CZ287619B6 - Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins - Google Patents
Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287619B6 CZ287619B6 CZ19973691A CZ369197A CZ287619B6 CZ 287619 B6 CZ287619 B6 CZ 287619B6 CZ 19973691 A CZ19973691 A CZ 19973691A CZ 369197 A CZ369197 A CZ 369197A CZ 287619 B6 CZ287619 B6 CZ 287619B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pdc
- pyruvate decarboxylase
- acyloins
- pyruvate
- obtaining
- Prior art date
Links
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 10
- 101150034686 PDC gene Proteins 0.000 title description 11
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 claims abstract description 19
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- WLVPRARCUSRDNI-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-1-phenyl-1-propanone Chemical compound CC(O)C(=O)C1=CC=CC=C1 WLVPRARCUSRDNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 7
- ZBFFNPODXBJBPW-VIFPVBQESA-N (R)-phenylacetylcarbinol Chemical compound CC(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000006657 acyloin condensation reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 10
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 30
- ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1-phenylpropan-2-one Chemical compound CC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 25
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 abstract description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 abstract 3
- UMQXPTSGLUXAQK-UHFFFAOYSA-N tryptophanyl radical Chemical group C1=CC=C[C]2C(CC(N)C(O)=O)=CN=C21 UMQXPTSGLUXAQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 3
- KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N (-)-ephedrine Chemical compound CN[C@@H](C)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N (E)-cinnamaldehyde Chemical compound O=C\C=C\C1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 2-oxopentanoic acid Chemical compound CCCC(=O)C(O)=O KDVFRMMRZOCFLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPWNRRAEBMQJKZ-UHFFFAOYSA-N 4,4-dimethyl-2-oxohexanoic acid Chemical compound CCC(C)(C)CC(=O)C(O)=O LPWNRRAEBMQJKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJWNVXXCJVKCNL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxohexanoic acid Chemical compound CCC(C)CC(=O)C(O)=O BJWNVXXCJVKCNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- AXMVYSVVTMKQSL-UHFFFAOYSA-N UNPD142122 Natural products OC1=CC=C(C=CC=O)C=C1O AXMVYSVVTMKQSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940117916 cinnamic aldehyde Drugs 0.000 description 1
- KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N cinnamic aldehyde Natural products O=CC=CC1=CC=CC=C1 KJPRLNWUNMBNBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N crotonaldehyde Chemical compound C\C=C\C=O MLUCVPSAIODCQM-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N crotonaldehyde Natural products CC=CC=O MLUCVPSAIODCQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- KVFDZFBHBWTVID-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarbaldehyde Chemical compound O=CC1CCCCC1 KVFDZFBHBWTVID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N d-ephedrine Natural products CNC(C)C(O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002179 ephedrine Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N furfuryl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CO1 XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 101150038671 strat gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
- C07C49/20—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
- C07C49/24—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups
- C07C49/245—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups containing six-membered aromatic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká pyruvátdekarboxylázy pro získání acyloinů, způsob přípravy této pyruvátdekarboxylázy, DNA sekvence příslušně kódujícího PDC-genu a způsob získání acyloinů enzymatickou přeměnou α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti této pyruvátdekarboxylázy (PDC).
Dosavadní stav techniky
Acyloiny případně α-hydroxyketony jsou sloučeniny s jedním opticky aktivním uhlíkovým atomem, které sehrávají významnou úlohu v syntéze komplexnějších sloučenin, jako zvláště (R)(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC), který má velký ekonomický význam pro výrobu efedrinu. Zde je zajímavý R-enantiomer, který se vytváří fermentativní přeměnou z pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu pomocí Saccharomyces cerevisiae (DE-PS 548 459 z roku 1932).
Při této syntéze PAC pomocí kvasinkových buněk se na základě velkého počtu v kvasnicích existujících enzymů tvoří četné vedlejší produkty a růst buněk se inhibuje přítomností benzaldehydu.
Také z droždí izolovaná pyruvátdekarboxyláza (PDC) vede při této přeměně ke značným podílům k PAC isomemího 2-hydroxypropiofenonu.
Na tiamindifosfát- a Mg2+ - závislá PDC (E.C. 4.1.1.1) je široce rozšířená a nachází se v mnoha rostlinách, kvasinkách a houbách i v některých bakteriích. Katalyzuje neoxidativní dekarboxylaci pyruvátu na acetaldehyd a jako vedlejší reakce probíhá kondenzace acyloinů za vzniku ahydroxyketonů jak je vidět z obr. 1.
