DE102008054918A1 - Verfahren zur enzymatischen Umsetzung von Alkanen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ketonen durch enzymatische Oxidation von Alkanen, bei dem man diese Alkane in Gegenwart einer Monooxygenase, einer Alkoholdehydrogenase und eines für beide Enzyme geeigneten Cofaktors in einem wässrigen Reaktionsmedium in Gegenwart von molekularem Sauerstoff umsetzt.

Description

  • Die Erfindung betrifft die Hydroxylierung von Alkanen sowie die Herstellung von Ketonen aus Alkanen durch enzymatische Reaktionen.
  • Die Herstellung von cyclischen Ketonen ist von großer Bedeutung für die chemische Industrie, wobei Cyclohexanon, Cyclooktanon, Cyclodekanon und Cyclododekanon besondere wirtschaftliche Aufmerksamkeit entgegengebracht wird. Für Cyclohexanon bestehen hierbei diverse synthetische Zugangswege ausgehend von verschiedenen Basischemikalien. Besonders attraktiv ist die selektive Direktumwandlung von Cyclohexan zu Cyclohexanon unter Einsatz von Sauerstoff. Eine solche Synthese konnte allerdings bis heute noch nicht realisiert werden: Stattdessen erfolgt zunächst im ersten Schritt eine wenig selektive Oxidation von Cyclohexan zu Cyclohexanol und Cyclohexanon, gefolgt von einer aufwändigen destillativen Trennung der beiden Verbindungen. Im zweiten Schritt kann dann eine „Restoxidation” des erhaltenen Cyclohexanols zu Cyclohexanon erfolgen, wobei hierfür typischerweise die aus Perspektive der Nachhaltigkeit und Atomökonomie problematische Salpetersäure zum Einsatz kommt. Der homologe Vertreter Cyclooktanon ist als Bausteine für Monomere ein wichtiges Produkt für die Polymerproduktion. Cyclododekanon (auch Cyclododecanon genannt) wiederum gilt als kommerziell attraktiver Building Block bei der Herstellung von Duftstoffen, UV-Absorber und den Monomeren Laurinlactam und Dodekandicarbonsäure für die Produktion von Nylon-12 oder Nylon-6.12.
  • Stand der Technik/Nachteile
  • Das derzeitige gängige Herstellungsverfahren zur Produktion von (insbesondere höher homologen) Cycloalkanonen wie Cyclooktanon (auch Cyclooktanon genannt) und Cyclododekanon besteht in der Luftoxidation des entsprechenden Cycloalkans in Anwesenheit von Borsäure zu Cycloalkylborat, gefolgt von einer anschließenden Hydrolyse des Borates zum Cycloalkanol und wiederum gefolgt von einer Dehydrierung des Cycloalkanols. Eine Beschreibung dieses technischen Verfahrens beispielsweise zur Synthese von Cyclododecanon findet sich unter anderem in T. Schiffer, G. Oenbrink, "Cyclododecanol, Cyclododecanon and Laurolactam" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Edition, 2000, Electronic Release, Wiley VCH und PCT Pat. Appl. WO/2005/030689 , Method for Producing Cyclododecanone. Diese Verfahrensweise weist gravierende Nachteile in der Prozessökonomie als auch der Nachhaltigkeit des Gesamtverfahrens auf. Diese Nachteile sind am Beispiel der Herstellung von Cyclododekanon verdeutlicht: Hierbei gewährleistet die Oxidation von Cyclododekan mit Sauerstoff in Gegenwart der Borsäure nur bei geringen Umsätzen eine akzeptable Selektivität, einhergehend mit der Notwendigkeit eines aufwändigen Trennverfahren des resultierenden Produktgemisches. Selbst unter Zusatz von Borsäure, die zur Vermeidung einer Überoxidation des entstandenen Cyclododecanols durch Bildung von Borsäureester zugesetzt werden muss, liegt der Umsatz an Cyclododecan nicht über 30%. Das nichtumgesetzte Cyclododecan muss aufwändig abgetrennt und anschließend dem Prozess wieder zurückgeführt werden. Nach der Oxidation müssen die Borsäureester in einem separiert durchgeführten Schritt hydrolysiert werden, wobei sich Cyclododecanol und Cyclododecanon im Verhältnis 10:1 bildet. Resultat ist auch eine hohe Abfallmenge an schwer zu entsorgenden Bor-haltigen Abfällen. Das erhaltene Gemisch an Cyclododecanol und Cyclododecanon (10:1) muss in ebenfalls aufwändiger Weise destillativ aufgetrennt werden. Das Cyclododecanol muss dann schließlich durch Dehydrierung in Cyclododekanon überführt werden, wobei infolge einer exothermen Reaktion wiederum nur partielle Umsätze erhalten werden. Nicht umgesetztes Cyclododecanol muss erneut destillativ abgetrennt und in das Verfahren zurückgeführt werden. Entsprechend ist der bisherige Stand der Technik sowohl aus ökonomischer als auch ökologischer Perspektive mit gravierenden Nachteilen verknüpft. Weitere Bemühungen haben in einem Verfahren unter Einsatz von hochtoxischem Stickstoffmonoxid geführt (PCT Pat. Appl. WO/2005/030689 , Method for Producing Cyclododecanone), wobei auch mit diesem Verfahren erhebliche Nachteile verknüpft sind und das obig beschriebene Verfahren mit Borsäure und Sauerstoff somit nach wie vor den industriellen „Benchmark” darstellt.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von Ketonen aus Alkanen bereitzustellen, das die obig beschriebenen Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist.
