JPS5978689A - 高度好熱菌由来の新規プラスミド - Google Patents
高度好熱菌由来の新規プラスミドInfo
- Publication number
- JPS5978689A JPS5978689A JP57189523A JP18952382A JPS5978689A JP S5978689 A JPS5978689 A JP S5978689A JP 57189523 A JP57189523 A JP 57189523A JP 18952382 A JP18952382 A JP 18952382A JP S5978689 A JPS5978689 A JP S5978689A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- thermophilic bacterium
- highly thermophilic
- vector
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は高度好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験のベ
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約１．０メガダルトンで
あり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけら
れる新規なプラスミドに関するものである。
クターとして有用な新規なプラスミドに関するものであ
り、より詳しくはその分子量が約１．０メガダルトンで
あり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけら
れる新規なプラスミドに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０
°〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。しかし、上記の菌はいずれも生育温度が３０
°〜３７℃の中温菌である点に問題がある。
一方、好熱性細菌は、生育上限温度が５５℃〜７５℃に
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主・ベク
クター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の宿主・ベク
ター系の開発研究は、これまで全く行われていない。し
かも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミド
ＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料と
した研究は以下の２報しか知られていない。
ある中等度好熱菌と、生育上限温度が７５℃以上である
高度好熱菌とに大別されるが、いずれについても、その
有する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶媒性に優れている
事が知られており、とりわけ好熱菌由来の耐熱性酵素及
び耐熱性生体機能のバイオリアクター等の工業プロセス
への応用という点から注目を集めている。従って、好熱
性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一つの、
しかも有力な手段と考えられる好熱性細菌の宿主・ベク
クター系の開発研究、とりわけ高度好熱菌の宿主・ベク
ター系の開発研究は、これまで全く行われていない。し
かも、ベクターの開発研究の基礎となるべきプラスミド
ＤＮＡの検索という点についても、高度好熱菌を材料と
した研究は以下の２報しか知られていない。
（１）高度好熱菌よりの染色体外ＤＮＡの分離ヒシヌマ
、Ｆ．、タナカ、Ｔ．アンド サカグチ、Ｋ．Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、１０４、１９３−１９９（１９７
８）（２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプ
ラスミド（ｐＨ１）の物理的性状 エベルハード、Ｍ．Ｄ．、バスクエズ、Ｃ．、バレンズ
エラ、Ｐ．、ビキュナ、Ｒ．アンド ユデレビック、Ａ
．Ｐｌａｓｍｉｄ、６、１−Ｇ（１９８１）上記２報に
記載されているプラスミドは、いずれもその性質が不明
ないわゆるクリプティック・プラスミドであり、またそ
れらの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。従っ
て、このままの形でベクターとして利用する、或いはこ
れらを素材としてベクター開発を行う事には、あまりに
困難が大きいものと考えられる。そこで、本発明者らは
、高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミドが宿
主内に存在していることを示すマーカー）を有し、しか
も分子量の小さいプラスミドの検索を行った。その結果
カナマイシン耐性を示したサーマス・フラバスから分子
量約１．０メガダルトンのプラスミドを単離する事に成
功した。
、Ｆ．、タナカ、Ｔ．アンド サカグチ、Ｋ．Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．、１０４、１９３−１９９（１９７
８）（２）サーマス・サーモフィルスから単離されたプ
ラスミド（ｐＨ１）の物理的性状 エベルハード、Ｍ．Ｄ．、バスクエズ、Ｃ．、バレンズ
エラ、Ｐ．、ビキュナ、Ｒ．アンド ユデレビック、Ａ
．Ｐｌａｓｍｉｄ、６、１−Ｇ（１９８１）上記２報に
記載されているプラスミドは、いずれもその性質が不明
ないわゆるクリプティック・プラスミドであり、またそ
れらの分子量も６メガダルトン程度とやや大きい。従っ
て、このままの形でベクターとして利用する、或いはこ
れらを素材としてベクター開発を行う事には、あまりに
困難が大きいものと考えられる。そこで、本発明者らは
、高度好熱菌より、選択マーカー（そのプラスミドが宿
主内に存在していることを示すマーカー）を有し、しか
も分子量の小さいプラスミドの検索を行った。その結果
カナマイシン耐性を示したサーマス・フラバスから分子
量約１．０メガダルトンのプラスミドを単離する事に成
功した。
このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が極めて小さくしかも数種の制限酵素によ
る切断点を特異的に存している（以下、本プラスミドを
ｐＮＨＫ１０１と略称する）。
如く、分子量が極めて小さくしかも数種の制限酵素によ
る切断点を特異的に存している（以下、本プラスミドを
ｐＮＨＫ１０１と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
ＢａｍＨ■はバチルス・アミロサクエファシエンス由来
の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニア由来の
酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・スナアロサーモフィルス
由来の酵素を示す。
の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニア由来の
酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・スナアロサーモフィルス
由来の酵素を示す。
以下、これまでに報告されているサーマス属細菌、即ち
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に表す。
高度好熱菌由来のプラスミドとの相違点を表に表す。
表から明らかなように、ｐＮＨＫ１０１は既知のプラス
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。
ミドに較べ、分子量、制限酵素による切断パターンが明
らかに異なっており、新規なプラスミドであることが認
められる。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得える為には、そのプ
ラスミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー
（そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマ
ーカー）を有していることが必須である。しかし、高度
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない様な温泉である菌について考えた場
合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容
易ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティ
ック・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与す
るという方式でベクター開発を行わなければならないで
あろう。その際にｐＮＨＫ１０１を利用すれば、極めて
便利であるものと考えられる。
ラスミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー
（そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマ
ーカー）を有していることが必須である。しかし、高度
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない様な温泉である菌について考えた場
合、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容
易ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティ
ック・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与す
るという方式でベクター開発を行わなければならないで
あろう。その際にｐＮＨＫ１０１を利用すれば、極めて
便利であるものと考えられる。
何故ならば、第１にｐＮＨＫ１０１は高度好熱菌で複製
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプティック・プラスミドに
比べてはるかに小さい分子量しか有しないという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大き
なプラスミドよりも、はるかに容易に行えるという利点
を有しているからである。
が可能なプラスミドであるからであり、第２には、他の
高度好熱菌由来の既知のクリプティック・プラスミドに
比べてはるかに小さい分子量しか有しないという点から
、本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複
製に関与する遺伝子等の解析が、他の分子量のより大き
なプラスミドよりも、はるかに容易に行えるという利点
を有しているからである。
更にｐＮＨＫ１０１は図からも明らかなように、Ｋｐｎ
■、ＢａｍＨ■などの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に有している。
■、ＢａｍＨ■などの制限酵素による開裂部位を特定の
しかも限られた位置に有している。
このことはｐＮＨＫ１０１をベクターとして利用する際
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。
に、挿入すべき異種遺伝子の導入部位を有意に保持でき
るという点で有利である。
さて、本プラスミドをベクターとして異種の耐熱性を有
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業に於ける冷
却コストの節減が達成されよう。
する遺伝子を好熱菌に導入すれば、醗酵工業に於ける冷
却コストの節減が達成されよう。
また、耐熱性、耐溶媒性等の性質に優れた好熱菌の酵素
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図ることによって、バイオ
リアクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの
応用が期待される。
の遺伝子を、本プラスミドをベクターとして好熱菌宿主
にクローン化し、その量産を図ることによって、バイオ
リアクター等への応用が可能であり、工業プロセスへの
応用が期待される。
ｐＮＨＫ１０１の人手は、本発明者らが温泉水中から新
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＫ１０
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（五大栄養）０．８％、ＮａＣ
ｌ０．２％）により対数増殖後期迄増殖させて得た菌体
を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事によ
って達せられる。
たに分離した高度好熱菌、サーマス・フラバスＴＫ１０
株をサーマス培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．４％、ポリペプトン（五大栄養）０．８％、ＮａＣ
ｌ０．２％）により対数増殖後期迄増殖させて得た菌体
を、リゾチーム、ＳＤＳ処理によって溶菌させる事によ
って達せられる。
また、サーマス・フラバスＴＫ１０株は好気性のグラム
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ含量
が約７０％、生育至適温度が７０℃の菌株であるがｐＮ
ＨＫ１０１を保存する点では従来には認められない新規
な微生物である。本菌株はカナマイシン耐性株として温
泉水中より分離されたが、エリスロマイシン、ストレプ
トマイシンにも耐性を示し、アンピシリン、クロラムフ
ェニコール、ネオマイシン、テトラサイクリンには感受
性であった。
染色陰性の桿菌で、黄色々素を産生しＤＮＡのＧＣ含量
が約７０％、生育至適温度が７０℃の菌株であるがｐＮ
ＨＫ１０１を保存する点では従来には認められない新規
な微生物である。本菌株はカナマイシン耐性株として温
泉水中より分離されたが、エリスロマイシン、ストレプ
トマイシンにも耐性を示し、アンピシリン、クロラムフ
ェニコール、ネオマイシン、テトラサイクリンには感受
性であった。
