JPS5978691A - 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド - Google Patents
高度好熱菌に由来する新規なプラスミドInfo
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- JPS5978691A JPS5978691A JP57189527A JP18952782A JPS5978691A JP S5978691 A JPS5978691 A JP S5978691A JP 57189527 A JP57189527 A JP 57189527A JP 18952782 A JP18952782 A JP 18952782A JP S5978691 A JPS5978691 A JP S5978691A
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- plasmid
- thermophilic bacterium
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は高度好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベ
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約５．４メガダルトンで
あり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけら
れる新規なプラスミドに関するものである。
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約５．４メガダルトンで
あり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけら
れる新規なプラスミドに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究が行なわれインシュリン、インターフェロ
ン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大き
な成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほぼ
完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌など
で宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討されつ
つある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０℃
〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
系で広く研究が行なわれインシュリン、インターフェロ
ン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大き
な成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほぼ
完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌など
で宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討されつ
つある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０℃
〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主・ベク
ター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の宿主・ベクタ
ー系の開発研究は、これまで全く行なわれていない。し
かも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミド
ＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料と
した研究は以下の２報しか知られていない。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主・ベク
ター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の宿主・ベクタ
ー系の開発研究は、これまで全く行なわれていない。し
かも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミド
ＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料と
した研究は以下の２報しか知られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
，Ｆ．．タナカ，Ｔ．アンドサカグチ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９３−１９９（１９７８
）（２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラ
スミド（ｐＴＴ１）の物理的性状 エベルハード，Ｍ．Ｄ．，バスクエズ，Ｃ．，バレンズ
エラ，Ｐ．，ビキュナ．Ｒ．アンドユデレビック，Ａ．
Ｐｌａｓｍｉｄ，６，１−６（１９８１）上記２報に記
載されているプラスミドは、いずれもその性質が不明な
いわゆるクリプティック・プラスミドであり、またそれ
らの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。従って
、このままの形でベクターとして利用する、或いはこれ
らを素材としてベクター開発を行う事には、あまりに困
難が大きいものと考えられる。そこで、本発明者らは、
高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミドが宿主
内に存在していることを示すマーカー）を有し、しかも
分子量の小さいプラスミドの検索を行った。その結果ス
トレプトマイシンに耐性を示したサーマス・■■バスか
ら分子量約５．４メガダルトンのプラスミドを単離する
事に成功した。
，Ｆ．．タナカ，Ｔ．アンドサカグチ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｍｉｃｒｏｂ．，１０４，１９３−１９９（１９７８
）（２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラ
スミド（ｐＴＴ１）の物理的性状 エベルハード，Ｍ．Ｄ．，バスクエズ，Ｃ．，バレンズ
エラ，Ｐ．，ビキュナ．Ｒ．アンドユデレビック，Ａ．
Ｐｌａｓｍｉｄ，６，１−６（１９８１）上記２報に記
載されているプラスミドは、いずれもその性質が不明な
いわゆるクリプティック・プラスミドであり、またそれ
らの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。従って
、このままの形でベクターとして利用する、或いはこれ
らを素材としてベクター開発を行う事には、あまりに困
難が大きいものと考えられる。そこで、本発明者らは、
高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミドが宿主
内に存在していることを示すマーカー）を有し、しかも
分子量の小さいプラスミドの検索を行った。その結果ス
トレプトマイシンに耐性を示したサーマス・■■バスか
ら分子量約５．４メガダルトンのプラスミドを単離する
事に成功した。
このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量がやや小さくしかも数種の制限酵素による
接断点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐ
ＮＨＳ２１２と略称する）。
如く、分子量がやや小さくしかも数種の制限酵素による
接断点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐ
ＮＨＳ２１２と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
ＭｌｕＩハミクロコッカス・ルテウス由来の酵素、Ｂｇ
ｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素、ＰｓｔＩは
プロビデンシア・スチュアルティイ由来の酵素を示す。
ｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素、ＰｓｔＩは
プロビデンシア・スチュアルティイ由来の酵素を示す。
以下、これまでに報告されているリーマス属細菌、即ち
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
表
高度好熱菌由来のプラスミド
表から明らかなように、ｐＮＨＳ２１２は既知のプラス
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、高度好
熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗生
物質が存在しない様な温泉である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＮＨＳ２１２を利用すれば、極めて便
利であるものと考えられる。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、高度好
熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗生
物質が存在しない様な温泉である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＮＨＳ２１２を利用すれば、極めて便
利であるものと考えられる。
何故ならば、第１にｐＮＨＳ２１２は高度好熱菌で複製
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプティック・プラスミドに
比べてやや小さい分子量を有するという点から、本プラ
スミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製に関与
する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大きなプラス
ミドよりも、容易に行えるという利点を有しているから
である。
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプティック・プラスミドに
比べてやや小さい分子量を有するという点から、本プラ
スミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製に関与
する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大きなプラス
ミドよりも、容易に行えるという利点を有しているから
である。
更にｐＮＨＳ２１２は図からも明らかなように、Ｍｌｕ
Ｉ、ＢｇｌＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に有している。
Ｉ、ＢｇｌＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に有している。
このことはｐＮＨＳ２１２をベクターとして利用する際
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。
さて、本プラスミドをベクターとして異種の耐熱性を有
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業における冷
却コストの節減が達成されよう。
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業における冷
却コストの節減が達成されよう。
また、耐熱性、対溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
ｐＮＨＳ２１２の入手は、本発明者らが温泉水中から新
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＳ２１
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（大五栄養）０．８％、ＮａＣ
ｌ０．２％）により対数増殖後期まで増殖させて得た菌
体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事に
よって達せられる。
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＳ２１
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（大五栄養）０．８％、ＮａＣ
ｌ０．２％）により対数増殖後期まで増殖させて得た菌
体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事に
よって達せられる。
また、リーマス・フラバスＴＳ２１株は好気性のグラム
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ含量
が約７０％、生育至適温度が７０℃の菌株であるがｐＮ
ＨＳ２１２を保有する点では従来には認められない新規
な微生物である。本菌株はストレプトマイシン耐性株と
して温泉水中より分離されたものである。
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ含量
が約７０％、生育至適温度が７０℃の菌株であるがｐＮ
ＨＳ２１２を保有する点では従来には認められない新規
な微生物である。本菌株はストレプトマイシン耐性株と
して温泉水中より分離されたものである。
なお、本菌株は微工研菌寄第６７５２号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
静岡県の熱川温泉の温泉水約１ｍｌをサーマス培地（デ
ィフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプト
ン（大五栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％）１００ｍ
ｌに加え７０℃で約１８時間震盪培養後、ストレプトマ
イシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むリーマス寒天平板上で
生育したコロニーの一つからリーマス・フラバスＴＳ２
１株微工研菌寄第６７５２号）が得られた。
ィフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプト
ン（大五栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％）１００ｍ
ｌに加え７０℃で約１８時間震盪培養後、ストレプトマ
イシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むリーマス寒天平板上で
生育したコロニーの一つからリーマス・フラバスＴＳ２
１株微工研菌寄第６７５２号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＮＨＳ２１２ノサーマス・フラバスＴＳ２
１株からの分離 サーマス・フラバスＴＳ２１株（微工研菌寄岱７５２号
）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍｌのサーマス
培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポ
リペプトン（大五栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％、
ｐＨ７．５）に接種し７０℃で１６〜１８時間震盪培養
する。
１株からの分離 サーマス・フラバスＴＳ２１株（微工研菌寄岱７５２号
）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍｌのサーマス
培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポ
リペプトン（大五栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％、
ｐＨ７．５）に接種し７０℃で１６〜１８時間震盪培養
する。
この培養液を１ｌのストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ
を含むサーマス培地に接種し、７０℃で５時間培養する
。菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｌ，５ｍＭＥＤＩＡ，１００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ
７．５）で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５
％ショ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＩＡ（ｐＨ８０）
４ｍｌを加え、０℃で１０分間静置、続いて３７℃に１
０分間保温する。この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤ
Ｓ、５ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時
間静置する。これを２８０００ｒｐｍ，１時間の超遠心
によって遠心し、上清を得る。この上清にポリエチレン
グリコール６０００を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時
間０℃に静置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心で沈殿を得
る。この沈殿を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣｌ及
びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＩＡ，２０ｍＭＮａＣｌ）に透析
