JPS5945354B2 - ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 - Google Patents
ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物Info
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- JPS5945354B2 JPS5945354B2 JP57157369A JP15736982A JPS5945354B2 JP S5945354 B2 JPS5945354 B2 JP S5945354B2 JP 57157369 A JP57157369 A JP 57157369A JP 15736982 A JP15736982 A JP 15736982A JP S5945354 B2 JPS5945354 B2 JP S5945354B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベクタ
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約
３．０メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂
地図により特徴づけられる新規なプラスミドを保有する
新規なバチルス・ステアロサーモフィルスに関するもの
である。
ーとして有用な新規なプラスミドを保有する新規な微生
物に関するものであり、より詳しくはネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の遺伝子を内部に備え、その分子量が約
３．０メガダルトンであり、図に示される制限酵素開裂
地図により特徴づけられる新規なプラスミドを保有する
新規なバチルス・ステアロサーモフィルスに関するもの
である。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。
大腸菌の宿主−ベクター系はほぼ完成されており、また
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。
大腸菌以外にも酵母、枯草菌などで宿主−ベクター系が
開発され応用への道が検討されつつある。
しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０℃〜３７℃
の中温菌である点に問題がある。
の中温菌である点に問題がある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。
従って、好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられるプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
為の一つの、しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌
の宿主−ベクター系の開発研究については、ベクターの
有力候補と考えられるプラスミドの検索を含めても以下
の報告しか知られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、Ｔ／トサカグチ、Ｋ。
、Ｆ、、タナカ、Ｔ、Ｔ／トサカグチ、Ｋ。
Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ、、 １０４ 、１９３−１
９９（１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、
Ａ、ＨｌＡ、、ブルドン、Ｃ１Ｊ、アンド アトキソン
、Ｔ。
９９（１９７８） （２）薬剤耐性の好熱性バチルス属細菌よりの４種類の
プラスミドの分離とその性質の部分解析ピングハム、
Ａ、ＨｌＡ、、ブルドン、Ｃ１Ｊ、アンド アトキソン
、Ｔ。
Ｊ、Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂ、、 １１４ 、４０１−
４０８（１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
ミドｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハ
ム、Ａ、ＨｏＡ、、ブルドン、Ｃ１Ｊ、アンドアトキン
ソン、Ｔ。
４０８（１９７９） （３） バチルス・ステアロサーモフィルスのプラス
ミドｐＡＢ１２４の解析及び欠失誘導体の創製ピングハ
ム、Ａ、ＨｏＡ、、ブルドン、Ｃ１Ｊ、アンドアトキン
ソン、Ｔ。
Ｊ、Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂ、 、 １１９．１０９−１
１５（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析、及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ９Ｍ、アンドアイバ、Ｓ。
１５（１９８０） （４）好熱性バチルス属細菌よりの薬剤耐性プラスミド
の分離と解析、及び部分欠失プラスミドの創製 イマナカ、Ｔ、、フジイ９Ｍ、アンドアイバ、Ｓ。
Ｊ、Ｂａｃｔ、、１４６（３）、１０９１−１０９７（
１９８１） （５）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラス
ミド（ｐ’ｒ’ｒｉ）の物理的性状 エベルハード、Ｍ、Ｄ、、バスクエズ、Ｃ６，バレンズ
エラ、Ｐ、、ビキュナ、Ｒ，アンド ユデレビツク、Ａ
。
１９８１） （５）サーマス・サーモフィルスから単離されたプラス
ミド（ｐ’ｒ’ｒｉ）の物理的性状 エベルハード、Ｍ、Ｄ、、バスクエズ、Ｃ６，バレンズ
エラ、Ｐ、、ビキュナ、Ｒ，アンド ユデレビツク、Ａ
。
Ｐｌａｓｍｉｄ、６．１−６ （１９８１）（６）プラ
スミドＤＮＡによるバチルス・ステアロサーモフィルス
の形質転換及びバチルス・ステアロサーモフィルス、バ
チルス・ズブチルス間共用ベクターの性質 イマナカ、Ｔ、、フジイ１Ｍ、、アラモリ９Ｉ。
スミドＤＮＡによるバチルス・ステアロサーモフィルス
の形質転換及びバチルス・ステアロサーモフィルス、バ
チルス・ズブチルス間共用ベクターの性質 イマナカ、Ｔ、、フジイ１Ｍ、、アラモリ９Ｉ。
アンド アイバ、Ｓ。
Ｊ、Ｂａｃｔ、、１４９（３）、８２４−８３０（１９
８２） そこで、本発明者らは、その宿主が好熱性の微生物であ
って、その内部にネオマイシン、カナマイシン耐性の遺
伝子を備えた微生物を自然界より検索した結果、バチル
ス属に属する一菌株から新規なプラスミドを得ることに
成功した。
８２） そこで、本発明者らは、その宿主が好熱性の微生物であ
って、その内部にネオマイシン、カナマイシン耐性の遺
伝子を備えた微生物を自然界より検索した結果、バチル
ス属に属する一菌株から新規なプラスミドを得ることに
成功した。
このプラスミドは前記の制限酵素開裂地図に示され、分
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、ネオマイシン、カナマイシンに対する耐性遺
伝子をプラスミドＤＮＡ上に有している。
子量は小さく、また種々の制限酵素による特異的な切断
点を有し、ネオマイシン、カナマイシンに対する耐性遺
伝子をプラスミドＤＮＡ上に有している。
（以下、本プラスミドを１１）ＴＨＮＩ 、ｊと略称す
る。
る。
）なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおり
である。
である。
（１） 、Ａｃｃｌはアシネトバクタ−・カルコアセテ
ィカス由来の酵素 （２）ＢｇｌｌＩはバチルス・グロビギー由来の酵素（
３） ＥｃｏＲＩはエシュリヒア・コリ由来の酵素（
４） ＩＦ（ｈａＩはハエモフイルス・ハエモリティ
カス由来の酵素 （５） ＨｐａＩＩはハエモフイルス・パラインフル
エンザエ由来の酵素 （６）ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルテイイ由来
の酵素 （７） Ｔａｇｌはサーマス・アクアティカス由来の
酵素を示す。
ィカス由来の酵素 （２）ＢｇｌｌＩはバチルス・グロビギー由来の酵素（
３） ＥｃｏＲＩはエシュリヒア・コリ由来の酵素（
４） ＩＦ（ｈａＩはハエモフイルス・ハエモリティ
カス由来の酵素 （５） ＨｐａＩＩはハエモフイルス・パラインフル
エンザエ由来の酵素 （６）ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルテイイ由来
の酵素 （７） Ｔａｇｌはサーマス・アクアティカス由来の
酵素を示す。
以下、ネオマイシン、カナマイシン耐性を有する既知の
好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。
表から明らかなように、ｐＴＨＮｌは既知のプラスミド
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが認めら
れる。
に較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明らか
に異なっており、新規なプラスミドであることが認めら
れる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを宗すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＮｌは
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びネオマイシン、
カナマイシン耐性という極めて選択に有利なマーカーを
有している。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを宗すマー
カー）を有していることが必須であるが、ｐＴＨＮｌは
好熱菌及び枯草菌での自律的増殖能及びネオマイシン、
カナマイシン耐性という極めて選択に有利なマーカーを
有している。
更にｐＴＨＮｌは図から明らかなように、Ａｃｄ。
Ｂｇｌｎ、ＥｃｏＲＪ、ＨｈａＩ、Ｐｓｔｒ などの制
限酵素による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有
している。
限酵素による開裂部位を特定のしかも限られた位置に有
している。
このことはｐＴＨＮｌをベクターとして利用する際に、
挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できると
い・う点で有利である。
挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持できると
い・う点で有利である。
また、ｐＴＨＮｌは枯草菌でも好熱菌でもベクターとし
て利用できる点で有利である。
て利用できる点で有利である。
従って、ｐＴＨＮｌをベクターとして用いることにより
