JPS5923792B2 - テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物 - Google Patents
テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物Info
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- JPS5923792B2 JPS5923792B2 JP57037538A JP3753882A JPS5923792B2 JP S5923792 B2 JPS5923792 B2 JP S5923792B2 JP 57037538 A JP57037538 A JP 57037538A JP 3753882 A JP3753882 A JP 3753882A JP S5923792 B2 JPS5923792 B2 JP S5923792B2
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- novel
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- ptht9
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベクタ
ーとして有用な新規なプラスミド及びこれを保有する新
規な微生物に関するものであり、より詳しくはテトラサ
イクリン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約５
．２メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地
図により特徴づけされる新規なプラスミド及び該プラス
ミドを保有する新規なバチルス・ステアロサーモフィル
スに関するものである。
ーとして有用な新規なプラスミド及びこれを保有する新
規な微生物に関するものであり、より詳しくはテトラサ
イクリン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約５
．２メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂地
図により特徴づけされる新規なプラスミド及び該プラス
ミドを保有する新規なバチルス・ステアロサーモフィル
スに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
大腸菌の宿主−ベクター系はほぼ完成されており、また
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。
しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０℃〜３７℃
の中温菌である点に問題がある。
の中温菌である点に問題がある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。
従って、好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられるプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられるプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、アントサカグチ。
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、アントサカグチ。
Ｋ。
Ｊ −Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂ−１０４１９３−１９９（
１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、Ａ
−Ｈ，Ａ、、フルトン、 Ｃ，Ｊ 、アンド アトキン
ソン、Ｔ。
１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、Ａ
−Ｈ，Ａ、、フルトン、 Ｃ，Ｊ 、アンド アトキン
ソン、Ｔ。
Ｊ 、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ−１１４４０１−４０８（
１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
トｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハム
、Ａ、ＨｏＡ、、ブルドン、Ｃ，Ｊ、アンド アトキン
ソン、Ｔ。
１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
トｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハム
、Ａ、ＨｏＡ、、ブルドン、Ｃ，Ｊ、アンド アトキン
ソン、Ｔ。
Ｊ、Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂ、１１９． １０９−１１５
（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析、及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ２Ｍ、アンド アイバ。
（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析、及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ２Ｍ、アンド アイバ。
Ｓ。
Ｊ 、Ｂａｃｔ 、、 １４６（３） 、 １０９１−
１０９７（１９８１） そこで、本発明者らはその宿主が好熱性の微生物であっ
て、その内部にテトラサイクリン耐性の遺伝子を備えた
微生物を自然界より検索した結果、バチルス属に属する
一菌株から新規なプラスミドを得ることに成功した。
１０９７（１９８１） そこで、本発明者らはその宿主が好熱性の微生物であっ
て、その内部にテトラサイクリン耐性の遺伝子を備えた
微生物を自然界より検索した結果、バチルス属に属する
一菌株から新規なプラスミドを得ることに成功した。
このプラスミドは前記の制限酵素開裂地図に示され、分
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子をプラ
スミドＤＮＡ上に有しており、前記の制限酵素切断地図
上の約６０〜８０％の位置にかけて存在する。
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子をプラ
スミドＤＮＡ上に有しており、前記の制限酵素切断地図
上の約６０〜８０％の位置にかけて存在する。
（以下、本プラスミドを「ｐＴＨＴ９」と略称する。
）なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおり
である。
である。
（１） Ｂｇｌｎはバチルス・グロビギイ由来の酵素