Takováto enzymatická přeměna probíhá také, když se vychází z aldehydu místo z a-ketokarbonových kyselin a na kondenzační reakci se může také podílet dekarboxylaci vytvořený aldehyd jako „kosubstrát“ za vzniku homoacyloinů R-CHOH-CO-R‘, kde R = R‘.
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) byla již také izolována ze Zymomonas mobilis. Porovnání pyruvátdekarboxylázy (PDC) izolované z droždí s pyruvátdekarboxylázou (PDC) ze Zymomanas mobilis, případně tvorby (R)-(-)-fenylacetylkarbonilu (PAC) za srovnatelných podmínek však vykazovalo výrazně menší syntézní kapacitu PDC ze Zymomonas mobilis (S. Bringer-Meyer a H. Sahm, Biocatalysis (1988) strana 321-331).
Nyní bylo překvapivě zjištěno, že cílenou geneticko-technologickou přeměnou genu PDC ze Zymomonas mobilis, lze získat PDC se zlepšenou kapacitou syntézy pokud se týká tvorby PAC, která se navíc vyznačuje vysokou selektivitou pro tvorbu PAC ve srovnání s 2-hydroxypropiofenonem.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je pyruvátdekarboxyláza (PDC) ze Zymomonas mobilis pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R)-(-)-fenylacetylkarbinol (produkt I) v ž 95 % enantiomemí čistotě s poměrem produktu I k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % a se
-1CZ 287619 B6 specifickou aktivitou pro tvorbu produktu I >lU/mg, jejíž, tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené alifatické aminokyseliny.
Dalším význakem vynálezu je, že tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) se specifickou účinností >lU/mg pro tvorbu fenylacetylkarbinolu podle vynálezu se připravuje izolací z produkčního organismu, jejíž podstata spočívá v tom, že se použije produkční organismus s genem kódujícím PDC ze Zymomonas mobilis, v jehož DNA sekvenci je pro tryptofanový zbytek v poloze 392 kódující kodón TGG v pozici 1174-1176 nahrazen kodónem kódujícím zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
Význakem vynálezu je dále to, že sekvence DNA genu pro tiamindifostát závislý enzym pyruvátdekarboxylázu (PDC) ze Zymomonas mobilis má na místo kodónu kódujícího tryptofanový zbytek v poloze 392 v pozici 1174-1176 zaveden kodón kódující zbytek přirozené alifatické aminokyseliny. Dalším význakem je to, že sekvence DNA má v pozici 1174-1176 kodón kódující alaninový zbytek.
Vynález zahrnuje rovněž způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy (PDC) jehož podstata spočívá v tom, že se jako PDC použije enzym PDC ze Zymomonas mobilis, u kterého tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené aminokyseliny.
Výše uvedený způsob podle vynálezu se v podstatě vyznačuje tím, že se jako PDC použije enzym, u kterého je tryptofanový zbytek v substrátovém kanálu vedoucímu k aktivnímu centru nahrazen stericky menším zbytkem aminokyseliny.
U stericky menšího zbytku aminokyseliny se jedná zvláště o nějakou jednoduchou, zejména přirozenou alifatickou aminokyselinu, jako konkrétně o alanin, glycin, fenylalanin, leucin, isoleucin, arginin nebo histidin nebo také serin a threonin.
Geneticko-technologicky změněná nová PDC se získá výměnou pro tryptofan v poloze 392 kódujícího kodónu TGG na pozici 1174-1176 sekvence DNA PDC genu ze Zymomonas mobilis o sobě známým způsobem a expresí PDC v produkčním organismu, jako je zvláště Escherichia coli, ze kterého se PDC izoluje. Cílená mutace probíhá například pomocí polymerázové řetězové reakce při použití dále (na straně 6) uvedeného primeru. Konstrukce expresního vektoru pBTac2 pro mutovanou PDC se prováděla tak, že se vycházelo z expresního vektoru pPDC E.coli enzymu divokého typu.
Získávání mutované PDC se provádí po sklizení a otevření buněk z hrubého extraktu chromatografickými metodami způsobem o sobě známým.
Přeměnou PDC podle vynálezu se její kapacita syntézy (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) zlepšuje o faktor 4. Toto zlepšení je výsledkem cíleného oslabení případně odstranění limitace přístupu k aktivnímu centru enzymu vedoucího substrátového kanálu, čímž se usnadňuje přístup objemnější substrátové molekuly k aktivnímu centru a odchod vytvořeného produktu.