異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化するこ
とも可能である。
異種遺伝子を同時に枯草菌と好熱菌にクローン化するこ
とも可能である。
また、枯草菌とｐＴＨＮｌの分離源である好熱菌、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に属
するという共、適意を有するためその近縁性から既に枯
草菌で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現され
る可能性が高いものと考えられる。
ルス・ステアロサーモフィルスとは同じバチルス属に属
するという共、適意を有するためその近縁性から既に枯
草菌で発現している異種遺伝子は、好熱菌でも発現され
る可能性が高いものと考えられる。
そこで、既に枯草菌にクローン化されている遺伝子を、
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、発酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌によ
る発酵生産によって達成される事となる。
本プラスミドを用いて好熱菌に移入する事によって、も
しその遺伝子産物が５５℃付近での耐熱性を有するなら
ば、発酵工業における冷却コストの節減が、好熱菌によ
る発酵生産によって達成される事となる。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。
ｐＴＨＮｌの入手は、本発明者らが土壌中から新たに分
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スＮ１株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
離した中等度好熱菌、バチルス・ステアロサーモフィル
スＮ１株をＴＹＳ培地により対数増殖後期迄増殖させて
得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させ
る事によって達せられる。
才た、バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株は好気
性の有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｎｌ及びテトラサイクリン耐性を有するプラスミドｐＴ
ＨＴ１５を保有する点では従来には認められない新規な
微生物である。
性の有胞子桿菌、ダラム染色陽性であり、生育至適温度
が約５５℃で３７℃では生育しない菌株であるがｐＴＨ
Ｎｌ及びテトラサイクリン耐性を有するプラスミドｐＴ
ＨＴ１５を保有する点では従来には認められない新規な
微生物である。
また、本菌株はｐＴＨＮｌの他にもテトラサイクリン耐
性の遺伝子を内部に保有し、その分子量が約２．８メガ
ダルトンであり、次の図に示される制限酵素地図で特徴
づけられる新規なプラスミドを保有することが確認でき
た。
性の遺伝子を内部に保有し、その分子量が約２．８メガ
ダルトンであり、次の図に示される制限酵素地図で特徴
づけられる新規なプラスミドを保有することが確認でき
た。
本菌株は当初ネオマイシン耐性株として土壌中より分離
されたがネオマイシンに対して耐性を示したのみならず
カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリンに対し
ても耐性を示し、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、ストレフトマイシンには感受性であった。
されたがネオマイシンに対して耐性を示したのみならず
カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリンに対し
ても耐性を示し、エリスロマイシン、クロラムフェニコ
ール、ストレフトマイシンには感受性であった。
なお、本菌株は微工研菌寄第６６６０号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例 １（菌株のスクリーニング）
茨城県筑波郡谷田部町の土壌サンプル約１ｇをＴＹＳ培
地（ディフコ・トリプトン２係、ディフコ・イースト・
エキストラクト１係、ＮａＣ１１％）１００ｙｄに加え
５５℃で約８時間振盪培養後、ネオマイシン（２０μ９
７ｍ１りを含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコロニーの
一つからバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微
工研菌寄第６６６０号）が得られた。
地（ディフコ・トリプトン２係、ディフコ・イースト・
エキストラクト１係、ＮａＣ１１％）１００ｙｄに加え
５５℃で約８時間振盪培養後、ネオマイシン（２０μ９
７ｍ１りを含むＴＹＳ寒天平板上で生育したコロニーの
一つからバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微
工研菌寄第６６６０号）が得られた。
実施例 ２
プラスミドｐＴＨＮ１のバチルス・ステアロサーモフィ
ルスＮ１株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微工研菌寄
第６６６０号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
１のネオマイシン２０μ９／ｖｔｌを含むＴＹＳ培地（
