DE19523269C2 - Verfahren zur Gewinnung von Acyloinen, dafür geeignete Pyruvat-decarboxylase sowie deren Herstellung und DNA-Sequenz des für diese kodierenden PDC-Gens - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Acyloinen, dafür geeignete Pyruvat-decarboxylase sowie deren Herstellung und DNA-Sequenz des für diese kodierenden PDC-GensInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewin
nung von Acyloinen durch enzymatische Umwandlung von α-
Ketocarbonsäuren und/oder Aldehyden in Gegenwart
von Pyruvat-decarboxylase (PDC) und sie umfaßt eine da
für geeignete PDC sowie deren Herstellung und das für
diese kodierende Gen.
Acyloine bzw. α-Hydroxyketone sind Verbindungen mit ei
nem optisch aktiven C-Atom, die in der Synthese von
komplexeren Verbindungen eine erhebliche Rolle spielen,
wie insbesondere das (R)-(-)-Phenylacetylcarbinol
(PAC), das für die Produktion von Ephedrin wirtschaft
lich von großem Interessse ist. Hier interessiert das
R-Enantiomere, das durch fermentative Umwandlung von
Pyruvat in Gegenwart von Benzaldehyd mittels Saccha
romyces cerevisiae gebildet wird (DE-PS 548 459 von
1932).
Bei dieser Synthese von PAC mittels Hefezellen werden
auf Grund der Mehrzahl von in der Hefe vorhandenen En
zymen zahlreiche Nebenprodukte gebildet, und das Zell
wachstum wird durch die Anwesenheit von Benzaldehyd in
hibiert.
Auch die aus der Hefe isolierte Pyruvat-decarboxylase
(PDC) führt bei dieser Umsetzung zu erheblichen Antei
len des zu PAC isomeren 2-Hydroxypropiophenons.
Die thiamindiphosphat- und Mg2+-abhängige PDC (E. C.
4.1.1.1) ist weit verbreitet und wird in vielen Pflan
zen, Hefen und Pilzen und in einigen Bakterien gefun
den. Sie katalysiert die nicht-oxidative Decarboxylie
rung von Pyruvat zu Acetaldehyd und als Nebenreaktion
erfolgt eine Acyloinkondensation unter Bildung von α-
Hydroxyketonen, wie aus Fig. 1 ersichtlich ist.
Eine solche enzymatische Umsetzung erfolgt auch ausge
hend von einem Aldehyd an Stelle von α-Ketocarbon
säuren, und an der Kondensationsreaktion kann auch der
durch die Decarbooxylierung gebildete Aldehyd als "Co
substrat" unter Bildung von Homoacyloinen
R-CHOH-CO-R' mit R = R' teilnehmen.
Isoliert wurde auch bereits die PDC aus Zymomonas mobi
lis. Ein Vergleich einer aus Hefe isolierten PDC mit
PDC aus Zymomonas mobilis bzgl. der Bildung von PAC un
ter vergleichbaren Bedingungen zeigte jedoch eine deut
lich geringere Synthesekapazität der PDC aus Zymomonas
mobilis (S. Bringer-Meyer u. H. Sahm, Biocatalysis 1
(1988) S. 321-331).
Der Artikel "Reversible dissociation and unfolding of
pyruvat decarboxylase from Zymomonas mobilis" aus Eur.
J. Biochem., Sep. 1, 1994, 224, S. 651-661, beschäftigt
sich mit den chemischen Eigenschaften und der Stabili
tät der Pyruvat Decarboxylase.
In FEBS letters, vol. 296, 1992, S. 95-98, wird über
Versuche berichtet, die auf einem Austausch eines Tryp
tophanrestes in Position 487 basieren, bei denen der
Einfluß auf die Cofaktorbindung untersucht wird.
In der Veröffentlichung Biochem. J., May 15, 1994, 300,
S. 7-19, mit dem Titel "Investigation of the cofactor
binding site of Zymomonas mobilis pyruvat decarboxylase
by site-directed mutagenesis" wird ebenfalls über die
Veränderung der Bindung des Cofaktors durch Aminosäu
reaustausch in der Bindungsregion berichtet.
