコ・バンド・トリプトン２チ、ディフコ
・イースト・エキストラクト１チ、ＮａＣ１１％）に接
種し５５°Ｃで１６〜１８時間振盪培養する。
ィルスＴ１５株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＴ１５株（微工研菌
寄第６６６１号）の生物学的に純粋な培養基から１００
ｍ１のテトラサイクリン２０μｇ／ｒＩＬｌを含むＴＹ
Ｓ培地（ディフコ・バンド・トリプトン２チ、ディフコ
・イースト・エキストラクト１チ、ＮａＣ１１％）に接
種し５５°Ｃで１６〜１８時間振盪培養する。
この培養液を１１のテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを
含有するＴＹＳ培地に接種し、５５°Ｃで５時間培養す
る。
含有するＴＹＳ培地に接種し、５５°Ｃで５時間培養す
る。
菌体を遠心によって集め、Ｔ ＥＳ （２０ｍＭＴ ｒ
ｉｓ−ＨＣＩ 。
ｉｓ−ＨＣＩ 。
５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣ１ｐＨ７，５）
で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ＴＬｌの２５係シヨ
糖含有ＴＥＳに懸濁する。
で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ＴＬｌの２５係シヨ
糖含有ＴＥＳに懸濁する。
リゾチーム（１０μｇ／ｒＩＬｌ）を２ｍｌ、 ０．２
５Ｍ−ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）４ｍｌを加え、０℃で
１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。
５Ｍ−ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）４ｍｌを加え、０℃で
１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。
この細胞混合液に２ｒｒＬｌの１０％ＳＤＳ、５ｍｌの
５Ｍ−ＮａＣ１を加え４°Ｃに１５〜１８時間静置する
。
５Ｍ−ＮａＣ１を加え４°Ｃに１５〜１８時間静置する
。
これを２８０００ｔ−＝ＩＸＩｌ、１時間の超遠心によ
って遠心し、上清を得る。
って遠心し、上清を得る。
この上清にポリエチレングリコール６０００を１０％
（Ｗ／ｖ ）加え、２〜３時間時間例静置２２００ｒｐ
ｍ、２分の遠心で沈澱を得ろ。
（Ｗ／ｖ ）加え、２〜３時間時間例静置２２００ｒｐ
ｍ、２分の遠心で沈澱を得ろ。
この沈澱を１ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣ１及びエチ
ジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６２に
調整する。
ジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６２に
調整する。
この試料を３８００ Ｏｒｐｍで３０〜４０時間、平衝
密度勾配遠心する。
密度勾配遠心する。
生じたプラスミドＤＮＡのバンドを集め、イソアミルア
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭＴ ｒｉｓ−ＨＣＩ 、１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍＭＮａＣ１）に透析する事によって純粋なｐ
ＴＨＴｌ５が得られる。
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭＴ ｒｉｓ−ＨＣＩ 、１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍＭＮａＣ１）に透析する事によって純粋なｐ
ＴＨＴｌ５が得られる。
ｐＴＨＴｌ５の特性決定の手１屓
ｐＴＨＴｌ５の分子量は、その超らせん構造（５ｕｐｅ
ｒｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）のＤＮＡ及
び制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電
気泳動より得られた。
ｒｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）のＤＮＡ及
び制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電
気泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐ ＢＲ３２２ＤＮＡ （２
，６７ｍｄ）、Ｃｏ１ＥＩＤＮＡ（４，２ｍｄ）及びラ
ムダＤＮＡのＨｉｎｄ ｌ［分解断片（１４，６、５
，８４、４，０５、２，６７、１，０４゜１．２１ 、
０．３４ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（
１３，７、４，７４、３，７３、３，４８。
，６７ｍｄ）、Ｃｏ１ＥＩＤＮＡ（４，２ｍｄ）及びラ
ムダＤＮＡのＨｉｎｄ ｌ［分解断片（１４，６、５
，８４、４，０５、２，６７、１，０４゜１．２１ 、
０．３４ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（
１３，７、４，７４、３，７３、３，４８。
３．０２ 、２．１３ｍｄＸ用いた。
制限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行なった。
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行なった。
制限酵素は宝酒造よりの市販品を用いた。
アガロースゲル電気泳動はシーケム社のアガロースを０
．５ ％又は０．７ ％の濃度で用い、水平ゲル電気泳
動槽によってゲル長さ１ｃｒｒＬ当り１．５■の定電圧
で１５〜１７時間行なった。
．５ ％又は０．７ ％の濃度で用い、水平ゲル電気泳
動槽によってゲル長さ１ｃｒｒＬ当り１．５■の定電圧
で１５〜１７時間行なった。
ｐＴＨＴｌ５が、そのＤＮＡ上にテトラサイクリン耐性
遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズブチルス
ＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験によって
確かめられた。
遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズブチルス
ＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験によって
確かめられた。
バチルス・ズブチルスＲＭ１２５株のプロトプラストの
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ＆ ＣｏｈｅＨの方法（Ｍｏｌｅｃ−Ｇｅｎ−Ｇｅ
ｎｅｔ−＋ １６８ ｔｌｌｌ−１１５（１９７５））
によって行なった。
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ＆ ＣｏｈｅＨの方法（Ｍｏｌｅｃ−Ｇｅｎ−Ｇｅ
ｎｅｔ−＋ １６８ ｔｌｌｌ−１１５（１９７５））
によって行なった。
