CZ287619B6 - Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins - Google Patents

Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins Download PDF

Info

Publication number
CZ287619B6
CZ287619B6 CZ19973691A CZ369197A CZ287619B6 CZ 287619 B6 CZ287619 B6 CZ 287619B6 CZ 19973691 A CZ19973691 A CZ 19973691A CZ 369197 A CZ369197 A CZ 369197A CZ 287619 B6 CZ287619 B6 CZ 287619B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pdc
pyruvate decarboxylase
acyloins
pyruvate
obtaining
Prior art date
Application number
CZ19973691A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ369197A3 (cs
Inventor
Heike Bruhn
Martina Pohl
Katrin Mesch
Maria Regina Kula
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich Gmbh
Heike Bruhn
Martina Pohl
Katrin Mesch
Maria Regina Kula
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich Gmbh, Heike Bruhn, Martina Pohl, Katrin Mesch, Maria Regina Kula filed Critical Forschungszentrum Juelich Gmbh
Publication of CZ369197A3 publication Critical patent/CZ369197A3/cs
Publication of CZ287619B6 publication Critical patent/CZ287619B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26Ketones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07CACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/20Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C49/24Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups
    • C07C49/245Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups containing six-membered aromatic rings
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká pyruvátdekarboxylázy pro získání acyloinů, způsob přípravy této pyruvátdekarboxylázy, DNA sekvence příslušně kódujícího PDC-genu a způsob získání acyloinů enzymatickou přeměnou α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti této pyruvátdekarboxylázy (PDC).
Dosavadní stav techniky
Acyloiny případně α-hydroxyketony jsou sloučeniny s jedním opticky aktivním uhlíkovým atomem, které sehrávají významnou úlohu v syntéze komplexnějších sloučenin, jako zvláště (R)(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC), který má velký ekonomický význam pro výrobu efedrinu. Zde je zajímavý R-enantiomer, který se vytváří fermentativní přeměnou z pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu pomocí Saccharomyces cerevisiae (DE-PS 548 459 z roku 1932).
Při této syntéze PAC pomocí kvasinkových buněk se na základě velkého počtu v kvasnicích existujících enzymů tvoří četné vedlejší produkty a růst buněk se inhibuje přítomností benzaldehydu.
Také z droždí izolovaná pyruvátdekarboxyláza (PDC) vede při této přeměně ke značným podílům k PAC isomemího 2-hydroxypropiofenonu.
Na tiamindifosfát- a Mg2+ - závislá PDC (E.C. 4.1.1.1) je široce rozšířená a nachází se v mnoha rostlinách, kvasinkách a houbách i v některých bakteriích. Katalyzuje neoxidativní dekarboxylaci pyruvátu na acetaldehyd a jako vedlejší reakce probíhá kondenzace acyloinů za vzniku ahydroxyketonů jak je vidět z obr. 1.
Takováto enzymatická přeměna probíhá také, když se vychází z aldehydu místo z a-ketokarbonových kyselin a na kondenzační reakci se může také podílet dekarboxylaci vytvořený aldehyd jako „kosubstrát“ za vzniku homoacyloinů R-CHOH-CO-R‘, kde R = R‘.
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) byla již také izolována ze Zymomonas mobilis. Porovnání pyruvátdekarboxylázy (PDC) izolované z droždí s pyruvátdekarboxylázou (PDC) ze Zymomanas mobilis, případně tvorby (R)-(-)-fenylacetylkarbonilu (PAC) za srovnatelných podmínek však vykazovalo výrazně menší syntézní kapacitu PDC ze Zymomonas mobilis (S. Bringer-Meyer a H. Sahm, Biocatalysis (1988) strana 321-331).
Nyní bylo překvapivě zjištěno, že cílenou geneticko-technologickou přeměnou genu PDC ze Zymomonas mobilis, lze získat PDC se zlepšenou kapacitou syntézy pokud se týká tvorby PAC, která se navíc vyznačuje vysokou selektivitou pro tvorbu PAC ve srovnání s 2-hydroxypropiofenonem.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je pyruvátdekarboxyláza (PDC) ze Zymomonas mobilis pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R)-(-)-fenylacetylkarbinol (produkt I) v ž 95 % enantiomemí čistotě s poměrem produktu I k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % a se
-1CZ 287619 B6 specifickou aktivitou pro tvorbu produktu I >lU/mg, jejíž, tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené alifatické aminokyseliny.