（２） Ｅ ｃ ｏ ＲＩはニジエリシア・コリ由来
の酵素（３）Ｈｉｎｄ■はハエモフイルス・インフルエ
ンザ工由来の酵素 を示す。
（２） Ｅ ｃ ｏ ＲＩはニジエリシア・コリ由来
の酵素（３）Ｈｉｎｄ■はハエモフイルス・インフルエ
ンザ工由来の酵素 を示す。
以下、テトラサイクリン耐性を有する既知の好熱性細菌
由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
表から明らかなように、ｐＴＨＴ９は既知のプラスミド
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが８忍め
られる。
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが８忍め
られる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＴ９は
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びテトラサイクリ
ン耐性という極めて選択に有利なマーカーを有している
。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＴ９は
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びテトラサイクリ
ン耐性という極めて選択に有利なマーカーを有している
。
更にｐＴＩ−（Ｔ９は図からも明らかなように、ＢｇＡ
ＩＩ、ＥｃｏＲＴ、ＨｉｎｄｌｌＩなどの制限酵素によ
る開裂部位を特定のしかも限られた位置に有している。
ＩＩ、ＥｃｏＲＴ、ＨｉｎｄｌｌＩなどの制限酵素によ
る開裂部位を特定のしかも限られた位置に有している。
このことはｐＴＨＴ９をベクターとして利用する際に、
挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できると
いう点で有利である。
挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できると
いう点で有利である。
また、ｐＴＨＴ９は枯草菌でも好熱菌でもベクターとし
て利用できる点で有利である。
て利用できる点で有利である。
従って、ｐＴＨＴ９をベクターとして用いることにより
異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化するこ
とも可能である。
異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化するこ
とも可能である。
また、枯草菌とｐＴＨＴ９の分離源である好熱菌、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に属
するという共通点を有するためその近縁性から既に枯草
菌で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現される
可能性が高いものと考えられる。
ルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に属
するという共通点を有するためその近縁性から既に枯草
菌で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現される
可能性が高いものと考えられる。
そこで、既に枯草菌にクローン化されている遺伝子を、
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、醗酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌によ
る醗酵生産によって達成される事となる。
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、醗酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌によ
る醗酵生産によって達成される事となる。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、パイオリ
アククー等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、パイオリ
アククー等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
ｐＴＨＴ９の入手は、本発明者らが土壌中から新たに分
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
３１９株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
３１９株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
また、バチルス・ステアロサーモフィル３１９株は好気
性の有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｔ９を保有する点では従来には認められない新規な微生
物である。
性の有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｔ９を保有する点では従来には認められない新規な微生
物である。
本菌株はテトラサイクリンに対して耐性を示すが、他の
テストした６種の抗生物質、アンピシリン、エリスロマ
イシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマ
イシン、ストレプトマイシンのいずれに対しても感受性
を示した。
テストした６種の抗生物質、アンピシリン、エリスロマ
イシン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマ
イシン、ストレプトマイシンのいずれに対しても感受性
を示した。
なお、本菌株は微工研菌寄第６４３６号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例 １ （菌株のスクリーニング）
茨城県筑波郡谷田部町の土壌サンプル約１９をＴＹＳ培
地（ディフコ・トリプトン２％、ディフコ・イースト・
エキストラクト１％、Ｎａｃ１１％）１００ＴＬｌに加
え５５℃で約８時間振盪培養後、テトラサイクリン（２
０μＶｒｕｌ ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコ
ロニーの一つからバチルス・ステアロサーモフィル３１
９株（微工研菌寄第６４３６号）が得られた。
地（ディフコ・トリプトン２％、ディフコ・イースト・
エキストラクト１％、Ｎａｃ１１％）１００ＴＬｌに加
え５５℃で約８時間振盪培養後、テトラサイクリン（２
０μＶｒｕｌ ）を含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコ
ロニーの一つからバチルス・ステアロサーモフィル３１
９株（微工研菌寄第６４３６号）が得られた。