この方法の概略はＲＭ１２５株の対数増殖菌体を等張液
中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化しこのプ
ロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え、ポ
リエチレングリコール６０００によってＤＮＡのプロト
プラスト内への増込みを促した後、再生培地上でプロト
プラストから栄養細胞への再生を図るというものである
。
中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化しこのプ
ロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え、ポ
リエチレングリコール６０００によってＤＮＡのプロト
プラスト内への増込みを促した後、再生培地上でプロト
プラストから栄養細胞への再生を図るというものである
。
ｐＴＨＴｌ ５ＤＮＡ約１μｇを用いて、ＲＭ１２５株
のプロトプラスト懸濁液０．５ｍ１（２ｘ１０９プロト
プラスト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地
上でテトラサイクリン耐性株の出現を検討したところ、
この際のプロトプラストの再生率１０係（２Ｘ １０８
／ｍｌ ）に対して１×１０８／ｒｒＬｌの頻度でテト
ラサイクリン耐性株が生じた。
のプロトプラスト懸濁液０．５ｍ１（２ｘ１０９プロト
プラスト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地
上でテトラサイクリン耐性株の出現を検討したところ、
この際のプロトプラストの再生率１０係（２Ｘ １０８
／ｍｌ ）に対して１×１０８／ｒｒＬｌの頻度でテト
ラサイクリン耐性株が生じた。
一方、プラスミドＤＮＡ溶液を加えなかった系（コント
ロール）ではテトラサイクリン耐性株は２×１０８個以
上のプロトプラストを徹いても生じてはこなかった。
ロール）ではテトラサイクリン耐性株は２×１０８個以
上のプロトプラストを徹いても生じてはこなかった。
ここで得られたＲＭ１２５株のテトラサイクリン耐性株
よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＴ１５株よりのプラスミドＤＮＡの抽出の際と同
様（リゾチーム処理の温度及び時間か３７℃３０分間で
ある点が異なる。
よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＴ１５株よりのプラスミドＤＮＡの抽出の際と同
様（リゾチーム処理の温度及び時間か３７℃３０分間で
ある点が異なる。
）の方法で抽出し検討したところ、ｐＴＨＴ１５と同一
分子量で、制限酵素による切断パターンも全く同一なプ
ラスミドＤＮＡか回収された。
分子量で、制限酵素による切断パターンも全く同一なプ
ラスミドＤＮＡか回収された。
この事実は、ｐＴＨＴ１５がテトラサイクリン耐性遺伝
子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５株に入っ
た事によってＲＭ１２５株がテトラサイクリン耐性の形
質を示すに到った事を証明するものである。
子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５株に入っ
た事によってＲＭ１２５株がテトラサイクリン耐性の形
質を示すに到った事を証明するものである。
同時に、ｐＴＨＴ１５が、好熱菌及び枯草菌Ｔ；：、−
１律的増殖能及び形質の発現か可能なプラスミドである
事、つまり本プラスミドが両菌株でベクターとして利用
し得る事実を明らかにするものである。
１律的増殖能及び形質の発現か可能なプラスミドである
事、つまり本プラスミドが両菌株でベクターとして利用
し得る事実を明らかにするものである。
テトラサイクリン耐性を有する好熱菌のプラスミドとし
ては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴＨＴ１５と
他のものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＴ
ＨＴ１５は従来認められない新規なプラスミドである。
ては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴＨＴ１５と
他のものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＴ
ＨＴ１５は従来認められない新規なプラスミドである。
図面はｐＴ ＨＴ １５の制限酵素開裂地図を示し、図
中のＣ１ａ Ｉはカリオファノン・ラツム由来の酵素、
Ｅｃｏ ＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、Ｈｈａ
Ｉはハエモフイルス・バエモリティカス由来の酵素、Ｈ
ｐａ Ｉはハエモフイルス・パラインフルエンザ゛工由
来の酵素、Ｈｐａ ＩＩはハエモフイルス・パラインフ
ルエンザエ由来の酵素、Ｔａｑｌはサーマス・アクアテ
ィカス由来の酵素をそれぞれ示している。
中のＣ１ａ Ｉはカリオファノン・ラツム由来の酵素、
Ｅｃｏ ＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、Ｈｈａ
Ｉはハエモフイルス・バエモリティカス由来の酵素、Ｈ
ｐａ Ｉはハエモフイルス・パラインフルエンザ゛工由
来の酵素、Ｈｐａ ＩＩはハエモフイルス・パラインフ
ルエンザエ由来の酵素、Ｔａｑｌはサーマス・アクアテ
ィカス由来の酵素をそれぞれ示している。
Claims (1)
- １ テトラサイクリン耐性の遺伝子を内部に備え、その
分子量が約２．８メガダルトンであり、図示されろ制限
酵素地図で特徴づけられるプラスミドを保有する新規な
バチルス・ステアロサーモフィルスＴ１５株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157367A JPS5928392B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157367A JPS5928392B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5945877A JPS5945877A (ja) | 1984-03-14 |
| JPS5928392B2 true JPS5928392B2 (ja) | 1984-07-12 |
Family
ID=15648100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57157367A Expired JPS5928392B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928392B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
-
1982
- 1982-09-09 JP JP57157367A patent/JPS5928392B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5945877A (ja) | 1984-03-14 |
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