  • Beschreibung der Erfindung:
  • Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, in dem die Umwandlung eines Alkans in das gewünschte Keton durch enzymatische Umsetzung in Gegenwart einer Monooxygenase, Alkoholdehydrogenase und eines geeigneten Cofaktors in einem wässrigen Reaktionsmedium in Gegenwart von molekularem Sauerstoff erfolgt. Der verwendete Cofaktor wird dabei von beiden Enzymkomponenten (sowohl Monooxygenase als auch Alkoholdehydrogenase) akzeptiert. Vorzugsweise werden NAD(P)H-abhängige Enzymkomponenten verwendet.
  • Als Alkane werden im allgemeinen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, insbesondere 6 bis 12 Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist(en), bevorzugt einkernige, gesättigten Kohlenwasserstoffen mit 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatomen, eingesetzt. Besonders bevorzugt kommen als Alkankomponente unsubstituierte gesättigte Cycloalkane mit der Summenformel CnH2n (mit n = natürliche Zahl > 4) zum Einsatz, wobei Cyclohexan, Cyclooktan, Cyclodekan und Cyclododekan ganz bevorzugte Alkankomponenten darstellen.
  • Mit Hilfe dieses Reaktionssystems ist es nun überraschenderweise möglich, in einem einfachen wässrigen Reaktionssystem unter äußerst sanften Reaktionsbedingungen die gewünschten Zielverbindungen ausschließlich durch Sauerstoff als Oxidationsmittel in einer Eintopfsynthese direkt ausgehend von den jeweiligen Alkanen in hochselektiver Art und Weise und auf einem äußerst nachhaltigen Synthesewege zu erhalten.
  • Das wässrige Reaktionssystem kann einphasig oder zweiphasig vorliegen und gegebenenfalls organische Lösungsmittel wie z. B. Alkohole, insbesondere Isopropanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Methyl-tert-Butylether (MTBE), oder Emulgatoren enthalten.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im ersten Schritt ausgehend von der Alkankomponente (z. B. ein Cycloalkan) durch die Monooxygenase das Alkan unter Einsatz und Verbrauch von molekularem Sauerstoff (O2) hydroxyliert unter Ausbildung des korrespondierenden Alkohols (z. B. Cycloalkanol). Für diesen Schritt wird die reduzierte Form eines Cofaktors (z. B. NAD(P)H) benötigt, der hierbei oxidiert wird (z. B. zum NAD(P)+). In situ erfolgt nun (ohne Isolierung eines Zwischenprodukts!) die Alkoholdehydrogenase-katalysierte Weiteroxidation des Alkohols zum gewünschten Keton, wobei gleichzeitig die oxidierte Form des Cofaktors mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase wieder in die reduzierten Form überführt wird (z. B. zum NAD(P)H). Die so wieder hergestellte (= regenierte) reduzierte Form des Cofaktors (z. B. NAD(P)H) steht nun für einen erneuten Monooxygenase-katalysierten Hydroxylierungsschritt zur Verfügung. Das beschriebene Reaktionssystem ist graphisch auch in nachfolgender Abbildung, exemplarisch am Beispiel der Herstellung von Cyclooktanon ausgehend von Cyclooktan, aufgezeigt.
