JPS5953830B2 - 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高度好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベ
クターとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な
微生物に関するものであり、より詳しくはその分子量が
約０．９メガダルトンであり、図に示される制限酵素開
裂地図により特徴づけられる新規なプラスミドを保有す
る新規なサーマス・フラバスに関するものである。

従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。

大腸菌の宿主・ベクター系はほぼ完成されており、また
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主・ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。

しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０℃〜３７℃
の中温菌である点に問題がある。

一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。

従って、好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の
宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行なわれ
ていない。

しかも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミ
ドＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料
とした研究は以下の２報しか知られていない。

（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、アンド サカグチ、 Ｋ、Ｊ、
Ｇｅｎ１Ｍ１ｃｒｏｂ、、 １０４．１９３−１９９（
１９７８） （２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラス
ミド（ｐＴＴｌ）の物理的性状 エベルハード、 Ｍ、Ｄ、、バスクエズ、Ｃ０，バレン
ズエラ、Ｐ、、ビキュナ、Ｒ，アンド ユデレヒツク、
Ａ、Ｐｌａｓｍｉｄ、 ６’、 １−６ （１
９８１）上記２報に記載されているプラスミドは、いず
れもその性質が不明ないわゆるクリプテイック・プラス
ミドであり、またそれらの分子量も６メガダル）・ン程
度とやや大きい。

従って、このままの形でベクターとして利用する、或い
はこれらを素°材としてベクター開発を行う事には、あ
まりに困難が大きいものと考えられる。

そこで、本発明者らは、高度好熱菌より、選択マーカー
（そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマ
ーカー）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検
索を行った。

その結果ストレプ１〜マイシン耐性を示したサーマス・
フラバスから分子量約０．９メガダルトンのプラスミド
を単離する事に成功した。

このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が極めて小さくしがも数種の制限酵素によ
る切断点を特異的に有している（以下、本プラスミドを
ｐＮＨ３１７１と略称する）。

なお、図に示されている制限酵素の略称は次ののとおり
である。

ＢａｍＨＩはバチルス・アミロリクエファシェンス由来
の酵素、ＫＰｎＩはダレブシェラ・ニューモニアエ由来
の酵素、ＢｓｔＮＩはバチルス、ステアロサーモフィル
ス由来の酵素を示す。

以下、これまでに報告されているサーマス属細菌、即ち
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。

表から明らかなように、ｐＮＨ３１７１は既知のプラス
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。

プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。

しかし、高度好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏
しくしかも抗生物質が存在しない様な温泉である菌につ
いて考えた場合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミド
を得る事は容易ではない。

従って、性質か不明のいわゆるクリプテイック・プラス
ミドに宿主染色体由来のマ一カ−を賦与するという方式
でベクター開発を行わなければならないであろう。

その際にｐＮＨ５１７１を利用すれば、極めて便利であ
るものと考えられる。

何故ならば、第１にｐＮＨ５１７１は高度好熱菌で複製
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプテイック・プラスミドに
比べてはるかに小さい分子量しか有しないという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大き
なプラスミドよりも、はるかに容易に行えるという利点
を有しているからである。

更にｐＮＨ５１７１は図からも明らかなように、Ｋｐｎ
Ｉ、ＢａｍＨＩなどの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に有してる。

このことはｐＮＨ３１７１をベクターとして利用する際
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。

さて、本プラスミドをベクターとして異種の耐熱性を有
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業に於ける冷
却コストの節減が達成されよう。

また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。

ｐＮＨ３１７１の入手は、本発明者らが温泉水中から新
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＳ１７
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（大玉栄養）０．８％、ＭａＣ
Ｉｏ、 ２％）により対数増殖後期迄増殖させて得た菌
体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事に
よって達せられるが、本プラスミドを保有する点で本菌
株は新規である。

また、サーマス・フラバスＴＳ１７株は好気性のダラム
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生じＤＮＡのＧＣ含量
が約７０％、生育至適温度が７０’Ｃの菌株であるがｐ
ＮＨ３１７１を保有する点では従来には認められない新
規な微生物である。

本菌株はストレプトマイシン耐性株として温泉水中より
分離されたが、エリスロマイシン、カナマイシンにも耐
性を示し、アンピシリン、クロラムフェニコール、ネオ
マイシン、テトラサイクリンには感受性であった。

なお、本菌株は微工研菌寄第６７５１号として寄託され
ている。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。

実施例 １ （菌株のスクリーニング） 静岡系の熱用温泉の温泉水的１ｍｌをサーマス培地（デ
ィフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプト
ン（大玉栄養）０．８％、ＮａＣ１００２％）１００ｍ
ｌに加え７０℃で約１８時間振盪培養後、ストレプトマ
イシン（２０Ｍｇ ／ｍｌ）を含むサーマス寒天平板上
で生育したコロニーの一つからサーマス・フラバスＴＳ
１７株（微工研菌寄第６７５１号）が得られた。