Analogická optimalizace se dosahuje obecně u tiamindifosfát-závislých enzymů, které vykazují přístupovou limitaci - ať již stericky, nebo vlivy nabíjením podmíněného způsobu - do substrátového kanálu vedoucího k aktivnímu centru. Analogickou přeměnou sekvence DNA pro enzym kódujícího genu a sice prostřednictvím výměny přístup limitujícího kódujícího kodónu kodónem, který kóduje zbytek aminokyseliny odstraňující přístupovou limitaci, se dosáhne značného zvýšení syntézní kapacity enzymu.
-2CZ 287619 B6
Pyruvátdekarboxyláza (PDC) získaná podle vynálezu je pro syntézu (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) mimořádně zajímavá, protože s její pomocí lze dosáhnout vysoké optické čistoty R-(-)-isomeru (»98 %) a dále PAC, která je provázena pouze malým procentem (23 %) 2-hydroxypropiofenonu. Získání a izolace enzymu ze sklizeného mikroorganismu je možné relativně jednoduchým způsobem (ve srovnání s droždím).
Při enzymatické acyloinové kondenzaci prostřednictvím PDC lze použít jako substrát lineární a/nebo rozvětvené α-ketokarbonové kyseliny a jako substrát a/nebo kosubstrát aldehydy aromatické, cyklické, s dlouhým řetězcem a/nebo řetězcem rozvětveným. Jako příklad lze zde uvést benzaldehyd, cyklohexanaldehyd, furfurol, aldehyd kyseliny skořicové, krotonaldehyd, pyruvát, kyselinu 2-ketomáselnou, kyselinu 2-ketopentanovou, kyselinu 2-keto-4-metylhexanovou, kyselinu 2-keto-4-metylpentanovou, kyselinu 2-keto-4,4-dimetylhexanovou, kyselinu 3-fenyl2-keto-propanovou.
Další zvláštnosti vynálezu vyplývají z patentových nároků a následujícího popisu podrobností provedení. Dále je vynález ilustrován pomocí obrázků jež jsou níže popsány.
Obrázek 1 znázorňuje reakční schéma pro PDC pro příklad pyruvát a benzaldehyd jako substrát a kosubstrát s hlavní cestou dekarboxylace a vedlejší reakce karboligázy s tvorbou PAC;
Obrázek 2 znázorňuje konstrukční schéma pro tvorbu expresního vektoru pPDC obsahujícího PDC ze Zymomonas mobilis.
Obrázek 3 znázorňuje schéma produkce PAC podle obrázku 1 optimalizované zachycením acetaldehydu prostřednictvím alkoholdehydrogenázy.
Příklad provedení
Příklad
1. Výroba PDC-mutantu PDC-W392A
1.1 Konstrukce expresního vektoru pPDC
Pro expresi PDC ze Zymomonas mobilis byl zvolen vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim). Transkripce cizího genu je kontrolována silným tacpromotorem, hybridem z trp- a lacUVpromotoru s 11 násobnou případně 3 násobnou účinností rodičovských promotorů. Sekvence operátoru a oblast vazby ribozomu pocházejí z genu lacZ. Regulace transkripce se takto provádí lac-represorem nadexpremierujícího (laciQ) bakteriálního kmene a je indukovatelná isopropylβ-d-tiogalaktosidem (IPTG). Vektor obsahuje jednu jedinou rozeznávací sekvenci restrikční endonukleázy EcoRI, následovanou iniciačním kodónem ATG a dále pak dalšími restrikčními rozeznávacími sekvencemi (sites), takže tento vektor může být použit univerzálně k expresi genových sekvencí jak s a nebo také bez vlastního iniciačního kodónu.
Násobné klónovací místo následují silné ribozomální RNA transkripční terminátory rmB, aby se zaručilo kontrolovatelné přerušení transkripce. Jako výchozí materiál pro klonování genu PDC ze Zymomonas mobilis (ATCC 29191) byl k dispozici vektor pZY134B (G. Sprenger, Institut fůr Biotechnologie 2, KFA-Jůlich). Tento plazmid obsahuje 3.2 kb velký fragment DNA ze Zymomonas mobilis s úplným genem PDC včetně nekódujících regionů (obrázek 2). Aby se umožnila ligace kódovaných sekvencí v expresním vektoru, bylo potřebné zavést ve směru 5‘ iniciačního kodónu novou restrikční rozeznávací sekvenci. Optimální vzdálenost iniciačního kodónu od Shine-Dalgarmovy-sekvence vektoru zajišťuje ligaci genu na EcoRI-site vektoru pBTac2. Elegantní a jednoduchou metodu k modifikaci sekvence DNA nabízí polymerázová
-3CZ 287619 B6 řetězová reakce (PCR). Opakované cykly tepelné denaturace dvojvlákna DNA a enzymatická syntéza pomocí termostabilní polymerázy DNA umožňují exponenciální zesílení (amplifíkaci) definovaných fragmentů DNA. Velikost a identita produktu je podmíněna východiskem (primerem) syntézy. Jestliže příměry obsahují modifikaci původní sekvence, například mutace, delece nebo také dodatkové báze (inzerce), budou tyto v důsledku toho k dispozici také v syntetickém fragmentu.