    Figure 00050001
    Abb. 1. Konzeption des erfindungsgemäßen Verfahrens
  • Die Umsetzung kann auch so geführt werden, dass man den Alkohol als Produkt isoliert, wenn man keine Alkoholdehydrogenase einsetzt, die für den zweiten Reaktionsschritt vom Alkanol zum Alkanon geeignet ist. In diesem Falle würde man zur Regenerierung des Cofaktors eine Glukosedehydrogenase (in Kombination mit Glukose als Cosubstrat) oder eine Formiatdehydrogenase (in Kombination mit Ameisensäure bzw. dessen Salzform) vorzugsweise verwenden, wobei auch andere Methoden der Cofaktorregenerierung Anwendung finden können.
  • Besonders vorteilhaft hat sich das Verfahren für die Umwandlung von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen erwiesen, wobei ganz bevorzugt das Verfahren für die Herstellung von Cyclohexanon, Cyclooktanon, Cyclodekanon und Cyclododekanon genutzt wird. Im experimentellen Teil ist hierzu die Herstellung von Cyclooktanon (Beispiele 3 und 5) und Cyclodekanon (Beispiel 4) mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
  • Es ist als unerwartet anzusehen, dass es mit Hilfe der beschriebenen – verglichen mit dem Stand der Technik – äußerst sanften enzymatischen Oxidationsmethode in Wasser gelingt, einen selektiveren und zugleich mit signifikant höheren Umsätzen verbundenen Syntheseweg zu Alkanonen, vorzugsweise Cycloalkanonen, ausgehend von der jeweiligen Alkankomponente herbeizuführen. In den bisherigen Verfahren hat sich gezeigt, dass Reaktionsbedingungen, die zu höheren Selektivitäten führen, typischerweise mit niedrigeren Umsätzen verknüpft sind (siehe Stand der Technik). Auch als überraschend ist anzusehen, dass die beiden enzymatischen Schritte in einer solchen Art und Weise kompatibel sind, dass zur Regeneration des Cofaktors jeweils die andere enzymatische Reaktion dient und somit keine weiteren Arten der Cofaktorregenerierung (unter Zuhilfenahme weiterer Cosubstrate) notwendig sind. Da zudem gleich drei äußerst hydrophobe unnatürliche Komponenten in erhöhten Konzentrationen eingesetzt werden kann es als weiterhin überraschend angesehen werden, das keine (signifikanten) Inhibierungseffekte dieser Komponenten weder auf die Monooxygenase noch auf die Alkoholdehydrogenase beobachtbar sind.
  • Im nachfolgenden Teil sind beispielhaft Gene und die dazugehörigen Enzyme enthalten, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Allgemeinen bei 0–90°C, insbesondere 15–50°C und ganz bevorzugt zwischen 20–40°C durchgeführt.
  • 1. Monooxygenasen: Ausgewählte Vertreter
  • Der Fachmann ist frei in der Wahl der Monooxygenase. Als bevorzugte Monooxygenasen gelten sogenannte Cytochrom P450-Monooxygenasen (Häm-Monooxygenasen). Darunter werden insbesondere bakterielle Cytochrom P450-Monooxygenasen, die zudem rekombinant verfügbar sind und mit Hilfe eines bakteriellen oder eukaryontischen Wirtsorganismus gut exprimiert werden, vorzugsweise eingesetzt. Als Wirtsorganismus wird bevorzugt Escherichia coli verwendet, wobei auch andere bewährte Wirtsorganismen in vorteilhafter Weise zum Einsatz kommen können. Als Beispiele für besonders geeignete Monooxygenasen sind die aus Bacillus megaterium (insbesondere das Enzym CYP102A1, auch als P450 BM-3 bezeichnet) sowie Thermus thermophilus (insbesondere das Enzym CYP175A1) stammenden Monooxygenasen und hierbei ganz bevorzugt entsprechend für die Hydroxylierung geeignete Mutanten zu nennen (R. Schmid, J. Pleiss, V. Urlacher, Nachrichten aus der Chemie 2004, 52, 767–772). Die Monooxygenase aus Bacillus megaterium ist beispielsweise beschrieben in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167–171, U. Schwaneberg, A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, R. D. Schmid, J. Chromatography A 1999, 848, 149–159 sowie J. Kuper, T. S. Wong, D. Roccatano, M. Wilmanns, U. Schwaneberg, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5786 und für Hydroxylierungen geeignete Mutanten dieses Enzyms sind beispielsweise in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 85, 167–171, T. S. Wong, F. H. Arnold, U. Schwaneberg, Biotechnol. Bioeng. 