DE102017210944A9 - Alkoholdehydrogenasen und Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft Enzyme zur Verwendung in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen, deren Aminosäuresequenz, Fusionsproteine umfassend das Enzym, sowie einen Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym, eine Zelle oder einen Organismus enthaltend das Enzym, das Fusionsprotein und/oder den Vektor, sowie ein Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen unter Verwendung des Enzyms.

Description

  • Die Erfindung betrifft Enzyme zur Verwendung in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen, deren Aminosäuresequenz, Fusionsproteine umfassend das Enzym, sowie einen Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym, eine Zelle oder einen Organismus enthaltend das Enzym, das Fusionsprotein und/oder den Vektor, sowie ein Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen unter Verwendung des Enzyms.
  • Die Synthese pharmakologisch wirksamer Verbindungen erfolgt in der chemischen Industrie weitestgehend durch organische Synthesen. Für die Herstellung chiraler Verbindungen eignen sich organische Synthesen aufgrund geringer Ausbeuten und Enantioselektivitäten häufig nicht.
  • Eine Alternative bieten enzymkatalysierte Reaktionen, welche unter milden Bedingungen ablaufen und hohe Spezifitäten ermöglichen.
  • Die Synthese chiraler Hydroxylgruppen erfolgt herkömmlich aus der entsprechenden Carbonylverbindung, z. B. einem prochiralen Keton, Aldehyd oder Ester, unter Verwendung von Dehydrogenasen, insbesondere Alkoholdehydrogenasen. Alkoholdehydrogenasen sind Oxidoreduktasen (Enzymklasse 1), welche den Hydridtransfer in Abhängigkeit des Co-Faktors Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) oder Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP) katalysieren. Alkoholdehydrogenasen können entsprechend des Hydridtransfers auf der Si-Seite oder der Re-Seite der prochiralen Carbonylgruppe (R)- oder (S)-spezifisch sein.
  • Loderer und Ansorge-Schumacher beschreiben die regio- und enantioselektive Synthese von (S)-2-Hydroxyalkanonen, wie (S)-2-Hydroxypentan-3-on, (S)-2-Hydroxy-hexan-3-on und (S)-2-Hydroxy-heptan-3-on; aus den entsprechenden prochiralen Diketonen (Loderer und Ansorge-Schumacher 2015). Die Reduktion der Diketone sowie die Regeneration des Co-Faktors erfolgen durch eine gereinigte Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR2). Die Enantiomerenreinheit wurde auf 89%ee (enantiomeric excess) bis 95%ee bei Ausbeuten bis zu 46% bestimmt.
  • Weiterhin werden Alkoholdehydrogenasen zur Verwendung in der Synthese von chiralen arylaliphatischen Verbindungen beschrieben. Eine dieser chiralen arylaliphatischen Verbindungen ist das Phenylacetylcarbinol (PAC), welches als Intermediat in der pharmazeutischen Herstellung von Ephedrin und Pseudoephedrin dient. Für die Produktion dieses asymmetrischen a-Hydroxyketons wurden verschiedene Verfahren mit unterschiedlichen Enantiomerenreinheiten bzw. Ausbeuten entwickelt. Toukoniitty et al. beschreiben die chemische Synthese von (R)-PAC über einen Platin-Komplex-Katalysator mit einem Enantiomerenüberschuss von 65% und einer Ausbeute von 90% für beide Enantiomere (Toukoniitty et al. 2004). Torres et al. offenbaren die Synthese von PAC mit einem RhodiumKatalysator (Rh/MCM-41), wobei ein Enantiomerenüberschuss von bis zu 70%ee und eine Ausbeute von 80% erreicht wird (Torres et al. 2014).
  • Die CN 101486998 A offenbart eine spezifische Carbonylreduktase aus Morganella morganii (CMCC (B) NO. 49208), deren Nukleinsäuresequenz sowie Proteinsequenz. Die Carbonylreduktase reduziert das Substrat 2-Amino-1-phenyl-propanon asymmetrisch zu (D)-Pseudoephedrin ((-)-(1S,2S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-ol) unter Zusatz von NAD+ als Co-Faktor mit einer Ausbeute von 89%. Die Enantiomerenreinheit des Produkts wird nicht offenbart.
  • Alternativ erfolgt die Herstellung von asymmetrischen α-Hydroxycarbonylverbindungen unter Verwendung von Pyruvatdecarboxylasen oder deren Mutanten.