Touto metodou bylo zavedeno potřebné EcoRI-restrikční místo ve směru 5‘ iniciačního kodónu PDC genu, tak že během oligonukleotidové syntézy byla na 5‘-konci primeru komplementárního ke genu připojena rozeznávací sekvence enzymu. Protože některé endonukleázy mají silně sníženou aktivitu pro restrikci koncových sekvencí, byly na EcoRI-site vzestupně zavedeny čtyři další báze.
Pro PCR většinou používaná taq-polymeráza neobsahuje žádnou 3‘-5‘-exonukleázovou aktivitu (proof-reading). Jí syntetizovaná sekvence je v důsledku toho ovlivněna statistickou mírou chyby. I když toto lze volbou vhodných reakčních podmínek udržet na velmi nepatrné míře 1/100.000, podmiňuje to také nezbytnost sekvencování každého fragmentu, aby byla zajištěna integrita syntézy. Proto nebyl k amplifíkaci zvolen celý kódovaný region genu PDC (1712 bp), ale menší fragment (890 bp) od 5‘-konce až k jednotlivému restrikčnímu místu (EcoRV) (obrázek 2).
Produkt PCR byl potlačen odpovídajícími restrikčními endonukleázami EcoRI a EcoRV.
Chybějící druhá část PDC genu byla získána restrikcí pomocí ECoRV a BamHI z plazmidu pZY134B, přičemž takto vzniklý fragment (1.2 kb) na 3‘-konci obsahuje ještě asi 350 bp netranslatované sekvence PDC genu. Oba fragmenty byly separovány preparitivní elektroforézou na agarosovém gelu, izolovány a ligovány do EcoRI a BamHI linearizovaného, izolovaného pBTac2 (4.6 kb). Klonování se provádělo v E.coli JM 109, kmenem přeexprimujím Iac-represor.
1.2 Molekulárně biologické práce
Pro získání PDC mutované prostřednictvím výměny tryptofan/alanin v poloze 392 byl nejdříve u enzymu divokého typu existující kodón TGG (tryptofan) vyměněn za GCG (alanin) (výměna polohy 1174-1176 genu pyruvátdekarboxylázy ze Zymomonas mobilis). Zavedení cílené mutace se provádělo pomocí Ho et al. popsanou metodou podporovanou polymerázovou řetězovou reakcí (S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene 77 (1989) strana 51).
Jako východisko byl k dispozici PDC gen ze Zymomonas mobilis v expresním vektoru pPDC E.coli (viz obrázek 2). Izolace DNA se prováděla standardními metodami (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).
Jako templát pro syntézu obou se překrývajících jednotlivých fragmentů sloužil plazmid pPDC. Primery (příměrové sekvence podle přílohy) byly použity v koncentraci 0,2-0,4 nM. Reakce se prováděla taq polymerázou (Biomasters, Kolín nad Rýnem) ve výrobcem udávaném reakčním pufru, plus 1,5 mM MgCl2 a po 0,2 mM nukleotidu v „Robo-Cycler“ (Stratgene) s následujícím teplotním programem: 2,5 minut 94 °C pro denaturaci, potom 30 cyklů s 1,5 minutovou denaturací při 94 °C, 1,2 minut temperování při 48 °C a 2 minutovém prodloužení při 72 °C, následované 10 minutami při 72 °C k dokončení reakce. Temperovací teplota se pohybovala mezi 48 °C a 56 °C, podle teoretické teploty tání použitého primeru. Teplota tání oligonukleotidů byla vypočtena na základě následujícího vzorce:
Tm = 2*(A+T) + 3*(C+G)
Fragmenty byly separovány elektroforeticky, izolovány, vysráženy pro koncentrování etanolem a opět zachyceny do tris-HCl-pufru, 10 mM, pH 7,4.
-4CZ 287619 B6
V druhé kombinované PCR bylo vždy použito jako templátu asi 50-100 ng překrývajících se fragmentů. Další reakční podmínky byly identické jako u první reakce. Volba teploty temperování se řídila podle teploty tání výsledného překrývaného regionu fragmentů. Další manipulace (restrikce, izolace, ligace) pro nahrazení DNA divokého typu v expresním vektoru pPDC mutovanými fragmenty se prováděly standardními metodami (J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).