2004, 85, 351–358, S. C. Maurer, K. Kuehnel, L. A. Kaysser, S. Eiben, R. D. Schmid, V. B. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1090–1098, P. Meinhold. M. W. Peters. M. M. Chen, T. Takahashi, F. H. Arnold, ChemBioChem 2005, 6, 1765–1768, und D. F. Munzer, P. Meinhold, M. W. Peters, S. Feichtenhofer, H. Griengl, F. H. Arnold, A. Glieder, A. de Raadt, Chem. Commun. 2005, 2597-2599 genannt. Eine ganz bevorzugte Mutante stellt hierbei die Monooxygenase aus P450 BM-3 dar, bei der im Vergleich zum Wildtypenzym das in Position 87 befindliche Phenylalanin durch Valin ausgetauscht ist. Dieses Enzym (im Folgenden wird dieses Polypeptid als „P450 BM-3 Mutante F87V” bezeichnet; die Sequenz SEQ ID NO: 2 entspricht diesem Polypeptid) ist beschrieben in W. T. Sulistyaningdyah, J. Ogawa, Q. -S. Li, C. Maeda, Y. Yano, R. D. Schmid, S. Shimizu, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 67, 556–562 sowie S. Graham-Lorence, G. Truan, J. A. Peterson, J. R. Falck, S. Wie, C. Helvig, J. H. Capdevila, J. Biol. Chem. 1997, 272, 1127–1135. Die Monooxygenase aus Thermus thermophilus ist beispielsweise beschrieben in PCT Pat. Appl. WO0233057 , 2002.
  • Die Anwendung von Monooxygenasen in präparativen Hydroxylierungsreaktionen ist in K. Kühnel, S. C. Maurer, Y. Galeyeva, W. Frey, S. Laschat, V. B. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2007, 349, 1451–1461 beschrieben. Hierbei wird eine C-H-Bindungseinheit des Substrats in eine C-OH-Einheit überführt. Für die Hydroxylierung wird Sauerstoff als Oxidationsmittel sowie eine reduzierte Form des Cofaktors (NAD(P)H) benötigt. Die bei der Reaktion erhaltene oxidierte Form des Cofaktors wird anschließend in situ in die reduzierte Form wieder umgewandelt. Bei diesem Schritt wird nun ein Co-Substrat sowie ein weiteres Enzym benötigt. Typischerweise wird Ameisensäure eingesetzt in Gegenwart einer Formiatdehydrogenase als Enzymkomponente. Die Notwendigkeit des Co-Substrats stellt allerdings einen (nachteiligen) zusätzlichen Kostenfaktor dar und vermindert auch die Atomökonomie des Gesamtprozesses als Kriterium für die Nachhaltigkeit einer Synthese in unvorteilhafter Weise. Es sei an dieser Stelle noch einmal darauf verwiesen, dass dieser Nachteil beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr besteht und hierbei eine Cosubstrat-freie Synthese realisiert werden kann.
  • 2. Alkoholdehydrogenasen: Ausgewählte Vertreter
  • Der Fachmann ist frei in der Wahl der Alkoholdehydrogenase und wird sich hierbei an solchen Vertretern orientieren, die in besonderer Form für die Oxidation der jeweiligen Alkanolkomponente geeignet sind und sich hierbei durch hohe spezifische Enzymaktivitäten und eine Abhängigkeit von den Cofaktoren NADH und/oder NADPH auszeichnen. Bevorzugt eingesetzte Alkoholdehydrogenasen sind die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir, die in W. Hummel, M. -R. Kula, EP 456107 , 1991, C. W. Bradshaw, W. Hummel, C. -H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532–1536 und A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotransf. 2006, 24, 380–389 beschrieben ist, als auch die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis, die u. a. in K. Niefind, B. Riebel, J. Müller, W. Hummel, D. Schomburg, Acta Cryst. Sect. D 2000, D56, 1696–1698 und N. H. Schlieben, K. Niefind, J. Müller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 2005, 349, 801–813 beschrieben ist. Darüber hinaus lassen sich auch andere in der organischen Synthese bereits erfolgreich eingesetzte Alkoholdehydrogenasen verwenden. Eine Übersicht solcher weiterer bevorzugter Alkoholdehydrogenasen ist u. a. in S. Buchholz, H. Gröger in: Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries (Hrsg.: R. N. Patel), CRC Press, New York, 2006, Kapitel 32 enthalten.