  • WO 90/04639 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von (L)-Phenylacetylcarbinol (PAC) aus Benzaldehyd und Pyruvat, eine immobilisierte Zellmasse nicht-viabler Zellen mutierter Hefestämme, welche resistent gegen Aldehydinhibierung während der PAC-Bildung sind, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae P-2180-1A-8pa, zur Verwendung in dem Verfahren sowie ein Verfahren zur Herstellung der immobilisierten Zellmasse. Die Hefestämme bilden eine Pyruvatdecarboxylase. Mittels des Verfahrens werden Ausbeuten bis zu 73% erreicht. WO 2001044486 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Carbinolen, insbesondere (R)-Phenylacetylcarbinol (PAC), mittels Hefestämmen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, mit einer Ausbeute von bis zu 84% mit einer Enantiomerenreinheit von 90%ee bzw. einer Enantiomerenreinheit von bis zu 94%ee bei einer Ausbeute von 51%.
  • WO 99/09195 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen, insbesondere R-Phenylacetylcarbinol, aus Acetaldehyd und Benzaldehyden in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas, bevorzugt Zymomonas mobilis, wobei bevorzugt unsubstituiertes Benzaldehyd umgesetzt wird. Nachteilig sind die Bildung von Nebenprodukten sowie eine geringe Reaktionsgeschwindigkeit bei Abweichungen von der optimalen Acetaldehydkonzentration von 20 bis 50 mM. Weiterhin beschreibt DE 10142574 A1 die Verwendung eines Zweiphasensystems mit mindestens einer wässrigen Phase und bevorzugt einer organischen Phase, besonders bevorzugt Octanol. Unter Verwendung des Verfahrens werden nach 395 Stunden bei 4°C 195,1 g/l (R)-PAC erhalten, was einer Ausbeute von 98% PAC, bezogen auf Benzaldehyd, und 92,9% PAC, bezogen auf Pyruvat, entspricht.
  • WO 2016/041535 A1 offenbart eine mutierte Lyase aus Aceobacter pasteurianus sowie ein Verfahren zur asymmetrischen Synthese von (S)-Phenylacetylcarbinol (PAC) unter Verwendung der mutierten Lyase, wobei Ausbeuten von bis zu 73% nach 48 h und Enantiomerenreinheit von bis zu 98%ee erreicht werden.
  • Ein weiteres asymmetrisches Hydroxyketon, das (S)-3-Hydroxy-indolin-2-on, wird durch asymmetrische Reduktion von Isatin mit einem Enantiomerenüberschuss von 48%ee und einer Ausbeute von 68% erhalten (Birolli et al. 2017).
  • Die Nachteile der bekannten Verfahren sind die Bildung von Nebenprodukten, geringe Reaktionsgeschwindigkeiten oder hohe Substratspezifitäten.
  • Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zurstereoselektiven Reduktion verschiedener Carbonylverbindungen bereitzustellen. Dabei ist es im hohen Maße wünschenswert, sowohl (R)- als auch (S)-Hydroxyverbindungen herzustellen.
  • Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur regioselektiven Reduktion von Dicarbonylverbindungen bereitzustellen.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  • Unter Identität wird die Anzahl an übereinstimmenden Aminosäuren bezogen auf die Gesamtanzahl an Aminosäuren verstanden.
  • Die Enzyme mit einer Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1 oder 2 können aus Arthrobacter species TS-15 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Eingangsnummer der Internationalen Hinterlegungsstelle: DSM 32400, im Folgenden als DSM 32400 bezeichnet) isoliert werden. Erfindungsgemäß ist das Enzym eine Dehydrogenase, insbesondere eine kurzkettige Dehydrogenase (short-chain dehydrogenase/reductase superfamily, SDR) (Kavanagh et al. 2008).
  • In einer Ausführungsform ist das Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu SEQ ID NO. 1 eine prelogspezifische Ephedrindehydrogenase (EDH). Eine prelogspezifische Ephedrindehydrogenase (EDH) im Sinne der Erfindung ist ein Enzym, welches die Oxidation von (R)-Hydroxygruppen, insbesondere die Oxidation von Ephedrin nach Formel (I) katalysiert: (1R,2S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-ol + NAD+ → (S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-on + NADH + H+ (I).
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu SEQ ID NO. 2 eine anti-prelogspezifische Pseudoephedrindehydrogenase (PSEDH). Eine anti-prelogspezifische Pseudoephedrindehydrogenase (PSEDH) im Sinne der Erfindung ist ein Enzym, welches die Oxidation von (S)-Hydroxygruppen, insbesondere die Oxidation von Pseudoephedrin nach Formel (II) katalysiert: (1S,2S)-2-Methylamino-1-phenyl-propan-1-ol + NAD+ → (S)-2-Methylamino-1-phenylpropan-1-on + NADH + H+ (II).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2 auf, besonders bevorzugt mindestens 95% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  • In einer weiteren Ausführungsform weist das Enzym eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Identität, bevorzugt 95% Identität im aktiven Zentrum des Enzyms mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 oder 2 auf. Unter einem aktiven Zentrum wird der Bereich eines Enzyms verstanden, welcher für die katalytische Wirkung durch Bindung und Umsetzung des Substrats zuständig ist.