ディフコ・バンド・トリプトン２係、ディフコ・イース
ト・エキストラクト１チ、ＮａＣ１１％）に接種し５５
℃で１６〜１８時間振盪培養する。
ルスＮ１株からの分離 バチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株（微工研菌寄
第６６６０号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍ
１のネオマイシン２０μ９／ｖｔｌを含むＴＹＳ培地（
ディフコ・バンド・トリプトン２係、ディフコ・イース
ト・エキストラクト１チ、ＮａＣ１１％）に接種し５５
℃で１６〜１８時間振盪培養する。
この培養液を１１のテトラサイクリン２０μｇＡｒｔｌ
を含有するＴＹＳ培地に接種し、５５℃で５時間培養す
る。
を含有するＴＹＳ培地に接種し、５５℃で５時間培養す
る。
菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ。
ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ。
１００ ’ｍＭＮａｅ ｌ ｐＨ７，５）で洗浄後菌
体湿重量４ｇ当り、１０１７１１の２５係シヨ糖含有Ｔ
ＢＳに懸濁する。
体湿重量４ｇ当り、１０１７１１の２５係シヨ糖含有Ｔ
ＢＳに懸濁する。
リゾチーム（１０ｐｇｌｒｎｌ）を２１ｎｌ！、０．２
５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）４１ｒＬｌを加え、０℃
で１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。
５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）４１ｒＬｌを加え、０℃
で１０分間静置、続いて３７℃に１０分間保温する。
この細胞混合液に２ゴの１０％ＳＤＳ、５１１１１の５
Ｍ−ＮａＣ１を加え４°Ｃに１５〜１８時間静置する。
Ｍ−ＮａＣ１を加え４°Ｃに１５〜１８時間静置する。
これを２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心によって遠心
し、上清を得る。
し、上清を得る。
この上清にポリエチレングリコール６０００を１０係（
ｗ／ｖ ）加え、２〜３時間０℃に静置２２００ｒｐｍ
、２分の遠心で沈澱を得る。
ｗ／ｖ ）加え、２〜３時間０℃に静置２２００ｒｐｍ
、２分の遠心で沈澱を得る。
この沈澱を１５７７１１のＴＢＳに溶解し、ＣｓＣ１及
びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。
びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．
６２に調整する。
この試料を３８００Ｏｒｐｍで３０〜４０時間、平衝密
度勾配遠心する。
度勾配遠心する。
生じたプラスミドＤＮＡのバンドを集め、イソアミルア
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ。
ルコールでエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ
（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ。
１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＮａＣ１）に透析する事によ
ってプラスミドＤＮＡ溶液が得られる。
ってプラスミドＤＮＡ溶液が得られる。
このプラスミドＤＮＡ溶液はｐＴＨＮｌとｐＴＨＴ１５
の混合物であるがこの溶液を０．７ ％の低融点アガロ
ース（ＢＲＬ社製）による電気泳動し、生ずる２つのバ
ンドのうちｐＴＨＮｌに相当する部分を切り出し、ゲル
から溶出する事によって純粋なｐＴＨＮｌが得られる。
の混合物であるがこの溶液を０．７ ％の低融点アガロ
ース（ＢＲＬ社製）による電気泳動し、生ずる２つのバ
ンドのうちｐＴＨＮｌに相当する部分を切り出し、ゲル
から溶出する事によって純粋なｐＴＨＮｌが得られる。
低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。
によった。
切り出したゲルスライスを６５℃に保温して融解、これ
に２倍量の０．５ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含む５０
ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）を
加え、３７℃に移し保温する。
に２倍量の０．５ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａを含む５０
ｍＭＴ ｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）を
加え、３７℃に移し保温する。
これに等量の０．１ ＭＴ ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で飽和させたフェノールを加え混合、遠心（
３０００〜５０００ｒｐｍ１５分）後、上層の水層を分
取する。
Ｈ８，０）で飽和させたフェノールを加え混合、遠心（
３０００〜５０００ｒｐｍ１５分）後、上層の水層を分
取する。
フェノール抽出をもう一度行いエーテルによってフェノ
ールを水層より除去した後、３Ｍ酢酸アンモニウム溶液