Sekvence použitých primerů
Číslování se vztahuje na 1. (5‘)-nukleotidovou PDC sekvenci s = smysl, as = antismysl (protismysl)
Mutované báze jsou podtrženy.
Primer pro syntézu jednotlivého 5‘-fragmentu
PDC867s
CTACTCCACCACTGGTTGGACG
PDC1186as
GAGGATTGAAGGAGAGTCACC
Primer pro syntézu jednotlivého 3‘-fragmentu
PDC1159s
GAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC
PBTAC453as
ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci v návaznosti na PDC sekvenci PDC)
Primer pro syntézu fuzního fragmentu
PDC867S
CTACTCCACCACTGGTTGGAGG
PBTAC453as
ATCTTCTCTATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci navazující na sekvenci PDC)
-5CZ 287619 B6
DNA sekvence pro PDC ze Zymomonas mobilis atgagttata ctgtcggtac ctatttagcg gagcggcttg tccagattgg tctcaagcat 60 cacttcgcag tcgcgggcga ctacaacctc gtccttcttg acaacctgct tttgaacaaa 120 aacatggagc aggtttattg ctgtaacgaa ctgaactgcg gtttcagtgc agaaggttat 180 gctcgtgcca aaggcgcagc agcagccgtc gttacctaca gcgttggtgc gctttccgca 240 tttgatgcta tcggtggcgc ctatgcagaa aaccttccgg ttatcctgat ctccggtgct 300 ccgaacaaca acgaccacgc tgctggtcat gtgttgcatc acgctcttgg caaaaccgac 360 tatcactatc agttggaaat ggccaagaac atcacggccg ccgctgaagc gatttacacc 420 ccggaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgatcaaaa ctgctcttcg cgagaagaag 480 ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540 gcaagtgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagcat ccttgaatgc agcggttgac 600 gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660 cgcgctgctg gtgctgaaga agctgctgtt aaattcaccg acgctttggg cggtgcagtg 720 gctactatgg ctgctgccaa gagcttcttc ccagaagaaa atgccaatta cattggtacc 780 tcatggggcg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840 atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg gttggacgga tatccctgat 900 cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgttg tcaacggcat tcgcttcccc 960 agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020 tctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080 ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acattggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtt gctcagatgg ttčgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgc taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707
1.3 Exprese a čištění
Expresí modifikované DNA v buňkách E.coli byl obdržen enzym podle (PDC-W392A). Mutovaný enzym (mutant) PDC-W392A byl exprimován podle následujícího postupu a vyčištěn z buněčného extraktu:
Buňky E.coli nesoucí expresní plazmid pro mutanty PDC-W392A byly v LB prostředí včetně 100pg/ml ampicilinu fermentovány pro selekci. Prostředí bylo naočkováno předkulturami ve stacionární fázi růstu v poměru 1:50 a inkubováno při 37 °C a 220 ot./min.
Indukce exprese se prováděla při OD600 z 0,6 přidáním 1 mM IPTG. Mutant PDC byl za těchto podmínek exprimován do 20 % rozpustného proteinu E.coli.
Pro výrobu postačujících množství enzymů byla provedena exprese jak je popsáno výše v 8 litrovém fermentoru. Byla nastavena hodnota pH 7,0 a proud vzduchu 101/h. Rychlost míchání činila 200 ot./min. Pro zabránění nadměrné tvorbě pěny byl přidáván podle potřeby polypropylenglykol. Buňky byly po 3 hodinové expresi sklizeny pomocí chlazeného kontinuálního odstřeďování. Následovalo potom semletí skleněnými perličkami. Za tím účelem byla
-6CZ 287619 B6 vytvořena 30% buněčná suspenze v Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, včetně 5 mM MgCl2 a 0,1 mM ThDP a přidán dvojnásobný objem skleněných perliček (d = 0,3 mm). V závislosti na zpracovávaném objemu se provádělo rozpouštění v Eppendorfových nádobách v mlýně RetschMůhle nebo po vymrazení v dezintegrátoru S (maximální objem 80 ml). Mletí se provádělo 10 minut s maximálním výkonem. Suspenze byla odstředěna, skleněné perličky omyty pufřem a spojená odstředěná kapalina zfiltrována (1 gm). Vyčištění PDC mutantů se provádělo sloupcovou chromatografíí následovně:
1. Chromatografie na iontoměničích s výměnou aniontů
Surový extrakt (asi 110 ml, cca 1,0 - 1,5 g proteinu) byl dělen na Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) 2,6*9,5 cm) s rychlostí toku 5 ml/min za použití zařízení pro rychlou kapalinovou chromatografii (FPLC firmy Pharmacia). Enzym byl eluován za použití lineárního gradientu NaCl (0 - 200 mM) v 10 mM Mes/KOH, pH 6,5, 2 mM MgCl2, 1,0 mM ThDP, při 100 mM NaCl. Frakce obsahující cílový protein byly identifikovány testem účinností (viz níže).
2. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC)
Spojené frakce byly upraveny na obsah síranu amonného s 50% nasycením přídavkem určitého objemu nasyceného roztoku síranu amonného. Hydrofobní interakční chromatografie se prováděla na buthyl-sepharose (Pharmacia) (sloupec 5*8 cm) s rychlostí toku 2 ml/min. Materiál byl před nadávkováním uveden do rovnováhy (ekvilibrován) pomocí 40 % síranu amonného v 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ThDP. Enzym se eluoval ve stejném pufru s klesajícím gradientem síranu amonného (40 - 0 %) při 24 %. Cílové frakce byly opět identifikovány pomocí testu aktivity (účinnosti) a spojeny (asi 160 ml).
3. Odsolení se provádělo Sephadexem G25 a přepufrováním na 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ThDP. Rychlost toku činila 20 ml/min. Poté byla provedena lyofilizace.
1.4 Test účinnosti (dekarboxylační reakce)
Stanovení enzymatické účinnosti bylo provedeno spojeným enzymatickým testem, přičemž se fotometricky sledovala oxidace NADH pomocným enzymem alkoholdehydrogenázou z droždí (E.C. 1.1.1.1). Reakční vsázka obsahovala 16,9 mM pyruvátu, 0,18 mM NADH a 10 U ADH v 50 mM Mes/KOH, pH 6,5, 20 mM MgSO4, 1,5 mM ThDP. Enzymová jednotka PDC (1 U) odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 gmolu substrátu během jedné minuty při 30 °C. Enzymatická účinnost se vypočte podle vzorce:
AE/min*V*f c (U/ml) =--------------------e*d*v a(NADH) = 6,3 1 * mMol-1 * cm-1
V = celkový objem v = objem vzorku d = tloušťka vrstvy kyvety (1 cm)
ΔΕ/min = extinkční pokles za minutu f = zřeďovací faktor vzorku
2. Použití PDC-W392 A pro syntézu PAC
Získávání chirálních acyloinů se může provádět tak, že se vychází z α-ketokarbonové kyseliny případně aldehydu jako substrátu a dalšího aldehydu jako kosubstrátu pomocí PDC nebo mutantu PDC.
Jako příklad lze uvést následující použití:
Syntéza PAC vycházející z pyruvátu a benzaldehydu
Syntézní vsázka obsahovala 40 mM pyruvátu, 70 mM benzaldehydu a lOU/ml PDC-W392A v 50 mM Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO4, 1,5 mM ThDP. Reakce se prováděla hodinu při 37 °C a vzniklá PAC (6,2 mM) se detekovala pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC).
Syntéza PAC vycházející z acetaldehydu a benzaldehydu
Syntézní vsázka PAC obsahovala místo pyruvátu 40 mM acetaldehydu. Jinak se postupovalo jak je popsáno výše. Po jedné hodině vzniklo 3,7 mM PAC.
Syntéza PAC pomocí PDC-W392A ve spojeném 3-enzymovém systému
Enzymatická přeměna se prováděla podle obrázku 3. Použití alkoholdehydrogenázy (ADH) z droždí (E.C. 1.1.1.1) umožňuje kontinuální odstraňování acetaldehydu a tím podmíněnou inaktivaci PDC-W392A. Formiátdehydrogenáza (FDH) zCandida boidinii (E.C. 1.2.1.2) slouží pro regeneraci NADH. Enzymatická syntéza PAC se prováděla v 20 ml Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO4,1,5 mM ThDP.
Vsázka obsahovala:
l,3U/ml PDC-W392A, 2U/ml ADH, 2,5 U/ml FDH. Počáteční koncentrace pyruvátu činila 70 mM. Dále obsahovala vsázka 2 mM NADH a 200 mM mravenčanu. Po 120 minutách bylo znovu přidáno 0,7 ml 2,1 M roztoku pyruvátu a 0,125 ml 8 M roztoku mravenčanu sodného.
V důsledku enzymatické přeměny zvýšené pH bylo titrováno kyselinou mravenčí. Po 7 hodinách vzniklo 6,8 mM PAC.