  • Das aktive Zentrum der Ephedrindehydrogenase (EDH) mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 umfasst 54 Aminosäuren, insbesondere die Aminosäuren 142 bis 160 (SEQ ID NO. 3), die Aminosäuren 186 bis 214 (SEQ ID NO. 4) und die Aminosäuren 242 bis 247 (SEQ ID NO. 5). Das aktive Zentrum der Pseudoephedrindehydrogenase (PSEDH) mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 umfasst 71 Aminosäuren, insbesondere die Aminosäuren 135 bis 156 (SEQ ID NO. 6), die Aminosäuren 182 bis 220 (SEQ ID NO. 7) und die Aminosäuren 246 bis 255 (SEQ ID NO. 8).
  • In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Enzym eine Länge von 240 Aminosäuren bis 300 Aminosäuren auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Enzym eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  • In einer Ausführungsform weist das Enzym umfassend die Sequenz SEQ ID NO. 1 eine Länge von 249 Aminosäuren bis 280 Aminosäuren auf. In einer weiteren Ausführungsform weist das Enzym umfassend die Sequenz SEQ ID NO. 2 eine Länge von 274 Aminosäuren bis 300 Aminosäuren auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Enzym aus einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Enzym ein Fusionsprotein umfassend eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität, bevorzugt 90% Identität, besonders bevorzugt 95% Identität, zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Fusionsprotein weiterhin einen Marker, einen Peptidlinker und/oder ein weiteres Enzym.
  • Unter einem Marker oder Affinitätstag wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine kurze Peptidsequenz verstanden, welche zum Nachweis und/oder der Reinigung des Fusionsproteins dient. In einer Ausführungsform ist der Marker ausgewählt aus einem Polyhistidin (His)-Tag, einem Streptavidin (Strep)-Tag, einem Maltose-binding protein (MBP)-Tag, einem S-Tag oder einem Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag.
  • Unter einem Peptidlinker wird eine kurze Peptidsequenz zur Verlinkung von Bestandteilen des Fusionsproteins unter Erhalt derer Aktivität verstanden. In einer Ausführungsform weist der Peptidlinker 5 bis 20 Aminosäuren auf.
  • In einer Ausführungsform ist das weitere Enzym aus NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzymen ausgewählt. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme können verbrauchtes NAD(P)H regenerieren. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das weitere Enzym aus Formiatdehydrogenasen ausgewählt, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 9).
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms oder Fusionsproteins in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen, bevorzugt Carbonylverbindungen der Formel (III)
    Figure DE102017210944A9_0001
    wobei X ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Aryl- oder heterozyklischen Resten,
    wobei Y ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Alkyl, Aryl-, heterozyklischen Resten oder Carbonylresten.
  • Vorteilhaft weisen die erfindungsgemäßen Enzyme eine hohe Stereoselektivität bei der Reduktion von Carbonylverbindungen auf, bevorzugt bei der Reduktion von Carbonylverbindungen der Formel (III), besonders bevorzugt bei Dicarbonylverbindungen. Unter Stereoselektivität wird die bevorzugte Bildung eines von mehreren möglichen Stereoisomeren verstanden.
  • Weiterhin vorteilhaft erfolgt mit den erfindungsgemäßen Enzymen eine regioselektive Reduktion von Dicarbonylverbindungen zu Hydroxycarbonylverbindungen. Unter Regioselektivität wird die bevorzugte Reaktion einer von mehreren möglichen Stellen innerhalb eines Moleküls verstanden.
  • Weiter vorteilhaft weisen die erfindungsgemäßen Enzyme eine geringe Substratspezifität auf. Unter Substratspezifität wird die Fähigkeit von Enzymen verstanden, nur ein bestimmtes Substrat oder eine bestimmte Substratgruppe in ihrem aktiven Zentrum binden und umsetzen zu können.
  • Vorteilhaft wird unter Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins mit einem weiteren Enzym ausgewählt aus NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzymen in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen kein Co-Faktor benötigt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Enzym oder ein Fusionsprotein.
  • In einer Ausführungsform umfasst die Nukleotidsequenz eine der Sequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 11. Die Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 11, kodierend für die erfindungsgemäßen Enzyme, können aus genomischen Material von Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400) isoliert werden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor umfassend eine Nukleotidsequenz kodierend für ein erfindungsgemäßes Enzym oder ein Fusionsprotein Unter einem Vektor wird ein Transportvehikel zur Übertragung einer Nukleotidsequenz in eine Zelle verstanden.
