JP2603011B2 - プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２、組換え体プラスミド、プラスミドベクターおよび新規細菌 - Google Patents
プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２、組換え体プラスミド、プラスミドベクターおよび新規細菌Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、適合性である、コリネ
バクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からの新規プラスミ
ドおよびそれから誘導されるプラスミドベクター（シャ
トルベクター）に関する。
バクテリウム グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からの新規プラスミ
ドおよびそれから誘導されるプラスミドベクター（シャ
トルベクター）に関する。
【０００２】
【従来の技術】プラスミドベクターは、遺伝子工学的菌
株改良の重要な前提である。コリネバクテリウムないし
はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）のプラスミドベクターの構造は、一般にこれら細菌
群中に見出すことのできるクリプテイックプラスミドに
よる。
株改良の重要な前提である。コリネバクテリウムないし
はブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）のプラスミドベクターの構造は、一般にこれら細菌
群中に見出すことのできるクリプテイックプラスミドに
よる。
【０００３】コリネバクテリウムおよびブレビバクテリ
ウムのプラスミドベクターは、相応する遺伝子生産物な
いしは酵素を高度に表現し、これによってアミノ酸分離
を改善する、アミノ酸生合成の遺伝子をクローニングす
るために利用することができる。例として、コリネバク
テリウム グルタミクムのホスホエノールピルベート・
カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングおよび過度表現
による、コリネバクテリウム グルタミクムによるリシ
ンの分離が挙げられる（ヨーロッパ特許出願番号第８９
１１４ ６３２．６号）。
ウムのプラスミドベクターは、相応する遺伝子生産物な
いしは酵素を高度に表現し、これによってアミノ酸分離
を改善する、アミノ酸生合成の遺伝子をクローニングす
るために利用することができる。例として、コリネバク
テリウム グルタミクムのホスホエノールピルベート・
カルボキシラーゼ遺伝子のクローニングおよび過度表現
による、コリネバクテリウム グルタミクムによるリシ
ンの分離が挙げられる（ヨーロッパ特許出願番号第８９
１１４ ６３２．６号）。
【０００４】プラスミドは、コリネ型のアミノ酸分離細
菌の群中では、文献の閲覧の際に反対の印象が生じうる
としても、極めて希にしか見出せない。即ち、正確に展
望する場合、種々の名前で記載されたプラスミドは、多
数の同じ性質を有し、同一とみなすことができることが
明らかになる。
菌の群中では、文献の閲覧の際に反対の印象が生じうる
としても、極めて希にしか見出せない。即ち、正確に展
望する場合、種々の名前で記載されたプラスミドは、多
数の同じ性質を有し、同一とみなすことができることが
明らかになる。
【０００５】例として、Ｃ．グルタミクムＡＪ１１５６
０からのプラスミドｐＡＭ２８６（ヨーロッパ特許
（Ａ）第７７５４８号）；Ｂ．ラクトフェルメンツム
（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９
からのｐＡＭ３３０（ヨーロッパ特許（Ａ）第７７５４
８号）、Ｂ．ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１７９８
からのｐＢＬ１（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、Ｒ．等．，
“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”１３０，第２２
３７頁〜第２２４６頁（１９８４年））およびＢ．ラク
トフェルメンツムＡＴＣＣ２１０８６からのｐＸ１８
（Ｙｅｈ，Ｐ．等．，“Ｇｅｎｅ”第４７巻、第３０１
頁〜第３０８頁（１９８６年））が挙げられる。同じこ
とは、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのプラ
スミドｐＨＭ１５１９（ヨーロッパ特許（Ａ）第７８５
３７号）、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からの
ｐＲＮ３．１（ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０
２８７６号）およびＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１９２２
３からのｐＳＲ１（吉原、Ｍ等，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”，
第１６２巻、第５９１頁〜第５９７頁（１９８５年））
にもあてはまる。ここでも、それぞれのプラスミドに対
し公表されたデータは専門家に、同じプラスミド種でな
ければならないことを示す。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ，
Ｊ．Ｆ．等．，“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第５
巻，第１３７頁〜第１４６頁（１９８７年））は、この
想定を確認している。
０からのプラスミドｐＡＭ２８６（ヨーロッパ特許
（Ａ）第７７５４８号）；Ｂ．ラクトフェルメンツム
（ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９
からのｐＡＭ３３０（ヨーロッパ特許（Ａ）第７７５４
８号）、Ｂ．ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ２１７９８
からのｐＢＬ１（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、Ｒ．等．，
“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”１３０，第２２
３７頁〜第２２４６頁（１９８４年））およびＢ．ラク
トフェルメンツムＡＴＣＣ２１０８６からのｐＸ１８
（Ｙｅｈ，Ｐ．等．，“Ｇｅｎｅ”第４７巻、第３０１
頁〜第３０８頁（１９８６年））が挙げられる。同じこ
とは、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８からのプラ
スミドｐＨＭ１５１９（ヨーロッパ特許（Ａ）第７８５
３７号）、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ３１８０８からの
ｐＲＮ３．１（ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０
２８７６号）およびＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１９２２
３からのｐＳＲ１（吉原、Ｍ等，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”，
第１６２巻、第５９１頁〜第５９７頁（１９８５年））
にもあてはまる。ここでも、それぞれのプラスミドに対
し公表されたデータは専門家に、同じプラスミド種でな
ければならないことを示す。マーチン（Ｍａｒｔｉｎ，
Ｊ．Ｆ．等．，“Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”第５
巻，第１３７頁〜第１４６頁（１９８７年））は、この
想定を確認している。
【０００６】しかし、このテーマに対する多くの刊行物
および特許出願は、コリネ型細菌に対するクローニング
系の開発のために適当であるプラスミドの多様性が重要
であることを示す。
および特許出願は、コリネ型細菌に対するクローニング
系の開発のために適当であるプラスミドの多様性が重要
であることを示す。
【０００７】たとえばアミノ酸分離菌株の開発のために
とくに重要なのは、１つの細胞内に並存しうるプラスミ
ドである。
とくに重要なのは、１つの細胞内に並存しうるプラスミ
ドである。
【０００８】このような適合性プラスミドは、生合成遺
伝子の組合せを同時に、所望の酵素活性を高め、たとえ
ばＬ−トレオニンまたはＬ−リシンのような所望生産物
の生成を改善する微生物中へ組入れるのを許容する。こ
のために殊に有利な前提はたとえば、それぞれの遺伝子
の釣合のとれた過表現を達成し、宿主の不必要な負荷を
さけるために、一方で高コピー数を有し、他方で低コピ
ー数を有する適合性プラスミドにおいて生じる。
伝子の組合せを同時に、所望の酵素活性を高め、たとえ
ばＬ−トレオニンまたはＬ−リシンのような所望生産物
の生成を改善する微生物中へ組入れるのを許容する。こ
のために殊に有利な前提はたとえば、それぞれの遺伝子
の釣合のとれた過表現を達成し、宿主の不必要な負荷を
さけるために、一方で高コピー数を有し、他方で低コピ
ー数を有する適合性プラスミドにおいて生じる。
【０００９】もちろん、同時に使用されるプラスミドの
十分な安定性も目指さねばならない。文献から公知であ
るように、プラスミドベクターの適合性研究（Ｍａｒｔ
ｉｎ，Ｊ．Ｇ．等．，上記引用文中、第１３９頁）は存
在せず、プラスミドベクターの安定性の研究も同じく殆
んど存在しない。
十分な安定性も目指さねばならない。文献から公知であ
るように、プラスミドベクターの適合性研究（Ｍａｒｔ
ｉｎ，Ｊ．Ｇ．等．，上記引用文中、第１３９頁）は存
在せず、プラスミドベクターの安定性の研究も同じく殆
んど存在しない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、殊に
コリネ型アミノ酸分離細菌の遺伝子工学的菌株改善のた
めの組織的ないしは方法的前提を技術水準を越えて改善
するために、適合性でありかつ十分な安定性を有するプ
ラスミドないしはプラスミドぺクターを提供することで
ある。
コリネ型アミノ酸分離細菌の遺伝子工学的菌株改善のた
めの組織的ないしは方法的前提を技術水準を越えて改善
するために、適合性でありかつ十分な安定性を有するプ
ラスミドないしはプラスミドぺクターを提供することで
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、ＤＳＭ
番号５８１６で寄託された、コリネバクテリウム グル
タミクムＬＰ−６から単離され、約４．９Ｋｂの長さお
よび次の制限切断位置を特徴とするプラスミドｐＧＡ１