実施例 ２
プラスミドｐＴＨＴ９のバチルス・ステアロサーモフィ
ル３１９株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィル３１９株（微工研菌寄
第６４３６号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
１のＴＹＳ培地（ディフコ・バクト・トリプトン２％、
ディフコ・イースト・エキストラクト１％、ＮａＣＡ１
％）に接種し５５℃で１６〜１８時間振盪培養する。
ル３１９株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィル３１９株（微工研菌寄
第６４３６号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
１のＴＹＳ培地（ディフコ・バクト・トリプトン２％、
ディフコ・イースト・エキストラクト１％、ＮａＣＡ１
％）に接種し５５℃で１６〜１８時間振盪培養する。
この培養液を１４のテトラサイクリン２０μめｈｌ を
含有するＴＹＳ培地に接種し、５５℃で５時間培養する
。
含有するＴＹＳ培地に接種し、５５℃で５時間培養する
。
菌体を遠心によって集め、ＴＢＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ７，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣＡ
、ｐＨ７，５：で洗滌後、菌体湿重量４ｇ当り１０ｍＡ
の２５％シヨ糖含有ＴＢＳに懸濁する。
ｓ−ＨＣ７，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣＡ
、ｐＨ７，５：で洗滌後、菌体湿重量４ｇ当り１０ｍＡ
の２５％シヨ糖含有ＴＢＳに懸濁する。
リゾチーム（１０〜／ｒａｌ’）を２ｍ、ｌ、 ０；２
５Ｍ−ＥＤＴＡＣｐＨ８，Ｏ）４ｍｌを加え、０℃で１
０分間静置、続いて３７°Ｇに１０分間保温する。
５Ｍ−ＥＤＴＡＣｐＨ８，Ｏ）４ｍｌを加え、０℃で１
０分間静置、続いて３７°Ｇに１０分間保温する。
この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ、５ｍｌの５Ｍ
−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間静置する。
−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間静置する。
コれを２８，０００ｒｌ）ｍ。１時間の超遠心によって
遠心し、上清を得る。
遠心し、上清を得る。
この上清にポリエチレングリコール６．０００を１０％
（Ｗ／Ｖ）加え、２〜３時間０℃に静置、２，２００ｒ
ｌ）ｆｉ１１２分の遠心で沈澱を得る。
（Ｗ／Ｖ）加え、２〜３時間０℃に静置、２，２００ｒ
ｌ）ｆｉ１１２分の遠心で沈澱を得る。
この沈澱を１．５ ｒｒｔｌのＴＢＳに溶解し、Ｃ５（
Ｊ’及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１
〜１．６２に調製する。
Ｊ’及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１
〜１．６２に調製する。
この試料を３８，０００ｒｌ１ｍで３０〜４０時間、平
衡密度勾配遠心する。
衡密度勾配遠心する。
生じたプラスミドＤＮＡのバンドを集め、イソアミルア
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２
０ｍＭＮａＣＡ）に透析する事によって純粋なｐＴＨＴ
９が得られる。
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２
０ｍＭＮａＣＡ）に透析する事によって純粋なｐＴＨＴ
９が得られる。
ｐＴＨＴ９の特性決定の手順
ｐＴＨＴ９の分子量は、その超らせん構造（５ｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び）
制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気
泳動より得られた。
ｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び）
制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気
泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２，６
７ｍｄ ）、Ｃｏ１Ｅ Ｉ ＤＮＡ （４，２ｍｄ）及
びラムダＤＮＡのＨｉｎｄ１１１分解断片（１４，６，
５，８４，４，０５゜２．６７．１．４０，１．２１．
０．３４）、ラムダＤＮＡのＥ ｃ ｏ ＲＩ分解断片
（１３，７、４，７４。
７ｍｄ ）、Ｃｏ１Ｅ Ｉ ＤＮＡ （４，２ｍｄ）及
びラムダＤＮＡのＨｉｎｄ１１１分解断片（１４，６，
５，８４，４，０５゜２．６７．１．４０，１．２１．
０．３４）、ラムダＤＮＡのＥ ｃ ｏ ＲＩ分解断片
（１３，７、４，７４。
３．７３ 、３．４８ 、３．０２ 、２．１３ ）を
用いた。
用いた。
制限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行った。
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行った。
制限酵素は全酒造よりの市販品を用いた。
アガロースゲル電気泳動はシーケム社のアガロースを０
．５％又は０．７％の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽
によってゲル長さ１ｃｒｒＬ当り１．５■の定電圧で１
５〜１７時間行った。
．５％又は０．７％の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽
によってゲル長さ１ｃｒｒＬ当り１．５■の定電圧で１
５〜１７時間行った。
ｐＴＨＴ９が、そのＤＮＡ上にテトラサイクリン耐性遺
伝子を有している事は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＲＭｌ ２５株プロトプラストへの形質転
換実験によって確かめられた。
伝子を有している事は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ ＲＭｌ ２５株プロトプラストへの形質転
換実験によって確かめられた。
バチルス・スブチリスＲＭ１２５株のプロトプラストの
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅｓ−Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ 。
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅｓ−Ｇｅｎ、 Ｇｅ
ｎｅｔ 。
１６８ １１１−１１５（１９７９））によって行った
。
