DE10142574A1

DE10142574A1 - Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch ein enzymatisches verfahren in einem Zweiphasensystem

Info

Publication number: DE10142574A1
Application number: DE10142574A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Hauer; Michael Breuer; Peter Rogers; Vanessa Sandford; Bettina Rosche
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-09-01
Filing date: 2001-09-01
Publication date: 2003-03-20
Also published as: WO2003020942A2; JP2005501560A; US20040241816A1; US7074966B2; AU2002331097A1; EP1425405A2; WO2003020942A3

Abstract

Diese Anmeldung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetatcarbinol durch ein enzymatisches Verfahren in einem flüssigen Zweiphasensystem.

Description

Diese Anmeldung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch ein enzymatisches Verfahren in einem flüssigen Zweiphasensystem.
R-Phenylacetylcarbinol (R-PAC) ist eine Vorstufe für die chemische Synthese von Ephedrin und Pseudoephedrin. Ein Verfahren zur Herstellung von R-PAC durch Gärungshefe (Saccharomyces cerevisiae) in Gegenwart von Benzaldehyd und Melassen wurde bereits im vorigen Jahrhundert etabliert (Hildebrandt & Klavehn 1932, DE-PS 5 48 459).
Zudem ist seit einiger Zeit bekannt, dass es sich bei dem Katalysator, der für die Synthese von R-PAC in Mikroorganismen verantwortlich ist, um das Enzym Pyruvatdecarboxylase (PDC) handelt. Das Enzym setzt die stereoselektive Carboligation einer aus Brenztraubensäure stammenden C₂-Einheit oder und Benzaldehyd um. Der Katalysator führt auch die Carboligation einer Reihe weiterer Carbonylverbindungen durch. Mit bestimmten Enzymen, z. B. aus Zymomonas mobilis, kann auch Acetaldehyd anstelle von Brenztraubensäure als Substrat für das Verfahren eingesetzt werden.
Pyruvatdecarboxylase (PDC) wurde in verschiedenen andere Organismen neben Saccharomyces cerevisiae und Zymomonas mobilis identifiziert und charakterisiert. Die enzymatische Synthese von R-Phenylacetylcarbinol durch PDC ist bisher nur in einem wässrigen Einphasensystem beschrieben. Es gibt keine Informationen darüber, dass Pyruvatdecarboxylase auch in einem organischen Lösungsmittel oder in einer Emulsion aus organischen Lösungsmitteln und Wasser wirksam ist.
In WO 96/37620 ist ein Verfahren zur Herstellung von Acyloinen, insbesondere R-Phenylacetylcarbinolen, aus Benzaldehyd und Acetaldehyd oder Pyruvat in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis offenbart.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Biotransformation von Benzaldehyd und Pyruvat mit Pyruvatdecarboxylase (PDC) in einem flüssigen Zweiphasensystem, das heißt, dass die Umsetzung in zwei flüssigen Phasen stattfindet, die miteinander nicht mischbar sind. Eine der flüssigen Phasen ist eine wässrige Phase, die zweite flüssige Phase ist eine Phase, die mit der wässrigen Phase nicht mischbar ist und die nicht einer der Reaktanten ist.
Die zweite flüssige Phase kann weit variiert werden. Geeignet für die zweite Phase sind Alkane, Alkanole, Ether. Ebenfalls geeignet sind hydrophile polymere Verbindungen, wie Polyethylenglycole, die eine zweite flüssige Phase bilden, wenn sie mit einer wässrigen Phase in Kontakt kommen.
Bevorzugte Ausführungsformen für die zweite Phase sind Alkanole, insbesondere die Alkanole von C₄ bis C₁₀, d. h. Butanol, Pentanol, Hexanol, Heptanol, Octanol, Nonanol, Decanol oder Gemische dieser Alkohole. Darunter sind die n-Alkanole bevorzugt. Besonders bevorzugt sind n-Octanol und n-Nonanol.
In Abhängigkeit vom Rühren/Mischen des Reaktionsmediums wurde zwei verschiedene Zweiphasensysteme untersucht: der Zwei-getrennte-Phasen-Modus betrifft ein Zweiphasensystem, bei dem beide Phasen als zwei getrennte Phasen gerührt werden. Diese erfindungsgemäße Ausführungsform wird als "Zwei-getrennte-Phasen-Modus" bezeichnet.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist der "Zwei-gemischte-Phasen-Modus". Durch starkes Mischen der zwei Phasen, insbesondere durch starkes Rühren oder Schütteln, liegen die beiden Phasen nicht mehr als getrennte Phasen vor, sondern bilden eine Emulsion. Diese Ausführungsform wird als "Zwei-gemischte-Phasen- Modus" bezeichnet.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Phenylacetylcarbinolen der allgemeinen Formel (I),
wobei R für H, F, Cl oder B steht,

aus Acetaldehyd und Benzaldehyden der allgemeinen Formel (II)

in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem flüssigen Zweiphasensystem mit mindestens einer wässrigen Phase stattfindet.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen sind in den Ansprüchen und Beispielen offenbart.