である：第 １ 表 制限酵素 切断位置の数 ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ａｐａ Ｉ ０ − Ｂａｍ Ｈ Ｉ ２ ３．３ １．６ Ｂｃｌ Ｉ ０ − Ｂｇｌ Ｉ ０ − Ｂｇｌ ＩＩ ０ − Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ １ ４．９ Ｃｌａ Ｉ １ ４．９ Ｄｒａ Ｉ ０ − Ｅｃｏ Ｒ Ｉ １ ４．９ Ｅｃｏ Ｒ Ｖ ０ − Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ４ ２．４ １．１ １．０５ ０．３ Ｋｐｎ Ｉ ０ − Ｍｌｕ Ｉ ３ ２．４５ ２．２５ ０．２ Ｐｖｕ ＩＩ ２ ３．２５ １．６５ Ｓａｌ Ｉ ０ − Ｓｐｈ Ｉ １ ４．９ Ｓｓｔ Ｉ ０ − Ｘｂａ Ｉ ２ ２．５ ２．４ Ｘｈｏ Ｉ ０ − コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６は、カナダ
国ＧＯＫ７Ｐ４のケベック・ラバル大学（Ｑｕｅｂｅｃ
Ｌａｖａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ケベック１０
のフェリックス・ド・ヘレルの細菌ウイルス寄託センタ
ー（Ｆｅｌｉｘｄ´Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉ
ｒｕｅｓ）に番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．グ
ルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国のブラウ
ンシュワイグ在ドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ）において、ブダペスト条約によりＤＳＭ５８
１６として寄託された。
番号５８１６で寄託された、コリネバクテリウム グル
タミクムＬＰ−６から単離され、約４．９Ｋｂの長さお
よび次の制限切断位置を特徴とするプラスミドｐＧＡ１
である：第 １ 表 制限酵素 切断位置の数 ＤＮＡフラグメント（Ｋｂ） Ａｐａ Ｉ ０ − Ｂａｍ Ｈ Ｉ ２ ３．３ １．６ Ｂｃｌ Ｉ ０ − Ｂｇｌ Ｉ ０ − Ｂｇｌ ＩＩ ０ − Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ １ ４．９ Ｃｌａ Ｉ １ ４．９ Ｄｒａ Ｉ ０ − Ｅｃｏ Ｒ Ｉ １ ４．９ Ｅｃｏ Ｒ Ｖ ０ − Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ４ ２．４ １．１ １．０５ ０．３ Ｋｐｎ Ｉ ０ − Ｍｌｕ Ｉ ３ ２．４５ ２．２５ ０．２ Ｐｖｕ ＩＩ ２ ３．２５ １．６５ Ｓａｌ Ｉ ０ − Ｓｐｈ Ｉ １ ４．９ Ｓｓｔ Ｉ ０ − Ｘｂａ Ｉ ２ ２．５ ２．４ Ｘｈｏ Ｉ ０ − コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６は、カナダ
国ＧＯＫ７Ｐ４のケベック・ラバル大学（Ｑｕｅｂｅｃ
Ｌａｖａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ケベック１０
のフェリックス・ド・ヘレルの細菌ウイルス寄託センタ
ー（Ｆｅｌｉｘｄ´Ｈｅｒｅｌｌｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃ
ｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉ
ｒｕｅｓ）に番号ＨＥＲ１２２９で指名された。Ｃ．グ
ルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和国のブラウ
ンシュワイグ在ドイツ微生物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｎ）において、ブダペスト条約によりＤＳＭ５８
１６として寄託された。
【００１２】もう１つの対象は、ＤＳＭ番号５８１６で
寄託された、コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
（ＤＭ４１０−１）から単離され、約１９．５Ｋｂの長
さおよび次の制限切断位置を特徴とする、ｐＧＡ１と適
合性のプラスミドｐＧＡ２である： プラスミドＤＮＡは、寄託された菌株から、専門家に公
知の方法に従って単離することができる。
寄託された、コリネバクテリウムグルタミクムＬＰ−６
（ＤＭ４１０−１）から単離され、約１９．５Ｋｂの長
さおよび次の制限切断位置を特徴とする、ｐＧＡ１と適
合性のプラスミドｐＧＡ２である： プラスミドＤＮＡは、寄託された菌株から、専門家に公
知の方法に従って単離することができる。
【００１３】プラスミドｐＧＡ１は高いコピー数（細胞
あたり約５０）を有するが、ｐＧＡ２には低いコピー数
（約５）が測定される。
あたり約５０）を有するが、ｐＧＡ２には低いコピー数
（約５）が測定される。
【００１４】このプラスミドの宿主としては、コリネ型
細菌、殊にアミノ酸生産菌が使用される。
細菌、殊にアミノ酸生産菌が使用される。
【００１５】コリネ型細菌の例は次のものである： ブレビバクテリウム フラブム(Brevibacterium flavu
m)、殊にＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Brevibac
teriumfermentum）、殊にＡＴＣＣ１３８６９ コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium call
unae）、殊にＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）、殊にＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）、殊にＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム テルモアミノゲネス（Corynebact
eriumthermoaminogenes）、 殊にＦｅｒｍ Ｐ−９
２４４ 本発明によるプラスミドはコリネ型細菌の細胞内で増殖
するので、該細菌は、プラスミド中へ挿入された異質遺
伝子の情報を宿主中で増幅することができる。
m)、殊にＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンツム（Brevibac
teriumfermentum）、殊にＡＴＣＣ１３８６９ コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium call
unae）、殊にＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium
glutamicum）、殊にＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム メラセコラ（Corynebacterium me
lassecola）、殊にＡＴＣＣ１７９６５ コリネバクテリウム テルモアミノゲネス（Corynebact
eriumthermoaminogenes）、 殊にＦｅｒｍ Ｐ−９
２４４ 本発明によるプラスミドはコリネ型細菌の細胞内で増殖
するので、該細菌は、プラスミド中へ挿入された異質遺
伝子の情報を宿主中で増幅することができる。
【００１６】組換えられたプラスミドＤＮＡの宿主細胞
中への組込みは、望ましくはコンポジットプラスミド
（プラスミドベクター）を介して行なわれ、その構成の
ためには、耐性遺伝子を有する、Ｅ．コリ中で増殖する
ベクター、たとえばＰＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＩＰ５５、Ｒ１
６、Ｒ１、ＲＰ４およびｐＩＥ５４５がとくに適当であ
る。
中への組込みは、望ましくはコンポジットプラスミド
（プラスミドベクター）を介して行なわれ、その構成の
ためには、耐性遺伝子を有する、Ｅ．コリ中で増殖する
ベクター、たとえばＰＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８
４、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２、ｐＩＰ５５、Ｒ１
６、Ｒ１、ＲＰ４およびｐＩＥ５４５がとくに適当であ
る。
【００１７】このような構成の原理は、ヨーロッパ特許
（Ａ）第９３０１１号およびヨーロッパ特許（Ａ）第８
２４８５号に記載されている。
（Ａ）第９３０１１号およびヨーロッパ特許（Ａ）第８
２４８５号に記載されている。
【００１８】とくに適当なのは、図４による制限地図を
特徴とする、プラスミドｐＧＡ１とＥ．コリベクターｐ
ＨＳＫｍ１からなるシャトルベクターｐＨＳ２−１であ
る。
特徴とする、プラスミドｐＧＡ１とＥ．コリベクターｐ
ＨＳＫｍ１からなるシャトルベクターｐＨＳ２−１であ
る。
【００１９】ベクターｐＨＳＫｍ１は、トランスポゾン
Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたＥ．
コリベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ，Ｃおよび協力者、，（“Ｇｅｎｅ”第３３巻，第１
０３頁〜第１１９頁（１９８５年））に記載されてい
る）の誘導体である。
Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたＥ．
コリベクターｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ，Ｃおよび協力者、，（“Ｇｅｎｅ”第３３巻，第１
０３頁〜第１１９頁（１９８５年））に記載されてい
る）の誘導体である。
【００２０】これおよび他の、ｐＧＡ１に基づくシャト
ルベクターは、コリネ型細菌、殊にコリネバクテリウム
グルタミクム中で安定であるだけでなく、他の起源の
プラスミド、たとえばコリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９およびブレ
ビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１３８
６９からのｐＡＭ３３０、殊にコリネバクテリウム カ
ルナエＤＳＭ２０１４７からのｐＣＣ１とも共存する。
ルベクターは、コリネ型細菌、殊にコリネバクテリウム
グルタミクム中で安定であるだけでなく、他の起源の
プラスミド、たとえばコリネバクテリウム グルタミク
ムＡＴＣＣ１３０５８からのｐＨＭ１５１９およびブレ
ビバクテリウム ラクトフェルメンツムＡＴＣＣ１３８
６９からのｐＡＭ３３０、殊にコリネバクテリウム カ