を１／１０容加え、３容のエタノールによりエタノール
沈澱を行う。
ールを水層より除去した後、３Ｍ酢酸アンモニウム溶液
を１／１０容加え、３容のエタノールによりエタノール
沈澱を行う。
得られた沈澱をＴＥＮに溶解してプラスミド溶液とした
。
。
ｐＴＨＮｌの特性決定の手順手順
ｐＴＨＮｌの分子量は、その超らせん構造（５ｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）のＤＮＡ及び制
限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳
動より得られた。
ｃｏｉｌｅｄ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ）のＤＮＡ及び制
限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳
動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐ Ｂ Ｒ３２２ＤＮＡ （
２，６７ｍｄ ）、Ｃｏ１ＥＩＤＮＡ（４，２ｍｄ）及
びラムダＤＮＡのＨｉｎｄｌ［分解断片（１４，６、５
，８４、４，０５、２，６７、１，０４。
２，６７ｍｄ ）、Ｃｏ１ＥＩＤＮＡ（４，２ｍｄ）及
びラムダＤＮＡのＨｉｎｄｌ［分解断片（１４，６、５
，８４、４，０５、２，６７、１，０４。
１．２１ 、０．３４ｍｄ、 ラムダＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ分解断片（１３，７、４，７４、３，７３、３，４８
、３，０２゜２．１３ｍｄ）を用いた。
Ｉ分解断片（１３，７、４，７４、３，７３、３，４８
、３，０２゜２．１３ｍｄ）を用いた。
制御酵素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタ
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行なった。
ノール沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に
溶解して行なった。
制限酵素は宝酒造よりの市販品を用いた。アガロースゲ
ル電気泳動はシーケム社のアガロースを０．５係又は０
．７係の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル
長さ１ｃＩｒＬ当り１．５■の定電圧で１５〜１７時間
行なった。
ル電気泳動はシーケム社のアガロースを０．５係又は０
．７係の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル
長さ１ｃＩｒＬ当り１．５■の定電圧で１５〜１７時間
行なった。
ｐＴＨＮｌが、そのＤＮＡ上にネオマイシン、カナマイ
シン耐性遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズ
ブチルスＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験
によって確かめられた。
シン耐性遺伝子を有している事は、枯草菌バチルス・ズ
ブチルスＲＭ１２５株プロトプラストへの形質転換実験
によって確かめられた。
バチルス・ズブチルスＲＭ１２５株のプロトプラストの
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅｃ 、Ｇｅｎ 。
調製、形質転換、プロトプラストの再生の手順はＣｈａ
ｎｇ ＆Ｃｏｈｅｎの方法（Ｍｏ１ｅｃ 、Ｇｅｎ 。
Ｇｅｎｅｔ、、１６８，１１１−１１５（１９７９））
によって行なった。
によって行なった。
この方法の概略はＲＭ１２５株の対数増殖菌体を等張液
中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化し、この
プロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え、
ポリエチレングリコール６０００によってＤＮＡのプロ
トプラスト内への取込みを促した後、再生培地上でプロ
トプラストから栄養細胞への再生を図るというものであ
る。
中でリゾチーム処理によってプロトプラスト化し、この
プロトプラスト懸濁液にプラスミドＤＮＡ溶液を加え、
ポリエチレングリコール６０００によってＤＮＡのプロ
トプラスト内への取込みを促した後、再生培地上でプロ
トプラストから栄養細胞への再生を図るというものであ
る。
ｐＴＨＮＩＤＮＡ約１μＩを用いて、ＲＭ１２５株のプ
ロトプラスト懸濁液０．５ｍ１（２Ｘ１０９プロトプラ
スト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地上で
ネオマイシン、カナマイシン耐性株の出現を検討したと
ころ、この際のプロトプラストの再生率１０％（２Ｘ１
０６／１ｒＬｌ）に対して１×１０３／ｍｌの頻度でネ
オマイシン、カナマイシン耐：性株が生じた。
ロトプラスト懸濁液０．５ｍ１（２Ｘ１０９プロトプラ
スト／ｍｌ）に対して形質転換を行ない、再生培地上で
ネオマイシン、カナマイシン耐性株の出現を検討したと
ころ、この際のプロトプラストの再生率１０％（２Ｘ１
０６／１ｒＬｌ）に対して１×１０３／ｍｌの頻度でネ
オマイシン、カナマイシン耐：性株が生じた。
一方、プラスミドＤＮＡ溶液を加えなかった系（コント
ロール）ではネオマイシン、カナマイシン耐性株は２×
１０６個以上のプロトプラストを徹いても生じてはこな
かった。