Beispiel 1

Auswahl der organischen Phase

Die PDC-Aktivität wurde in verschiedenen organischen Lösungsmitteln gemessen.
Mehrere organische Lösungsmittel, einschließlich Benzaldehyd, wurden für Experimente zur biologischen Verträglichkeit ausgewählt. Es wurden 1,5 ml organisches Lösungsmittel 30 Sekunden lang mit 750 µl Reaktionspuffer (200 mM Citrat, 20 mM MgSO₄, 2 mM TPP, pH 7 bei 25°C) gründlich gemischt. Nach Auftreten der Phasentrennung wurden 750 µl doppelt konzentriertes Enzym im gleichen Puffer in die untere, wässrige Phase injiziert. Das endgültige Verhältnis von organischer Phase zu wässriger Phase beträgt 1 : 1, wobei jede 1,5 ml ausmacht. Die ungefähre Fläche der Grenzfläche ist 1,8 cm². Die untere, wässrige Schicht wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt, wodurch sichergestellt wurde, dass die Phasentrennung erhalten blieb. Die Anfangs-Decarboxylaseaktivität betrug 13 U/ml bei einer Proteinkonzentration von 2 mg/ml. In der Fig. 1 sind die verbleibende Decarboxylierungsaktivität und Proteinkonzentrationen für jedes getestete Lösungsmittel gezeigt. Octanol und Nonanol waren mit dem Enzym verträglicher als die anderen Lösungsmittel. Ein Octanol ausgesetztes Enzym behielt 70% seiner Decarboxylaseaktivität, während ein Nonanol ausgesetztes Enzym 50% seiner Aktivität behielt. Von Interesse ist die Beobachtung, dass die bei Raumtemperatur gerührte Kontrolle, die keinem Lösungsmittel ausgesetzt wurde, schneller inaktiviert wurde als das Enzym in Gegenwart von Octanol und Nonanol. Diese zwei Lösungsmittel könnten vorhandene Proteasen inaktivieren oder eine stabilisierende Wirkung auf das Enzym besitzen.
Aufgrund von Problemen bei der Trennung von PAC und Nonanol mittels Gaschromatographie wurde Octanol für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Die berechnete Carboligaseaktivität betrug 7,4 U/ml. Nach 96 Stunden wurden die verbleibende Decarboxylierungsaktivität und das Protein gemessen.
Die Ergebnisse des Beispiels 1 sind in Fig. 1 gezeigt.
Fig. 1 Wirkung verschiedener Lösungsmittel auf die Decarboxylierungsaktivität und die Proteinkonzentration nach 96stündiger Inkubation bei Raumtemperatur.