  • In einer Ausführungsform ist der Vektor rekombinant. Unter rekombinant wird ein artifizielles Molekül verstanden, welches mittels gentechnischer Methoden zusammengesetzt wurde.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Vektor eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 11.
  • In einer Ausführungsform ist der Vektor aus einem Plasmid oder Cosmid ausgewählt. Unter einem Plasmid wird ein kleines, ringförmiges, extrachromosomal vorliegendes, doppelsträngiges DNA-Molekül verstanden. Unter einem Cosmid wird ein Plasmid verstanden, welches sogenannte cos-sites (cohesive sites) enthält.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Vektor weiterhin eine Nukleotidsequenz kodierend für ein NAD+- oder NADP+-abhängiges Enzym. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme können verbrauchtes NAD(P)H regenerieren. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor eine Nukleotidsequenz kodierend für Formiatdehydrogenasen, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 12).
  • Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Zelle oder ein Organismus enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor. Erfindungsgemäß ist die Zelle oder der Organismus nicht menschlich.
  • In einer Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in das Genom der Zelle oder des Organismus integriert.
  • In einer Ausführungsform ist die Zelle oder der Organismus aus E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oder aus der Gattung Arthrobacter, Rhodococcus, bevorzugt Arthrobacter aurescens; Bacillus, bevorzugt Bacillus subtilis; Streptomyces oder Pseudomonas, bevorzugt Pseudomonas sp., ausgewählt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle oder der Organismus Arthrobacter aurescens, bevorzugt Arthrobacter species TS-15 (DSM 32400).
  • Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen umfassend die Schritte
    1. a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms, eines Fusionsproteins und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle oder eines Organismus,
    2. b) Bereitstellen mindestens einer Carbonylverbindung, und
    3. c) Stereoselektive Reduktion der mindestens einen Carbonylverbindung durch Kontaktieren mit dem Enzym, dem Fusionsprotein und/oder der Zelle oder dem Organismus in mindestens einem Lösemittel.
  • In einer Ausführungsform erfolgt das Verfahren zur stereoselektive Reduktion von Carbonylverbindungen in der Reihenfolge der Schritte a), b) und c) oder b), a) und c).
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt a) die Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms, eines Fusionsproteins, einer Zelle oder eines Organismus.
  • Vorteilhaft entfällt bei der Bereitstellung der Zelle oder des Organismus die Proteinreinigung des Enzyms. Weiterhin vorteilhaft weist das Enzym in der Zelle oder dem Organismus eine höhere Stabilität auf.
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mindestens eine Carbonylverbindung aus symmetrischen oder unsymmetrischen, substituierten oder unsubstituierten Ketonen, α- oder β-Diketonen, α-Ketoestern, α-Aminoketonen, α-Hydroxyketonen oder α-Halogenketonen ausgewählt.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mindestens eine Carbonylverbindung aus Dicarbonylverbindungen, bevorzugt aus α- oder β-Diketonen ausgewählt. Vorteilhaft werden Dicarbonylverbindungen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren oder mit dem erfindungsgemäßen Enzym selektiv zu Hydroxycarbonylverbindungen umgesetzt.
  • In einer Ausführungsform sind die α- oder β-Diketone zyklische α- oder β-Diketone.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die mindestens eine Carbonylverbindung eine Carbonylverbindung der Formel (III)
    Figure DE102017210944A9_0002
    wobei X ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Aryl-, bevorzugt Phenylresten; oder heterozyklischen Resten, bevorzugt Furanylresten, Thiophenresten oder Pyridinresten; wobei Y ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Alkyl, Aryl-, heterozyklischen Resten oder Carbonylresten.