なお、本菌株は微工研菌寄第６７５０号として寄託され
ている。
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
静岡の熱川温泉の温泉水約１ｍｌをサーマス培地（ディ
フコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプトン
（五大栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％）１００ｍｌ
に加え７０℃で約１８時間振盪培養後、カナマイシン（
１０μｇ／ｍｌ）を含むサーマス寒天平板状で生育した
コロニーの一つからサーマス・フラバスＴＫ１０株（微
工研菌寄第６７５０号）が得られた。
フコ・イーストエキストラクト０．４％、ポリペプトン
（五大栄養）０．８％、ＮａＣｌ０．２％）１００ｍｌ
に加え７０℃で約１８時間振盪培養後、カナマイシン（
１０μｇ／ｍｌ）を含むサーマス寒天平板状で生育した
コロニーの一つからサーマス・フラバスＴＫ１０株（微
工研菌寄第６７５０号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＮＨＫ１０１のサーマス・フラバスＴＫ１
０株からの分離 サーマス・フラバスＴＫ１０株（微工研菌寄第６７５０
号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍｌのサーマ
ス培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、
ポリペプトン（五大栄養）０．８％ＮａＣｌ０．２％ｐ
Ｈ７．５）に接続し７０℃で１６〜１８時間振盪培養す
る。
０株からの分離 サーマス・フラバスＴＫ１０株（微工研菌寄第６７５０
号）の生物学的に純粋な培養基から１００ｍｌのサーマ
ス培地（ディフコ・イーストエキストラクト０．４％、
ポリペプトン（五大栄養）０．８％ＮａＣｌ０．２％ｐ
Ｈ７．５）に接続し７０℃で１６〜１８時間振盪培養す
る。
この培養液を１ｌのカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含有
するサーマス培地に接種し、７０℃で５時間培養する。
するサーマス培地に接種し、７０℃で５時間培養する。
菌体を遠心によって集め、ＴＥＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌｐＨ７．
５）で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５％シ
ョ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４
ｍｌを加え、０℃で１０分間静置、続いて３７℃に１０
分間保温する。この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ
、５ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間
静置する。これを２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心に
よって遠心し、上清を得る。この上清にポリエチレング
リコール６０００を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時間
０℃に静置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心で沈澱を得る
。この沈澱を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣｌ及び
エチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６
２に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４
０時間、平衝密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮ
Ａのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウム
ブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＮａｃｌ）に透析す
る事によってプラスミド溶液が得られる。このプラスミ
ド溶液はｐＮＨＫ１０１と分子量約９メガダルトンのｐ
ＮＨＫ１０２との混合物であるが、このプラスミド溶液
を、１．０％の低融点アガロース（ＢＲＥ社製）による
電気泳動に供し、生ずるｐＮＨＫ１０１に相当するバン
ドを切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐＮ
ＨＫ１０１が得られる。
ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌｐＨ７．
５）で洗浄後菌体湿重量４ｇ当り、１０ｍｌの２５％シ
ョ糖含有ＴＥＳに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を２ｍｌ、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４
ｍｌを加え、０℃で１０分間静置、続いて３７℃に１０
分間保温する。この細胞混合液に２ｍｌの１０％ＳＤＳ
、５ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌを加え４℃に１５〜１８時間
静置する。これを２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心に
よって遠心し、上清を得る。この上清にポリエチレング
リコール６０００を１０％（ｗ／ｖ）加え、２〜３時間
０℃に静置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心で沈澱を得る
。この沈澱を１５ｍｌのＴＥＳに溶解し、ＣｓＣｌ及び
エチジウムブロマイドを加えて密度を１．６１〜１．６
２に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４
０時間、平衝密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮ
Ａのバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウム
ブロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＮａｃｌ）に透析す
る事によってプラスミド溶液が得られる。このプラスミ
ド溶液はｐＮＨＫ１０１と分子量約９メガダルトンのｐ
ＮＨＫ１０２との混合物であるが、このプラスミド溶液
を、１．０％の低融点アガロース（ＢＲＥ社製）による
電気泳動に供し、生ずるｐＮＨＫ１０１に相当するバン
ドを切り出してＤＮＡを回収する事によって純粋なｐＮ
ＨＫ１０１が得られる。
低融点アガロースゲルからのＤＮＡの回収は以下の手順
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、これに２倍量の０．５ｍＭＤＴＡを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７℃