Beispiel 2

Herstellung von PAC mit variierender Enzymaktivität

Die Veränderung der Enzymkonzentration im Zwei-getrennte-Phasen- Modus wird direkt unter den gleichen Bedingungen mit dem vollkommen gerührten Zweiphasensystem (Zwei-gerührte-Phasen-Modus) verglichen.
In einem Volumen-zu-Oberfläche-Verhältnis von 2,3 cm wurden 1,08 ml 1,5 M Benzaldehyd in Octanol mit 1,08 ml MOPS-Puffer (2,5 M MOPS, 1 mM TPP, 1 mM Mg²⁺, pH 6,5 bei 4°C), der verschiedene Mengen Pyruvatdecarboxylase von Candida utilis und 1,4 M Pyruvat enthielt, gemischt. Die Umsetzungen wurden langsam gerührt, wobei die Phasentrennung bei 4°C aufrechterhalten wurde. Die Umsetzung wurde beendet, wenn das gesamte Pyruvat verbraucht worden war. Die nach 395 Stunden Durchführung erreichten PAC-Spiegel sind in Fig. 2 gezeigt.
Fig. 2 Herstellung von PAC als Funktion der Enzymaktivität über 395 Std. bei 4°C.
Die Herstellung von PAC besitzt ein Maximum bei 3,8 U/ml Enzym, wobei 167,3 g/l in der oberen Phase und 27,8 g/l in der unteren Phase erzielt werden. Dies entspricht 880 g PAC/g PDC, bezogen auf eine angenommene spezifische Aktivität von 17 U/mg Protein für gereinigte PDC. Die Ausbeute von PAC, bezogen auf Benzaldehyd, betrug 98%, und die Ausbeute von PAC, bezogen auf Pyruvat, beträgt 92,9%. Die Ausbeuten sind höher als die im vollkommen gerührten System erzielten. Geringere Pyruvat- und Benzaldehydverluste verglichen mit der vollkommen gerührten Durchführung wurden in der Kontrolle festgestellt, die kein Enzym enthielt. Geringere Verluste an Substraten können zu verbesserten Ausbeuten führen, da diese Verluste in die Berechnung der Ausbeute eingehen.
Der endgültige pH-Wert stieg in allen Gefäßen auf 8, was signifikant zur Enzyminaktivierung beiträgt. Die pH-Wert-Erhöhung könnte zusammen mit der Substratlimitierung durch Maßstabsvergrößerung des Verfahrens behoben werden, wodurch eine pH-Wert-Kontrolle und Substratzufuhr ermöglicht wird.
Die Tabelle 1 zeigt, dass die spezifische Herstellung von PAC pro Menge des Enzyms auf 2388 g PAC/g PDC gesteigert wurde, wobei eine Aktivität von 0,9 U/ml vorlag. Bei diesem Enzymspiegel werden 112 g/l PAC in der oberen Phase und 15,6 g/l in der unteren Phase hergestellt. Tabelle 1
Tabelle 1 Endproduktkonzentrationen, Ausbeuten und Substratspiegel der Biotransformation bei Variation der Fig. 3 zeigt einen Vergleich der spezifischen PAC-Produktion für die vollkommen gerührte Durchführung und die phasengetrennte Durchführung. Die Menge Produkt pro Menge Enzym ist bei der phasengetrennten Durchführung signifikant erhöht.
Bei diesem niedrigen Enzymspiegel sind die Produktausbeuten, bezogen auf Benzaldehyd, hoch, jedoch die Produktausbeuten, bezogen auf Pyruvat, mit 60,8% niedrig. Es könnte ein Verlust an Pyruvat aufgrund von Dimerisierung wegen der langsamen Reaktionsgeschwindigkeit und der dadurch langsamen Pyruvatnutzung bei diesem Enzymspiegel aufgetreten sein. Das nicht verbrauchte Pyruvat könnte dem Abbau unterliegen.
Fig. 3 Vergleich der pro Menge Enzym hergestellten Menge PAC für die phasengetrennte und die vollkommen gerührte Durchführung. Beide System begannen mit 1,5 M Benzaldehyd und 1,4 M Pyruvat und wurden bei 4°C inkubiert. Die Reaktionsdauer betrug 395 Std. für die phasengetrennte Durchführung und 40 Std. für die vollkommen gerührte Durchführung.

Beispiel 3

Im vollkommen gerührten Zweiphasensystem hergestelltes Acetoin

Die Abtrennung von Acetoin von PAC ist für die chemische Synthese von Ephedrin erforderlich. Acetoin hat während der reduktiven Aminierung von R-Phenylacetylcarbinol einen negativen Einfluss. Daher ist die Minimierung der Acetoinproduktion und eine anschließende Extraktion von Acetoin in die wässrige Phase weg von R-PAC von Nutzen.
Die Acetoinspiegel wurden im Zwei-gerührte-Phasen-Modus in der oberen Octanolphase und der unteren wässrigen Phase gemessen. Die Ergebnisse sind in Tab. 2 dargestellt. Verglichen mit der in Tab. 1 gezeigten, phasengetrennten Durchführung werden mit diesem Durchführungsmodus sehr niedrige Acetoinspiegel hergestellt. Der Grund dafür könnte die schnelle Extraktion von Acetaldehyd in die obere Phase bei vollkommenem Rühren sein, wodurch PDC an der Katalyse der Acetoinbildung gehindert wird. Tabelle 2
Fig. 4 Herstellungsleistung von R-Phenylacetylcarbinol in verschiedenen Systemen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Phenylacetylcarbinolen der allgemeinen Formel (I)

aus Acetaldehyd und Benzaldehyden der allgemeinen Formel (II)

in Gegenwart einer Pyruvatdecarboxylase, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem flüssigen Zweiphasensystem mit mindestens einer wässrigen Phase stattfindet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine flüssige Phase eine wässrige Phase ist und die andere flüssige Phase eine organische Phase ist, die mit der wässrigen Phase nicht mischbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die organische Phase Octanol ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei flüssigen Phasen derart mechanisch gerührt werden, dass aus den beiden Phasen eine Emulsion gebildet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pyruvatcarboxylase von Zymomonas-Pyruvatdecarboxylase stammt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Benzaldehyd (II) R = H ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Acetaldehyd während der Umsetzung gemessen wird, so dass die Konzentration von Acetaldehyd zwischen 20 und 50 mMol/l in der wässrigen Phase beträgt.