。
この方法の概略は、ＲＭ１２５株の対数増殖菌体を等張
液中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化し、こ
のプロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え
、ポリエチレングリコール６．０００によってＤＮＡの
プロトプラスト内への取込みを促した後、再生培地上で
プロトプラストから栄養細胞への再生を図るというもの
である。
液中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化し、こ
のプロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え
、ポリエチレングリコール６．０００によってＤＮＡの
プロトプラスト内への取込みを促した後、再生培地上で
プロトプラストから栄養細胞への再生を図るというもの
である。
ｐＴＨＴ９ＤＮＡ約０．５μｇを用いて、ＲＭ１２５株
のプロトプラスト懸濁液ｏ、２ｓｄ（約１０９プロトプ
ラスト／ｍｌ）に対して形質転換を行い、再生培地上で
テトラサイクリン耐性株の出現を検討したところ、この
際のプロトプラストの再生率０．１％（１〜２Ｘ１０６
／ｒｒｔｌりに対して１〜２×１０３／ｍＡの頻度でテ
トラサイクリン耐性株が生じた。
のプロトプラスト懸濁液ｏ、２ｓｄ（約１０９プロトプ
ラスト／ｍｌ）に対して形質転換を行い、再生培地上で
テトラサイクリン耐性株の出現を検討したところ、この
際のプロトプラストの再生率０．１％（１〜２Ｘ１０６
／ｒｒｔｌりに対して１〜２×１０３／ｍＡの頻度でテ
トラサイクリン耐性株が生じた。
一方、プラスミドＤＮＡ溶液を加えなかった系（コント
ロール）ではテトラサイクリン耐性株は１０７個以上の
プロトプラストを撒いても生じてはこなかった。
ロール）ではテトラサイクリン耐性株は１０７個以上の
プロトプラストを撒いても生じてはこなかった。
ここで得られたＲＭ１２５株のテトラサイクリン耐性株
よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＴ９株よりのプラスミドＤＮＡの抽出の際と同様
（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３０分間であ
る点が異なる）の方法で抽出し検討したところ、ｐＴＨ
Ｔ９と同一分子量で、制限酵素による切断パターンも全
く同一なプラスミドＤＮＡが回収された。
よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＴ９株よりのプラスミドＤＮＡの抽出の際と同様
（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３０分間であ
る点が異なる）の方法で抽出し検討したところ、ｐＴＨ
Ｔ９と同一分子量で、制限酵素による切断パターンも全
く同一なプラスミドＤＮＡが回収された。
この事実は、ｐＴＨＴ９がテトラサイクリン耐性遺伝子
を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５株に入った
事によってＲＭ１２５株がテトラサイクリン耐性の形質
を示すに到った事を証明するものである。
を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５株に入った
事によってＲＭ１２５株がテトラサイクリン耐性の形質
を示すに到った事を証明するものである。
同時に、ｐＴＨＴ９が、好熱菌及び枯草菌で、自律的増
殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである事、つま
り本プラスミドが両菌株でベクターとして利用し得る事
実を明らかにするものである。
殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである事、つま
り本プラスミドが両菌株でベクターとして利用し得る事
実を明らかにするものである。
テトラサイクリン耐性を有する好熱菌のプラスミドとし
ては前記の表に示したとおりであるがｐＴＨＴ９と他の
ものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＴＨＴ
９は従来認められない新規なプラスミドである。
ては前記の表に示したとおりであるがｐＴＨＴ９と他の
ものでは前述のように明らかに異なっており、ｐＴＨＴ
９は従来認められない新規なプラスミドである。
図面はｐＴＨＴ９の制限酵素開裂地図を示し、図中のＢ
ｇｌ■はバチルス・グ吊ビギイ由来の酵素、ＥｃｏＲｌ
はニジエリア・コリ由来の酵素、Ｈｉｎｄ■はハエモフ
イルス・インフルエンザエ由来の酵素をそれぞれ示して
いる。 また、図中の０内の数字は前記の制限酵素による切断部
位の位置関係を示す。
ｇｌ■はバチルス・グ吊ビギイ由来の酵素、ＥｃｏＲｌ
はニジエリア・コリ由来の酵素、Ｈｉｎｄ■はハエモフ
イルス・インフルエンザエ由来の酵素をそれぞれ示して
いる。 また、図中の０内の数字は前記の制限酵素による切断部
位の位置関係を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ テトラサイクリン耐性の遺伝子を内部に保有し、そ
の分子量が約５．２メガダルトンであり、図に示される
制限酵素地図で特徴づけられるテトラサイクリン耐性を
備えた新規なプラスミド。 ２ 図に示されたテトラサイクリン耐性を備えたプラス
ミドを保有する新規なバチルス・ステアロサーモフィル
スＴ９株
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57037538A JPS5923792B2 (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57037538A JPS5923792B2 (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58170799A JPS58170799A (ja) | 1983-10-07 |
| JPS5923792B2 true JPS5923792B2 (ja) | 1984-06-05 |
Family
ID=12500299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57037538A Expired JPS5923792B2 (ja) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5923792B2 (ja) |
-
1982
- 1982-03-09 JP JP57037538A patent/JPS5923792B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58170799A (ja) | 1983-10-07 |
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