Der Artikel "Application of hydrolytic and decarboxyla
ting enzyms in biotransformations", Biocatalysis, vol.
9, 1999, site 1-30, zeigt eine Übersicht von Reaktionen
natürlicher Decarboxylasen (von Hefe oder Zymomonas)
ohne Mutationen.
Es wurde nun überraschend festgestellt, daß durch ge
zielte gentechnologische Abwandlung des PDC-Gens von Z.
mobilis eine PDC mit verbesserter Synthesekapazität
bzgl. der Bildung von PAC erhalten werden kann, die
sich zudem durch eine hohe Selektivität zur Bildung von
PAC im Vergleich zu 2-Hydroxypropiophenon auszeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten
Art ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß man
als PDC ein Enzym verwendet, bei dem der Tryptophanrest
im zum aktiven Zentrum hinführenden Substratkanal durch
einen sterisch kleineren Aminosäurerest ersetzt ist.
Bei einem sterisch kleineren Aminosäurerest handelt es
sich insbesondere um eine einfache, insbesondere ali
phatische Aminosäure, wie speziell Alanin, Glycin, Phe
nylalanin, Leucin, Isoleucin, Arginin oder Histidin
oder auch Serin und Threonin.
Man erhält die gentechnologisch abgewandelte neue PDC
durch Austausch des für Tryptophan an der Stelle 392
kodierenden Kodons TGG in der Position 1174-1176 der
DNA-Sequenz des PDC-Gens aus Z. mobilis in an sich be
kannter Weise und Expression der PDC in einem Produzen
ten-Organismus, wie insbesondere E. coli, aus dem die
PDC isoliert wird. Die gezielte Mutation erfolgt z. B.
mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwen
dung der auf Seite 9 angegebenen Primer. Die Konstruk
tion des Expressionsvektors pBTac2 für die mutierte PDC
wurde ausgehend vom E. coli-Expressionsvektor pPDC des
Wildtypenzyms durchgeführt.
Die Gewinnung der mutierten PDC erfolgt nach Ernte und
Aufschluß der Zellen aus dem Rohextrakt in an sich be
kannter Weise durch chromatographische Methoden.
Durch die erfindungsgemäße Abwandlung der PDC wird ihre
PAC-Synthesekapazität um den Faktor 4 verbessert. Diese
Verbesserung resultiert aus der gezielten Abschwächung
bzw. Beseitigung der Zugangslimitierung im zum aktiven
Zentrum des Enzyms hinführenden Substratkanal, wodurch
der Zugang voluminöser Sustratmoleküle zum aktiven Zen
trum und der Abgang des gebildeten Produkts erleichtert
wird.
Die gemäß der den Ausgangspunkt der Erfindung bildenden
Zielsetzung so erhaltene PDC ist für die PAC-Synthese
von erheblichem Interesse, da mit ihr eine hohe opti
sche Reinheit des R-(-)-Isomeren (<< 98%) und ein PAC
erhalten werden kann, das nur zu wenigen Prozenten
(2-3%) von 2-Hydroxy-propiophenon begleitet wird. Die
Gewinnung und Isolierung des Enzyms aus dem geernteten
Mikroorganismus ist auf relativ einfache Weise (im Ver
gleich zur Hefe) möglich.
Bei der enzymatischen Acyloinkondensation mittels PDC
können als Substrat lineare und/oder verzweigte α-
Ketocarbonsäuren und als Substrat und/oder Cosubstrat
aromatische, cyclische, längerkettige und/oder ver
zweigte Aldehyde eingesetzt werden. Als Beispiel können
hier Benzaldehyd, Cyclohexanaldehyd, Furfurol, Zimtal
dehyd, Krotonaldehyd, Pyruvat, 2-Ketobuttersäure,
2-Ketopentansäure, 2-Keto-4-methyllhexansäure,
2-Keto-4-methylpentansäure, 2 Keto-4,4-dimethylhexan
säure, 3-Phenyl-2-keto-propansäure genannt werden.
Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus
den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung
von Ausführungsdetails. Dabei wird Bezug genommen auf
die angefügten Zeichnungen; es sind im einzelnen:
Fig. 1: Das Reaktionsschema der PDC für das Beispiel
Pyruvat und Benzaldehyd als Substrat und Co
substrat mit dem Hauptweg der Decarboxylie
rung und der Carboligase-Nebenreaktion mit
der Bildung von PAC;
Fig. 2: Ein Konstruktionsschema für die Bildung des
die PDC aus Z. mobilis enthaltenden Expressi
onsvektors pPDC und
Fig. 3: Ein Schema für eine durch Abfangen von Ace
taldehyd mittels Alkoholdehydrogenase opti
mierte Produktion von PAC gemäß Fig. 1.
Für die Expression der PDC aus Zymomonas mobilis wurde
der Vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim) gewählt. Die
Transkription des Fremdgens steht unter der Kontrolle
des starken tac-Promotors, einem Hybrid aus trp- und
lacUV-Promotor mit der 11-fachen bzw. 3-fachen Effizi
enz der parentalen Promotoren. Die Operatorsequenz und
Ribosomenbindungsregion entstammen dem lacZ-Gen. Die
Regulation der Transkription erfolgt somit durch den
lac-Repressor eines überexpremierenden (laciQ) Bak
teerienstammes und ist durch Isopropyl-β-D-thiogalac
tosid (IPTG) induzierbar. Der Vektor enthält eine ein
zelne Erkennungssequenz der Restriktionssendonuklease
EcoRl, gefolgt von dem Initiationskodon ATG und an
schließend weiteren Restriktionserkennungssequenzen
(sites), so daß dieser Vektor universell zur Expression
sowohl für Gensequenzen mit als auch ohne eigenem
Initiationskodon eingesetzt werden kann.
Der multiplen Klonierungsstelle folgen die starken ri
bosomalen RNA Transkriptionsterminatoren rrnB, um den
kontrollierten Abbruch der Transkription zu gewährlei
sten. Als Ausgangsmaterial zur Klonierung des PDC-Gens
aus Zymomonas mobilis (ATCC 29191) stand der Vektor
pZY134B (G. Sprenger, Inst f. Biotechnologie 2, KFA-
Jülich) zur Verfügung. Dieses Plasmid beinhaltet ein
3.2 kb großes DNA-Fragment aus Zymomonas mobilis mit
dem vollständigen PDC-Gen inklusive nichtkodierender
Regionen (Fig. 2). Um eine Ligation der kodierenden Se
quenz in den Expressionsvektor zu ermöglichen, war es
erforderlich, in 5'-Richtung des Initiationskodons eine
neue Restriktionserkennungssequenz einzuführen. Den op
timalen Abstand des Initiationskodons von der Shine-
Dalgarno-Sequenz des Vektors gewährleistet die Ligation
des Gens in die EcoRI-site des pBTac2-Vektors. Eine
elegante und einfache Methode, eine DNA-Sequenz zu mo
difizieren, bietet die Polymerase, Kettenrektion (PCR).
Wiederholte Zyklen von Hitzedenaturierung des DNA-
Doppelstrangs und enzymatische Synthese durch eine
thermostabile DNA-Polymerase ermöglichen die exponenti
elle Amplifizierung definierter DNA-Fragmente. Die Grö
ße und Identität der Produkte wird durch die Startpunk
te (Primer) der Synthese bedingt. Enthalten die Primer
eine Modifikation der ursprünglichen Sequenz, etwa Mu
tationen, Deletionen oder auch zusätzliche Basen (In
sertionen), werden diese folglich auch im synthetischen
Fragment vorhanden sein.
Mit dieser Methode wurde die benötigte EcoRI-Restrik
tionssite in 5'-Richtung des Initiationskodons des PDC-
Gens eingeführt, indem während der Oligonukleotidsyn
these am 5'-Ende des zum Gen komplementären Primers die
Erkennungssequenz des Enzyms angeschlossen wurde. Da
einige Endonukleasen eine stark verminderte Aktivität
für die Restriktion endständiger Sequenzen zeigen, wur
den vier weitere Basen stromaufwärts an die ECoRI-site
angefügt.
