DE19523269C2

DE19523269C2 - Verfahren zur Gewinnung von Acyloinen, dafür geeignete Pyruvat-decarboxylase sowie deren Herstellung und DNA-Sequenz des für diese kodierenden PDC-Gens

Info

Publication number: DE19523269C2
Application number: DE19523269A
Authority: DE
Inventors: Heike Bruhn; Martina Pohl; Kathrin Mesch; Maria-Regina Kula
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2015-06-30
Also published as: CZ287619B6; CN1192244A; EP0828841A2; KR19990021965A; IN189539B; BR9608798A; WO1996037620A3; JPH11505710A; US6004789A; AU714414B2; DE19523269A1; CA2222493A1; AU5810296A; IN186507B; CZ369197A3; WO1996037620A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewin nung von Acyloinen durch enzymatische Umwandlung von α- Ketocarbonsäuren und/oder Aldehyden in Gegenwart von Pyruvat-decarboxylase (PDC) und sie umfaßt eine da für geeignete PDC sowie deren Herstellung und das für diese kodierende Gen.

Acyloine bzw. α-Hydroxyketone sind Verbindungen mit ei nem optisch aktiven C-Atom, die in der Synthese von komplexeren Verbindungen eine erhebliche Rolle spielen, wie insbesondere das (R)-(-)-Phenylacetylcarbinol (PAC), das für die Produktion von Ephedrin wirtschaft lich von großem Interessse ist. Hier interessiert das R-Enantiomere, das durch fermentative Umwandlung von Pyruvat in Gegenwart von Benzaldehyd mittels Saccha romyces cerevisiae gebildet wird (DE-PS 548 459 von 1932).

Bei dieser Synthese von PAC mittels Hefezellen werden auf Grund der Mehrzahl von in der Hefe vorhandenen En zymen zahlreiche Nebenprodukte gebildet, und das Zell wachstum wird durch die Anwesenheit von Benzaldehyd in hibiert.

Auch die aus der Hefe isolierte Pyruvat-decarboxylase (PDC) führt bei dieser Umsetzung zu erheblichen Antei len des zu PAC isomeren 2-Hydroxypropiophenons.

Die thiamindiphosphat- und Mg²⁺-abhängige PDC (E. C. 4.1.1.1) ist weit verbreitet und wird in vielen Pflan zen, Hefen und Pilzen und in einigen Bakterien gefun den. Sie katalysiert die nicht-oxidative Decarboxylie rung von Pyruvat zu Acetaldehyd und als Nebenreaktion erfolgt eine Acyloinkondensation unter Bildung von α- Hydroxyketonen, wie aus Fig. 1 ersichtlich ist.

Eine solche enzymatische Umsetzung erfolgt auch ausge hend von einem Aldehyd an Stelle von α-Ketocarbon säuren, und an der Kondensationsreaktion kann auch der durch die Decarbooxylierung gebildete Aldehyd als "Co substrat" unter Bildung von Homoacyloinen R-CHOH-CO-R' mit R = R' teilnehmen.

Isoliert wurde auch bereits die PDC aus Zymomonas mobi lis. Ein Vergleich einer aus Hefe isolierten PDC mit PDC aus Zymomonas mobilis bzgl. der Bildung von PAC un ter vergleichbaren Bedingungen zeigte jedoch eine deut lich geringere Synthesekapazität der PDC aus Zymomonas mobilis (S. Bringer-Meyer u. H. Sahm, Biocatalysis 1 (1988) S. 321-331).

Der Artikel "Reversible dissociation and unfolding of pyruvat decarboxylase from Zymomonas mobilis" aus Eur. J. Biochem., Sep. 1, 1994, 224, S. 651-661, beschäftigt sich mit den chemischen Eigenschaften und der Stabili tät der Pyruvat Decarboxylase.

In FEBS letters, vol. 296, 1992, S. 95-98, wird über Versuche berichtet, die auf einem Austausch eines Tryp tophanrestes in Position 487 basieren, bei denen der Einfluß auf die Cofaktorbindung untersucht wird.