Dalším význakem vynálezu je, že tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) se specifickou účinností >lU/mg pro tvorbu fenylacetylkarbinolu podle vynálezu se připravuje izolací z produkčního organismu, jejíž podstata spočívá v tom, že se použije produkční organismus s genem kódujícím PDC ze Zymomonas mobilis, v jehož DNA sekvenci je pro tryptofanový zbytek v poloze 392 kódující kodón TGG v pozici 1174-1176 nahrazen kodónem kódujícím zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
Význakem vynálezu je dále to, že sekvence DNA genu pro tiamindifostát závislý enzym pyruvátdekarboxylázu (PDC) ze Zymomonas mobilis má na místo kodónu kódujícího tryptofanový zbytek v poloze 392 v pozici 1174-1176 zaveden kodón kódující zbytek přirozené alifatické aminokyseliny. Dalším význakem je to, že sekvence DNA má v pozici 1174-1176 kodón kódující alaninový zbytek.
Vynález zahrnuje rovněž způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy (PDC) jehož podstata spočívá v tom, že se jako PDC použije enzym PDC ze Zymomonas mobilis, u kterého tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené aminokyseliny.
Výše uvedený způsob podle vynálezu se v podstatě vyznačuje tím, že se jako PDC použije enzym, u kterého je tryptofanový zbytek v substrátovém kanálu vedoucímu k aktivnímu centru nahrazen stericky menším zbytkem aminokyseliny.
U stericky menšího zbytku aminokyseliny se jedná zvláště o nějakou jednoduchou, zejména přirozenou alifatickou aminokyselinu, jako konkrétně o alanin, glycin, fenylalanin, leucin, isoleucin, arginin nebo histidin nebo také serin a threonin.
Geneticko-technologicky změněná nová PDC se získá výměnou pro tryptofan v poloze 392 kódujícího kodónu TGG na pozici 1174-1176 sekvence DNA PDC genu ze Zymomonas mobilis o sobě známým způsobem a expresí PDC v produkčním organismu, jako je zvláště Escherichia coli, ze kterého se PDC izoluje. Cílená mutace probíhá například pomocí polymerázové řetězové reakce při použití dále (na straně 6) uvedeného primeru. Konstrukce expresního vektoru pBTac2 pro mutovanou PDC se prováděla tak, že se vycházelo z expresního vektoru pPDC E.coli enzymu divokého typu.
Získávání mutované PDC se provádí po sklizení a otevření buněk z hrubého extraktu chromatografickými metodami způsobem o sobě známým.
Přeměnou PDC podle vynálezu se její kapacita syntézy (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) zlepšuje o faktor 4. Toto zlepšení je výsledkem cíleného oslabení případně odstranění limitace přístupu k aktivnímu centru enzymu vedoucího substrátového kanálu, čímž se usnadňuje přístup objemnější substrátové molekuly k aktivnímu centru a odchod vytvořeného produktu.
Analogická optimalizace se dosahuje obecně u tiamindifosfát-závislých enzymů, které vykazují přístupovou limitaci - ať již stericky, nebo vlivy nabíjením podmíněného způsobu - do substrátového kanálu vedoucího k aktivnímu centru. Analogickou přeměnou sekvence DNA pro enzym kódujícího genu a sice prostřednictvím výměny přístup limitujícího kódujícího kodónu kodónem, který kóduje zbytek aminokyseliny odstraňující přístupovou limitaci, se dosáhne značného zvýšení syntézní kapacity enzymu.
-2CZ 287619 B6
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) získaná podle vynálezu je pro syntézu (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) mimořádně zajímavá, protože s její pomocí lze dosáhnout vysoké optické čistoty R-(-)-isomeru (»98 %) a dále PAC, která je provázena pouze malým procentem (23 %) 2-hydroxypropiofenonu. Získání a izolace enzymu ze sklizeného mikroorganismu je možné relativně jednoduchým způsobem (ve srovnání s droždím).