ルナエＤＳＭ２０１４７からのｐＣＣ１とも共存する。
【００２１】このことは、記載の事例は高コピー数を有
するプラスミドないしはベクターであるので驚異的であ
る。
するプラスミドないしはベクターであるので驚異的であ
る。
【００２２】証明はこの方法で行なわれた：プラスミド
ｐＡＭ３３０を有するブレビバクテリウム ラクトフェ
ルメンツムＡＴＣＣ１３８６９は、チールバッハ（Ｔｈ
ｉｅｒｂａｃｈ）等（“Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”）により記載されたよう
に、ｐＨＳ２−１−ＤＮＡで形質転換した。
ｐＡＭ３３０を有するブレビバクテリウム ラクトフェ
ルメンツムＡＴＣＣ１３８６９は、チールバッハ（Ｔｈ
ｉｅｒｂａｃｈ）等（“Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．”）により記載されたよう
に、ｐＨＳ２−１−ＤＮＡで形質転換した。
【００２３】形質転換の研究は、双方のプラスミドが共
存しうることを示した。
存しうることを示した。
【００２４】プラスミドｐＧＡ１の可動性誘導体は、シ
エ−ファ−（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）等，（“Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．”，第１７２巻，第１６６３頁〜第１６６６頁（１
９９０年））に記載されているような接合法を用いて、
プラスミドｐＨＭ１５１９を有するコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８中へ導入した。トラ
ンス接合個体の研究は、双方のプラスミドは共存しうる
ことを示した。
エ−ファ−（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）等，（“Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．”，第１７２巻，第１６６３頁〜第１６６６頁（１
９９０年））に記載されているような接合法を用いて、
プラスミドｐＨＭ１５１９を有するコリネバクテリウム
グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８中へ導入した。トラ
ンス接合個体の研究は、双方のプラスミドは共存しうる
ことを示した。
【００２５】プラスミドｐＧＡ２も、可動性シャトルベ
クターの構成のために適当である。ｐＧＡ２のＤＮＡ配
列と可動性Ｅ．コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂから
も、コリネバクテリウム グルタミクム中で増殖するシ
ャトルベクターｐＦＢＨ２が構成される。
クターの構成のために適当である。ｐＧＡ２のＤＮＡ配
列と可動性Ｅ．コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂから
も、コリネバクテリウム グルタミクム中で増殖するシ
ャトルベクターｐＦＢＨ２が構成される。
【００２６】
【実施例】１．コリネバクテリウム グルタミクムＬＰ
−６からのｐＧＡ１の単離および特性決定 コリネバクテリウム グルタミクム菌株ＬＰ−６は、カ
ナダ国ＧＩＫ７Ｐ４のケベックラバル大学の、ケベック
３ １０在“フェリックス・ド・ヘレル細菌ウイルスの
寄託センター”により番号ＨＥＲ１２２９で指名され
た。Ｃ．グルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和
国ブラウンシュワイブにおけるドイツ微生物寄託局にお
いて、ブダペスト条約によりＤＳＭ５８１６として寄託
された。
−６からのｐＧＡ１の単離および特性決定 コリネバクテリウム グルタミクム菌株ＬＰ−６は、カ
ナダ国ＧＩＫ７Ｐ４のケベックラバル大学の、ケベック
３ １０在“フェリックス・ド・ヘレル細菌ウイルスの
寄託センター”により番号ＨＥＲ１２２９で指名され
た。Ｃ．グルタミクム菌株ＬＰ−６は、ドイツ連邦共和
国ブラウンシュワイブにおけるドイツ微生物寄託局にお
いて、ブダペスト条約によりＤＳＭ５８１６として寄託
された。
【００２７】プラスミドＤＮＡは、菌株ＬＰ−６から、
たとえばヨーロッパ特許出願第３１８６６３号およびバ
ーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、ＨＣ）およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ、Ｊ．）（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第７巻，第１５１３頁〜第１５２
３頁（１９７９年））により記載されているような専門
家に公知の方法によって単離された。こうして得られた
ＤＮＡ溶液は、アガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．等，１９８２年、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，コールドスプリングハーバー）によって特性決定
された。このＤＮＡ溶液は、ｐＧＡ１およびｐＧＡ２と
呼ばれる２種のプラスミドを含有していた。プラスミド
ｐＧＡ１は約４．９Ｋｂの長さを有し、プラスミドｐＧ
Ａ２は約１９．５Ｋｂの長さを有していた。制限酵素Ｓ
ａｌ Ｉでの処理により、プラスミドｐＧＡ２は切断さ
れるが、ｐＧＡ１は完全のままであった。
たとえばヨーロッパ特許出願第３１８６６３号およびバ
ーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、ＨＣ）およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ、Ｊ．）（“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第７巻，第１５１３頁〜第１５２
３頁（１９７９年））により記載されているような専門
家に公知の方法によって単離された。こうして得られた
ＤＮＡ溶液は、アガロースゲル電気泳動（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．等，１９８２年、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，コールドスプリングハーバー）によって特性決定
された。このＤＮＡ溶液は、ｐＧＡ１およびｐＧＡ２と
呼ばれる２種のプラスミドを含有していた。プラスミド
ｐＧＡ１は約４．９Ｋｂの長さを有し、プラスミドｐＧ
Ａ２は約１９．５Ｋｂの長さを有していた。制限酵素Ｓ
ａｌ Ｉでの処理により、プラスミドｐＧＡ２は切断さ
れるが、ｐＧＡ１は完全のままであった。
【００２８】これによって得られたＤＮＡ溶液に、Ｃｓ
Ｃｌ／エチジウムブロミド密度勾配遠心法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）を行な
い、こうしてプラスミドｐＧＡ１を単離した。
Ｃｌ／エチジウムブロミド密度勾配遠心法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）を行な
い、こうしてプラスミドｐＧＡ１を単離した。
【００２９】プラスミドｐＧＡ１は、制限酵素Ａｐａ
Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ
Ｅ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、Ｅｃｏ Ｒ Ｉ、Ｅｃ
ｏ ＲＶ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｐ
ｖｕ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｔ Ｉ、Ｘｂａ
ＩおよびＸｈｏ Ｉで処理し、ＤＮＡフラグメントの長
さをアガロースゲル電気泳動で測定した。かかる標準
は、たとえば制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断されたエ
シエリキア・コリ・ファージλ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｐｈａｇｅλ）のＤＮＡであり、このも
のは米国ゲイザーーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）にあるベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｆ
ｉｒｍａ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手することができる。第
１表は、試験された制限酵素のプラスミドｐＧＡ１にお
ける制限切断位置の数および得られたＤＮＡフラグメン
トの長さを記載する。２つおよび３つの制限酵素による
ｐＧＡ１の消化および得られたＤＮＡフラグメントの長
さ測定によって、図１に示したプラスミドの制限地図を
作製することができた。プラスミドｐＧＡ１は４．９Ｋ
ｂの長さを有する。
Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ
Ｅ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、Ｅｃｏ Ｒ Ｉ、Ｅｃ
ｏ ＲＶ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｐ
ｖｕ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｔ Ｉ、Ｘｂａ
ＩおよびＸｈｏ Ｉで処理し、ＤＮＡフラグメントの長
さをアガロースゲル電気泳動で測定した。かかる標準
は、たとえば制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断されたエ
シエリキア・コリ・ファージλ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ Ｐｈａｇｅλ）のＤＮＡであり、このも
のは米国ゲイザーーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ）にあるベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｆ
ｉｒｍａ Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手することができる。第
１表は、試験された制限酵素のプラスミドｐＧＡ１にお
ける制限切断位置の数および得られたＤＮＡフラグメン
トの長さを記載する。２つおよび３つの制限酵素による
ｐＧＡ１の消化および得られたＤＮＡフラグメントの長
さ測定によって、図１に示したプラスミドの制限地図を
作製することができた。プラスミドｐＧＡ１は４．９Ｋ