  • In einer Ausführungsform ist die Carbonylverbindung der Formel (III), wobei X aus substituierten Phenylresten ausgewählt ist, aus Phenyl-α-Carbonylverbindungen mit mindestens einer Alkylgruppe, einer Hydroxygruppe, einer Alkoxygruppe, bevorzugt einer Methoxygruppe; und/oder einem Halogen am Phenylring ausgewählt. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren oder mit dem erfindungsgemäßen Enzym regioselektiv die Carbonylgruppe einer Dicarbonylverbindungen mit einem Phenylrest reduziert, welche sich in α-Position zu dem Phenylrest befindet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Carbonylverbindung ein Phenyl-α-Diketon.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen der mindestens einen Carbonylverbindung sind die folgenden Verbindungen:
    • 1-Phenyl-1,2-propandion (CAS No. 579-07-7)
    • 1-Phenyl-1-propanon (CAS No. 93-55-0)
    • Benzil (CAS No. 134-81-6)
    • Benzoylformamid (CAS No. 7505-92-2)
    • Benzoylformylchlorid (CAS No. 25726-04-9)
    • 4-Chlorobenzil (CAS No. 22711-23-5)
    • 2,2'-Dichlorobenzil (CAS No. 21854-95-5)
    • 4,4'-Difluorobenzil (CAS No. 579-39-5)
    • 4,4'-Dimethylbenzil (CAS No. 3457-48-5)
    • 1-Phenyl-1,3-butandion (CAS No. 93-91-4)
    • 2,2'-Furil (CAS No. 492-94-4)
    • 1-Phenylglyoxal (CAS No. 1074-12-0)
    • 2,2'-Pyridil (CAS No. 492-73-9)
    • 2,2'-Thenil (CAS No. 7333-07-5)
    • Methylbenzoylformiat (CAS No. 15206-55-0)
    • 2,3-lndolindion (Isatin, CAS No. 91-56-5)
    • Indan-1,2-dion (CAS No. 16214-27-0)
  • Unter einem Lösemittel wird eine anorganische oder organische Flüssigkeit verstanden, welche feste oder flüssige Stoffe auf physikalischem Wege zur Lösung bringt. Voraussetzung für die Eignung als Lösemittel ist, dass sich beim Lösevorgang weder der lösende noch der gelöste Stoff chemisch verändern.
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das mindestens eine Lösemittel aus einer wässrigen Lösung oder einem Zweiphasensystem umfassend eine wässrige Lösung und mindestens ein organisches Lösemittel ausgewählt.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das mindestens eine organische Lösemittel aus langkettigen Alkanen, bevorzugt Hexan; langkettigen Alkanolen, bevorzugt 1-Hexanol,1-Octanol oder 1-Decanol; oder Ethern, bevorzugt Cyclopentylmethylether (CPME), Methyl-tert-butylether (MTBE) oder 2-Methyltetrahydrofuran (2-MTHF); ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen in einem Zweiphasensystem umfassend die Schritte
    1. a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Enzyms, eines Fusionsproteins und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle oder eines Organismus in einer wässrigen Lösung,
    2. b) Bereitstellen mindestens einer Carbonylverbindung in mindestens einem organischen Lösemittel, und
    3. c) Inkontaktbringen der wässrigen Lösung mit dem mindestens einen organischen Lösemittel und stereoselektive Reduktion der mindestens einen Carbonylverbindung durch Kontaktieren mit dem Enzym, dem Fusionsprotein und/oder der Zelle oder dem Organismus über die Phasengrenze zwischen wässriger Lösung und dem mindestens einen organischen Lösemittel.
  • Vorteilhaft erfolgt bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Zweiphasensystem die Lösung der schwer löslichen Carbonylverbindungen in dem mindestens einen organischen Lösemittel und die enzymatische Aktivität des Enzyms bleibt in der wässrigen Lösung erhalten.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt a) die Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Enzyms oder eines Fusionsproteins und ist das mindestens eine Lösemittel aus einem organischen Lösemittel ausgewählt, wobei das organische Lösemittel aus Alkoholen ausgewählt ist, bevorzugt aus Alkanolen, besonders bevorzugt 1-Decanol.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt c) bei einer Temperatur zwischen 0°C und 80°C durchgeführt, bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 5°C und 50°C, besonders bevorzugt bei 20°C bis 35°C.
  • In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt c) mindestens ein Co-Faktor zugesetzt. Unter Co-Faktoren werden Moleküle und Molekülgruppen verstanden, welche für die enzymatische Aktivität von Enzymen notwendig sind. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Co-Faktor ausgewählt aus NADH und NADPH, bevorzugt ist der Co-Faktor NADH. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Co-Faktor in Schritt c) umgesetzt.
  • In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Regeneration des Co-Faktors in Schritt c). In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Regeneration des Co-Faktors durch Zusatz eines NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzyms. NAD+- oder NADP+-abhängige Enzyme sind aus Alkoholdehydrogenasen (ADH), Formiatdehydrogenasen (FDH), Glucosedehydrogenasen (GDH), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen (G6PDH), Glutamatdehydrogenasen (GluDH), NAD+-abhängigen Hydrogenasen oder Phosphitdehydrogenasen (PtDH) ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das NAD+- oder NADP+-abhängige Enzym aus Formiatdehydrogenasen ausgewählt, besonders bevorzugt aus Candida boidinii (SEQ ID NO. 9). Vorteilhaft wird durch Zusatz eines NAD+- oder NADP+-abhängigen Enzyms kein Co-Faktor für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Regeneration des Co-Faktors durch Zusatz einer Formiatdehydrogenase, besonders bevorzugt aus Candida boidinii. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt in Schritt c) der Zusatz von Formiat (Methansäure), bevorzugt Kaliumformiat; in einer Konzentration von 0,2 mol/l bis 2 mol/l, bevorzugt 0,5 mol/l bis 1 mol/l.