Die zur PCR meist verwendete Taq-Polymerase besitzt
keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität (proof-reading). Die
von ihr synthetisierte Sequenz ist folglich mit einer
statistischen Fehlerrate behaftet. Auch wenn diese
durch die Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen mit
1/100.000 sehr gering gehalten werden kann, bedingt
dies die Notwendigkeit der Sequenzierung eines jeden
Fragments, um die Integrität der Synthese sicherzustel
len. Daher wurde nicht die gesamte kodierende Region
des PDC-Gens (1712 bp), sondern ein kleineres Fragment
(890 bp) vom 5'-Terminus bis zu einer einzelnen Re
striktionssite (EcoRV) zur Amplifikation gewählt (Fig.
2).
Das PCR-Produkt wurde mit den entsprechenden Restrikti
onsendonukleasen EcoRI und EcoRV verdaut.
Der fehlende zweite Teil des PDC-Gens wurde durch Re
striktion mit ECoRV und BamHI aus dem Plasmid pZY134B
gewonnen, wobei das so entstehende Fragment (1.2 kb) am
3'-Ende noch ca 350 bp nicht-translatierte Sequenz des
PDC-Gens enthält. Beide Fragmente wurden durch präpara
tive Agarosegelektrophorese separiert, isoliert und in
den EcoRI und BamHI linearisierten, isolierten pBTac2
(4.6 kb) ligiert. Die Klonierung erfolgte in E. coli JM
109, einem den lac-Repressor überexpremierenden Stamm.
Für die Gewinnung einer durch Tryptophan/Alanin-
Austausch mutierten PDC an der Position 392 wurde zu
nächst das beim Wildtyp-Enzym vorhandene Kodon TGG
(Tryptophan) gegen GCG (Alanin) ausgetauscht (Austausch
der Position 1174-1176 des Gens der Pyruvat
decarboxylase aus Zymomonas mobilis). Die Einführung
der gezielten Mutation erfolgte mit Hilfe der von Ho et
al. beschriebenen Polymerasekettenrektion gestützten
Methode (S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen,
L. R. Pease, Gene 77 (1989) S. 51).
Als Ausgangspunkt stand das PDC-Gen aus Z. mobilis
im E. coli-Expressionsvektor pPDC zur Verfügung (s.
Fig. 2). Die DNA-Isolierung erfolgte nach Standardme
thoden (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Mole
cular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).
Als Templat zur Synthese der beiden überlappenden Ein
zelfragmente diente das Plasmid pPDC. Die Primer (Pri
mersequenzen gemäß Anhang) wurden mit einer Konzentra
tion von 0.2-0.4 nM eingesetzt. Die Reaktion wurde mit
Taq-Polymerase (Biomasters, Köln) im von Hersteller an
gegebenen Reaktionspuffer, zuzüglich 1.5 mM MgCl2 und
je 0.2 mM der Nukleotide im "Robo-Cycler"(Stratgene)
mit folgendem Temperaturprogramm durchgeführt: 2.5 Mi
nuten 94°C zur Denaturierung, anschließend 30 Zyklen
mit einer 1.5-minütigen Denaturierung bei 94°C, 1.2 Mi
nuten Annealing bei 48°C und 2 Minuten Extension bei
72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C zur Vervollstän
digung der Reaktion. Die Annealing-Temperatur variierte
zwischen 48°C und 56°C, je nach theoretischem Schmelz
punkt der verwendeten Primer. Der Schmelzpunkt der Oli
gonukleotide wurde anhand folgender Formel berechnet:
Tm = 2 . (A + T) + 3 . (C + G)
Die Fragmente wurden elektrophoretisch separiert, iso
liert, zur Konzentrierung mit Ethanol präzipitiert und
in Tris-HCl-Puffer, 10 mM, pH 7.4, wieder aufgenommen.
In der zweiten kombinierten PCR wurden je ca. 50-100 ng
der überlappenden Fragmente als Template eingesetzt.