In der Veröffentlichung Biochem. J., May 15, 1994, 300, S. 7-19, mit dem Titel "Investigation of the cofactor binding site of Zymomonas mobilis pyruvat decarboxylase by site-directed mutagenesis" wird ebenfalls über die Veränderung der Bindung des Cofaktors durch Aminosäu reaustausch in der Bindungsregion berichtet.

Der Artikel "Application of hydrolytic and decarboxyla ting enzyms in biotransformations", Biocatalysis, vol. 9, 1999, site 1-30, zeigt eine Übersicht von Reaktionen natürlicher Decarboxylasen (von Hefe oder Zymomonas) ohne Mutationen.

Es wurde nun überraschend festgestellt, daß durch ge zielte gentechnologische Abwandlung des PDC-Gens von Z. mobilis eine PDC mit verbesserter Synthesekapazität bzgl. der Bildung von PAC erhalten werden kann, die sich zudem durch eine hohe Selektivität zur Bildung von PAC im Vergleich zu 2-Hydroxypropiophenon auszeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man als PDC ein Enzym verwendet, bei dem der Tryptophanrest im zum aktiven Zentrum hinführenden Substratkanal durch einen sterisch kleineren Aminosäurerest ersetzt ist.

Bei einem sterisch kleineren Aminosäurerest handelt es sich insbesondere um eine einfache, insbesondere ali phatische Aminosäure, wie speziell Alanin, Glycin, Phe nylalanin, Leucin, Isoleucin, Arginin oder Histidin oder auch Serin und Threonin.

Man erhält die gentechnologisch abgewandelte neue PDC durch Austausch des für Tryptophan an der Stelle 392 kodierenden Kodons TGG in der Position 1174-1176 der DNA-Sequenz des PDC-Gens aus Z. mobilis in an sich be kannter Weise und Expression der PDC in einem Produzen ten-Organismus, wie insbesondere E. coli, aus dem die PDC isoliert wird. Die gezielte Mutation erfolgt z. B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwen dung der auf Seite 9 angegebenen Primer. Die Konstruk tion des Expressionsvektors pBTac2 für die mutierte PDC wurde ausgehend vom E. coli-Expressionsvektor pPDC des Wildtypenzyms durchgeführt.

Die Gewinnung der mutierten PDC erfolgt nach Ernte und Aufschluß der Zellen aus dem Rohextrakt in an sich be kannter Weise durch chromatographische Methoden.

Durch die erfindungsgemäße Abwandlung der PDC wird ihre PAC-Synthesekapazität um den Faktor 4 verbessert. Diese Verbesserung resultiert aus der gezielten Abschwächung bzw. Beseitigung der Zugangslimitierung im zum aktiven Zentrum des Enzyms hinführenden Substratkanal, wodurch der Zugang voluminöser Sustratmoleküle zum aktiven Zen trum und der Abgang des gebildeten Produkts erleichtert wird.

Die gemäß der den Ausgangspunkt der Erfindung bildenden Zielsetzung so erhaltene PDC ist für die PAC-Synthese von erheblichem Interesse, da mit ihr eine hohe opti sche Reinheit des R-(-)-Isomeren (<< 98%) und ein PAC erhalten werden kann, das nur zu wenigen Prozenten (2-3%) von 2-Hydroxy-propiophenon begleitet wird. Die Gewinnung und Isolierung des Enzyms aus dem geernteten Mikroorganismus ist auf relativ einfache Weise (im Ver gleich zur Hefe) möglich.

Bei der enzymatischen Acyloinkondensation mittels PDC können als Substrat lineare und/oder verzweigte α- Ketocarbonsäuren und als Substrat und/oder Cosubstrat aromatische, cyclische, längerkettige und/oder ver zweigte Aldehyde eingesetzt werden. Als Beispiel können hier Benzaldehyd, Cyclohexanaldehyd, Furfurol, Zimtal dehyd, Krotonaldehyd, Pyruvat, 2-Ketobuttersäure, 2-Ketopentansäure, 2-Keto-4-methyllhexansäure, 2-Keto-4-methylpentansäure, 2 Keto-4,4-dimethylhexan säure, 3-Phenyl-2-keto-propansäure genannt werden.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsdetails. Dabei wird Bezug genommen auf die angefügten Zeichnungen; es sind im einzelnen:

Fig. 1: Das Reaktionsschema der PDC für das Beispiel Pyruvat und Benzaldehyd als Substrat und Co substrat mit dem Hauptweg der Decarboxylie rung und der Carboligase-Nebenreaktion mit der Bildung von PAC;

Fig. 2: Ein Konstruktionsschema für die Bildung des die PDC aus Z. mobilis enthaltenden Expressi onsvektors pPDC und

Fig. 3: Ein Schema für eine durch Abfangen von Ace taldehyd mittels Alkoholdehydrogenase opti mierte Produktion von PAC gemäß Fig. 1.

Beispiel 1. Herstellung des PDC-Mutante PDC-W392A 1.1 Konstruktion des Expressionsvektors pPDC

Für die Expression der PDC aus Zymomonas mobilis wurde der Vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim) gewählt. Die Transkription des Fremdgens steht unter der Kontrolle des starken tac-Promotors, einem Hybrid aus trp- und lacUV-Promotor mit der 11-fachen bzw. 3-fachen Effizi enz der parentalen Promotoren. Die Operatorsequenz und Ribosomenbindungsregion entstammen dem lacZ-Gen. Die Regulation der Transkription erfolgt somit durch den lac-Repressor eines überexpremierenden (laciQ) Bak teerienstammes und ist durch Isopropyl-β-D-thiogalac tosid (IPTG) induzierbar. Der Vektor enthält eine ein zelne Erkennungssequenz der Restriktionssendonuklease EcoRl, gefolgt von dem Initiationskodon ATG und an schließend weiteren Restriktionserkennungssequenzen (sites), so daß dieser Vektor universell zur Expression sowohl für Gensequenzen mit als auch ohne eigenem Initiationskodon eingesetzt werden kann.

Der multiplen Klonierungsstelle folgen die starken ri bosomalen RNA Transkriptionsterminatoren rrnB, um den kontrollierten Abbruch der Transkription zu gewährlei sten. Als Ausgangsmaterial zur Klonierung des PDC-Gens aus Zymomonas mobilis (ATCC 29191) stand der Vektor pZY134B (G. Sprenger, Inst f. Biotechnologie 2, KFA- Jülich) zur Verfügung. Dieses Plasmid beinhaltet ein 3.2 kb großes DNA-Fragment aus Zymomonas mobilis mit dem vollständigen PDC-Gen inklusive nichtkodierender Regionen (Fig. 2). Um eine Ligation der kodierenden Se quenz in den Expressionsvektor zu ermöglichen, war es erforderlich, in 5'-Richtung des Initiationskodons eine neue Restriktionserkennungssequenz einzuführen. Den op timalen Abstand des Initiationskodons von der Shine- Dalgarno-Sequenz des Vektors gewährleistet die Ligation des Gens in die EcoRI-site des pBTac2-Vektors. Eine elegante und einfache Methode, eine DNA-Sequenz zu mo difizieren, bietet die Polymerase, Kettenrektion (PCR). Wiederholte Zyklen von Hitzedenaturierung des DNA- Doppelstrangs und enzymatische Synthese durch eine thermostabile DNA-Polymerase ermöglichen die exponenti elle Amplifizierung definierter DNA-Fragmente. Die Grö ße und Identität der Produkte wird durch die Startpunk te (Primer) der Synthese bedingt. Enthalten die Primer eine Modifikation der ursprünglichen Sequenz, etwa Mu tationen, Deletionen oder auch zusätzliche Basen (In sertionen), werden diese folglich auch im synthetischen Fragment vorhanden sein.

Mit dieser Methode wurde die benötigte EcoRI-Restrik tionssite in 5'-Richtung des Initiationskodons des PDC- Gens eingeführt, indem während der Oligonukleotidsyn these am 5'-Ende des zum Gen komplementären Primers die Erkennungssequenz des Enzyms angeschlossen wurde. Da einige Endonukleasen eine stark verminderte Aktivität für die Restriktion endständiger Sequenzen zeigen, wur den vier weitere Basen stromaufwärts an die ECoRI-site angefügt.