  • Vorteilhaft werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Reduktion von 1-Phenyl-1,2-Propandion Umsatzraten von mindestens 5 mg pro Stunde in 1 ml Lösemittel, bevorzugt mindestens 10 mg pro Stunde in 1 ml Lösemittel, erreicht. Weiterhin vorteilhaft werden Ausbeuten bis zu 99% und Stereoselektivitäten bis zu 99%ee erreicht.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms, des Fusionsproteins oder der Zelle oder des Organismus zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen, bevorzugt Carbonylverbindungen der Formel (III)
    Figure DE102017210944A9_0003
    wobei X ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Aryl- oder heterozyklischen Resten,
    wobei Y ausgewählt ist aus unsubstituierten oder substituierten Alkyl, Aryl-, heterozyklischen Resten oder Carbonylresten,
    oder in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Für die Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
  • Ausführungsbeispiele
  • Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und zugehöriger Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen dabei die Erfindung beschreiben ohne diese zu beschränken.
  • Es zeigen die
    • 1 die Umsetzung einer Acetylbenzoylverbindung in einem rekombinanten E. coli-Stamm, welcher EDH oder PSEDH sowie eine Formiatdehydrogenase (FDH) co-exprimiert.
    • 2 die 1H-NMR-Daten des Produkts (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC, (R)-1-Hydroxy-1-phenyl-propan-2-on) nach der Reduktion von 1-Phenyl-1,2-propandion mittels der erfindungsgemäßen EDH.
    • 3 die 1H-NMR-Daten des Produkts (S)-Phenylacetylcarbinol ((S)-PAC, (S)-1-Hydroxy-1-phenyl-propan-2-on) nach der Reduktion von 1-Phenyl-1,2-propandion mittels der erfindungsgemäßen PSEDH.
  • Sequenzierung
  • Zur Sequenzierung wird die Sequenziertechnik MiSeq Sequenzierer (Illumina; 2x250 bp pairedend sequencing, v3 chemistry; 2.9 Mio reads) verwendet und die Assemblierung der Reads erfolgt über CLC Genomics software. Um die erhaltenen Contigs entsprechend der Genomreferenzen einzuordnen, wird die Software „mauve“ verwendet. Anschließend wird die erhaltene Reihenfolge manuell geprüft.
  • Expression der nativen Enzyme
  • Die Expression der nativen Peptidsequenzen der EDH und PSEDH erfolgt durch Klonierung der Nukleotidsequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 11 ohne Marker in einen pETDuet-Vektor.
  • Weiterhin wird die Nukleotidsequenz der Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii jeweils in die zweite hintere Multiple cloning site kloniert. Mittels der so erhaltenen Vektoren pETDuet_PSEDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH werden zwei E. coli-Stämme SHuffel T7 enthaltend die Vektoren pETDuet_PSEDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH generiert.
  • Expression von Enzymmutanten
  • Die Untersuchung von Enzymmutanten erfolgte an PSEDH. Dazu wurde am C-Terminus eine Mutation eingefügt, insbesondere die letzten 12 Aminosäuren deletiert. Die entstandene Mutante zeigte eine Restaktivität von 17% im Vergleich zum Wildtyp.
  • Generierung eines Fusionsproteins
  • Die Enzyme EDH und PSEDH werden in Form eines Fusionsproteins mit der Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii im rekombinanten Stamm E. coli SHuffleT7 exprimiert. Als Marker wird jeweils am N-Terminus sowie am C-Terminus ein Polyhistidin-tag eingefügt. Der N-terminale Marker besteht aus 6 Histidinresten gefolgt von einem Linkerpeptid „SSGHIDDDDKH“ und FDH. Der C-terminale Marker besteht aus 6 Histidinresten zwischen EDH bzw. PSEDH und FDH. EDH und PSEDH zeigten als Fusionsproteine enzymatische Aktivität.
  • Weiterhin wurde ein EDH-Fusionsprotein generiert, in dem der N-Terminus mit der zusätzlichen Aminosäuresequenz „MNGRl“ beginnt und ein rigider kurzer Peptidlinker „AAAKEAAAKAA“ eingefügt wurde. Dieses EDH-Fusionsprotein zeigte eine 30% höhere enzymatische Aktivität als der Wildtyp, war jedoch weniger löslich.
  • Reduktion der Carbonylverbindungen
  • Die zwei generierten E. coli-Stämme SHuffel T7 mit den Vektoren pETDuet_PSEDH_FDH oder pETDuet_EDH_FDH werden für Zweiphasen-Ganzzellbiotransformation eingesetzt.