Die weiteren Reaktionsbedingungen waren identisch zu
ersten Reaktion. Die Wahl der Annealingtemperatur rich
tete sich nach der Schmelztemperatur der resultierenden
Überlappungsregion der Fragmente. Die weiteren Manipu
lationen (Restriktion, Isolierung, Ligation) zum Ersatz
der Wildtyp-DNA im Expressionsvektor pPDC durch die mu
tierten Fragmente erfolgten nach Standardmethoden
(J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular
Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).
Die Numerierung bezieht sich auf das 1. (5')-Nukleotid
der PDC-Sequenz
s = sense, as = anti-sense
s = sense, as = anti-sense
Die mutierten Basen sind unterstrichen.
Durch Expression der modifizierten DNA in E. coli-
Zellen wurde ein erfindungsgemäßes Enzym (PDC-W392A)
erhalten. Das mutierte Enzym (Mutante) PDC-W392A wurde
gemäß folgender Prozedur exprimiert und aus dem Zellex
trakt aufgereinigt:
Die das Expressionsplasmid für die Mutante PDC-W392A
tragenden E. coli-Zellen wurden in LB-Medium inklusive
100 µg/ml Ampicillin zur Selektion fermentiert. Das Me
dium wurde mit Vorkulturen in der stationären Wachs
tumsphase im Verhältnis 1 : 50 angeimpft und bei 37°C und
220 rpm inkubiert.
Die Induktion der Expression erfolgte bei einer OD600
von 0.6 durch Zugabe von 1 mM IPTG. Die PDC-Mutante
wurde unter diesen Bedingungen mit 20% des löslichen
Proteins in E. coli überexpremiert.
Zur Produktion ausreichender Enzymmengen wurde die Ex
pression wie oben beschrieben im 8-Liter-Fermenter
durchgeführt. Es wurde ein ph-Wert von 7.0 sowie ein
Luftstrom von 10 l/h eingestellt. Die Rührgeschwindig
keit betrug 200 rpm. Zur Vermeidung überschüssiger
Schaumbildung wurde nach Bedarf Polypropylenglycol zu
gesetzt. Die Zellen wurden nach 3-stündiger Expression
durch gekühlte kontinuierliche Zentrifugation geerntet.
Der Aufschluß erfolgte durch Vermahlen mit Glasperlen.
Hierzu wurde eine 30%ige Zellsuspension in Mes/KOH-
Puffer, 50 mM, pH 6.5, inklusive 5 mM MgCl2 und 0,1 mM
ThDP hergestellt und mit einem doppelten Volumen an
Glasperlen (d = 0,3 mm) versetzt. Abhängig vom zu bear
beitenden Volumen wurde der Aufschluß in Eppendorfgefä
ßen in einer Retsch-Mühle oder eisgekühlt im Disinte
grator S (Maximalvolumen 80 ml) durchgeführt. Die Ver
mahlung erfolgte über 10 Minuten mit maximaler Lei
stung. Die Suspension wurde zentrifugiert, die Glasper
len mit Puffer gewaschen und die vereinigten Zentrifu
gate filtriert (1 µm). Die Aufreinigung der PDC-Mutanten
erfolgte säulenchromatographisch wie folgt:
Der Rohextrakt (ca. 110 ml, ca. 1.0-1.5 g Protein) wur
de auf eine Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
(2.6 . 9.5 cm) mit einer Flußrate von 5 ml/min unter
Verwendung einer FPLC-Anlage der Fa. Pharmacia. Das En
zym eluierte durch Anlegen eines linearen NaCl-
Gradienten (von 0-200 mM) in 10 mM Mes/KOH, pH 6.5,
2 mM MgCl2, 0.1 mM ThDP, bei 100 mM NaCl. Die das Ziel
protein enthaltenden Fraktionen wurden durch Aktivi
tätstest (s. unten) identifiziert.