  • Die Herkunft der für die genannten Enzyme kodierenden Polynukleotide ist im Allgemeinen nicht auf die Gattung oder Spezies des rekombinanten Mikroorganismus beschränkt, der als Host dient.
  • Die Gene können ohne Rücksicht auf die Herkunft zur Transformation des Host-Organismus ausgewählt werden, die zur Herstellung der codierten Enzyme dienen.
  • Bevorzugt wird ein Polynukleotid eingesetzt, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei im Vergleich zur Sequenz des Wildtyps die Aminosäure an der Position 87 gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht ist (z. B. Phe → Val), und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt. Bevorzugt ist eine 100%-ige Identität mit SEQ ID NO: 2. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein
    • a) Polynukleotid mit der Sequenz aus SEQ ID NO: 1
    • b) Polynukleotid mit einer Sequenz korrespondierend zu SEQ ID NO: 1 im Umfang der Degeneriertheit des genetischen Kodes
    • c) Polynukleotid mit einer Sequenz, die mit den komplementären Sequenzen zu Punkt a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
    das für das genannte Polypeptid kodiert.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch weitere durch Deletion, Transition, Transversion oder Insertion an maximal 5 Positionen entstandene Mutanten von SEQ ID NO: 2, die eine höhere Aktivität und/oder Stabilität und/oder Selektivität im Vergleich zum Wildtyp aufweisen.
  • Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (Internation Journal of Systemtic Bacteriology 41: 255–260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C–68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde ausweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 × SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C–68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 × SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1–2°C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren, die eine vollständige Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558).
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden isolierte Enzyme aber auch Ganzzellkatalysatoren eingesetzt, wobei die Verwendung von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren ganz bevorzugt ist. Darüber hinaus können sowohl isolierte Enzyme und Ganzzellkatalysatoren auch in immobilisierter Form verwendet werden, wobei der Fachmann frei in der Wahl der Immobilisierungsmethode ist.
  • Beim Einsatz von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren ergibt sich der Vorteil, dass die hierbei erfindungsgemäß eingesetzten Zellen, die die benötigten Enzyme zumindest teilweise enthalten, bevorzugt die Monooxygenase und die Alkoholdehydrogenase, nach der Reaktion leicht abgetrennt werden können. Auch ist der Einsatz von solchen (rekombinanten) Zellen ökonomisch attraktiver im Vergleich zu isolierten Enzymen, für deren Zugang weitere Produktionsschritte wie Zellaufschluss, Abtrennung ungelöster Zellbestandteile, Enzymreinigung und/oder -isolierung nötig sind. Auch ist die Stabilität von Enzymen in (rekombinanten) Zellen oftmals erhöht im Vergleich zur Stabilität der „freien” in Lösung vorliegenden Enzyme.
  • Die Umsetzung der Alkane (z. B. Cycloalkane) erfolgt bevorzugt mit ruhenden Zellen. Darunter versteht man Zellen, die lebensfähig sind, sich aber unter gegebenen Bedingungen nicht vermehren, und die mit den für die benötigten Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen transformiert wurden.
  • Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von in den ausgewählten Host-Stämmen im allgemeinen autonom replizierbaren Vektoren, die miteinander kompatibel sind und mindestens ein Gen enthalten, das für eines der erfindungsgemäß notwendigen Enzyme kodiert.
  • Vector DNA kann in eukaroyotische oder prokaryotische Zellen durch bekannte Transformationstechniken eingeführt werden.
  • Bevorzugt werden Vektoren, die für zwei Enzyme kodierende Nukleotidsequenzen enthalten, insbesondere z. B. für Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase.
  • Vorteilhaft ist auch die Kombination von für Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase kodierenden Nukleotidsequenzen auf einem Vektor.
  • Die Nukleotidsequenz für den Cofaktor befindet sich typischerweise in der genomischen DNA des Wirtsorganismus. Für eine typische Herstellung eines Ganzzellkatalysators enthaltend für Biotransformationen ausreichende Mengen des im rekombinanten Stamm gebildeten Cofaktors, siehe beispielsweise: H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker, O. May, Angew. Chem. 2006, 118, 5806–5809; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5677–5681.