に移し保温する。これに等量の０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを加え
混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、上
層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行いエ
ーテルによってフェノールを水層より除去した後、３Ｍ
酵素アンモニウム溶液を１／１０容加え、３容のエタノ
ールによりエタノール沈澱を行う。得られた沈澱をＴＥ
Ｎに溶解してプラスミド溶液とした。
によった。切り出したゲルスライスを６５℃に保温して
融解、これに２倍量の０．５ｍＭＤＴＡを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３７℃
に移し保温する。これに等量の０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で飽和させたフェノールを加え
混合、遠心（３０００〜５０００ｒｐｍ、５分）後、上
層の水層を分取する。フェノール抽出をもう一度行いエ
ーテルによってフェノールを水層より除去した後、３Ｍ
酵素アンモニウム溶液を１／１０容加え、３容のエタノ
ールによりエタノール沈澱を行う。得られた沈澱をＴＥ
Ｎに溶解してプラスミド溶液とした。
ｐＮＨＫ１０１の特性決定の手順
ｐＮＨＫ１０１の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐ
ｃｒｃｏｉｌｃｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制
限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳
動及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた
。
ｃｒｃｏｉｌｃｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制
限酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳
動及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた
。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＴＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄ■分解断片（１４．６、５．８４、４
．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４ｍｄ
）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲ■分解断片（１３．７、４
．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｍｄ
）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅ■分解断片（０．８３６
、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．１９２、
０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１２０、０
．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵素による
切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈澱によ
ってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解して行なっ
た。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マンハイム
社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動はシ
ーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃度で
用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃｍ当り
１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＴＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄ■分解断片（１４．６、５．８４、４
．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４ｍｄ
）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲ■分解断片（１３．７、４
．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３ｍｄ
）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｅ■分解断片（０．８３６
、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．１９２、
０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１２０、０
．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵素による
切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール沈澱によ
ってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解して行なっ
た。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マンハイム
社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気泳動はシ
ーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％の濃度で
用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１ｃｍ当り
１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
高度好熱菌のプラスミドとしては、前記の表に示したと
おりであるがｐＮＨＫ１０１と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨＫ１０１は従来認めれ
ない新規なプラスミドである。
おりであるがｐＮＨＫ１０１と他のものでは前述のよう
に明らかに異なっており、ｐＮＨＫ１０１は従来認めれ
ない新規なプラスミドである。
図面はｐＮＨＫ１０１の制限酵素開裂地図を示し、図中
のＢａｍＨ■はバチルス・アミロリクエファシエンス由