  • Für die Zweiphasen-Ganzzellbiotransformation werden 20 mg lyophilisierte Zellen 30 min in 100 mM Kpi-Puffer (pH 7,5) inkubiert und gemischt bis eine homogene Suspension erhalten wird. Anschließend wird Kaliumformiat mit einer Endkonzentration von 0,5 M bis 1 M dazugeben. Zu einem Volumen der wässrigen Phase von 500 µl werden 500µl organisches Lösungsmittel (Cyclopentylmethylether (CPME) oder Hexanol) mit dem Substrat dazugeben. Die Substratkonzentration variiert nach der Enzymaktivität und der Löslichkeit des jeweiligen Substrats von 20 mM bis 600 mM, insbesondere 371,5 mM Acetylbenzoyl, 500 mM Methylbenzylformiat, 50 mM 1-Phenylglyoxal, 40 mM Isatin, 500 mM 1-Phenyl-1,3-butandion, 600 mM 1-Phenyl-1-propanon, 145 mM Desylbromid, 163 mM 4-Chlorobenzil, 20 mM 2,2'-Furil, 380 mM Benzil, 143 mM 2,2'-Dichlorobenzil, 324 mM 4,4'-Difluorobenzil und 335 mM 4,4'-Dimethylbenzil.
  • Nachweis der Reduktion der Carbonylverbindungen
  • Der Nachweis der Produkte erfolgt mittels 1H-NMR-Messung mit 400 MHz und als Lösemittel wurde deuteriertes Chloroform (CDCl3) verwendet). Die chirale Trennung der Substrate erfolgt im Knauer Smartline HPLC-System mit einer CHIRALPAK IA-Säule (250 x 4,6 mm Partikelgröße 5 µM) und mittels des Eluents n-Hexan:2-Isopropanol 9:1 mit einer Flussrate 0,8 ml/min und einer Temperatur von 25°C. Die Analyse wird bei einer Wellenlänge von 256 nm durchgeführt.
  • Die Chiralität der Produkte wird anhand der Drehwerte gemessen mittels Polarimeter (Perkin Elmer) bestimmt und mit Literaturwerten (Giovannini et al. 2016) verglichen. Tab. 1 Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Ephedrindehydrogenase (EDH) und/oder Pseudoephedrindehydrogenase (PSEDH) reduzierte Carbonylverbindungen, der Nachweis des Umsatzes, Ausbeute, Enantiomerenreinheit sowie Umsatzrate.
    Carbonylverbindung Reduktion mittels EDH oder PSEDH Nachweis Ausbeute (%) Enantiomerenreinheit (%ee) Umsatzrate (mg/h/ml)
    S R S R S R
    1-Phenyl-1,2-propandion (CAS No. 579-07-7) PSEDH und EDH NMR 99 99 99,9 99,9 5-10 4-8
    1-Phenyl-1-propanon (CAS No. 93-55-0) EDH HPLC 99 99,9
    Benzil (CAS No. 134-81-6) PSEDH und EDH HPLC 98,6 99,9
    4-Chlorobenzil (CAS No. 22711-23-5) EDH HPLC 99
    2,2'-Dichlorobenzil (CAS No. 21854-95-5) PSEDH und EDH HPLC 98 96,2
    4,4'-Difluorobenzil (CAS No. 579-39-5) PSEDH und EDH HPLC 98,4 99,7
    4,4'-Dimethylbenzil (CAS No. 3457-48-5) PSEDH und EDH HPLC 99 95,7
    1-Phenyl-1,3-butandion (CAS No. 93-91-4) PSEDH und EDH HPLC 99,2 96,4
    2,2'-Furil (CAS No. 492-94-4) PSEDH und EDH HPLC 99,4 96,6
    1-Phenylglyoxal (CAS No. 1074-12-0) PSEDH Abnahme der Eduktkonzentration
    2,2'-Pyridil (CAS No. 492-73-9) PSEDH und EDH Abnahme der Eduktkonzentration
    2,2'-Thenil (CAS No. 7333-07-5) PSEDH und EDH HPLC 97,1 -
    Methylbenzoylformiat (CAS No. 15206-55-0) PSEDH und EDH HPLC 99,5 96,6
    Isatin (CAS No. 91-56-5) PSEDH und EDH HPLC 99 -
    Indan-1,2-dion (CAS No. 16214-27-0) PSEDH und EDH HPLC 98,3 -
  • Zitierte Nichtpatentliteratur
    • C. Loderer, M. B. Ansorge-Schumacher (2015) Enzyme-catalysed regio- and enantioselective preparative scale synthesis of (S)-2-hydroxy alkanones. RSC Adv. 5, 38271-38276.