Při enzymatické acyloinové kondenzaci prostřednictvím PDC lze použít jako substrát lineární a/nebo rozvětvené α-ketokarbonové kyseliny a jako substrát a/nebo kosubstrát aldehydy aromatické, cyklické, s dlouhým řetězcem a/nebo řetězcem rozvětveným. Jako příklad lze zde uvést benzaldehyd, cyklohexanaldehyd, furfurol, aldehyd kyseliny skořicové, krotonaldehyd, pyruvát, kyselinu 2-ketomáselnou, kyselinu 2-ketopentanovou, kyselinu 2-keto-4-metylhexanovou, kyselinu 2-keto-4-metylpentanovou, kyselinu 2-keto-4,4-dimetylhexanovou, kyselinu 3-fenyl2-keto-propanovou.
Další zvláštnosti vynálezu vyplývají z patentových nároků a následujícího popisu podrobností provedení. Dále je vynález ilustrován pomocí obrázků jež jsou níže popsány.
Obrázek 1 znázorňuje reakční schéma pro PDC pro příklad pyruvát a benzaldehyd jako substrát a kosubstrát s hlavní cestou dekarboxylace a vedlejší reakce karboligázy s tvorbou PAC;
Obrázek 2 znázorňuje konstrukční schéma pro tvorbu expresního vektoru pPDC obsahujícího PDC ze Zymomonas mobilis.
Obrázek 3 znázorňuje schéma produkce PAC podle obrázku 1 optimalizované zachycením acetaldehydu prostřednictvím alkoholdehydrogenázy.
Příklad provedení
Příklad
1. Výroba PDC-mutantu PDC-W392A
1.1 Konstrukce expresního vektoru pPDC
Pro expresi PDC ze Zymomonas mobilis byl zvolen vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim). Transkripce cizího genu je kontrolována silným tacpromotorem, hybridem z trp- a lacUVpromotoru s 11 násobnou případně 3 násobnou účinností rodičovských promotorů. Sekvence operátoru a oblast vazby ribozomu pocházejí z genu lacZ. Regulace transkripce se takto provádí lac-represorem nadexpremierujícího (laciQ) bakteriálního kmene a je indukovatelná isopropylβ-d-tiogalaktosidem (IPTG). Vektor obsahuje jednu jedinou rozeznávací sekvenci restrikční endonukleázy EcoRI, následovanou iniciačním kodónem ATG a dále pak dalšími restrikčními rozeznávacími sekvencemi (sites), takže tento vektor může být použit univerzálně k expresi genových sekvencí jak s a nebo také bez vlastního iniciačního kodónu.
Násobné klónovací místo následují silné ribozomální RNA transkripční terminátory rmB, aby se zaručilo kontrolovatelné přerušení transkripce. Jako výchozí materiál pro klonování genu PDC ze Zymomonas mobilis (ATCC 29191) byl k dispozici vektor pZY134B (G. Sprenger, Institut fůr Biotechnologie 2, KFA-Jůlich). Tento plazmid obsahuje 3.2 kb velký fragment DNA ze Zymomonas mobilis s úplným genem PDC včetně nekódujících regionů (obrázek 2). Aby se umožnila ligace kódovaných sekvencí v expresním vektoru, bylo potřebné zavést ve směru 5‘ iniciačního kodónu novou restrikční rozeznávací sekvenci. Optimální vzdálenost iniciačního kodónu od Shine-Dalgarmovy-sekvence vektoru zajišťuje ligaci genu na EcoRI-site vektoru pBTac2. Elegantní a jednoduchou metodu k modifikaci sekvence DNA nabízí polymerázová
-3CZ 287619 B6 řetězová reakce (PCR). Opakované cykly tepelné denaturace dvojvlákna DNA a enzymatická syntéza pomocí termostabilní polymerázy DNA umožňují exponenciální zesílení (amplifíkaci) definovaných fragmentů DNA. Velikost a identita produktu je podmíněna východiskem (primerem) syntézy. Jestliže příměry obsahují modifikaci původní sekvence, například mutace, delece nebo také dodatkové báze (inzerce), budou tyto v důsledku toho k dispozici také v syntetickém fragmentu.