Zpracování a analytika enzymatických reakčních produktů:
Oddělení reakčních produktů se provádělo pomocí preparativní vysoce účinné kapalinové chromatografie v obrácené fázi (reversed-phase HPLC). Jako stacionární fáze byl použit sloupec C8-MOS Hypersil, 250 x 4,6 mm. Eluce se prováděla za isokratických podmínek kyselinou octovou/acetonitrilem 0,5 %/12,5 % (obj/obj) s rychlostí toku 1,5 ml/min. Doby eluce za těchto podmínek činily: PAC 4,77 min a 2-hydroxypropiofenon 5,41 min. Přiřazení vzniklých enantiomerů jako R-(-)-PAC se provádělo polarimetricky pomocí standardu z výroby PAC (Knoll AG).
Enantiomerový poměr PAC byl určen pomocí chirální plynové chromatografie jako » 98 %.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Pyruvátdekarboxyláza ze Zymomonas mobilis pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R)-(-)-fenylacetylkarbinol, produkt I, v > 95 % enantiomemí čistotě, s poměrem produktu I k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % a se specifickou aktivitou pro tvorbu produktu I >lU/mg, jejíž tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené alifatické aminokyseliny.-8CZ 287619 B6
- 2. Pyruvátdekarboxyláza podle nároku 1, kde tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.
- 3. Způsob získání pyruvátdekarboxylázy podle nároku 1, izolací z produkčního organismu, vyznačující se tím, že se použije produkční organismus sgenem kódujícím pyruvátdekarboxylázu ze Zymomonas mobilis, v jehož DNA sekvenci je pro tryptofanový zbytek v poloze 392 kódující kodón TGG v pozici 1174-1176 nahrazen kodónem kódujícím zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
- 4. Sekvence DNA genu pro enzym pyruvátdekarboxylázu ze Zymomonas mobilis podle nároku 1, kde na místo kodónu kódujícího tryptofanový zbytek v poloze 392 je v pozici 1174— 1176 zaveden kodón kódující zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.
- 5. Sekvence DNA podle nároku 4, která má v pozici 1174-1176 kodón kódující alaninový zbytek.
- 6. Způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací a-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy, vyznačující se tím, že se jako pyruvátdekarboxyláza použije enzym podle nároku 1 nebo 2.3 výkresy
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19518809 | 1995-05-26 | ||
| DE19523269A DE19523269C2 (de) | 1995-05-26 | 1995-06-29 | Verfahren zur Gewinnung von Acyloinen, dafür geeignete Pyruvat-decarboxylase sowie deren Herstellung und DNA-Sequenz des für diese kodierenden PDC-Gens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ369197A3 CZ369197A3 (cs) | 1998-02-18 |
| CZ287619B6 true CZ287619B6 (en) | 2001-01-17 |
Family
ID=26015375
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19973691A CZ287619B6 (en) | 1995-05-26 | 1996-05-22 | Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6004789A (cs) |
| EP (1) | EP0828841A2 (cs) |
| JP (1) | JPH11505710A (cs) |
| KR (1) | KR19990021965A (cs) |
| CN (1) | CN1192244A (cs) |
| AU (1) | AU714414B2 (cs) |
| BR (1) | BR9608798A (cs) |
| CA (1) | CA2222493A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ287619B6 (cs) |
| DE (1) | DE19523269C2 (cs) |
| IN (2) | IN186507B (cs) |
| WO (1) | WO1996037620A2 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19736104A1 (de) * | 1997-08-20 | 1999-02-25 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Phenylacetylcarbinolen aus Acetaldchyd und Benzaldehyd in Gegenwart von Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas |
| DE19918935A1 (de) * | 1999-04-27 | 2000-11-02 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Stereoselektive Synthese von 2-Hydroxyketonen |
| MXPA03009877A (es) * | 2001-05-04 | 2005-07-15 | Univ Florida | Clonacion y secuenciamiento de genes de piruvato decarboxilasa (pdc) a partir de bacterias y usos de los mismos. |
| DE10142467A1 (de) * | 2001-08-31 | 2003-03-20 | Basf Ag | Neue Pyruvatdecarboxylase, ihre Herstellung und Verwendung |
| DE10142574A1 (de) | 2001-09-01 | 2003-03-20 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch ein enzymatisches verfahren in einem Zweiphasensystem |
| IL147823A (en) | 2002-01-24 | 2008-06-05 | Univ Ben Gurion | Process for the preparation of alpha-hydroxy aromatic chiral ketones using acetohydroxyacide synthase |
| DE10313971A1 (de) * | 2003-03-27 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem |
| DE102014013644A1 (de) * | 2014-09-16 | 2016-03-17 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Lyase und für die Lyase kodierende DNA, die DNA enthaltende Vektoren, sowie Verfahren zur asymmetrischen Synthese von (S)-Phenylacetylcarbinol |
| CN107630049B (zh) * | 2017-04-01 | 2018-09-21 | 武汉茵茂特生物技术有限公司 | 麻黄碱的生物制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE548459C (de) * | 1930-04-09 | 1932-04-13 | Gustav Hildebrandt Dr | Verfahren zur Herstellung von 1-1-Phenyl-2-methylaminopropan-1-ol |
-
1995
- 1995-06-29 DE DE19523269A patent/DE19523269C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-05-22 CA CA002222493A patent/CA2222493A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-22 EP EP96919594A patent/EP0828841A2/de not_active Withdrawn
- 1996-05-22 KR KR1019970708440A patent/KR19990021965A/ko not_active Ceased
- 1996-05-22 BR BR9608798A patent/BR9608798A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-22 CN CN96195936A patent/CN1192244A/zh active Pending
- 1996-05-22 WO PCT/DE1996/000928 patent/WO1996037620A2/de not_active Application Discontinuation
- 1996-05-22 JP JP8535270A patent/JPH11505710A/ja active Pending
- 1996-05-22 CZ CZ19973691A patent/CZ287619B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-05-22 AU AU58102/96A patent/AU714414B2/en not_active Ceased
- 1996-05-24 IN IN946CA1996 patent/IN186507B/en unknown
-
1997
- 1997-11-24 US US08/976,852 patent/US6004789A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-11-17 IN IN647KO2000 patent/IN189539B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ369197A3 (cs) | 1998-02-18 |
| EP0828841A2 (de) | 1998-03-18 |
| WO1996037620A2 (de) | 1996-11-28 |
| AU5810296A (en) | 1996-12-11 |
| BR9608798A (pt) | 1999-02-17 |
| CA2222493A1 (en) | 1996-11-28 |
| DE19523269A1 (de) | 1996-11-28 |
| CN1192244A (zh) | 1998-09-02 |
| IN189539B (cs) | 2003-03-22 |
| JPH11505710A (ja) | 1999-05-25 |
| KR19990021965A (ko) | 1999-03-25 |
| AU714414B2 (en) | 2000-01-06 |
| US6004789A (en) | 1999-12-21 |
| DE19523269C2 (de) | 2000-05-31 |
| WO1996037620A3 (de) | 1997-02-06 |
| IN186507B (cs) | 2001-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090203096A1 (en) | Process for Production of Optically Active Alcohol | |
| WO2001061014A1 (fr) | (r)-2-octanol deshydrogenase, production de cet enzyme, adn codant pour cet enzyme et production d'alcool a l'aide de cet enzyme | |
| CN1322129C (zh) | 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法 | |
| CZ287619B6 (en) | Pyruvate decarboxylase for obtaining acyloins, process for preparing such pyruvate decarboxylase, DNA sequences of correspondingly encoding PDC-gene and process for obtaining acyloins | |
| CN111454918B (zh) | 一种烯醇还原酶突变体及其在制备(r)-香茅醛中的应用 | |
| EP1762625B1 (en) | Reductase gene and use thereof | |
| EP2562253B1 (en) | Modified carbonyl reductase, gene thereof, and method of producing optically active alcohols using these | |
| JP2004357639A (ja) | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 | |
| KR20150121789A (ko) | 2,3―부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3―부탄디올의 생산 방법 | |
| JP5761641B2 (ja) | （ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 | |
| US7250278B2 (en) | α-keto acid reductase, method for producing the same, and method for producing optically active α-hydroxy acids using the same | |
| CN112280723B (zh) | 联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用 | |
| WO2003093477A1 (fr) | Carbonyl reductase, gene de celle-ci et son utilisation | |
| WO2007099764A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4729919B2 (ja) | 微生物の培養方法及び光学活性カルボン酸の製造方法 | |
| CN113710812A (zh) | (1r,3r)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇及其中间体的生产方法 | |
| JP2002247987A (ja) | 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法 | |
| KR102598992B1 (ko) | 이소부탄올 및 폴리히드록시 부티레이트 동시 생산 균주 및 이의 이용 | |
| JP2005027552A (ja) | 新規な光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法 | |
| JP2004065049A (ja) | Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、及びその用途 | |
| WO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| JP2003289895A (ja) | メチレンジオキシフェニル基を有するケトン化合物の不斉還元による光学活性アルコール化合物の製造方法 | |
| EP1688480A2 (en) | NOVEL ACETOACETYL-CoA REDUCTASE AND PROCESS FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE ALCOHOL | |
| JP2024513194A (ja) | 副産物の生成が低減した２，３－ブタンジオール生産用の組換え微生物、及びこれを用いる２，３－ブタンジオールの生産方法 | |
| JP2004350625A (ja) | 光学活性ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20040522 |