ロール）ではネオマイシン、カナマイシン耐性株は２×
１０６個以上のプロトプラストを徹いても生じてはこな
かった。
ここで得られたＲＭ１２５株のネオマイシン、カナマイ
シン耐性株よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステア
ロサーモフィルスＮ１株よりのプラスミドＤＮＡの抽出
の際と同様（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３
０分間である点が異なる。
シン耐性株よりプラスミドＤＮＡを、バチルス・ステア
ロサーモフィルスＮ１株よりのプラスミドＤＮＡの抽出
の際と同様（リゾチーム処理の温度及び時間が３７℃３
０分間である点が異なる。
）の方法で抽出し検討したところ、ｐＴＨＮｌと同一分
子量で、制限酵素による切断パターンも全く同一なプラ
スミドＤＮＡが回収された。
子量で、制限酵素による切断パターンも全く同一なプラ
スミドＤＮＡが回収された。
この事実は、ｐＴＨＮｌがネオマイシン、カナマイシン
耐性遺伝子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５
株に入った事によってＲＭ１２５株がネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の形質を示すに到った事を証明するもの
である。
耐性遺伝子を有しており、このプラスミドがＲＭ１２５
株に入った事によってＲＭ１２５株がネオマイシン、カ
ナマイシン耐性の形質を示すに到った事を証明するもの
である。
同時に、ｐＴＨＮｌが、好熱菌及び枯草菌で、自律的増
殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである事、つま
り本プラスミドが両菌株でベクタ△として利用し得る事
実を明らかにするものである。
殖能及び形質の発現が可能なプラスミドである事、つま
り本プラスミドが両菌株でベクタ△として利用し得る事
実を明らかにするものである。
ネオマイシン、カナマイシン耐性を有する好熱菌のプラ
スミドとしては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴ
ＨＮｌと他のものでは前述のように明らかに異なってお
り、ｐＴＨＮｌは従来認められない新規なプラスミドで
ある。
スミドとしては前記の表に示したとおりであるが、ｐＴ
ＨＮｌと他のものでは前述のように明らかに異なってお
り、ｐＴＨＮｌは従来認められない新規なプラスミドで
ある。
図面はｐＴＨＮｌの制限酵素開裂地図を示し、図中のＡ
ｃｃＩはアシネトバクタ−・カルコアセティカス由来の
酵素、Ｂｇｌｌｌはバチルス・グロビギー由来の酵素、
Ｅｃ ｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、Ｈｈａ
Ｉはハエモフイルス・ハエモリティカス由来の酵素、Ｈ
ｐａＩｌはハエモフイルス・パラインフルエンザエ由来
の酵素、ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルテイイ由
来の酵素、ＴａｇＩはサーマス・アクアティカス由来の
酵素をそれぞれ示している。
ｃｃＩはアシネトバクタ−・カルコアセティカス由来の
酵素、Ｂｇｌｌｌはバチルス・グロビギー由来の酵素、
Ｅｃ ｏＲＩはエシェリヒア・コリ由来の酵素、Ｈｈａ
Ｉはハエモフイルス・ハエモリティカス由来の酵素、Ｈ
ｐａＩｌはハエモフイルス・パラインフルエンザエ由来
の酵素、ＰｓｔＩはプロビデンシア・ストアルテイイ由
来の酵素、ＴａｇＩはサーマス・アクアティカス由来の
酵素をそれぞれ示している。
Claims (1)
- １ ネオマイシン、カナマイシン耐性の遺伝子を内部に
備え、その分子量が約３．０メガダルトンであり、図に
示される制限酵素地図で特徴づけられるプラスミドを保
有する新規なバチルス・ステアロサーモフィルスＮ１株
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157369A JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57157369A JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5945878A JPS5945878A (ja) | 1984-03-14 |
| JPS5945354B2 true JPS5945354B2 (ja) | 1984-11-06 |
Family
ID=15648142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57157369A Expired JPS5945354B2 (ja) | 1982-09-09 | 1982-09-09 | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5945354B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
-
1982
- 1982-09-09 JP JP57157369A patent/JPS5945354B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5945878A (ja) | 1984-03-14 |
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