  • Im Allgemeinen geht man so vor, dass man ein gut exprimierbares oder sehr aktives Gen in einen Vektor mit niedriger Kopienzahl, Gene mit schwächerer Expressionsleistung auf einem Vektor mit höherer Kopienzahl und/oder mit einem starken Promotor kloniert. Die Wirtszellen sind mit diesen Vektoren in der Weise transformiert, dass sie im Vergleich zum Startorganismus mindestens jeweils eine zusätzlicher Kopie der für die beiden Enzyme (Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase) kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten.
  • Durch diese Maßnahme gelingt es, die genannten Nukleotidsequenzen zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
  • Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
  • Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869 , im US Patent 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
  • Die Überexpression führt zur Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Enzyme.
  • Die Steigerung liegt im allgemeinen bei mindestens 10 bis 500%, insbesondere 50 bis 500% oder 100 bis 500%, bis zu einem Maximum von 1000 oder 2000% verglichen mit der Konzentration oder Aktivität des Enzyms in dem der Transformation zugrunde liegenden Organismus (Startorganismus).
  • Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
  • Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191–195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58–64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159–164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).
  • Mutationen, die zu einer Veränderung beziehungsweise Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511–5515 (1998)), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833–20839 (1991)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
  • Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations”) oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations”) gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations”), die dazu führen, dass „falsche” Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Generierung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
  • Geeignete Mutationen in den Genen wie beispielsweise Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Mikroorganismen, in denen eine erfindungsgemäße Monooxygenase und eine geeignete Alkoholdehydrogenase in überexprimierter Form vorliegen. Zusätzlich enthalten solche Zellen (Ganzzellkatalysatoren) typischerweise noch den für die Biotransformation benötigten Cofaktor NAD(P)H.
  • Diese werden als Ganzzellkatalysatoren bezeichnet und bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
  • Dabei werden die Zellwände durch chemische oder physikalische Maßnahmen durchlässig für die Aufnahme der Substrate und Abgabe der Produkte.
  • Die Substrate werden im Allgemeinen in einer Konzentration von > 0 bis 700 g/L, vorzugsweise > 50 bis 500 g/L, ganz besonders bevorzugt > 100 bis 300 g/L eingesetzt. Der Fachmann ist dabei frei in der Wahl in der Art und Weise, wie das Substrat zugegeben wird. Dabei kann beispielsweise die gesamte Substratmenge bereits am Beginn der Reaktion vorgelegt werden oder alternativ die Gesamtmenge oder eine Teilmenge des Substrats dosiert über einen bestimmten Zeitraum während der Reaktions zugegeben werden.
  • Unter Konzentration wird dabei bevorzugt das Verhältnis der Gesamtmenge des eingesetzten Substrats/Gesamtmenge des wässrigen Reaktionsmediums verstanden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind rekombinante Mikroorganismen, in denen nur eine mutierte Monooxygenase vorliegt. Diese Stämme enthalten eine Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und werden zur Hydroxylierung der genannten Alkane (z. B. Cycloalkane) eingesetzt. In diesen Stämmen wird keine Alkoholdehydrogenase überexprimiert.
  • Der für die Reaktion notwendige Cofaktor kann in jedem Fall auch dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, wenn die Zellen diesen nicht in ausreichender Menge produzieren. Dabei kann der Cofaktor sowohl in reduzierter Form (z. B. NAD(P)H) als auch in oxidierter Form (NAD(P)+) zugesetzt werden.
  • Werden isolierte Enzyme verwendet, so erfolgt die Umsetzung entweder durch Zugabe der reduzierten Form des Cofaktors (z. B. NAD(P)H) wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben oder alternativ ausgehend von der oxidierten Form und eines Additivs, das die Bildung der für den ersten Reduktionsschritt erforderlichen reduzierten Form des Cofaktors ermöglicht. Letztere Vorgehensweise ist in Beispiel 5 beschrieben. Vorzugsweise stellt das Additiv hierbei ein Alkohol dar (insbesondere Isopropanol), der in Gegenwart der vorhandenen Alkoholdehydrogenase oxidiert wird und hierbei die oxidierte Form den Cofaktors (z. B. NAD(P)+) zur reduzierten Form (z. B. NAD(P)H) reduziert (siehe Beispiel 5).