ｂの長さを有する。
【００３０】菌株ＬＰ−６におけるｐＧＡ１のコピー数
は、次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、定常の成長相のはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、ビ
ルンボア(Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．)およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ．Ｊ）（“Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ”第７巻，第１５１３頁〜第１５２３頁
(１９７９年)）により記載されたようにして、プラスミ
ドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の一定部分
量および上記したλ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡスタン
ダードの既知量とを、アガロースゲル電気泳動にかけ、
引き続きエチジウムブロミドでの染色を行なった。ｐＧ
Ａ１ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、λ−Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光と比較し、こ
うしてｐＧＡ１ＤＮＡの量を半定量的に測定した。こう
して、コピー数（細胞あたりのプラスミド分子の数）は
約５０と決定された。
は、次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準
Ｉブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メル
ク社から入手）中で、定常の成長相のはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、ビ
ルンボア(Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．)およびドーリイ
（Ｄｏｌｙ．Ｊ）（“Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ”第７巻，第１５１３頁〜第１５２３頁
(１９７９年)）により記載されたようにして、プラスミ
ドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の一定部分
量および上記したλ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡスタン
ダードの既知量とを、アガロースゲル電気泳動にかけ、
引き続きエチジウムブロミドでの染色を行なった。ｐＧ
Ａ１ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、λ−Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光と比較し、こ
うしてｐＧＡ１ＤＮＡの量を半定量的に測定した。こう
して、コピー数（細胞あたりのプラスミド分子の数）は
約５０と決定された。
【００３１】２．コリネバクテリウム グルタミクムＬ
Ｐ−６からのｐＧＡ２の単離および特性決定 プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２を有するプラスミド
ＤＮＡ含有溶液を、前記１項に記載したようにして製造
した。両種のプラスミドを、アガロース電気泳動によっ
て分離し、プラスミドｐＧＡ２を電気溶離（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｅｌｕｔｉｏｎ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等（１９８
２年），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。
Ｐ−６からのｐＧＡ２の単離および特性決定 プラスミドｐＧＡ１およびｐＧＡ２を有するプラスミド
ＤＮＡ含有溶液を、前記１項に記載したようにして製造
した。両種のプラスミドを、アガロース電気泳動によっ
て分離し、プラスミドｐＧＡ２を電気溶離（Ｅｌｅｃｔ
ｒｏｅｌｕｔｉｏｎ；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等（１９８
２年），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。
【００３２】プラスミドｐＧＡ２を、制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、Ｈｐａ
Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸ
ｈｏＩで処理し、ＤＮＡフラグメントの長さを、上記１
項に記載したようにして測定した。第２表は、試験した
制限酵素のプラスミドｐＧＡ２における制限切断位置の
数および得られるＤＮＡフラグメントの長さを記載す
る。２つおよび３つの制限酵素によるｐＧＡ２の消化お
よび得られるＤＮＡフラグメントの長さ測定によって、
第２表に記載したプラスミドの制限カードを作製するこ
とができた。プラスミドｐＧＡ２は１９．５Ｋｂの長さ
を有する。
Ｒ Ｉ、Ｂａｍ Ｈ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、Ｈｐａ
Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＸ
ｈｏＩで処理し、ＤＮＡフラグメントの長さを、上記１
項に記載したようにして測定した。第２表は、試験した
制限酵素のプラスミドｐＧＡ２における制限切断位置の
数および得られるＤＮＡフラグメントの長さを記載す
る。２つおよび３つの制限酵素によるｐＧＡ２の消化お
よび得られるＤＮＡフラグメントの長さ測定によって、
第２表に記載したプラスミドの制限カードを作製するこ
とができた。プラスミドｐＧＡ２は１９．５Ｋｂの長さ
を有する。
【００３３】菌株ＬＰ−６におけるｐＧＡ２のコピー数
は次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準Ｉ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット、メルク
社から入手）中で、定常の成長相がはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、プ
ラスミドＤＮＡを、ビルンボアおよびドーリイ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第７巻，第
１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記載
されたようにして単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の一
定部分量および上記したλ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ
スタンダードの既知量を、アガロースゲル電気泳動にか
け、引き続きエチジウムブロミド染色を行なった。ｐＧ
Ａ２ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、λ Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光と比較し、こ
うしてｐＧＡ２ＤＮＡの量を半定量的に測定した。こう
して、コピー数（細胞あたりのプラスミド分子の数）は
約５と決定された。
は次のようにして決定された：菌株ＬＰ−６を、標準Ｉ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット、メルク
社から入手）中で、定常の成長相がはじまるまで培養
し、細胞数を測定した。培養懸濁液１．５ｍｌから、プ
ラスミドＤＮＡを、ビルンボアおよびドーリイ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第７巻，第
１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記載
されたようにして単離した。プラスミドＤＮＡ溶液の一
定部分量および上記したλ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ
スタンダードの既知量を、アガロースゲル電気泳動にか
け、引き続きエチジウムブロミド染色を行なった。ｐＧ
Ａ２ ＤＮＡバンドのＵＶ照射の際の蛍光を、λ Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントの蛍光と比較し、こ
うしてｐＧＡ２ＤＮＡの量を半定量的に測定した。こう
して、コピー数（細胞あたりのプラスミド分子の数）は
約５と決定された。
【００３４】 第２表：制限エンドヌクレアーゼを用いるプラスミドｐ
ＧＡ２の特性決定 ３．ｐＧＡ１とエシエリキア・コリベクターｐＨＳＫｍ
１からなるシャトルベクターｐＨＳ２−１の構成 プラスミドｐＨＳＫｍ−１は、ヤニシュ・ペロン（Ｙａ
ｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等（Ｇｅｎｅ、第３３
巻，第１０３頁〜第１１９頁（１９８５年））により記
載された、スエーデン国ウプサラ在ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）社で得られる専門家に公知のＥ．コリ
ベクターｐＵＣ１８の誘導体であり、この中へトランス
ポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（岡、Ａ．
等、“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，第１４７巻，第２１
７頁〜第２２６頁（１９８１年））が挿入された。
ＧＡ２の特性決定 ３．ｐＧＡ１とエシエリキア・コリベクターｐＨＳＫｍ
１からなるシャトルベクターｐＨＳ２−１の構成 プラスミドｐＨＳＫｍ−１は、ヤニシュ・ペロン（Ｙａ
ｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等（Ｇｅｎｅ、第３３
巻，第１０３頁〜第１１９頁（１９８５年））により記
載された、スエーデン国ウプサラ在ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）社で得られる専門家に公知のＥ．コリ
ベクターｐＵＣ１８の誘導体であり、この中へトランス
ポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子（岡、Ａ．