来の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニア由来
の酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・ステアロリーエフィル
ス由来の酵素をそれぞれ示している。
のＢａｍＨ■はバチルス・アミロリクエファシエンス由
来の酵素、Ｋｐｎ■はクレブシエラ・ニューモニア由来
の酵素、ＢｓｔＮ■はバチルス・ステアロリーエフィル
ス由来の酵素をそれぞれ示している。
Claims (1)
- 分子量が約１．０メガダルトンであり、図に示される制
限酵素地図で特徴づけられる高度好熱菌由来の新規プラ
スミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189523A JPS5953836B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌由来の新規プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57189523A JPS5953836B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌由来の新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5978689A true JPS5978689A (ja) | 1984-05-07 |
| JPS5953836B2 JPS5953836B2 (ja) | 1984-12-27 |
Family
ID=16242708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57189523A Expired JPS5953836B2 (ja) | 1982-10-28 | 1982-10-28 | 高度好熱菌由来の新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5953836B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202112837A (zh) | 2019-09-26 | 2021-04-01 | 日商富士軟片股份有限公司 | 導熱層的製造方法、積層體的製造方法及半導體器件的製造方法 |
-
1982
- 1982-10-28 JP JP57189523A patent/JPS5953836B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5953836B2 (ja) | 1984-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yoshihama et al. | Cloning vector system for Corynebacterium glutamicum | |
| CA1198693A (en) | Plasmid pcg2 | |
| Jackson et al. | Cloning and expression of the exfoliative toxin B gene from Staphylococcus aureus | |
| Brestic-Goachet et al. | Transfer and expression of an Erwinia chrysanthemi cellulase gene in Zymomonas mobilis | |
| Heierson et al. | Transformation of vegetative cells of Bacillus thuringiensis by plasmid DNA | |
| Collins et al. | Identification of restriction fragments from two cryptic Clostridium butyricum plasmids that promote the establishment of a replication-defective plasmid in Bacillus subtilis | |
| Matveyev et al. | A novel genome rearrangement involved in heterocyst differentiation of the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 | |
| Löfdahl et al. | A vector for recombinant DNA in Staphylococcus aureus | |
| JPS5978684A (ja) | 新規プラスミドを保有する新規微生物 | |
| Trautwetter et al. | Structural organization of the Corynebacterium glutamicum plasmid pCG100 | |
| JPS5978689A (ja) | 高度好熱菌由来の新規プラスミド | |
| JPS5978690A (ja) | 高度好熱菌に由来する新規プラスミド | |
| JPS5978688A (ja) | 高度好熱菌由来の新規なプラスミド | |
| JPS5978685A (ja) | 新規なプラスミドを保有する新規微生物 | |
| JPS5978691A (ja) | 高度好熱菌に由来する新規なプラスミド | |
| JPS5953830B2 (ja) | 新規なプラスミドを保有する新規な微生物 | |
| EVANS et al. | Molecular cloning of a pIP501 derivative yields a model replicon for the study of streptococcal conjugation | |
| JPS5928392B2 (ja) | テトラサイクリン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 | |
| JPS5923793B2 (ja) | テトラサイクリン耐性を備えた新規プラスミド及びこれを保有する新規微生物 | |
| JPS5945354B2 (ja) | ネオマイシン、カナマイシン耐性プラスミドを保有する新規な微生物 | |
| JPH0787790B2 (ja) | 新規な遺伝子ｄｎａおよびアルカリ性プロテア−ゼの製造法 | |
| MATSUNO et al. | Transformation of Bacillus subtilis, antifungal-antibiotic iturin producers with isolated antibiotic resistance plasmids | |
| JPS5928396B2 (ja) | テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド | |
| JPS5923792B2 (ja) | テトラサイクリン耐性を備えた新規なプラスミド及びこれを保有する新規な微生物 | |
| JP3520322B2 (ja) | 低温細菌由来の新規なプラスミドｐＰＳ１Ｍ２及びその誘導体 |