する事によってプラスミド溶液が得られる。このプラス
ミド溶液はｐＮＨＳ２１２と分子量約３．１メガダルト
ンのｐＮＨＳ２１１及び分子量約１０メガダルトンのｐ
ＮＨＳ２１３との混合物であるが、このプラスミド溶液
を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＩ社製）による電
気泳動に供し、生ずるｐＮＨＳ２１２に相当するバンド
を切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐＮＨ
Ｓ２１２が得られる。
を含むサーマス培地に接種し、７０℃で５時間培養する
。菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈｃｌ，５ｍＭＥＤＩＡ，１００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ
７．５）で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５
％ショ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＩＡ（ｐＨ８０）
４ｍｌを加え、０℃で１０分間静置、続いて３７℃に１
０分間保温する。この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤ
Ｓ、５ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時
間静置する。これを２８０００ｒｐｍ，１時間の超遠心
によって遠心し、上清を得る。この上清にポリエチレン
グリコール６０００を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時
間０℃に静置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心で沈殿を得
る。この沈殿を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣｌ及
びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜
４０時間、平衡密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤ
ＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウ
ムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＩＡ，２０ｍＭＮａＣｌ）に透析
する事によってプラスミド溶液が得られる。このプラス
ミド溶液はｐＮＨＳ２１２と分子量約３．１メガダルト
ンのｐＮＨＳ２１１及び分子量約１０メガダルトンのｐ
ＮＨＳ２１３との混合物であるが、このプラスミド溶液
を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＩ社製）による電
気泳動に供し、生ずるｐＮＨＳ２１２に相当するバンド
を切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐＮＨ
Ｓ２１２が得られる。
低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、これに２倍量の０．５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７
℃に移し保温する。これに当量の０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを加
え混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、
上層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行い
エーテルによってフェノールを水層より除去した後、３
Ｍ酢酸アンモニウム溶液を１／１０容加え、３用のエタ
ノールによりエタノール沈殿を行う。選られた沈殿をＴ
ＥＮに溶解してプラスミド溶液とした。
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、これに２倍量の０．５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７
℃に移し保温する。これに当量の０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを加
え混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、
上層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行い
エーテルによってフェノールを水層より除去した後、３
Ｍ酢酸アンモニウム溶液を１／１０容加え、３用のエタ
ノールによりエタノール沈殿を行う。選られた沈殿をＴ
ＥＮに溶解してプラスミド溶液とした。
ｐＮＨＳ２１２の特性決定の手順
ｐＮＨＳ２１２の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐ
ｅｒｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び
制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気
泳動及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られ
た。
ｅｒｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び
制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気
泳動及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られ
た。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＩＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動層によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
７ｍｄ）、ＣｏｌＩＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動層によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
高度好熱菌のプラスミドとしては、前記の表に示したと
おりであるがｐＮＨＳ２１２と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨＳ２１２は従来認めら
れない新規なプラスミドである。
おりであるがｐＮＨＳ２１２と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨＳ２１２は従来認めら
れない新規なプラスミドである。
図面はｐＮＨＳ２１２の制限酵素開裂地図を示し、図中
のＭｌｕＩはミクロコッカス・ルテウス由来の酵素、Ｂ
ＧｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素、ＰｓｔＩ
はプロビデンシア・ス■■アル■■■由来の酵素をそれ
ぞれ示している■
のＭｌｕＩはミクロコッカス・ルテウス由来の酵素、Ｂ
ＧｌＩＩはバチルス・グロビギイ由来の酵素、ＰｓｔＩ
はプロビデンシア・ス■■アル■■■由来の酵素をそれ
ぞれ示している■
Claims (1)
- 分子量が約５．４メガダルトンであり、図に示される制
限酵素地図で特徴づけられる高度好熱菌由来の新規なプ
ラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189527A JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189527A JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5978691A true JPS5978691A (ja) | 1984-05-07 |
| JPS6037B2 JPS6037B2 (ja) | 1985-01-05 |
Family
ID=16242779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57189527A Expired JPS6037B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6037B2 (ja) |
-
1982
- 1982-10-28 JP JP57189527A patent/JPS6037B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6037B2 (ja) | 1985-01-05 |
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