等、“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，第１４７巻，第２１
７頁〜第２２６頁（１９８１年））が挿入された。
【００３５】プラスミドｐＨＳＫｍ１は、次に記載した
ようにして構成された。トランスポゾンＴｎ９０３のカ
ナマイシン耐性遺伝子（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｅ．；“Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第１６
巻，第３５６頁（１９８８年））を有するプラスミドｐ
ＡＣＹＣ１７７は、エシエリキア・コリＡＴＣＣ３７０
３１から、ヨーロッパ特許（Ａ）第３１８６６３号に記
載されたようにして単離された。プラスミドｐＡＣＹＣ
１７７を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩで切断し、カナマイシ
ン耐性遺伝子を有する１４３０ｂｐの長さのＤＮＡフラ
グメントは電気溶離（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等、（１９
８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。プラスミド
ｐＵＣ１８はＨａｅ ＩＩで部分的に切断し、長さ１４
３０ｂｐのＨａｅ ＩＩ ＤＮＡフラグメントと混合
し、得られるＤＮＡ混合物をＴ４−ＤＮＡリガーゼで処
理した。米国ゲイザースバーグ在のベセスダ・リサーチ
・ラボラトリイズ社から入手したエシエリキア・コリＤ
Ｈ５αのコンピテント細胞を、連結反応混合物で形質転
換した。カナマイシン耐性形質転換細胞を、カナマイシ
ン２０μｇ／ｍｌを補充したＬＢ寒天（トリプトン：１
０ｇ／ｌ；酵母エキス：５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：１０ｇ／
ｌ；寒天１２ｇ／ｌ）上で選択した。形質転換細胞から
ｐＨＳＫｍ１と呼ばれるプラスミドを単離した。制限分
析によって、カナマイシン耐性遺伝子の挿入された長さ
１４３０ｂｐのＤＮＡフラグメントの配列および挿入位
置を決定した。プラスミドｐＨＳＫｍ１の制限地図は図
３に示されている。
ようにして構成された。トランスポゾンＴｎ９０３のカ
ナマイシン耐性遺伝子（Ｒｏｓｅ，Ｒ．Ｅ．；“Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，第１６
巻，第３５６頁（１９８８年））を有するプラスミドｐ
ＡＣＹＣ１７７は、エシエリキア・コリＡＴＣＣ３７０
３１から、ヨーロッパ特許（Ａ）第３１８６６３号に記
載されたようにして単離された。プラスミドｐＡＣＹＣ
１７７を、制限酵素Ｈａｅ ＩＩで切断し、カナマイシ
ン耐性遺伝子を有する１４３０ｂｐの長さのＤＮＡフラ
グメントは電気溶離（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ等、（１９
８２年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）によって単離した。プラスミド
ｐＵＣ１８はＨａｅ ＩＩで部分的に切断し、長さ１４
３０ｂｐのＨａｅ ＩＩ ＤＮＡフラグメントと混合
し、得られるＤＮＡ混合物をＴ４−ＤＮＡリガーゼで処
理した。米国ゲイザースバーグ在のベセスダ・リサーチ
・ラボラトリイズ社から入手したエシエリキア・コリＤ
Ｈ５αのコンピテント細胞を、連結反応混合物で形質転
換した。カナマイシン耐性形質転換細胞を、カナマイシ
ン２０μｇ／ｍｌを補充したＬＢ寒天（トリプトン：１
０ｇ／ｌ；酵母エキス：５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：１０ｇ／
ｌ；寒天１２ｇ／ｌ）上で選択した。形質転換細胞から
ｐＨＳＫｍ１と呼ばれるプラスミドを単離した。制限分
析によって、カナマイシン耐性遺伝子の挿入された長さ
１４３０ｂｐのＤＮＡフラグメントの配列および挿入位
置を決定した。プラスミドｐＨＳＫｍ１の制限地図は図
３に示されている。
【００３６】上記１．項に記載されたプラスミドｐＧＡ
１を、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、線形に
し、一度切断した形のプラスミドを電気溶離によって単
離した。こうして得られたＤＮＡを、Ｂａｍ Ｈ Ｉで線
形にしたｐＨＳＫｍ１−ＤＮＡと混合し、得られるＤＮ
Ａ混合物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理した。エシエリ
キア・コリＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、形
質転換細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−
Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロル−β−インドリル−Ｄ
−ガラクトピラノシド、４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、
２０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上で選択した。形
質転換細胞の約５％は、記載した寒天上で無色であっ
た。ゾンデとしてのプラスミドｐＧＡ１によるコロニー
ハイブリッド法を、ｌａｃＺの相補性を示さなかった約
９００の形質転換細胞を用いて実施した。コロニーハイ
ブリッド法には、ｐＧＡ１をニックトランスレーション
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等、（１９８２年）、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）を用いてビオチン化ヌクレオシド三リン酸（ビ
オチン−７−ｄＡＴＰ）で標識し、米国ゲイザースバー
グ在ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイス社のＢｌｕＧ
ＥＮＥ核酸検出システムを用いて、ストレプトアビジン
（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）により結合されたアル
カリ性ホスファターゼを検出した。ＤＮＡの標識付け
は、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）等（米国、“Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第８０巻，第６６３３
頁〜第６６３７頁（１９８１年））が記載したように実
施し、コロニーハイブリッド法はトレーバー（Ｔｒｅｖ
ｏｒ、Ｇ．Ｔ．）等（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３巻，第２５９頁以降（１９８５
年））により記載されたように実施した。試験した９０
０の形質転換細胞のうち、７０が正の反応を与えた。形
質転換細胞から、ｐＨＳ２−１と呼ばれるプラスミドを
単離し、制限酵素を用いて地図を作製した。プラスミド
ｐＨＳ２−１の制限地図は図４に示されている。
１を、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化し、線形に
し、一度切断した形のプラスミドを電気溶離によって単
離した。こうして得られたＤＮＡを、Ｂａｍ Ｈ Ｉで線
形にしたｐＨＳＫｍ１−ＤＮＡと混合し、得られるＤＮ
Ａ混合物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理した。エシエリ
キア・コリＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、形
質転換細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−
Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロル−β−インドリル−Ｄ
−ガラクトピラノシド、４０μｇ／ｍｌ）およびＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、
２０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上で選択した。形
質転換細胞の約５％は、記載した寒天上で無色であっ
た。ゾンデとしてのプラスミドｐＧＡ１によるコロニー
ハイブリッド法を、ｌａｃＺの相補性を示さなかった約
９００の形質転換細胞を用いて実施した。コロニーハイ
ブリッド法には、ｐＧＡ１をニックトランスレーション
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等、（１９８２年）、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ）を用いてビオチン化ヌクレオシド三リン酸（ビ
オチン−７−ｄＡＴＰ）で標識し、米国ゲイザースバー
グ在ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイス社のＢｌｕＧ
ＥＮＥ核酸検出システムを用いて、ストレプトアビジン
（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）により結合されたアル
カリ性ホスファターゼを検出した。ＤＮＡの標識付け
は、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）等（米国、“Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍ
ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第８０巻，第６６３３
頁〜第６６３７頁（１９８１年））が記載したように実
施し、コロニーハイブリッド法はトレーバー（Ｔｒｅｖ
ｏｒ、Ｇ．Ｔ．）等（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３巻，第２５９頁以降（１９８５
年））により記載されたように実施した。試験した９０
０の形質転換細胞のうち、７０が正の反応を与えた。形
質転換細胞から、ｐＨＳ２−１と呼ばれるプラスミドを
単離し、制限酵素を用いて地図を作製した。プラスミド
ｐＨＳ２−１の制限地図は図４に示されている。
【００３７】４．コリネバクテリウム グルタミクムに
おけるシャトルベクターｐＨＳ２−１の複製 プラスミドｐＨＳ２−１を、エシエリキア・コリＤＨ５
α／ｐＨＳ２−１から単離し、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のスフェロプラストを用
