JPS60186286A - 嫌気性好熱菌に由来する新規プラスミド - Google Patents
嫌気性好熱菌に由来する新規プラスミドInfo
- Publication number
- JPS60186286A JPS60186286A JP59043364A JP4336484A JPS60186286A JP S60186286 A JPS60186286 A JP S60186286A JP 59043364 A JP59043364 A JP 59043364A JP 4336484 A JP4336484 A JP 4336484A JP S60186286 A JPS60186286 A JP S60186286A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- anaerobic
- plasmid
- thermophile
- ypg
- psh29
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は嫌気性好熱菌を宿主とする組換えＤＮＡ実験の
ベクターとして有用な新規なプラスミドに関するもので
あり、より詳しくはその分子量が約３．８メガダルトン
であり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけ
られる新規なプラスミドに関するものである。
ベクターとして有用な新規なプラスミドに関するもので
あり、より詳しくはその分子量が約３．８メガダルトン
であり、図に示される制限酵素開裂地図により特徴づけ
られる新規なプラスミドに関するものである。
従来、組換えＤＮＡ実験は主として大腸菌を宿主とする
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
系で広く研究がおこなわれインシュリン、インターフェ
ロン、ヒト成長ホルモン等が大腸菌で量産されるなど大
きな成果を挙げている。大腸菌の宿主・ベクター系はほ
ぼ完成されており、また大腸菌以外にも酵母、枯草菌な
どで宿主・ベクター系が開発され応用への道が検討され
つつある。
５０〜８０℃の高温条件下でセルロース、ヘミセルロー
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行なわ
れていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となる
べきプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気
性好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこ
で、本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索
を行った。その結果ストレプトマイシン耐性を示したサ
ーモアナエロバクターから分子量約３．８メガダルトン
のプラスミドを単離する事に成功した。
ス、デンプン等を分解し、アルコール類、有機酸、メタ
ン等を生産する嫌気性好熱菌は、バイオマス変換の効率
的生体触媒として、あるいは耐熱性、安定性に優れる有
用酵素の供給源として注目を集めている。従って、嫌気
性好熱性細菌の育種が重要と考えられるが、その為の一
つの、しかも有力な手段と考えられる嫌気性好熱性細菌
の宿主・ベクター系の開発研究は、これまで全く行なわ
れていない。しかも、ベクターの開発研究の基礎となる
べきプラスミドＤＮＡの検索という点についても、嫌気
性好熱菌を材料とした研究は全く知られていない。そこ
で、本発明者らは、嫌気性好熱菌より、選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有し、しかも分子量の小さいプラスミドの検索
を行った。その結果ストレプトマイシン耐性を示したサ
ーモアナエロバクターから分子量約３．８メガダルトン
のプラスミドを単離する事に成功した。
このプラスミドは、前記の制限酵素開裂地図に示される
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
２９と略称する）。
如く、分子量が小さくしかも数種の制限酵素による切断
点を特異的に有している（以下、本プラスミドをｐＳＨ
２９と略称する）。
なお、図に示されている制限酵素の略称は次のとおりで
ある。
ある。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、
ＨｐａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由
来の酵素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の
酵素をそれぞれ示している。
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素、ＨｐａＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、
ＨｐａＩＩはハエモフィルス・パラインフルエンザエ由
来の酵素、ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の
酵素をそれぞれ示している。
プラスミドＤＮＡがベクターたり得る為には、そのプラ
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ２９を利用すれば、極めて便利で
あるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ２９
は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるからで
あり、第２には、小さい分子量を存するという点から、
本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製
に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利点
を有しているからである。
スミドが宿主内での自律的増殖能、及び選択マーカー（
そのプラスミドが宿主内に存在していることを示すマー
カー）を有していることが必須である。しかし、嫌気性
好熱菌の様に、その生育環境が栄養源に乏しくしかも抗
生物質が存在しない温泉等である菌について考えた場合
、薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドを得る事は容易
ではない。従って、性質が不明のいわゆるクリプティッ
ク・プラスミドに宿主染色体由来のマーカーを賦与する
という方式でベクター開発を行わなければならないであ
ろう。その際にｐＳＨ２９を利用すれば、極めて便利で
あるものと考えられる。何故ならば、第１にｐＳＨ２９
は嫌気性好熱菌で複製が可能なプラスミドであるからで
あり、第２には、小さい分子量を存するという点から、
本プラスミドの必須領域、例えば複製開始点領域、複製
に関与する遺伝子等の解析が、容易に行えるという利点
を有しているからである。
更にｐＳＨ２９は図からも明らかなように、ＥｃｏＲＩ
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ２９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
、ＨｐａＩＩなどの制限酵素による開裂部位を特定のし
かも限られた位置に有している。このことはｐＳＨ２９
をベクターとして利用する際に、挿入すべき異種遺伝子
の導入部位を有意に保持できるという点で有利である。