Die zur PCR meist verwendete Taq-Polymerase besitzt keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität (proof-reading). Die von ihr synthetisierte Sequenz ist folglich mit einer statistischen Fehlerrate behaftet. Auch wenn diese durch die Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen mit 1/100.000 sehr gering gehalten werden kann, bedingt dies die Notwendigkeit der Sequenzierung eines jeden Fragments, um die Integrität der Synthese sicherzustel len. Daher wurde nicht die gesamte kodierende Region des PDC-Gens (1712 bp), sondern ein kleineres Fragment (890 bp) vom 5'-Terminus bis zu einer einzelnen Re striktionssite (EcoRV) zur Amplifikation gewählt (Fig. 2).

Das PCR-Produkt wurde mit den entsprechenden Restrikti onsendonukleasen EcoRI und EcoRV verdaut.

Der fehlende zweite Teil des PDC-Gens wurde durch Re striktion mit ECoRV und BamHI aus dem Plasmid pZY134B gewonnen, wobei das so entstehende Fragment (1.2 kb) am 3'-Ende noch ca 350 bp nicht-translatierte Sequenz des PDC-Gens enthält. Beide Fragmente wurden durch präpara tive Agarosegelektrophorese separiert, isoliert und in den EcoRI und BamHI linearisierten, isolierten pBTac2 (4.6 kb) ligiert. Die Klonierung erfolgte in E. coli JM 109, einem den lac-Repressor überexpremierenden Stamm.

1.2 Molekularbiologische Arbeiten

Für die Gewinnung einer durch Tryptophan/Alanin- Austausch mutierten PDC an der Position 392 wurde zu nächst das beim Wildtyp-Enzym vorhandene Kodon TGG (Tryptophan) gegen GCG (Alanin) ausgetauscht (Austausch der Position 1174-1176 des Gens der Pyruvat decarboxylase aus Zymomonas mobilis). Die Einführung der gezielten Mutation erfolgte mit Hilfe der von Ho et al. beschriebenen Polymerasekettenrektion gestützten Methode (S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene 77 (1989) S. 51).

Als Ausgangspunkt stand das PDC-Gen aus Z. mobilis im E. coli-Expressionsvektor pPDC zur Verfügung (s. Fig. 2). Die DNA-Isolierung erfolgte nach Standardme thoden (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Mole cular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).

Als Templat zur Synthese der beiden überlappenden Ein zelfragmente diente das Plasmid pPDC. Die Primer (Pri mersequenzen gemäß Anhang) wurden mit einer Konzentra tion von 0.2-0.4 nM eingesetzt. Die Reaktion wurde mit Taq-Polymerase (Biomasters, Köln) im von Hersteller an gegebenen Reaktionspuffer, zuzüglich 1.5 mM MgCl₂ und je 0.2 mM der Nukleotide im "Robo-Cycler"(Stratgene) mit folgendem Temperaturprogramm durchgeführt: 2.5 Mi nuten 94°C zur Denaturierung, anschließend 30 Zyklen mit einer 1.5-minütigen Denaturierung bei 94°C, 1.2 Mi nuten Annealing bei 48°C und 2 Minuten Extension bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C zur Vervollstän digung der Reaktion. Die Annealing-Temperatur variierte zwischen 48°C und 56°C, je nach theoretischem Schmelz punkt der verwendeten Primer. Der Schmelzpunkt der Oli gonukleotide wurde anhand folgender Formel berechnet:

Tm = 2 . (A + T) + 3 . (C + G)

Die Fragmente wurden elektrophoretisch separiert, iso liert, zur Konzentrierung mit Ethanol präzipitiert und in Tris-HCl-Puffer, 10 mM, pH 7.4, wieder aufgenommen.