いてチールバッハ（Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ）等（Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第
２９巻，第３５６頁〜第３６２頁（１９８８年））によ
り記載されたようにして形質転換した。形質転換細胞
を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含有していたＳ
Ｂ寒天上で選択した。１２の形質転換細胞からプラスミ
ドＤＮＡを単離し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＭｌｕ
Ｉで切断することにより特性表示した。プラスミドＤ
ＮＡは、エシエリキア・コリから単離したｐＨＳ２−１
と同じ大きさを有し、同じ制限地図を示した。
おけるシャトルベクターｐＨＳ２−１の複製 プラスミドｐＨＳ２−１を、エシエリキア・コリＤＨ５
α／ｐＨＳ２−１から単離し、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のスフェロプラストを用
いてチールバッハ（Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ）等（Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第
２９巻，第３５６頁〜第３６２頁（１９８８年））によ
り記載されたようにして形質転換した。形質転換細胞
を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含有していたＳ
Ｂ寒天上で選択した。１２の形質転換細胞からプラスミ
ドＤＮＡを単離し、制限酵素ＥｃｏＲ ＩおよびＭｌｕ
Ｉで切断することにより特性表示した。プラスミドＤ
ＮＡは、エシエリキア・コリから単離したｐＨＳ２−１
と同じ大きさを有し、同じ制限地図を示した。
【００３８】５．コリネバクテリウム グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２中でのシャトルベクターｐＨＳ２−１
の安定性 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
／ｐＨＳ２−１を、グルコース４ｇ／ｌおよび付加的に
カナマイシン１０μｇ／ｍｌを補足したスタンダードＩ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メルク
社から入手）中で、３０℃、１５０ｒ．ｐ．ｍ．で、定
常の成長相に到達するまで培養した。カナマイシンを有
する上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとカナマイシ
ンなしの上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとに、そ
れぞれ１：１００００の割合で予試培養液を接種し、上
記したように、定常の成長相に到達するまで培養した。
細菌培養液の光学密度は、波長６６０ｎｍにおいて７〜
８であった。
ＴＣＣ１３０３２中でのシャトルベクターｐＨＳ２−１
の安定性 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
／ｐＨＳ２−１を、グルコース４ｇ／ｌおよび付加的に
カナマイシン１０μｇ／ｍｌを補足したスタンダードＩ
ブイヨン（ドイツ連邦共和国、ダルムスタット在メルク
社から入手）中で、３０℃、１５０ｒ．ｐ．ｍ．で、定
常の成長相に到達するまで培養した。カナマイシンを有
する上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとカナマイシ
ンなしの上記の培養基からなる培養液５０ｍｌとに、そ
れぞれ１：１００００の割合で予試培養液を接種し、上
記したように、定常の成長相に到達するまで培養した。
細菌培養液の光学密度は、波長６６０ｎｍにおいて７〜
８であった。
【００３９】引き続き、カナマイシン含有細菌培養液
を、新しいカナマイシン含有ブイヨン上へ移種し、カナ
マイシンの不在で成長した細菌培養液を同じ割合でカナ
マイシン不含の新しいブイヨンを移種した。このような
移種を合計１６回実施して、菌株をカナマイシンの存在
ないしは不含で約２１０世代培養した。その後、試料を
スタンダードＩ寒天（ドイツ連邦共和国、ダルムスタッ
ト在メルク社から入手）上で平板培養し、３０℃で恒温
に保った。こうして形成した個々のコロニーを、スタン
ダードＩ寒天およびカナマイシン１０μｇ／ｍｌで補足
したスタンダードＩ上へ移種した。カナマイシンの不在
での２１０世代の培養の場合には試験した１８１の単独
コロニーのうち１８１がカナマイシン耐性であり、カナ
マイシンの存在での培養の場合には試験した８４の単独
コロニーのうちの８４がカナマイシン耐性であった。そ
れぞれ１２の単独コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭＩｕ Ｉでの切断に
よって特性表示した。プラスミドＤＮＡはｐＨＳ２−１
の大きさを有し、ｐＨＳ２−１に特徴的な制限地図を示
した。
を、新しいカナマイシン含有ブイヨン上へ移種し、カナ
マイシンの不在で成長した細菌培養液を同じ割合でカナ
マイシン不含の新しいブイヨンを移種した。このような
移種を合計１６回実施して、菌株をカナマイシンの存在
ないしは不含で約２１０世代培養した。その後、試料を
スタンダードＩ寒天（ドイツ連邦共和国、ダルムスタッ
ト在メルク社から入手）上で平板培養し、３０℃で恒温
に保った。こうして形成した個々のコロニーを、スタン
ダードＩ寒天およびカナマイシン１０μｇ／ｍｌで補足
したスタンダードＩ上へ移種した。カナマイシンの不在
での２１０世代の培養の場合には試験した１８１の単独
コロニーのうち１８１がカナマイシン耐性であり、カナ
マイシンの存在での培養の場合には試験した８４の単独
コロニーのうちの８４がカナマイシン耐性であった。そ
れぞれ１２の単独コロニーからプラスミドＤＮＡを単離
し、制限酵素Ｅｃｏ Ｒ ＩおよびＭＩｕ Ｉでの切断に
よって特性表示した。プラスミドＤＮＡはｐＨＳ２−１
の大きさを有し、ｐＨＳ２−１に特徴的な制限地図を示
した。
【００４０】６．コリネバクテリウム カルナエ（Ｃ．
ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０１４７からのプラスミド
ｐＣＣ１とシャトルベクターｐＨＳ２−１との共存 コリネバクテリウム カルナエＤＳＭ２０１４７を、コ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２／
ｐＨＳ２−１から単離したｐＨＳ２−１プラスミドＤＮ
Ａで、チールバッハ等（ＡＰＰｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第３５６頁〜
第３６２頁（１９８８年）が記載したように形質転換し
た。形質転換細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）
を含有していたＳＢ寒天上で選択した。２０の形質転換
細胞を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したス
タンダード栄養寒天上で分離した。それぞれ１つの単独
コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単離した。タイ
プＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の試験した２０の単
独コロニーのうち１７中のプラスミドｐＣＣ１をアガロ
ースゲル電気泳動によって検出された；試験したすべて
のコロニー中にプラスミドｐＨＳ２−１が存在してい
た。
ｃａｌｌｕｎａｅ）ＤＳＭ２０１４７からのプラスミド
ｐＣＣ１とシャトルベクターｐＨＳ２−１との共存 コリネバクテリウム カルナエＤＳＭ２０１４７を、コ
リネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２／
ｐＨＳ２−１から単離したｐＨＳ２−１プラスミドＤＮ
Ａで、チールバッハ等（ＡＰＰｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，第２９巻，第３５６頁〜
第３６２頁（１９８８年）が記載したように形質転換し
た。形質転換細胞を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）
を含有していたＳＢ寒天上で選択した。２０の形質転換
細胞を、カナマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を補足したス
タンダード栄養寒天上で分離した。それぞれ１つの単独
コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単離した。タイ
プＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の試験した２０の単
独コロニーのうち１７中のプラスミドｐＣＣ１をアガロ
ースゲル電気泳動によって検出された；試験したすべて
のコロニー中にプラスミドｐＨＳ２−１が存在してい
た。
【００４１】同様にして、対照としてコリネバクテリウ
ム カルナエＤＳＭ２０１４７のスフェロプラストを製
造し、ＳＢ寒天上で再生した。再生した２０の単独コロ
ニーをスタンダードＩ寒天培養基上で分離した。それぞ
れ１つの単独コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単
離した。タイプＤＳＭ２０１４７の試験した２０の単独
コロニーのうちの１７に、プラスミドｐＣＣ１が検出さ
れた。タイプＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の形質転
換細胞を、カナマイシンの存在ないしは不在で、約５０
世代、下記５．項に記載したようにして培養した。引き
続き、双方の培養液をスタンダードＩ寒天上で平板培養
し、３０℃で恒温に保った。それぞれ８つの単独コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを単離した。試験した８つのコ
ロニーのうちそれぞれ８つにプラスミドｐＣＣ１および
ｐＨＳ２−１を検出することができた。同様にして、対
照菌株ＤＳＭ２０１４７の再生した単独コロニーを約５
０世代培養し、引き続き８つの単独コロニーからプラス
ミドＤＮＡを単離した。試験した８つの単独コロニーの
うちそれぞれ８つに、プラスミドｐＣＣ１が検出され
た。試験は、プラスミドｐＣＣ１とｐＨＳ２−１とが共
存しうることを示した。
ム カルナエＤＳＭ２０１４７のスフェロプラストを製
造し、ＳＢ寒天上で再生した。再生した２０の単独コロ
ニーをスタンダードＩ寒天培養基上で分離した。それぞ