Die vereinigten Fraktionen wurden auf einen Ammonium
sulfatgehalt von 50%-Sättigung durch Zugabe eines Vo
lums gesättigter Ammoniumsulfatlösung eingestellt. Die
hydrophobe Interaktionschromatographie wurde an Buthyl
sepharose (Pharmacia) (Säule 5 . 8 cm) mit einer Fluß
rate von 2 ml/ min durchgeführt. Das Material wurde vor
dem Beladen mit 40% Ammoniumsulfat in 50 mM Mes/KOH,
2 mM MgCl2, 0,1 mM ThDP äqulibriert. Das Enzym eluierte
im selben buffer mit einem fallenden Ammoniumsulfatgra
dienten (40-0%) bei 24%. Die Zielfraktionen wurden wie
derum mittels Aktivitätstest identifiziert und verei
nigt (ca. 160 ml).
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde im ge
koppelten enzymatischen Test durchgeführt, wobei photo
metrisch die NADH-Oxidation durch das Hilfsenzym Alko
hol-dehydrogenase aus Hefe (E. C. 1.1.1.1) verfolgt
wird. Der Reaktionsansatz enthielt 16.9 mM Pyruvat,
0.18 mM NADH und 10 U ADH in 50 mM Mes/KOH, pH 6.5,
20 mM MgSO4, 1.5 mM ThDP. Eine Enzymeinheit PDC (1 U)
entspricht der Enzymmenge, die die Umsetzung von 1 µmol
Substrat in einer Minute bei 30°C katalysiert. Die En
zymaktivität berechnet sich nach:
ε (NADH) = 6.3 l.mMol-1.cm-1
V = Gesamtvolumen
v = Probenvolumen
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
ΔE/min = Extinktionsabnahme pro Minute
f = Verdünnungsfaktor der Probe
V = Gesamtvolumen
v = Probenvolumen
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
ΔE/min = Extinktionsabnahme pro Minute
f = Verdünnungsfaktor der Probe
Die Gewinnung chiraler Acyloine kann ausgehend von ei
ner α-Ketocarbonsäure bzw. einem Aldehyd als Substrat
und einem weiteren Aldehyd als Cosubstrat mittels PDC
oder PDC-Mutanten erfolgen.
Beispielhaft seien die folgenden Anwendungen genannt:
Der Syntheseansatz enthielt 40 mM Pyruvat, 70 mM Ben
zaldehyd und 10 U/ml PDC-W392A in Mes/KOH-Puffer,
50 mM, pH 6.5, 20 mM MgSO4, 1.5 mM ThDP. Die Reaktion
wurde eine Stunde bei 37°C durchgeführt und das ent
standene PAC (6.2 mM) mittels HPLC detektiert.
PAC-Syntheseansatz enthielt anstelle von Pyruvat 40 mM
Acetaldehyd. Ansonsten wurde wie oben beschrieben ver
fahren. Nach einer Stunde waren 3.7 mM PAC entstanden.
Die enzymatische Umsetzung erfolgte gemäß Fig. 3. Der
Einsatz der Alkohol-dehydrogenase (ADH) aus Hefe (E. C.
1.1.1.1) ermöglicht die kontinuierliche Entfernung von
Acetaldehyd und die dadurch bedingte Inaktivierung der
PDC-W392A. Die Formiatdehydrogenase (FDH) aus Candida
boidinii (E. C. 1.2.1.2) dient zur Regeneration von
NADH. Die enzymatische PAC-Synthese wurde in 20 ml
Mes/KOH-Puffer, 50 mM, PH 6.5, 20 mM MgSO4, 1.5 mM
ThDP, durchgeführt.
Der Anssatz enthielt:
1.3 U/ml PDC-W392A, 2 U/ml ADH, 2.5 U/ml FDH. Die an
fängliche Pyruvatkonzentration betrug 70 mM. Ferner
enthielt der Ansatz 2 mM NADH und 200 mM Formiat. Nach
120 min wurden erneut 0.7 ml einer 2.1 M Pyruvatlösung
und 0,125 ml einer 8 M Natriumformiatlösung zugegeben.