Touto metodou bylo zavedeno potřebné EcoRI-restrikční místo ve směru 5‘ iniciačního kodónu PDC genu, tak že během oligonukleotidové syntézy byla na 5‘-konci primeru komplementárního ke genu připojena rozeznávací sekvence enzymu. Protože některé endonukleázy mají silně sníženou aktivitu pro restrikci koncových sekvencí, byly na EcoRI-site vzestupně zavedeny čtyři další báze.
Pro PCR většinou používaná taq-polymeráza neobsahuje žádnou 3‘-5‘-exonukleázovou aktivitu (proof-reading). Jí syntetizovaná sekvence je v důsledku toho ovlivněna statistickou mírou chyby. I když toto lze volbou vhodných reakčních podmínek udržet na velmi nepatrné míře 1/100.000, podmiňuje to také nezbytnost sekvencování každého fragmentu, aby byla zajištěna integrita syntézy. Proto nebyl k amplifíkaci zvolen celý kódovaný region genu PDC (1712 bp), ale menší fragment (890 bp) od 5‘-konce až k jednotlivému restrikčnímu místu (EcoRV) (obrázek 2).
Produkt PCR byl potlačen odpovídajícími restrikčními endonukleázami EcoRI a EcoRV.
Chybějící druhá část PDC genu byla získána restrikcí pomocí ECoRV a BamHI z plazmidu pZY134B, přičemž takto vzniklý fragment (1.2 kb) na 3‘-konci obsahuje ještě asi 350 bp netranslatované sekvence PDC genu. Oba fragmenty byly separovány preparitivní elektroforézou na agarosovém gelu, izolovány a ligovány do EcoRI a BamHI linearizovaného, izolovaného pBTac2 (4.6 kb). Klonování se provádělo v E.coli JM 109, kmenem přeexprimujím Iac-represor.
1.2 Molekulárně biologické práce
Pro získání PDC mutované prostřednictvím výměny tryptofan/alanin v poloze 392 byl nejdříve u enzymu divokého typu existující kodón TGG (tryptofan) vyměněn za GCG (alanin) (výměna polohy 1174-1176 genu pyruvátdekarboxylázy ze Zymomonas mobilis). Zavedení cílené mutace se provádělo pomocí Ho et al. popsanou metodou podporovanou polymerázovou řetězovou reakcí (S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene 77 (1989) strana 51).
Jako východisko byl k dispozici PDC gen ze Zymomonas mobilis v expresním vektoru pPDC E.coli (viz obrázek 2). Izolace DNA se prováděla standardními metodami (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).
Jako templát pro syntézu obou se překrývajících jednotlivých fragmentů sloužil plazmid pPDC. Primery (příměrové sekvence podle přílohy) byly použity v koncentraci 0,2-0,4 nM. Reakce se prováděla taq polymerázou (Biomasters, Kolín nad Rýnem) ve výrobcem udávaném reakčním pufru, plus 1,5 mM MgCl2 a po 0,2 mM nukleotidu v „Robo-Cycler“ (Stratgene) s následujícím teplotním programem: 2,5 minut 94 °C pro denaturaci, potom 30 cyklů s 1,5 minutovou denaturací při 94 °C, 1,2 minut temperování při 48 °C a 2 minutovém prodloužení při 72 °C, následované 10 minutami při 72 °C k dokončení reakce. Temperovací teplota se pohybovala mezi 48 °C a 56 °C, podle teoretické teploty tání použitého primeru. Teplota tání oligonukleotidů byla vypočtena na základě následujícího vzorce:
Tm = 2*(A+T) + 3*(C+G)
Fragmenty byly separovány elektroforeticky, izolovány, vysráženy pro koncentrování etanolem a opět zachyceny do tris-HCl-pufru, 10 mM, pH 7,4.
-4CZ 287619 B6
V druhé kombinované PCR bylo vždy použito jako templátu asi 50-100 ng překrývajících se fragmentů. Další reakční podmínky byly identické jako u první reakce. Volba teploty temperování se řídila podle teploty tání výsledného překrývaného regionu fragmentů. Další manipulace (restrikce, izolace, ligace) pro nahrazení DNA divokého typu v expresním vektoru pPDC mutovanými fragmenty se prováděly standardními metodami (J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).
Sekvence použitých primerů
Číslování se vztahuje na 1. (5‘)-nukleotidovou PDC sekvenci s = smysl, as = antismysl (protismysl)
Mutované báze jsou podtrženy.