れ１つの単独コロニーを取出し、プラスミドＤＮＡを単
離した。タイプＤＳＭ２０１４７の試験した２０の単独
コロニーのうちの１７に、プラスミドｐＣＣ１が検出さ
れた。タイプＤＳＭ２０１４７／ｐＨＳ２−１の形質転
換細胞を、カナマイシンの存在ないしは不在で、約５０
世代、下記５．項に記載したようにして培養した。引き
続き、双方の培養液をスタンダードＩ寒天上で平板培養
し、３０℃で恒温に保った。それぞれ８つの単独コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを単離した。試験した８つのコ
ロニーのうちそれぞれ８つにプラスミドｐＣＣ１および
ｐＨＳ２−１を検出することができた。同様にして、対
照菌株ＤＳＭ２０１４７の再生した単独コロニーを約５
０世代培養し、引き続き８つの単独コロニーからプラス
ミドＤＮＡを単離した。試験した８つの単独コロニーの
うちそれぞれ８つに、プラスミドｐＣＣ１が検出され
た。試験は、プラスミドｐＣＣ１とｐＨＳ２−１とが共
存しうることを示した。
【００４２】７．菌株ＬＰ−６からのコリネバクテリウ
ム グルタミクムによるＬ−リシンの分離 菌株ＬＰ−６を、硫酸アンモニウム１２ｇ／ｌ、糖密２
４０ｇ／ｌおよび大豆粉加水分解物６０ｍｌ／ｌからな
り、そのｐＨをアンモニア水で約７．２に調節した培地
中で培養した。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ
に、上記の培地を満たし、菌株ＬＰ−６を接種し、３０
℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．で７２時間インキュベートし
た。Ｌ−リシンの測定は、遠心分離の上澄み中でアミノ
酸分析器を用いて行なった。分離した、Ｌ−リシン・Ｈ
Ｃｌの濃度は０．９ｇ／ｌであった。
ム グルタミクムによるＬ−リシンの分離 菌株ＬＰ−６を、硫酸アンモニウム１２ｇ／ｌ、糖密２
４０ｇ／ｌおよび大豆粉加水分解物６０ｍｌ／ｌからな
り、そのｐＨをアンモニア水で約７．２に調節した培地
中で培養した。１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ
に、上記の培地を満たし、菌株ＬＰ−６を接種し、３０
℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．で７２時間インキュベートし
た。Ｌ−リシンの測定は、遠心分離の上澄み中でアミノ
酸分析器を用いて行なった。分離した、Ｌ−リシン・Ｈ
Ｃｌの濃度は０．９ｇ／ｌであった。
【００４３】８．ｐＧＡ２からのＤＮＡ配列と可動性エ
シエリキア・コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからなる
可動性シャトルベクターｐＦＢＨ２の構成 プラスミドｐＫ１８：：ｍｏｂは、専門家に公知のエシ
エリキア・コリクローンベクターｐＫ１８（プリドモア
（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，Ｒ．Ｄ．）；Ｇｅｎｅ第５６巻、
第３０９頁〜第３１２頁（１９８７年））からの誘導体
である。プラスミド１８：：ｍｏｂは、自己伝達性プラ
スミドＲＰ４（ダッタ（Ｄａｔｔａ，Ｎ．等；Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．第１０８巻，第１２４４頁〜第１２４９頁（１９
７１年））の移動にとって重要な領域を有し、次のよう
にして構成された：プラスミドＲＰ４の移動領域を有す
るプラスミドｐＳＵＰ１０２（シモン（Ｓｉｍｏｎ，
Ｒ．等）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，第１１８巻，第６４０頁〜第６５９頁（１９８６
年））を、エシエリキア・コリＳ１７−１（シモン等
・，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁
〜第７９４頁（１９８３年））から、専門家に慣用の方
法、たとえばホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．＆キグ
レイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．）（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，第１１４巻，第１９３頁〜第１９７頁（１
９８１年））により記載された方法に従って単離し、制
限酵素Ａｌｕ Ｉで部分的に切断した。プラスミドｐＫ
１８を、制限酵素Ｎａｅ Ｉで部分的に消化し、プラス
ミドｐＳＵＰ１０２のＡｌｕ Ｉ消化によって得られた
ＤＮＡフラグメントと一緒にし、得られるＤＮＡ混合物
をＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。コーエン（Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｓ）等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、
米国、第６９巻，第２１１０頁〜第２１１４頁（１９７
２年））の処方により製造したエシエリキア・コリＳ１
７−１のコンピテント細胞を、連結反応混合物で形質転
換し、細胞を、ピナセイ・ブロース（Ｐｅｎａｓｓａｙ
−Ｂｒｏｔｈ）（米国デトロイト在Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１７．５ｇ／ｌおよび寒天１５ｇ
／ｌからなり、カナマイシンが２５μｇ／ｌの最終濃度
で添加されていたＰＡ寒天上に塗布した。カナマイシン
耐性コロニーをＰＡ液体媒地で洗い流し、大量のＰＡ液
体焙地にとり、サイモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ）等（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４
頁（１９８３年））により記載された慣用法により、エ
シエリキア・コリＭＭ２９４（タルマジ（Ｔａｌｍａｄ
ｇｅ，Ｋ）およびギルバート（Ｇｉ１ｂｅｒｔ，Ｗ），
Ｇｅｎｅ第１２巻，第２３５頁〜第２４１頁（１９８０
年））との交差のために使用した。選択焙地（カナマイ
シン２５μｇ／ｍｌおよびナリジキシン酸５０μｇ／ｍ
ｌを有するＰＡ寒天）から成長したトランス接合体から
ｐＳＵＰ１０２ ＤＮＡの挿入を有するプラスミドＰＫ
１８の誘導体を単離することができた。ここでｐＫ１
８：ｍｏｂと記載されたベクターは長さ１．１Ｋｂのｐ
ＳＵＰ１０２挿入を有する。制限分析により、挿入され
た、移動領域を有するＤＮＡフラグメントの部位が確か
められた。プラスミドｐＫ１８：：ｍｏｂの制限地図は
図５に示されている。
シエリキア・コリベクターｐＫ１８：：ｍｏｂからなる
可動性シャトルベクターｐＦＢＨ２の構成 プラスミドｐＫ１８：：ｍｏｂは、専門家に公知のエシ
エリキア・コリクローンベクターｐＫ１８（プリドモア
（Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，Ｒ．Ｄ．）；Ｇｅｎｅ第５６巻、
第３０９頁〜第３１２頁（１９８７年））からの誘導体
である。プラスミド１８：：ｍｏｂは、自己伝達性プラ
スミドＲＰ４（ダッタ（Ｄａｔｔａ，Ｎ．等；Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．第１０８巻，第１２４４頁〜第１２４９頁（１９
７１年））の移動にとって重要な領域を有し、次のよう
にして構成された：プラスミドＲＰ４の移動領域を有す
るプラスミドｐＳＵＰ１０２（シモン（Ｓｉｍｏｎ，
Ｒ．等）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，第１１８巻，第６４０頁〜第６５９頁（１９８６
年））を、エシエリキア・コリＳ１７−１（シモン等
・，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁
〜第７９４頁（１９８３年））から、専門家に慣用の方
法、たとえばホルメス（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．＆キグ
レイ（Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｍ．）（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，第１１４巻，第１９３頁〜第１９７頁（１
９８１年））により記載された方法に従って単離し、制
限酵素Ａｌｕ Ｉで部分的に切断した。プラスミドｐＫ
１８を、制限酵素Ｎａｅ Ｉで部分的に消化し、プラス
ミドｐＳＵＰ１０２のＡｌｕ Ｉ消化によって得られた
ＤＮＡフラグメントと一緒にし、得られるＤＮＡ混合物
をＴ４ＤＮＡリガーゼで処理した。コーエン（Ｃｏｈｅ
ｎ，Ｓ）等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、
米国、第６９巻，第２１１０頁〜第２１１４頁（１９７
２年））の処方により製造したエシエリキア・コリＳ１
７−１のコンピテント細胞を、連結反応混合物で形質転
換し、細胞を、ピナセイ・ブロース（Ｐｅｎａｓｓａｙ
−Ｂｒｏｔｈ）（米国デトロイト在Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１７．５ｇ／ｌおよび寒天１５ｇ
／ｌからなり、カナマイシンが２５μｇ／ｌの最終濃度
で添加されていたＰＡ寒天上に塗布した。カナマイシン
耐性コロニーをＰＡ液体媒地で洗い流し、大量のＰＡ液
体焙地にとり、サイモン（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ）等（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１巻，第７８４頁〜第７９４
頁（１９８３年））により記載された慣用法により、エ
シエリキア・コリＭＭ２９４（タルマジ（Ｔａｌｍａｄ
ｇｅ，Ｋ）およびギルバート（Ｇｉ１ｂｅｒｔ，Ｗ），
Ｇｅｎｅ第１２巻，第２３５頁〜第２４１頁（１９８０
年））との交差のために使用した。選択焙地（カナマイ
シン２５μｇ／ｍｌおよびナリジキシン酸５０μｇ／ｍ
ｌを有するＰＡ寒天）から成長したトランス接合体から
ｐＳＵＰ１０２ ＤＮＡの挿入を有するプラスミドＰＫ
１８の誘導体を単離することができた。ここでｐＫ１
８：ｍｏｂと記載されたベクターは長さ１．１Ｋｂのｐ
ＳＵＰ１０２挿入を有する。制限分析により、挿入され
た、移動領域を有するＤＮＡフラグメントの部位が確か
められた。プラスミドｐＫ１８：：ｍｏｂの制限地図は
図５に示されている。
【００４４】上記２．項に記載したプラスミドｐＧＡ２
を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、得られるｐＧＡ