実施例 ２ プラスミドｐＮＨ３１７１のサーマス・フラバスＴＳ１
７株からの分離 サーマス・フラバスＴＳ１７株（微工研菌寄第６７５１
号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ１のサーマ
ス培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、
ポリペプトン（大玉栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％
、Ｉｆ（７，５）に接種し、７０℃で１６〜１８時間振
盪培養する。

この培養液を１１のストレプトマイシン２０μｇ ７ｍ
、１を含有するサーマス培地に接種し、７０℃で５時間
培養する。

菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ （２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ、 ５ｍＭＥＤＴＡ。

１００ｍＭＮａＣｌ Ｉｆ（７，５）で洗浄接菌体温
重量４ｇ当り、１０ｍ１の２５％シヨ糖含有ＴＥＳに懸
濁する。

リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−
ＥＤＴＡ（Ｉｆ（８，０）４ｍｌを加え、０℃で１０分
間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。

この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ、５ｍｌの５Ｍ
−ＮａＣ１を加え４℃に１５〜１８時間静置する。

これを２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心によって遠心
し、上清を得る。

この上清にポリエチレンングリコール６０００を１０％
（Ｗ／Ｖ）加え、２〜３時間Ｏ℃に静置、２２００ｒｐ
ｍ、２分の遠心で沈澱を得る。

この沈澱を１５ｍ１のＴＥＳに溶解し、ＣｓＣ１及びエ
チジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６２
に調整する。

この試料を３８００Ｏｒｐｍで３０〜４０時間、平衡密
度勾配遠心する。

生じたプラスミドＤＮＡのバンドを集め、イソアミルア
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ 。

１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＮａＣ１）に透析する事によ
ってプラスミド溶液が得られる。

このプラスミド溶液はｐＮＨ３１７１と分子量約１０メ
ガダルトンのｐＮＨ３１７２との混合物であるが、この
プラスミド溶液を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＬ
社製）による電気泳動に供し、生ずるｐＮＨ８１７１に
相当するバンドを切り出してＤＮＡを回収する事によっ
て純粋なｐＮＨ３１７１が得られる。

低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。

切り出したゲルスライスを６５℃に保温して融解、これ
に２倍量の ０、５ｍＭＥＤＴＡを含む５ｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩
衝液（ＩｆＩ８．０）を加え、３７℃に移し保温する。

これに等量の０． ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｉｆ
（８，０）で飽和させたフェノールを加え混合、遠心（
３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、上層の水層を分
取する。

フェノール抽出をもう一度行いエーテルによってフェノ
ールを水層より除去した後、３Ｍ酢酸アンモニウム溶液
を１／１０容加え、３容のエタノールによりエタノール
沈澱を行う。

得られた沈澱をＴＥＮに溶解してプラスミド溶液とした
。

ｐＮＨ８１７１の特性決定の手順 ｐＮＨ８１７１の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐ
ｅｒｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び
制限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気
泳動及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られ
た。

この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２，６
７ｍｄ ）、Ｃｏ１ＥＩＤＮＡ （４，２ｍｄ）及びラ
ムダＤＮＡ（７） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ分解断片（１４，
６，５，８４，４，０５゜２．６７、１，３０．１，１
７．０．３４ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断
片（１３，７，４，７４，３，７３，３，４８゜３．０
２．２．１３ｍｄ）、φＸ １７４ＤＮＡノＨａｅＩＩ
Ｉ分解断片（０，８３６，０，６６６、０，５３９，０
，３７３，０，１９２゜０．１７４． ０，１６７、
０．１４５． ０，１２０． ０，０７３゜０、０４４
ｍｄ）を用いた。

制限酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行なった。

制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マンハイム社よ
りの市販品を用いた。

アガロースゲル電気泳動はシーケム社のアガロースを０
．５％又は０・７％の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽
によってゲル長さ１ｃｍ当＃） １．５Ｖの定電圧で１
５〜１７時間行なった。

ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽によ−リ、ゲル長さ１ｃｍあたり１０■の
定電圧によって２〜３時間行った。

高度好熱菌のプラスミドとしては、前記の表に示したと
おりであるがｐＮＨ３１７１と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨ８１７１は従来認めら
れない新規なプラスミドである。

【図面の簡単な説明】

図面はｐＮＨ３１７１の制限酵素開裂地図を示し、図中
のＢａｍＨＩはバチルス・アミロリクエファシェンス由
来の酵素、ＫｐｎＩはクレブシェラ・二二＋ニアエ’
由来の酵素、ＢｓｔＮＩはバチルス・ステアロサーモフ
ィルス由来の酵素をそれぞれ示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 分子量が約０．９メガダルトンであり、図に示され
   る制限酵素地図で特徴づけられるプラスミドを保有する
   新規なサーマス・フラバスＴＳ１７株。