本プラスミドをベクターとして用いることにより、バイ
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性好
熱菌の育種が可能となろう。
オマス変換効率が高く、有用化成品を生産する嫌気性好
熱菌の育種が可能となろう。
ｐＳＨ２９の入手は、本発明者らが温泉水中から新たに
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
２９をＹＰＧ培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって溶菌させる事によって達せられる。
分離した嫌気性好熱菌、サーモアナエロバクターＮｏ．
２９をＹＰＧ培地（ディフコ・イーストエキストラクト
０．２％、ポリペプトン（大五栄養）０．４％、ＮａＣ
ｌ０．２％、グルコース１％、Ｎａ２ＣＯ３０．３％、
Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ７．５）により対数増殖
後期迄増殖させて得た菌体を、リゾチーム、ＳＤＳ処理
によって溶菌させる事によって達せられる。
また、サーモアナエロバクターＮｏ．２９の菌学的性質
を表に示すがｐＳＨ２９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
を表に示すがｐＳＨ２９を保有する点では従来には認め
られない新規な微生物である。
本菌体はストレプトマイシン耐性株として温泉水中より
分離されたものである。
分離されたものである。
表
（分類学的性質）
生育至適温度；６９℃
生育温度範囲；５０〜７８℃
形態；周鞭毛を有する桿菌０．５〜０．７×２〜１５μ
ｍ胞子形成性；なし グラム染色；不定 ＧＣ含有；３４％ 主要生産物；酢酸、乳酸 糖の利用性；グルコース、ラクトース、マルトースキシ
ロース、セロビオース、デンプン なお、本菌株は微工研菌寄第７４９４号として寄託され
ている。
ｍ胞子形成性；なし グラム染色；不定 ＧＣ含有；３４％ 主要生産物；酢酸、乳酸 糖の利用性；グルコース、ラクトース、マルトースキシ
ロース、セロビオース、デンプン なお、本菌株は微工研菌寄第７４９４号として寄託され
ている。
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述する。
実施例１（菌株のスクリーニング）
静岡県熱川温泉の温泉水約１ｍｌをＹＰＧ培地（ディフ
コ・イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペ
プトン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、
Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ
７．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気性条件下、７０
℃で約１８時間培養後、ストレプトマイシン１０μｇ／
ｍｌを含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの
一つからサーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌
寄第７４９４号）が得られた。
コ・イーストエキストラクト０．２％、大五栄養ポリペ
プトン０．４％、グルコース１％、ＮａＣｌ０．２％、
Ｎａ２ＣＯ３０．３％、Ｌ−システイン０．２％、ｐＨ
７．５）１０ｍｌに加え、炭酸ガス嫌気性条件下、７０
℃で約１８時間培養後、ストレプトマイシン１０μｇ／
ｍｌを含むＹＰＧロールチューブで生育したコロニーの
一つからサーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌
寄第７４９４号）が得られた。
実施例２
プラスミドｐＳＨ２９のサーモアナエロバクターＮｏ．
２９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌寄第７４
９４号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ培地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ培地に接種し、７０
℃嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によってめ
、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２０ｍ
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後、菌体湿重量４ｇ当りア
ジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有Ｔ
ＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ
）を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃
２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０
％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌ
のアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）
を加え、０℃に２時間放置する。
２９からの分離 サーモアナエロバクターＮｏ．２９（微工研菌寄第７４
９４号）の生物学的に純粋な培養基から２０ｍｌのＹＰ
Ｇ培地に接種し炭酸ガス嫌気条件下７０℃で１２時間培
養する。この培養液を１ｌのＹＰＧ培地に接種し、７０
℃嫌気条件下１２時間培養する。菌体を遠心によってめ
、アジ化ナトリウム１０ｍＭを添加したＴＥＳ（２０ｍ
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄後、菌体湿重量４ｇ当りア
ジ化ナトリウム１０ｍＭを添加した２５％ショ糖含有Ｔ
ＥＳ１０ｍｌに懸濁する。リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ
）を３ｍｌ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２ｍｌを加え、０℃
２０分間放置する。この細胞混合液に３００μｌの１０
％ジエチルピロカーボネイトエタノール溶液、１６ｍｌ
のアルカリＳＤＳ溶液（１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯ
Ｈ）、１２ｍｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．８）
を加え、０℃に２時間放置する。
これを７０００ｒｐｍ、１時間の遠心をおこない上清を
得る。上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え、２
時間−２０℃に静置し、７０００ｒｐｍ、１０分の遠心
で沈澱を得る。この沈澱を５０ｍｌの９５％エタノール
で洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、Ｃｓ
Ｃｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．５８
に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４０
時間、平均密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮＡ
のバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウムブ
ロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透析す
る事によってプラスミド溶液が得られる。
得る。上清に１００ｍｌの９５％エタノールを加え、２
時間−２０℃に静置し、７０００ｒｐｍ、１０分の遠心
で沈澱を得る。この沈澱を５０ｍｌの９５％エタノール
で洗浄し減圧乾燥後、１４ｍｌのＴＥＳに溶解し、Ｃｓ
Ｃｌ及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．５８
に調整する。この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４０
時間、平均密度勾配遠心する。生じたプラスミドＤＮＡ
のバンドを集め、イソアミルアルコールでエチジウムブ
ロマイドを除去した後、ＴＥＮ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣｌ）に透析す
る事によってプラスミド溶液が得られる。
ｐＳＨ２９の特性決定の手順
ｐＳＨ２９の分子量は、その超らせん構造（ｓｕｐｅｒ
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
ｃｏｉｌｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のＤＮＡ及び制限
酵素によって切断された断片のアガロースゲル電気泳動
及びポリアクリルアミド・ゲル電気泳動より得られた。
この際の分子量マーカーはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（２．６
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｃＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
７ｍｄ）、ＣｏｌＥＩＤＮＡ（４．２ｍｄ）及びラムダ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ分解断片（１４．６、５．８４
、４．０５、２．６７、１．３０、１．１７、０．３４
ｍｄ）、ラムダＤＮＡのＥｃｏＲＩ分解断片（１３．７
、４．７４、３．７３、３．４８、３．０２、２．１３
ｍｄ）、φ×１７４ＤＮＡのＨａｃＩＩＩ分解断片（０
．８３６、０．６６６、０．５３９、０．３７３、０．
１９２、０．１７４、０．１６７、０．１４５、０．１
２０、０．０７３、０．０４４ｍｄ）を用いた。制限酵
素による切断は、プラスミドＤＮＡ溶液からエタノール
沈澱によってＤＮＡを沈澱させ、適当な緩衝液に溶解し
て行なった。制限酵素は宝酒造及び、ベーリンガー・マ
ンハイム社よりの市販品を用いた。アガロースゲル電気
泳動はシーケム社のアガロースを０．５％又は０．７％
の濃度で用い、水平ゲル電気泳動槽によってゲル長さ１
ｃｍ当り１．５Ｖの定電圧で１５〜１７時間行なった。
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動は、生化学工業社製
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
のポリアクリルアミド・ビスアクリルアミドを用い、５
％濃度３０：１の架橋度のゲルによって垂直型スラブゲ
ル電気泳動槽により、ゲル長さ１ｃｍあたり１０Ｖの定
電圧によって２〜３時間行った。
従来、嫌気性好熱菌においてプラスミドが検出された例
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．２９の存するｐＳＨ２９は全く新規なプラスミ
ドである。
は知られておらず、嫌気性好熱菌サーモアナエロバクタ
ーＮｏ．２９の存するｐＳＨ２９は全く新規なプラスミ
ドである。
図−１はｐＳＨ２９の制限酵素開裂地図を示し、図中の
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはバ
チルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、ＨｐａＩＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、
ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素をそれ
ぞれ示している。
ＥｃｏＲＩはエシァリシア・コリ由来の酵素、ＣｌａＩ
はカリオファノン・ラツム由来の酵素、ＢｓｔＮＩはバ
チルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、ＨｐａＩＩ
はハエモフィルス・パラインフルエンザエ由来の酵素、
ＰｖｕＩＩはプロテウス・ブルガリス由来の酵素をそれ
ぞれ示している。
Claims (1)
- 分子量が約３．８メガダルトンであり、図に示される制
限酵素開裂地図で特徴づけられる嫌気性好熱菌に由来す
る新規プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043364A JPS60186286A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱菌に由来する新規プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043364A JPS60186286A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱菌に由来する新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60186286A true JPS60186286A (ja) | 1985-09-21 |
| JPS6221515B2 JPS6221515B2 (ja) | 1987-05-13 |
Family
ID=12661795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59043364A Granted JPS60186286A (ja) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | 嫌気性好熱菌に由来する新規プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60186286A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07117091A (ja) * | 1993-10-26 | 1995-05-09 | Shuji Ishihara | ゴム用射出機における素材の圧入加熱装置 |
-
1984
- 1984-03-07 JP JP59043364A patent/JPS60186286A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07117091A (ja) * | 1993-10-26 | 1995-05-09 | Shuji Ishihara | ゴム用射出機における素材の圧入加熱装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6221515B2 (ja) | 1987-05-13 |
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