２ ＤＮＡフラグメントを、あらかじめＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで線状にしたプラスミドベクターｐＫ１８：：ｍｏｂ
と混合した。得られるＤＮＡ混合物をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで処理し、引き続きエシエリキア・コリＤＨ５αの
形質転換のために使用した。形質転換細胞を、カナマイ
シン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／ｍ
ｌ）およびＩＰＴＧ（２０μｇ／ｍｌ）が補足されてい
るＬＢ寒天上で選択した。すべての無色のコロニーを、
専門家に公知の、たとえばバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリイ（Ｄｏｌｙ，Ｊ）（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第７巻，
第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記
載されたようなプラスミド製剤を用いてプラスミド含有
量を調べ、プラスミド制限酵素を用いて特性表示した。
単離したプラスミドの１つは長さ５．７ＫｂのｐＧＡ２
挿入を有し、ｐＦＢＨ２と呼ばれた。ｐＦＢＨ２の制限
地図は図６に示されている。
を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、得られるｐＧＡ
２ ＤＮＡフラグメントを、あらかじめＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで線状にしたプラスミドベクターｐＫ１８：：ｍｏｂ
と混合した。得られるＤＮＡ混合物をＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで処理し、引き続きエシエリキア・コリＤＨ５αの
形質転換のために使用した。形質転換細胞を、カナマイ
シン（２０μｇ／ｍｌ）、Ｘ−Ｇａｌ（４０μｇ／ｍ
ｌ）およびＩＰＴＧ（２０μｇ／ｍｌ）が補足されてい
るＬＢ寒天上で選択した。すべての無色のコロニーを、
専門家に公知の、たとえばバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ，Ｈ．Ｃ．）およびドーリイ（Ｄｏｌｙ，Ｊ）（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第７巻，
第１５１３頁〜第１５２３頁（１９７９年））により記
載されたようなプラスミド製剤を用いてプラスミド含有
量を調べ、プラスミド制限酵素を用いて特性表示した。
単離したプラスミドの１つは長さ５．７ＫｂのｐＧＡ２
挿入を有し、ｐＦＢＨ２と呼ばれた。ｐＦＢＨ２の制限
地図は図６に示されている。
【００４５】９．コリネバクテリウムＲＭ３中でのシャ
トルベクターｐＦＢＨ２の複製 エシエリキア・コリＳ１７−１を、ｐＦＢＨ２−ＤＮＡ
（ＤＨ５α／ｐＦＢＨ２から単離）で形質転換し、得ら
れる形質転換細胞をカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を
有するＬＢ寒天上で選択した。タイプＳ１７−１／ｐＦ
ＢＨ２の形質転換細胞を、コリネバクテリウム グルタ
ミクムＲＭ３と接合するため、シエーファー等（ｊ．Ｂ
ａｃｔ．，第１７２巻、第１６６３頁〜第１６６６頁
（１９９０年）により記載されたように使用した。Ｃ．
グルタミクムＲＭ３のトランス接合体を、カナマイシン
（２０μｇ／ｍｌ）およびナリジキシン酸（５０μｇ／
ｍｌ）で補足したＬＢ寒天上で選択した。１２のトラン
ス接合体からプラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵
素を用いて切断することによって特性決定した。単離し
たプラスミドＤＮＡは、エシエリキア・コリから単離し
たｐＦＢＨ２と同じ制限地図を示した。
トルベクターｐＦＢＨ２の複製 エシエリキア・コリＳ１７−１を、ｐＦＢＨ２−ＤＮＡ
（ＤＨ５α／ｐＦＢＨ２から単離）で形質転換し、得ら
れる形質転換細胞をカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を
有するＬＢ寒天上で選択した。タイプＳ１７−１／ｐＦ
ＢＨ２の形質転換細胞を、コリネバクテリウム グルタ
ミクムＲＭ３と接合するため、シエーファー等（ｊ．Ｂ
ａｃｔ．，第１７２巻、第１６６３頁〜第１６６６頁
（１９９０年）により記載されたように使用した。Ｃ．
グルタミクムＲＭ３のトランス接合体を、カナマイシン
（２０μｇ／ｍｌ）およびナリジキシン酸（５０μｇ／
ｍｌ）で補足したＬＢ寒天上で選択した。１２のトラン
ス接合体からプラスミドＤＮＡを単離し、種々の制限酵
素を用いて切断することによって特性決定した。単離し
たプラスミドＤＮＡは、エシエリキア・コリから単離し
たｐＦＢＨ２と同じ制限地図を示した。
【図１】プラスミドｐＧＡ１の、線形図での制限地図
【図２】プラスミドｐＧＡ２の、線形図での制限地図
【図３】プラスミドｐＨＳＫｍ１の、円形図での制限地
図 マルチプルクローニング位置は位置４００〜４５２の間
に延びている。
図 マルチプルクローニング位置は位置４００〜４５２の間
に延びている。
【図４】プラスミドｐＨＳ２−１の、線形図での制限地
図 ｐＧＡ１およびｐＨＳＫｍ−１部１は別個に示されてお
り、ｐＨＳ２−１のｐＧＡ１部は少なくとも６個のＨａ
ｅ ＩＩの制限切断位置を有する：
図 ｐＧＡ１およびｐＨＳＫｍ−１部１は別個に示されてお
り、ｐＨＳ２−１のｐＧＡ１部は少なくとも６個のＨａ
ｅ ＩＩの制限切断位置を有する：
【図５】プラスミドｐＫ１８の制限地図 位置（２３７５，Ｎａｅ Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）および（１２
７５，Ｎａｅ Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）間のＤＮＡ範囲は３つの
制限切断部位（図示せず）を有する。
７５，Ｎａｅ Ｉ／ＡｌＵ Ｉ）間のＤＮＡ範囲は３つの
制限切断部位（図示せず）を有する。
【図６】プラスミドｐＦＢＨ２の、線形図での制限地図 分子のｐＧＡ２部分は灰色の陰影により表わされかつｐ
Ｋ１８：：ｍｏｂ部分はハッチングによって表わされて
いる。
Ｋ１８：：ｍｏｂ部分はハッチングによって表わされて
いる。
Ｂａ Ｂａｍ Ｈ Ｉ Ｂ Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ Ｃ Ｃｌａ Ｉ Ｅ Ｅｃｏ Ｒ Ｉ Ｈ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｍ Ｍｌｕ Ｉ Ｐｖ Ｐｖｕ ＩＩ Ｓ Ｓｐｈ Ｉ Ｘ Ｘｂａ Ｉ Ｈｐ Ｈｐａ Ｉ Ｋ Ｋｐｎ Ｉ Ｓｃ Ｓｃａ Ｉ ａｍｐ アンピシリン耐性遺伝子 Ｋａｎ カナマイシン耐性遺伝子 ｌａｃＺ´ ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ
遺伝子の５´末端部 ｏｒｉ 複製源 Ｓａ Ｓａｕ３Ａ ｌａｃＺ−α ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ
遺伝子の５´末端部 ｏｒｉＶ 複製源 ｏｒｉＴ 接合的プラスミド転移（移動領域） Ｂｇ Ｂｇ ＩＩＩ ＥＶ Ｅｃｏ Ｒ Ｖ Ｐｓｔ Ｐｓｔ Ｉ Ｓｍ Ｓｍａ Ｉ Ｓｓｔ Ｓｓｔ Ｉ Ｘ Ｘｂａ Ｉ
遺伝子の５´末端部 ｏｒｉ 複製源 Ｓａ Ｓａｕ３Ａ ｌａｃＺ−α ｌａｃＺの相補性を許容するｌａｃＺ
遺伝子の５´末端部 ｏｒｉＶ 複製源 ｏｒｉＴ 接合的プラスミド転移（移動領域） Ｂｇ Ｂｇ ＩＩＩ ＥＶ Ｅｃｏ Ｒ Ｖ Ｐｓｔ Ｐｓｔ Ｉ Ｓｍ Ｓｍａ Ｉ Ｓｓｔ Ｓｓｔ Ｉ Ｘ Ｘｂａ Ｉ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲオルク ティールバッハ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ グンストシュトラーセ 21 (72)発明者 ペトラ−ザビーネ カウツ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト 16 グラーフェンハイダーシュトラーセ 54 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト 15 アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 アンドレアス シェーファー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ビュンダーシュトラーセ 33
Claims (7)
- 【請求項１】 ＤＳＭ番号５８１６で寄託された、コリ
ネバクテリウム グルタミクムＬＰ−６から単離された
プラスミドであって、以下の構造： 約４．９Ｋｂの長さおよび次の制限切断位置： および下記の制限地図： 【表１】 を有するか、または約１９．５Ｋｂの長さおよび次の制
限切断位置： および下記の制限地図： 【表２】 を有することを特徴とする、プラスミドｐＧＡ１または
ｐＧＡ２。 - 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドｐＧＡ１また
はｐＧＡ２から、少なくとも１つの異質ＤＮＡフラグメ
ントを付加することによって構成された、コリネ型細菌
中で自律的複製することが可能な組換え体プラスミド。 - 【請求項３】 ａ）プラスミドｐＧＡ１またはｐＧＡ
２、ｂ）Ｅ．コリ中で複製する、耐性遺伝子を有するベ
クターから誘導されたＤＮＡフラグメントから構成され
た、請求項２記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 プラスミドｐＧＡ１およびＥ．コリベク
ターｐＨＳＫｍｌからなるプラスミドベクターｐＨＳ２
−１であって、下記の制限地図： 【表３】 を有することを特徴とする請求項３記載の組換え体プラ
スミド。 - 【請求項５】 ｐＧＡ２からのＤＮＡ配列および移動可
能なＥ．コリベクターｐＫ１８ｉｉｍｂからなるプラス
ミドベクターｐＦＢＨ２であって、下記の制限地図： 【表４】 および 【表５】 を有することを特徴とする請求項３記載の組換え体プラ
スミド。 - 【請求項６】 付加的に、コリネ型細菌中で表現可能な
遺伝子を含有する、請求項２から５までのいずれか１項
記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項７】 請求項２から６までのいずれか１項記載
の組換え体プラスミドを含有する、コリネ型細菌。
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