Primer pro syntézu jednotlivého 5‘-fragmentu
PDC867s
CTACTCCACCACTGGTTGGACG
PDC1186as
GAGGATTGAAGGAGAGTCACC
Primer pro syntézu jednotlivého 3‘-fragmentu
PDC1159s
GAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC
PBTAC453as
ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci v návaznosti na PDC sekvenci PDC)
Primer pro syntézu fuzního fragmentu
PDC867S
CTACTCCACCACTGGTTGGAGG
PBTAC453as
ATCTTCTCTATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci navazující na sekvenci PDC)
-5CZ 287619 B6
DNA sekvence pro PDC ze Zymomonas mobilis atgagttata ctgtcggtac ctatttagcg gagcggcttg tccagattgg tctcaagcat 60 cacttcgcag tcgcgggcga ctacaacctc gtccttcttg acaacctgct tttgaacaaa 120 aacatggagc aggtttattg ctgtaacgaa ctgaactgcg gtttcagtgc agaaggttat 180 gctcgtgcca aaggcgcagc agcagccgtc gttacctaca gcgttggtgc gctttccgca 240 tttgatgcta tcggtggcgc ctatgcagaa aaccttccgg ttatcctgat ctccggtgct 300 ccgaacaaca acgaccacgc tgctggtcat gtgttgcatc acgctcttgg caaaaccgac 360 tatcactatc agttggaaat ggccaagaac atcacggccg ccgctgaagc gatttacacc 420 ccggaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgatcaaaa ctgctcttcg cgagaagaag 480 ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540 gcaagtgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagcat ccttgaatgc agcggttgac 600 gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660 cgcgctgctg gtgctgaaga agctgctgtt aaattcaccg acgctttggg cggtgcagtg 720 gctactatgg ctgctgccaa gagcttcttc ccagaagaaa atgccaatta cattggtacc 780 tcatggggcg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840 atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg gttggacgga tatccctgat 900 cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgttg tcaacggcat tcgcttcccc 960 agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020 tctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080 ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acattggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtt gctcagatgg ttčgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgc taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707
1.3 Exprese a čištění
Expresí modifikované DNA v buňkách E.coli byl obdržen enzym podle (PDC-W392A). Mutovaný enzym (mutant) PDC-W392A byl exprimován podle následujícího postupu a vyčištěn z buněčného extraktu:
Buňky E.coli nesoucí expresní plazmid pro mutanty PDC-W392A byly v LB prostředí včetně 100pg/ml ampicilinu fermentovány pro selekci. Prostředí bylo naočkováno předkulturami ve stacionární fázi růstu v poměru 1:50 a inkubováno při 37 °C a 220 ot./min.
Indukce exprese se prováděla při OD600 z 0,6 přidáním 1 mM IPTG. Mutant PDC byl za těchto podmínek exprimován do 20 % rozpustného proteinu E.coli.
Pro výrobu postačujících množství enzymů byla provedena exprese jak je popsáno výše v 8 litrovém fermentoru. Byla nastavena hodnota pH 7,0 a proud vzduchu 101/h. Rychlost míchání činila 200 ot./min. Pro zabránění nadměrné tvorbě pěny byl přidáván podle potřeby polypropylenglykol. Buňky byly po 3 hodinové expresi sklizeny pomocí chlazeného kontinuálního odstřeďování. Následovalo potom semletí skleněnými perličkami. Za tím účelem byla
-6CZ 287619 B6 vytvořena 30% buněčná suspenze v Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, včetně 5 mM MgCl2 a 0,1 mM ThDP a přidán dvojnásobný objem skleněných perliček (d = 0,3 mm). V závislosti na zpracovávaném objemu se provádělo rozpouštění v Eppendorfových nádobách v mlýně RetschMůhle nebo po vymrazení v dezintegrátoru S (maximální objem 80 ml). Mletí se provádělo 10 minut s maximálním výkonem. Suspenze byla odstředěna, skleněné perličky omyty pufřem a spojená odstředěná kapalina zfiltrována (1 gm). Vyčištění PDC mutantů se provádělo sloupcovou chromatografíí následovně:
1. Chromatografie na iontoměničích s výměnou aniontů
Surový extrakt (asi 110 ml, cca 1,0 - 1,5 g proteinu) byl dělen na Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) 2,6*9,5 cm) s rychlostí toku 5 ml/min za použití zařízení pro rychlou kapalinovou chromatografii (FPLC firmy Pharmacia). Enzym byl eluován za použití lineárního gradientu NaCl (0 - 200 mM) v 10 mM Mes/KOH, pH 6,5, 2 mM MgCl2, 1,0 mM ThDP, při 100 mM NaCl. Frakce obsahující cílový protein byly identifikovány testem účinností (viz níže).
2. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC)
Spojené frakce byly upraveny na obsah síranu amonného s 50% nasycením přídavkem určitého objemu nasyceného roztoku síranu amonného. Hydrofobní interakční chromatografie se prováděla na buthyl-sepharose (Pharmacia) (sloupec 5*8 cm) s rychlostí toku 2 ml/min. Materiál byl před nadávkováním uveden do rovnováhy (ekvilibrován) pomocí 40 % síranu amonného v 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ThDP. Enzym se eluoval ve stejném pufru s klesajícím gradientem síranu amonného (40 - 0 %) při 24 %. Cílové frakce byly opět identifikovány pomocí testu aktivity (účinnosti) a spojeny (asi 160 ml).
3. Odsolení se provádělo Sephadexem G25 a přepufrováním na 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ThDP. Rychlost toku činila 20 ml/min. Poté byla provedena lyofilizace.
1.4 Test účinnosti (dekarboxylační reakce)
Stanovení enzymatické účinnosti bylo provedeno spojeným enzymatickým testem, přičemž se fotometricky sledovala oxidace NADH pomocným enzymem alkoholdehydrogenázou z droždí (E.C. 1.1.1.1). Reakční vsázka obsahovala 16,9 mM pyruvátu, 0,18 mM NADH a 10 U ADH v 50 mM Mes/KOH, pH 6,5, 20 mM MgSO4, 1,5 mM ThDP. Enzymová jednotka PDC (1 U) odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 gmolu substrátu během jedné minuty při 30 °C. Enzymatická účinnost se vypočte podle vzorce:
AE/min*V*f c (U/ml) =--------------------e*d*v a(NADH) = 6,3 1 * mMol-1 * cm-1
V = celkový objem v = objem vzorku d = tloušťka vrstvy kyvety (1 cm)
ΔΕ/min = extinkční pokles za minutu f = zřeďovací faktor vzorku
2. Použití PDC-W392 A pro syntézu PAC
Získávání chirálních acyloinů se může provádět tak, že se vychází z α-ketokarbonové kyseliny případně aldehydu jako substrátu a dalšího aldehydu jako kosubstrátu pomocí PDC nebo mutantu PDC.
Jako příklad lze uvést následující použití:
Syntéza PAC vycházející z pyruvátu a benzaldehydu
Syntézní vsázka obsahovala 40 mM pyruvátu, 70 mM benzaldehydu a lOU/ml PDC-W392A v 50 mM Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO4, 1,5 mM ThDP. Reakce se prováděla hodinu při 37 °C a vzniklá PAC (6,2 mM) se detekovala pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC).
Syntéza PAC vycházející z acetaldehydu a benzaldehydu
Syntézní vsázka PAC obsahovala místo pyruvátu 40 mM acetaldehydu. Jinak se postupovalo jak je popsáno výše. Po jedné hodině vzniklo 3,7 mM PAC.
Syntéza PAC pomocí PDC-W392A ve spojeném 3-enzymovém systému
Enzymatická přeměna se prováděla podle obrázku 3. Použití alkoholdehydrogenázy (ADH) z droždí (E.C. 1.1.1.1) umožňuje kontinuální odstraňování acetaldehydu a tím podmíněnou inaktivaci PDC-W392A. Formiátdehydrogenáza (FDH) zCandida boidinii (E.C. 1.2.1.2) slouží pro regeneraci NADH. Enzymatická syntéza PAC se prováděla v 20 ml Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO4,1,5 mM ThDP.