  • Beispiel 1: Herstellung der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2
  • Die Expression und Aufreinigung der Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, die für die enzymatische Umsetzung von Alkanen (z. B. Cycloalkane) vorzugsweise eingesetzt wird und auch für die Beispiele 2 bis 5 verwendet wurde, erfolgte im präparativen Maßstab gemäß der in J. Nazor, S. Dannenmann, R. O. Adjei, Y. B. Fordjour, I. T. Ghampson, M. Blanusa, D. Roccatano, and U. Schwaneberg, Protein Eng. Des. Sel. 2008 21, 29–35 beschriebenen Arbeitsvorschrift.
  • Dazu werden in 500 mL Schüttelkolben 50 ml TB-Medium (Pro Liter: 12 g Pepton, 24 g Hefe-Extrakt, 4 mL Glyerin, 2,31 g KH2PO4, 12,54, K2HPO4), das mit Ampicillin (100 μg/ml) und 50 μl einer sterilen Spurenelement-Lösung (Pro Liter: 0,5 g CaCl2 × 2H2O, 0,18 g ZnSO4 × 7H2O, 0.1 g MnSO4 × H2O, 20.1 g Na2-EDTA, 16,7 g FeCl3 × 6H2O, 0,16 g CuSO4 × 5H2O, 0,18 g CoCl2 × 6H2O) supplementiert ist, mit 500 μl einer LB-Übernachtkultur (Pro Liter LB-Medium: 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl) eines E. coli Stammes inokuliert, der auf einem Plasmid das Monooxygenasegen für eine erhöhte Expression trägt. Diese Expressionskultur wird bei 30°C in einem Schüttelinkubator (250 rpm) inkubiert bis bei einer spektrophotometrisch bestimmten Zelldichte von 0,8–1,0 (Wellenlänge: 578 nm) die Expression des Monooxygenasegens auf dem Plasmid durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (Enkonzentration: 100 μM) induziert wird. Für einen erhöhten Anteil aktiver Monooxygenasen im Zell-Rohextrakt wird das Medium außerdem mit der Häm-Vorstufe 5-Aminolävulinsäure (Endkonzentration: 500 μM) supplementiert. Nach 20 Stunden Expression werden die E. coli-Zellen mit exprimiertem Monooxygenaseprotein durch Zentrifugation geerntet und die Zellen in PBS-Puffer (2 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH 7,4) einmal gewaschen. Nach Resuspension in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) werden die Zellen durch Ultraschall lysiert. Durch Zentrifugation und anschließende Filtration des Zell-Lysats wird der Rohextrakt gewonnen. Die Monooygenase-Proteine können wie bereits beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden (U. Schwaneberg, U., A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, and R. D. Schmid. J. Chromatogr. 848, 149–159).
  • Beispiel 2: Enzymaktivitäten der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2
  • Die Enzymaktivität wird in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift (E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew. Chem. 2008, 120, 9693) spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen Cycloalkans als Substrat bestimmt (ε340 = 6.3 mM–1cm–1). Zur spektrophotometrischen Bestimmung der Enzymaktivität werden zunächst in einer Küvette (1 mL) 690 μL Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM), 10 μL einer DMSO-Lösung des Cycloalkans (100 mM) und 100 μL Enzymlösung der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (partiell gereinigt; lyophilisiert; NADPH-abhängig) vorgelegt. Die Reaktion wird anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μL einer Lösung von NADPH (NADPH: 0.8 mM; Phosphatpuffer: pH 7.0, 50 mM) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (in U/mg) mit der für das Substrat Cyclohexan erhaltenen Enzymaktivität (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität 100%) bestimmt.
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Beispiel 3: Oxidation von Cyclooktan zu Cyclooktanon
  • In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander 0.392 U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan als Substrat), 0.1 mmol Cyclooktan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 μL) gegeben und danach wird die Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADPH (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 67 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fügt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Lösungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 50% bezogen auf die Bildung von Cyclooktanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclooktanol bei < 5% liegt.
  • Beispiel 4: Oxidation von Cyclodekan zu Cyclodekanon
  • In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander 0.392 U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan als Substrat), 0.1 mmol Cyclodekan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 μL) gegeben und danach wird die Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADPH (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 70 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fügt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Lösungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 63% bezogen auf die Bildung von Cycloodekanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclodekanol bei < 5% liegt.