Die durch die enzymatische Umsetzung resultierende pH-
Erhöhung wurde mit Ameisensäure gegentitriert. Nach
7 Stunden waren 6,8 mM PAC entstanden.
Die Auftrennung der Reaktionsprodukte erfolgte mittels
präparativer reversed-phase HPLC. Als stationäre Phase
wurde eine C8-MOS Hypersil-Säule, 250 × 4,6 mm, verwen
det. Die Elution erfolgte unter isokratischen Bedingun
gen mit Essigsäure/Acetonitril 0,5%/12,5% (v/v) mit
einer Flußrate von 1,5 ml/min. Die Elutionszeiten be
trugen unter diesen Bedingungen: PAC, 4.77 min und 2-
Hydroxypropiophenon, 5.41 min. Die Zuordnung des ent
standenen Enantiomeren als R-(-)-PAC erfolgte mittels
Polarimetrie anhand eines Standards aus der PAC-Produk
tion (Knoll AG).
Das Enantiomerenverhältnis von PAC wurde mittels chira
ler Gaschromatographie zu << 98% bestimmt.
Claims (13)
1. Verfahren zur Gewinnung einer zur Bildung von (R)-
(-)-Phenylacetylcarbinol (I) in ≧ 95% Enantiomeren
reinheit mit einem Produktverhältnis von I zu 2-
Hydroxypropiophenon von ≧ 95% befähigten Pyruvat
decarboxylase (PDC) mit einer spezifischen Aktivi
tät bezüglich der Phenylacetylcarbinolbildung von
< 1 U/mg durch Isolierung aus einem Produzenten-
Organismus,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Produzenten-Organismus mit einem für
PDC kodierenden Gen aus Zymomonas mobilis verwen
det, in dessen DNA-Sequenz das für den Tryptophan
rest kodierende Kodon TGG an der Position 1174-1176
durch ein Kodon ersetzt ist, das für einen Ami
nosäurerest mit verminderter Raumerfüllung kodiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet
daß das Kodon TGG durch ein Kodon ersetzt ist, das
für einen aliphatischen Aminosäurerest kodiert.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Kodon TGG durch ein Kodon ersetzt ist, das
für einen Alaninrest kodiert.
4. Pyruvat-decarboxylase befähigt zur Umwandlung von
Pyruvat in Gegenwart von Benzaldehyd in (R)-(-)-
Phenylacetylcarbinol in ≧ 95% Enantiomerenreinheit
mit einem Produktverhältnis von I zu 2-
Hydroxypropiophenon von ≧ 95% mit einer spezifi
schen Aktivität bezüglich der Produktbildung von
< 1 U/mg, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis
3, deren Tryptophanrest in Position 392 durch einen
Aminosäurerest minderer Größe ersetzt ist.
5. Pyruvat-decarboxylase nach Anspruch 4
gekennzeichnet durch
einen den Tryptophanrest an der Position 392 erset
zenden Alaninrest.
6. Pyruvat-decarboxylase nach Anspruch 4
gekennzeichnet durch
einen den Tryptophanrest an der Position 392 erset
zenden Isoleucinrest.
7. Verfahren zur enzymatischen Gewinnung von Acyloinen
durch enzymatische Acyloinkondensation von α-
Ketocarbonsäuren und/oder Aldehyden in Gegenwart
von PDC,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als PDC ein Enzym nach Anspruch 5 oder 6
verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß Acetaldehyd mit Benzaldehyd zu Phenylace
tylcarbinol umgesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Acyloinkondensation ausgehend von α-
Ketocarbonsäure unter gleichzeitiger Reduktion von
überschüssigem durch Decarboxylierung gebildeten
Aldehyd mittels Alkohol-dehydrogenase und NADH
durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß das bei der Umsetzung gebildete NAD in situ
durch Formiat-dehydrogenase zu NADH regeneriert
wird.
11. DNA-Sequenz des PDC-Gens von Zymomonas mobilis,
gekennzeichnet durch
ein für einen Aminosäurerest minderer Größe kodie
rendes Kodon an der Position 1174-1176.
12. DNA-Sequenz nach Anspruch 11,
gekennzeichnet durch
ein für einen Rest einer aliphatischen Aminosäure
kodierendes Kodon an der Position 1174-1176.
13. DNA-Sequenz nach Anspruch 12,
gekennzeichnet durch
ein für einen Alaninrest kodierendes Kodon an der
Position 1174-1176.
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