Vsázka obsahovala:
l,3U/ml PDC-W392A, 2U/ml ADH, 2,5 U/ml FDH. Počáteční koncentrace pyruvátu činila 70 mM. Dále obsahovala vsázka 2 mM NADH a 200 mM mravenčanu. Po 120 minutách bylo znovu přidáno 0,7 ml 2,1 M roztoku pyruvátu a 0,125 ml 8 M roztoku mravenčanu sodného.
V důsledku enzymatické přeměny zvýšené pH bylo titrováno kyselinou mravenčí. Po 7 hodinách vzniklo 6,8 mM PAC.
Zpracování a analytika enzymatických reakčních produktů:
Oddělení reakčních produktů se provádělo pomocí preparativní vysoce účinné kapalinové chromatografie v obrácené fázi (reversed-phase HPLC). Jako stacionární fáze byl použit sloupec C8-MOS Hypersil, 250 x 4,6 mm. Eluce se prováděla za isokratických podmínek kyselinou octovou/acetonitrilem 0,5 %/12,5 % (obj/obj) s rychlostí toku 1,5 ml/min. Doby eluce za těchto podmínek činily: PAC 4,77 min a 2-hydroxypropiofenon 5,41 min. Přiřazení vzniklých enantiomerů jako R-(-)-PAC se provádělo polarimetricky pomocí standardu z výroby PAC (Knoll AG).
Enantiomerový poměr PAC byl určen pomocí chirální plynové chromatografie jako » 98 %.

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Pyruvátdekarboxyláza ze Zymomonas mobilis pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R)-(-)-fenylacetylkarbinol, produkt I, v > 95 % enantiomemí čistotě, s poměrem produktu I k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % a se specifickou aktivitou pro tvorbu produktu I >lU/mg, jejíž tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené alifatické aminokyseliny.
    -8CZ 287619 B6
  2. 2. Pyruvátdekarboxyláza podle nároku 1, kde tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.
  3. 3. Způsob získání pyruvátdekarboxylázy podle nároku 1, izolací z produkčního organismu, vyznačující se tím, že se použije produkční organismus sgenem kódujícím pyruvátdekarboxylázu ze Zymomonas mobilis, v jehož DNA sekvenci je pro tryptofanový zbytek v poloze 392 kódující kodón TGG v pozici 1174-1176 nahrazen kodónem kódujícím zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
  4. 4. Sekvence DNA genu pro enzym pyruvátdekarboxylázu ze Zymomonas mobilis podle nároku 1, kde na místo kodónu kódujícího tryptofanový zbytek v poloze 392 je v pozici 1174— 1176 zaveden kodón kódující zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
  5. 5. Sekvence DNA podle nároku 4, která má v pozici 1174-1176 kodón kódující alaninový zbytek.
  6. 6. Způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací a-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy, vyznačující se tím, že se jako pyruvátdekarboxyláza použije enzym podle nároku 1 nebo 2.
    3 výkresy
CZ19973691A 1995-05-26 1996-05-22 Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins CZ287619B6 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19518809 1995-05-26
DE19523269A DE19523269C2 (de) 1995-05-26 1995-06-29 Verfahren zur Gewinnung von Acyloinen, dafür geeignete Pyruvat-decarboxylase sowie deren Herstellung und DNA-Sequenz des für diese kodierenden PDC-Gens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ369197A3 CZ369197A3 (cs) 1998-02-18
CZ287619B6 true CZ287619B6 (en) 2001-01-17

Family

ID=26015375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973691A CZ287619B6 (en) 1995-05-26 1996-05-22 Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6004789A (cs)
EP (1) EP0828841A2 (cs)
JP (1) JPH11505710A (cs)
KR (1) KR19990021965A (cs)
CN (1) CN1192244A (cs)
AU (1) AU714414B2 (cs)
BR (1) BR9608798A (cs)
CA (1) CA2222493A1 (cs)
CZ (1) CZ287619B6 (cs)
DE (1) DE19523269C2 (cs)
IN (2) IN186507B (cs)
WO (1) WO1996037620A2 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19736104A1 (de) * 1997-08-20 1999-02-25 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen aus Acetaldchyd und Benzaldehyd in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas
DE19918935A1 (de) * 1999-04-27 2000-11-02 Forschungszentrum Juelich Gmbh Stereoselektive Synthese von 2-Hydroxyketonen
KR100708794B1 (ko) * 2001-05-04 2007-04-18 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨. 박테리아로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제(pdc) 유전자의 클로닝 및 서열분석, 및 그의 용도
DE10142467A1 (de) 2001-08-31 2003-03-20 Basf Ag Neue Pyruvatdecarboxylase, ihre Herstellung und Verwendung
DE10142574A1 (de) 2001-09-01 2003-03-20 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch ein enzymatisches verfahren in einem Zweiphasensystem
IL147823A (en) 2002-01-24 2008-06-05 Univ Ben Gurion Process for the preparation of alpha-hydroxy aromatic chiral ketones using acetohydroxyacide synthase
DE10313971A1 (de) * 2003-03-27 2004-10-21 Degussa Ag Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem
DE102014013644A1 (de) * 2014-09-16 2016-03-17 Forschungszentrum Jülich GmbH Lyase und für die Lyase kodierende DNA, die DNA enthaltende Vektoren, sowie Verfahren zur asymmetrischen Synthese von (S)-Phenylacetylcarbinol
CN107630049B (zh) * 2017-04-01 2018-09-21 武汉茵茂特生物技术有限公司 麻黄碱的生物制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE548459C (de) * 1930-04-09 1932-04-13 Gustav Hildebrandt Dr Verfahren zur Herstellung von 1-1-Phenyl-2-methylaminopropan-1-ol

Also Published As

Publication number Publication date
EP0828841A2 (de) 1998-03-18
CA2222493A1 (en) 1996-11-28
US6004789A (en) 1999-12-21
DE19523269C2 (de) 2000-05-31
WO1996037620A2 (de) 1996-11-28
JPH11505710A (ja) 1999-05-25
IN186507B (cs) 2001-09-22
WO1996037620A3 (de) 1997-02-06
AU714414B2 (en) 2000-01-06
CN1192244A (zh) 1998-09-02
IN189539B (cs) 2003-03-22
BR9608798A (pt) 1999-02-17
KR19990021965A (ko) 1999-03-25
DE19523269A1 (de) 1996-11-28
CZ369197A3 (cs) 1998-02-18
AU5810296A (en) 1996-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090203096A1 (en) Process for Production of Optically Active Alcohol
WO2001061014A1 (fr) (r)-2-octanol deshydrogenase, production de cet enzyme, adn codant pour cet enzyme et production d'alcool a l'aide de cet enzyme
CN1322129C (zh) 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法
CZ287619B6 (en) Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins
CN111454918B (zh) 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用
EP1762625B1 (en) Reductase gene and use thereof
EP2562253B1 (en) Modified carbonyl reductase, gene thereof, and method of producing optically active alcohols using these
JP2004357639A (ja) (2s,3s)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素
KR20150121789A (ko) 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법
JP5761641B2 (ja) (r)−3−キヌクリジノールの製造方法
US7250278B2 (en) α-keto acid reductase, method for producing the same, and method for producing optically active α-hydroxy acids using the same
CN112280723B (zh) 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用
WO2003093477A1 (fr) Carbonyl reductase, gene de celle-ci et son utilisation
WO2007099764A1 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP4729919B2 (ja) 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法
CN113710812A (zh) (1r,3r)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇及其中间体的生产方法
JP2002247987A (ja) 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα,β−不飽和ケトンの炭素−炭素2重結合を選択的に還元する方法
KR102598992B1 (ko) 이소부탄올 및 폴리히드록시 부티레이트 동시 생산 균주 및 이의 이용
JP2005027552A (ja) 新規な光学活性2−ヒドロキシメチル−3−アリールプロピオン酸の製造方法
JP2004065049A (ja) D−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、及びその用途
WO2005123921A1 (ja) 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法
JP2003289895A (ja) メチレンジオキシフェニル基を有するケトン化合物の不斉還元による光学活性アルコール化合物の製造方法
JP2024513194A (ja) 副産物の生成が低減した2,3-ブタンジオール生産用の組換え微生物、及びこれを用いる2,3-ブタンジオールの生産方法
JP2004350625A (ja) 光学活性n−ベンジル−3−ピロリジノールの製造方法
CN116790530A (zh) 烯还原酶突变体、工程菌及在不对称还原(e/z)-柠檬醛合成(r)-香茅醛中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20040522