In der zweiten kombinierten PCR wurden je ca. 50-100 ng der überlappenden Fragmente als Template eingesetzt. Die weiteren Reaktionsbedingungen waren identisch zu ersten Reaktion. Die Wahl der Annealingtemperatur rich tete sich nach der Schmelztemperatur der resultierenden Überlappungsregion der Fragmente. Die weiteren Manipu lationen (Restriktion, Isolierung, Ligation) zum Ersatz der Wildtyp-DNA im Expressionsvektor pPDC durch die mu tierten Fragmente erfolgten nach Standardmethoden (J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).

Sequenzen der verwendeten Primer

Die Numerierung bezieht sich auf das 1. (5')-Nukleotid der PDC-Sequenz
s = sense, as = anti-sense

Die mutierten Basen sind unterstrichen.

Primer zur Synthese des 5'-Einzelfragmentes

Primer zur Synthese des 3'-Einzelfragmentes

Primer zur Synthese des Fusionsfragmentes

1.2 Expression und Reinigung

Durch Expression der modifizierten DNA in E. coli- Zellen wurde ein erfindungsgemäßes Enzym (PDC-W392A) erhalten. Das mutierte Enzym (Mutante) PDC-W392A wurde gemäß folgender Prozedur exprimiert und aus dem Zellex trakt aufgereinigt:

Die das Expressionsplasmid für die Mutante PDC-W392A tragenden E. coli-Zellen wurden in LB-Medium inklusive 100 µg/ml Ampicillin zur Selektion fermentiert. Das Me dium wurde mit Vorkulturen in der stationären Wachs tumsphase im Verhältnis 1 : 50 angeimpft und bei 37°C und 220 rpm inkubiert.

Die Induktion der Expression erfolgte bei einer OD600 von 0.6 durch Zugabe von 1 mM IPTG. Die PDC-Mutante wurde unter diesen Bedingungen mit 20% des löslichen Proteins in E. coli überexpremiert.

Zur Produktion ausreichender Enzymmengen wurde die Ex pression wie oben beschrieben im 8-Liter-Fermenter durchgeführt. Es wurde ein ph-Wert von 7.0 sowie ein Luftstrom von 10 l/h eingestellt. Die Rührgeschwindig keit betrug 200 rpm. Zur Vermeidung überschüssiger Schaumbildung wurde nach Bedarf Polypropylenglycol zu gesetzt. Die Zellen wurden nach 3-stündiger Expression durch gekühlte kontinuierliche Zentrifugation geerntet.

Der Aufschluß erfolgte durch Vermahlen mit Glasperlen. Hierzu wurde eine 30%ige Zellsuspension in Mes/KOH- Puffer, 50 mM, pH 6.5, inklusive 5 mM MgCl₂ und 0,1 mM ThDP hergestellt und mit einem doppelten Volumen an Glasperlen (d = 0,3 mm) versetzt. Abhängig vom zu bear beitenden Volumen wurde der Aufschluß in Eppendorfgefä ßen in einer Retsch-Mühle oder eisgekühlt im Disinte grator S (Maximalvolumen 80 ml) durchgeführt. Die Ver mahlung erfolgte über 10 Minuten mit maximaler Lei stung. Die Suspension wurde zentrifugiert, die Glasper len mit Puffer gewaschen und die vereinigten Zentrifu gate filtriert (1 µm). Die Aufreinigung der PDC-Mutanten erfolgte säulenchromatographisch wie folgt:

1. Anionenaustauschchromatographie

Der Rohextrakt (ca. 110 ml, ca. 1.0-1.5 g Protein) wur de auf eine Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (2.6 . 9.5 cm) mit einer Flußrate von 5 ml/min unter Verwendung einer FPLC-Anlage der Fa. Pharmacia. Das En zym eluierte durch Anlegen eines linearen NaCl- Gradienten (von 0-200 mM) in 10 mM Mes/KOH, pH 6.5, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM ThDP, bei 100 mM NaCl. Die das Ziel protein enthaltenden Fraktionen wurden durch Aktivi tätstest (s. unten) identifiziert.

2. Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)

Die vereinigten Fraktionen wurden auf einen Ammonium sulfatgehalt von 50%-Sättigung durch Zugabe eines Vo lums gesättigter Ammoniumsulfatlösung eingestellt. Die hydrophobe Interaktionschromatographie wurde an Buthyl sepharose (Pharmacia) (Säule 5 . 8 cm) mit einer Fluß rate von 2 ml/ min durchgeführt. Das Material wurde vor dem Beladen mit 40% Ammoniumsulfat in 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM ThDP äqulibriert. Das Enzym eluierte im selben buffer mit einem fallenden Ammoniumsulfatgra dienten (40-0%) bei 24%. Die Zielfraktionen wurden wie derum mittels Aktivitätstest identifiziert und verei nigt (ca. 160 ml).

3. Entsalzung über Sephadex G25 und Umpuffern auf 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM ThDP. Die Flußrate betrug 20 ml/min. Anschließend wurde lyophilisiert. 1.3 Aktivitätstest (Decarboxylierungsreaktion)

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde im ge koppelten enzymatischen Test durchgeführt, wobei photo metrisch die NADH-Oxidation durch das Hilfsenzym Alko hol-dehydrogenase aus Hefe (E. C. 1.1.1.1) verfolgt wird. Der Reaktionsansatz enthielt 16.9 mM Pyruvat, 0.18 mM NADH und 10 U ADH in 50 mM Mes/KOH, pH 6.5, 20 mM MgSO₄, 1.5 mM ThDP. Eine Enzymeinheit PDC (1 U) entspricht der Enzymmenge, die die Umsetzung von 1 µmol Substrat in einer Minute bei 30°C katalysiert. Die En zymaktivität berechnet sich nach:

ε (NADH) = 6.3 l.mMol^-1.cm^-1
V = Gesamtvolumen
v = Probenvolumen
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
ΔE/min = Extinktionsabnahme pro Minute
f = Verdünnungsfaktor der Probe

2. Einsatz von PDC-W392 A zur PAC-Synthese

Die Gewinnung chiraler Acyloine kann ausgehend von ei ner α-Ketocarbonsäure bzw. einem Aldehyd als Substrat und einem weiteren Aldehyd als Cosubstrat mittels PDC oder PDC-Mutanten erfolgen.

Beispielhaft seien die folgenden Anwendungen genannt:

PAC-Synthese ausgehend von Pyruvat und Benzaldehyd

Der Syntheseansatz enthielt 40 mM Pyruvat, 70 mM Ben zaldehyd und 10 U/ml PDC-W392A in Mes/KOH-Puffer, 50 mM, pH 6.5, 20 mM MgSO₄, 1.5 mM ThDP. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 37°C durchgeführt und das ent standene PAC (6.2 mM) mittels HPLC detektiert.

PAC-Synthese ausgehend von Acetaldehyd und Benzaldehyd

PAC-Syntheseansatz enthielt anstelle von Pyruvat 40 mM Acetaldehyd. Ansonsten wurde wie oben beschrieben ver fahren. Nach einer Stunde waren 3.7 mM PAC entstanden.

PAC-Synthese mit PDC-W392A im gekoppelten 3-Enzymsystem

Die enzymatische Umsetzung erfolgte gemäß Fig. 3. Der Einsatz der Alkohol-dehydrogenase (ADH) aus Hefe (E. C. 1.1.1.1) ermöglicht die kontinuierliche Entfernung von Acetaldehyd und die dadurch bedingte Inaktivierung der PDC-W392A. Die Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida boidinii (E. C. 1.2.1.2) dient zur Regeneration von NADH. Die enzymatische PAC-Synthese wurde in 20 ml Mes/KOH-Puffer, 50 mM, PH 6.5, 20 mM MgSO₄, 1.5 mM ThDP, durchgeführt.

Der Anssatz enthielt: 1.3 U/ml PDC-W392A, 2 U/ml ADH, 2.5 U/ml FDH. Die an fängliche Pyruvatkonzentration betrug 70 mM. Ferner enthielt der Ansatz 2 mM NADH und 200 mM Formiat. Nach 120 min wurden erneut 0.7 ml einer 2.1 M Pyruvatlösung und 0,125 ml einer 8 M Natriumformiatlösung zugegeben.