  • Beispiel 5: Oxidation von Cyclooktan zu Cyclooktanon mit Isopropanol als Additiv und NADP+ als Cofaktor
  • In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander 0.392 U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan), 0.1 mmol Cyclooktan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M), 10 μL Isopropanol (0.13 mmol), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 statt 0 μL) gegeben und danach wird die Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADP+ (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 67 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fügt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Lösungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 79% bezogen auf die Bildung von Cyclooktanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclooktanol bei < 5% liegt.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • - Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)) [0040]
    • - Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511–5515 (1998)) [0040]
    • - Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833–20839 (1991)) [0040]
    • - Hagemann („Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) [0040]
    • - Knippers („Molekulare Genetik”, 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) [0041]
    • - Winnacker („Gene und Klone”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) [0041]
    • - Hagemann („Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) [0041]
    • - J. Nazor, S. Dannenmann, R. O. Adjei, Y. B. Fordjour, I. T. Ghampson, M. Blanusa, D. Roccatano, and U. Schwaneberg, Protein Eng. Des. Sel. 2008 21, 29–35 [0051]
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Claims (29)

  1. Verfahren zur Herstellung von Ketonen durch enzymatische Oxidation von Alkanen, bei dem man diese Alkane in Gegenwart einer Monooxygenase, einer Alkoholdehydrogenase und eines für beide Enzyme geeigneten Cofaktors in einem wässrigen Reaktionsmedium in Gegenwart von molekularem Sauerstoff umsetzt.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man eine NAD(P)H-abhängige Monooxygenase, eine NAD(P)H-abhängige Alkoholdehydrogenase und als Cofaktor NAD(P)H einsetzt.
  3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 für das Polypeptid verwendet.
  4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis verwendet.
  5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem man Alkane, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist(en), einsetzt.
  6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem man ein gesättigtes Cycloalkan enthaltend 6, 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatome einsetzt.
  7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem man Enzyme und Cofaktor in isolierter Form einsetzt.
  8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, bei dem man das Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
  9. Rekombinante Mikroorganismen, in denen die Aktivität einer Monooxygenase einer Alkoholdehydrogenase und des Cofaktors, insbesondere NAD(P)H, erhöht vorliegen.
  10. Mikroorganismen gemäß Anspruch 9, die eine NADP(H)-abhängige Monooxygenase und eine NAD(P)H-abhängige Alkoholdehydrogenase enthalten.
  11. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen gemäß Anspruch 9 und 10 verwendet werden.
  12. Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei die Aminosäure an der Position 87 eine andere proteinogene Aminosäure als Phenylalanin (Phe) ist und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt.
  13. Polynukleotid gemäß Anspruch 12, enthaltend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe: a) Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 b) Polynukleotidsequenz korrespondierend zu SEQ ID NO: 1 im Umfang der Degeneriertheit des genetischen Kodes, c) Polynukleotidsequenz, die mit den komplementären Sequenzen zu Punkt a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
  14. Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei die Aminosäure an der Position 87 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist (außer Phenylalanin (Phe) oder Valin (Val)) und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt.
  15. Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 9 bis 11, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 enthalten.
  16. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 und 11, bei dem man die Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 9 bis 10 und 15 einsetzt.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem man als Cofaktor NAD(P)H dem Reaktionsgemisch zusetzt.
  18. Verfahren zur Hydroxylierung von Alkanen durch enzymatische Umsetzung, bei dem man diese Alkane mit einer Monooxygenase und einem Cofaktor in Gegenwart von Sauerstoff umsetzt.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 für das Polypeptid verwendet.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass man als Monooxygenase ein Polypeptid verwendet, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz dargestellt in der SEQ ID NO: 2.
  21. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Regenerierung des Cofaktors eine Glukosedehydrogenase in Kombination mit Glukose verwendet wird.
  22. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Regenerierung des Cofaktors eine Formiatdehydrogenase in Kombination mit Ameisensäure bzw. dessen Salzen verwendet wird.
  23. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, bei dem man Mikroorganismen einsetzt, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 enthalten.
  24. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 23, bei dem Alkane, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist(en), einsetzt.
  25. Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 bis 24, bei dem man ein gesättigtes Cycloalkan enthaltend 6, 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatome einsetzt.
  26. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 25, bei dem man das hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
  27. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, 11 und 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des verwendeten Substrats bezogen auf die Gesamtmenge des wässrigen Reaktionsmediums bei einer Konzentration von > 0 bis 500 g/L, vorzugsweise > 50 bis 500 g/L, ganz besonders bevorzugt > 100 bis 300 g/L liegt.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des Substrats bereits am Beginn der Reaktion im Reaktionsgemisch vorliegt.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des Substrats oder eine Teilmenge des Substrats während der Reaktion zudosiert wird.
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