JPS5978688A - 高度好熱菌由来の新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高度好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベ
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約０．９メガダルトンで
あり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけら
れる新規なプラスミドに関するものである。

従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０
°〜３７℃の中温菌である点に問題がある。

一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
存する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主・ベク
ター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の宿主・ベクタ
ー系の開発研究は、これまで全く行なわれていない。し
かも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミド
ＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料と
した研究は以下の２報しか知られていない。

（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ．、タナカ、Ｔ．アンド　サカグチ、Ｋ．Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、１０４、１９３−１９９（１９７
８）（２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプ
ラスミド（ｐＴＴ１）の物理的性状 エベルハード、Ｍ．Ｄ．、バスクエズ、Ｃ．、バレンズ
エラ、Ｐ．、ビキュナ、Ｒ．アンド　ユデレビック、Ａ
．Ｐｌａｓｍｉｄ、６、１−６（１９８１）上記２報に
記載されているプラスミドは、いずれもその性質が不明
ないわゆるクリプティック・プラスミドであり、またそ
れらの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。従っ
て、このままの形でベクターとして利用する、或いはこ
れらを素材としてベクター開発を行う事には、あまりに
困難が大きいものと考えられる。そこで、本発明者らは
、高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミドが宿
主内に存在していることを示すマーカー）を有し、しか
も分子量の小さいプラスミドの検索を行った。その結果
ストレプトマイシン耐性を示したサーマス・フラバスか
ら分子量約０．９メガダルトンのプラスミドを単離する
事に成功した。

このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が極めて小さくしかも数種の制限酵素によ
る切断点を特異的に有している（以下、本プラスミドを
ｐＮＨＳ１７１と略称する）。

なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。

ＢａｍＨ■はバチルス・アミロサクエファシエンス由来
の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニエア由来
の酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・ステアロサーモフィル
ス由来の酵素を示す。

以下、これまでに報告されているサーマス属細菌、即ち
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に示す。

表から明らかなように、ｐＮＨＳ１７１は既知のプラス
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。

プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、高度好
熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗生
物質が存在しない様な温泉である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＮＨＳ１７１を利用すれば、極めて便
利であるものと考えられる。

何故ならば、第１にｐＮＨＳ１７１は高度好熱菌で複製
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプティック・プラスミドに
比べてはるかに小さい分子量しか有しないという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大き
なプラスミドよりも、はるかに容易に行えるという利点
を有しているからである。

更にｐＮＨＳ１７１は図からも明らかなように、Ｋｐｎ
■、ＢａｍＨ■などの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に存している。

このことはｐＮＨＳ１７１をベクターとして利用する際
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。

さて、本プラスミドをベクターとして異種の耐熱性を有
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業に於ける冷
却コストの節減が達成されよう。

また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図る事によって、バイオリ
アクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの応
用が期待される。

ｐＮＨＳ１７１の人手は、本発明者らが温泉水中から新
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＳ１７
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（五大栄養）０．８％、ＮａＣ
ｌ０．２％）により対数増殖後期迄増殖させて得た菌体
を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事によ
って達せられる。

また、サーマス・フラバスＴＳ１７株は好気性のグラム
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生しＤＮＡｎｏＧＣ含
量が約７０％、生育至適温度が７０℃の菌株であるがｐ
ＮＨＳ１７１を保有する点では従来には認められない新
規な微生物である。本菌株はストレプトマイシン耐性株
として温泉水中より分離されたが、エリスロマイシン、
カナマイシンにも耐性を示し、アンピシリン、クロラム
フェニコール、ネオマイシン、テトラサイクリンには感
受性であった。

なお、本菌株は微工研菌寄第６７５１号として寄託され
ている。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。

実施例１（菌株のスクリーニング） 静岡県の熱川温泉の温泉水約１ｍｌをサーマス培地（デ
ィフコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプト
ン（五大栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％）１００ｍ
ｌに加え７０℃で約１８時間振盪培養後、ストレプトマ
イシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むサーマス寒天平板状で
生育したコロニーの一つからサーマス・フラバスＴＳ１
７株（微工研菌寄第６７５１号）が得られた。

実施例２ プラスミドｐＮＨＳ１７１のサーマス・フラバスＴＳ１
７株からの分離 サーマス・フラバスＴＳ１７株（微工研菌寄第６７５１
号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍｌのサーマ
ス培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、
ポリペプトン（五大栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％
、ｐＨ７．５）に接種し７０℃で１６〜１８時間振盪培
養する。

この培養液を１ｌのストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ
を含有するサーマス培地に接種し、７０℃で５時間培養
する。菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＴＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌｐ
Ｈ７．５）で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２
５％ショ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０ｍ
ｇ／ｍｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）４ｍｌを加え、０℃で１０分間静置、続いて３７℃
に１０分間保温する。この細胞混合液に２ｍｌの１０％
ＳＤＳ、５ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１
８時間静置する。これを２８０００ｒｐｍ、１時間の超
遠心によって遠心し、上清を得る。この上清にポリエチ
レングリコール６０００を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜
３時間０℃に静置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心で沈澱
を得る。この沈澱を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣ
ｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜
１．６２に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３
０〜４０時間、平衝密度勾配遠心する。生じたプラスミ
ドＤＮＡのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチ
ジウムブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＮａＣｌ）に
透析する事によってプラスミド溶液が得られる。このプ
ラスミド溶液はｐＮＨＳ１７１と分子量約１０メガダル
トンのｐＮＨＳ１７２との混合物であるが、このプラス
ミド溶液を１．０％の低融点アガロース（ＢＲＥ社製）
による電気泳動に供し、生ずるｐＮＨＳ１７１に相当す
るバンドを切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋
なｐＮＨＳ１７１が得られる。

低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、これに２倍量の０．５ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７
℃に移し保温する。これに等量の０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを加
え混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、
上層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行い
エーテルによってフェノールを水層より除去した後、３
Ｍ酢酸アンモニウム溶液を１／１０容加え、３容のエタ
ノールによりエタノール沈澱を行う。得られた沈澱をＴ
ＥＮに溶解してプラスミド溶液とした。

ｐＮＨＳ１７１の特性決定の手段 ｐＮＨＳ１７１の分子量は、そ超らせん構造（ｓｕｐｃ
ｒｃｏｉｌｅｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。

この際の分子量マーカーはｐｂＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、Ｃｏｌ■ＴＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄ■分解断片（１４．６、５．８４、４
．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４ｍｄ
）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲ■分解断片（１３．７、４
．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｍｄ
）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｃ■分解断片（０．８３６
、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．１９２、
０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１２０、０
．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵素による
断片は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈澱によ
ってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解して行なっ
た。制限酵素は宝造及び、ベーリンカー・マンハイム社
よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動はシー
ケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃度で用
い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃｍ当り１
．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。

ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。

高度好熱菌のプラスミドとしては、前記の表に示したと
おりであるがｐＮＨＳ１７１と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨＳ１７１は従来認めら
れない新規なプラスミドである。

【図面の簡単な説明】

図面はｐＮＨＳ１７１の制限酵素開裂地図を示し、図中
のＢａｍＨ■はバチルス・アミロリクエファシエンス由
来の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニア由来
の酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・ステアロサーモフィル
ス由来の酵素をそれぞれ示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 分子量が約０．９メガダルトンであり、図に示される制
   限酵素地図で特徴づけられる高度好熱菌由来の新規なプ
   ラスミド。