Die durch die enzymatische Umsetzung resultierende pH- Erhöhung wurde mit Ameisensäure gegentitriert. Nach 7 Stunden waren 6,8 mM PAC entstanden.

Aufarbeiten und Analytik der enzymatischen Reaktions produkte:

Die Auftrennung der Reaktionsprodukte erfolgte mittels präparativer reversed-phase HPLC. Als stationäre Phase wurde eine C8-MOS Hypersil-Säule, 250 × 4,6 mm, verwen det. Die Elution erfolgte unter isokratischen Bedingun gen mit Essigsäure/Acetonitril 0,5%/12,5% (v/v) mit einer Flußrate von 1,5 ml/min. Die Elutionszeiten be trugen unter diesen Bedingungen: PAC, 4.77 min und 2- Hydroxypropiophenon, 5.41 min. Die Zuordnung des ent standenen Enantiomeren als R-(-)-PAC erfolgte mittels Polarimetrie anhand eines Standards aus der PAC-Produk tion (Knoll AG).

Das Enantiomerenverhältnis von PAC wurde mittels chira ler Gaschromatographie zu << 98% bestimmt.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung einer zur Bildung von (R)- (-)-Phenylacetylcarbinol (I) in ≧ 95% Enantiomeren reinheit mit einem Produktverhältnis von I zu 2- Hydroxypropiophenon von ≧ 95% befähigten Pyruvat decarboxylase (PDC) mit einer spezifischen Aktivi tät bezüglich der Phenylacetylcarbinolbildung von < 1 U/mg durch Isolierung aus einem Produzenten- Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Produzenten-Organismus mit einem für PDC kodierenden Gen aus Zymomonas mobilis verwen det, in dessen DNA-Sequenz das für den Tryptophan rest kodierende Kodon TGG an der Position 1174-1176 durch ein Kodon ersetzt ist, das für einen Ami nosäurerest mit verminderter Raumerfüllung kodiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Kodon TGG durch ein Kodon ersetzt ist, das für einen aliphatischen Aminosäurerest kodiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kodon TGG durch ein Kodon ersetzt ist, das für einen Alaninrest kodiert.

4. Pyruvat-decarboxylase befähigt zur Umwandlung von Pyruvat in Gegenwart von Benzaldehyd in (R)-(-)- Phenylacetylcarbinol in ≧ 95% Enantiomerenreinheit mit einem Produktverhältnis von I zu 2- Hydroxypropiophenon von ≧ 95% mit einer spezifi schen Aktivität bezüglich der Produktbildung von < 1 U/mg, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 3, deren Tryptophanrest in Position 392 durch einen Aminosäurerest minderer Größe ersetzt ist.

5. Pyruvat-decarboxylase nach Anspruch 4 gekennzeichnet durch einen den Tryptophanrest an der Position 392 erset zenden Alaninrest.

6. Pyruvat-decarboxylase nach Anspruch 4 gekennzeichnet durch einen den Tryptophanrest an der Position 392 erset zenden Isoleucinrest.

7. Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von Acyloinen durch enzymatische Acyloinkondensation von α- Ketocarbonsäuren und/oder Aldehyden in Gegenwart von PDC, dadurch gekennzeichnet, daß man als PDC ein Enzym nach Anspruch 5 oder 6 verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Acetaldehyd mit Benzaldehyd zu Phenylace tylcarbinol umgesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acyloinkondensation ausgehend von α- Ketocarbonsäure unter gleichzeitiger Reduktion von überschüssigem durch Decarboxylierung gebildeten Aldehyd mittels Alkohol-dehydrogenase und NADH durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der Umsetzung gebildete NAD in situ durch Formiat-dehydrogenase zu NADH regeneriert wird.

11. DNA-Sequenz des PDC-Gens von Zymomonas mobilis, gekennzeichnet durch ein für einen Aminosäurerest minderer Größe kodie rendes Kodon an der Position 1174-1176.

12. DNA-Sequenz nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch ein für einen Rest einer aliphatischen Aminosäure kodierendes Kodon an der Position 1174-1176.

13. DNA-Sequenz nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch ein für einen Alaninrest kodierendes Kodon an der Position 1174-1176.