    • E. Toukoniitty, V. Nieminen, A. Taskinen, J. Paivarinta, M. Hotokka, DY. Murzin (2004) A combined experimental and theoretical study of 1-phenylpropane-1,2-dione hydrogenation over heterogeneous cinchonidine-modified Pt catalyst. J. Catal. 224(2), 326-339.
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    • W. G. Birolli, I. M. Ferrreira, E. D. Q. Jimenez, B. N. M. Silva, B. V. Silva, A. C. Pintoc and A. L. M. Porto (2017) First Asymmetric Reduction of Isatin by Marine-Derived Fungi. J. Braz. Chem. Soc. 28(6), 1023-1029.
    • K. L. Kavanagh, H. Jçrnvall, B. Persson, U. Oppermann U. (2008) The SDR superfamily: functional and structural diversity within a family of metabolic and regulatory enzymes. Cell. Mol. Life Sci. 65 (24), 3895-3906.
    • P. P. Giovannini, L. A. Lerin, M. Müller, G. Bernacchia, M. De Bastiani, M. Catani, G. Di Carmine, A. Massi (2016) (S)-Selectivity in Phenylacetyl Carbinol Synthesis Using the Wild-Type Enzyme Acetoin: Dichlorophenolindophenol Oxidoreductase from Bacillus licheniformis Advanced Synthesis and Catalysis 358 (17), 2767-2776.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    Shuffle T7 E.coli-Zelle
    2
    ADHP
    3
    ADHAP
    4
    FDH
    5
    NADH
    6
    NAD+
    7
    HCOO-
    8
    CO2
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • CN 101486998 A [0007]
    • WO 9004639 A1 [0009]
    • WO 2001044486 A1 [0009]
    • WO 9909195 A1 [0010]
    • DE 10142574 A1 [0010]
    • WO 2016/041535 A1 [0011]
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    • C. Loderer, M. B. Ansorge-Schumacher (2015) Enzyme-catalysed regio- and enantioselective preparative scale synthesis of (S)-2-hydroxy alkanones. RSC Adv. 5, 38271-38276 [0084]
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Claims (15)

  1. Enzym mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  2. Enzym mit einer Länge von 240 Aminosäuren bis 300 Aminosäuren umfassend eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  3. Enzym bestehend aus einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  4. Fusionsprotein umfassend eine der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2 oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Identität zu einer der Sequenzen SEQ ID NO. 1 oder 2.
  5. Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder Fusionsprotein nach Anspruch 4 zur Verwendung in einem Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen.
  6. Nukleotidsequenz umfassend eine Sequenz kodierend für ein Enzym nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 4.
  7. Nukleotidsequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz eine der Sequenzen SEQ ID NO. 10 oder SEQ ID NO. 11 umfasst.
  8. Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 6 oder 7.
  9. Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor weiterhin eine Nukleotidsequenz kodierend für ein NAD+- oder NADP+-abhängiges Enzym umfasst.
  10. Zelle oder Organismus enthaltend mindestens eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 6 oder 7 und/oder mindestens einen Vektor nach Anspruch 8 oder 9.
  11. Zelle oder Organismus nach Anspruch 10 ausgewählt aus E. coli, Corynebacterium glutamicum, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oder aus der Gattung Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Streptomyces oder Pseudomonas.
  12. Verfahren zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen umfassend die Schritte a) Bereitstellen eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Fusionsproteins nach Anspruch 4 und/oder einer Zelle oder eines Organismus nach Anspruch 10 oder 11, b) Bereitstellen mindestens einer Carbonylverbindung, und c) Stereoselektive Reduktion der mindestens einen Carbonylverbindung durch Kontaktieren mit dem Enzym, dem Fusionsprotein und/oder der Zelle oder dem Organismus in mindestens einem Lösemittel.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Carbonylverbindung ausgewählt ist aus symmetrischen oder unsymmetrischen, substituierten oder unsubstituierten Ketonen, α- oder β-Diketonen, α-Ketoestern, α-Aminoketonen, α-Hydroxyketonen oder α-Halogenketonen.
  14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) mindestens ein Co-Faktor zugesetzt wird.
  15. Verwendung eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Fusionsproteins nach Anspruch 4 oder einer Zelle oder eines Organismus nach Anspruch 10 oder 11 zur stereoselektiven Reduktion von Carbonylverbindungen oder in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14.
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EP18735275.2A EP3645500A1 (de) 2017-06-28 2018-06-28 Enzyme und verfahren zur stereoselektiven reduktion von carbonylverbindungen, oxidation sowie stereoselektiven reduktiven aminierung - zur enantioselektiven darstellung von alkoholaminverbindungen

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CN109824579B (zh) * 2019-03-11 2020-08-11 浙江工业大学 一种(s)-苯基(吡啶-2-基)甲醇衍生物的制备方法

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