Oblast techniky

Vynález se týká pyruvátdekarboxylázy pro získání acyloinů, způsob přípravy této pyruvátdekarboxylázy, DNA sekvence příslušně kódujícího PDC-genu a způsob získání acyloinů enzymatickou přeměnou α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti této pyruvátdekarboxylázy (PDC).

Dosavadní stav techniky

Acyloiny případně α-hydroxyketony jsou sloučeniny s jedním opticky aktivním uhlíkovým atomem, které sehrávají významnou úlohu v syntéze komplexnějších sloučenin, jako zvláště (R)(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC), který má velký ekonomický význam pro výrobu efedrinu. Zde je zajímavý R-enantiomer, který se vytváří fermentativní přeměnou z pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu pomocí Saccharomyces cerevisiae (DE-PS 548 459 z roku 1932).

Při této syntéze PAC pomocí kvasinkových buněk se na základě velkého počtu v kvasnicích existujících enzymů tvoří četné vedlejší produkty a růst buněk se inhibuje přítomností benzaldehydu.

Také z droždí izolovaná pyruvátdekarboxyláza (PDC) vede při této přeměně ke značným podílům k PAC isomemího 2-hydroxypropiofenonu.

Na tiamindifosfát- a Mg²⁺ - závislá PDC (E.C. 4.1.1.1) je široce rozšířená a nachází se v mnoha rostlinách, kvasinkách a houbách i v některých bakteriích. Katalyzuje neoxidativní dekarboxylaci pyruvátu na acetaldehyd a jako vedlejší reakce probíhá kondenzace acyloinů za vzniku ahydroxyketonů jak je vidět z obr. 1.

Takováto enzymatická přeměna probíhá také, když se vychází z aldehydu místo z a-ketokarbonových kyselin a na kondenzační reakci se může také podílet dekarboxylaci vytvořený aldehyd jako „kosubstrát“ za vzniku homoacyloinů R-CHOH-CO-R‘, kde R = R‘.

Pyruvátdekarboxyláza (PDC) byla již také izolována ze Zymomonas mobilis. Porovnání pyruvátdekarboxylázy (PDC) izolované z droždí s pyruvátdekarboxylázou (PDC) ze Zymomanas mobilis, případně tvorby (R)-(-)-fenylacetylkarbonilu (PAC) za srovnatelných podmínek však vykazovalo výrazně menší syntézní kapacitu PDC ze Zymomonas mobilis (S. Bringer-Meyer a H. Sahm, Biocatalysis (1988) strana 321-331).

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že cílenou geneticko-technologickou přeměnou genu PDC ze Zymomonas mobilis, lze získat PDC se zlepšenou kapacitou syntézy pokud se týká tvorby PAC, která se navíc vyznačuje vysokou selektivitou pro tvorbu PAC ve srovnání s 2-hydroxypropiofenonem.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je pyruvátdekarboxyláza (PDC) ze Zymomonas mobilis pro přeměnu pyruvátu za přítomnosti benzaldehydu na (R)-(-)-fenylacetylkarbinol (produkt I) v ž 95 % enantiomemí čistotě s poměrem produktu I k 2-hydroxypropiofenonu > 95 % a se

-1CZ 287619 B6 specifickou aktivitou pro tvorbu produktu I >lU/mg, jejíž, tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené alifatické aminokyseliny.

Dalším význakem vynálezu je, že tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen alaninovým zbytkem.

Pyruvátdekarboxyláza (PDC) se specifickou účinností >lU/mg pro tvorbu fenylacetylkarbinolu podle vynálezu se připravuje izolací z produkčního organismu, jejíž podstata spočívá v tom, že se použije produkční organismus s genem kódujícím PDC ze Zymomonas mobilis, v jehož DNA sekvenci je pro tryptofanový zbytek v poloze 392 kódující kodón TGG v pozici 1174-1176 nahrazen kodónem kódujícím zbytek přirozené alifatické aminokyseliny.

Význakem vynálezu je dále to, že sekvence DNA genu pro tiamindifostát závislý enzym pyruvátdekarboxylázu (PDC) ze Zymomonas mobilis má na místo kodónu kódujícího tryptofanový zbytek v poloze 392 v pozici 1174-1176 zaveden kodón kódující zbytek přirozené alifatické aminokyseliny. Dalším význakem je to, že sekvence DNA má v pozici 1174-1176 kodón kódující alaninový zbytek.

Vynález zahrnuje rovněž způsob enzymatického získávání acyloinů enzymatickou acyloinovou kondenzací α-ketokarbonových kyselin a/nebo aldehydů za přítomnosti pyruvátdekarboxylázy (PDC) jehož podstata spočívá v tom, že se jako PDC použije enzym PDC ze Zymomonas mobilis, u kterého tryptofanový zbytek v poloze 392 je nahrazen zbytkem přirozené aminokyseliny.

Výše uvedený způsob podle vynálezu se v podstatě vyznačuje tím, že se jako PDC použije enzym, u kterého je tryptofanový zbytek v substrátovém kanálu vedoucímu k aktivnímu centru nahrazen stericky menším zbytkem aminokyseliny.

U stericky menšího zbytku aminokyseliny se jedná zvláště o nějakou jednoduchou, zejména přirozenou alifatickou aminokyselinu, jako konkrétně o alanin, glycin, fenylalanin, leucin, isoleucin, arginin nebo histidin nebo také serin a threonin.

Geneticko-technologicky změněná nová PDC se získá výměnou pro tryptofan v poloze 392 kódujícího kodónu TGG na pozici 1174-1176 sekvence DNA PDC genu ze Zymomonas mobilis o sobě známým způsobem a expresí PDC v produkčním organismu, jako je zvláště Escherichia coli, ze kterého se PDC izoluje. Cílená mutace probíhá například pomocí polymerázové řetězové reakce při použití dále (na straně 6) uvedeného primeru. Konstrukce expresního vektoru pBTac2 pro mutovanou PDC se prováděla tak, že se vycházelo z expresního vektoru pPDC E.coli enzymu divokého typu.

Získávání mutované PDC se provádí po sklizení a otevření buněk z hrubého extraktu chromatografickými metodami způsobem o sobě známým.

Přeměnou PDC podle vynálezu se její kapacita syntézy (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) zlepšuje o faktor 4. Toto zlepšení je výsledkem cíleného oslabení případně odstranění limitace přístupu k aktivnímu centru enzymu vedoucího substrátového kanálu, čímž se usnadňuje přístup objemnější substrátové molekuly k aktivnímu centru a odchod vytvořeného produktu.

Analogická optimalizace se dosahuje obecně u tiamindifosfát-závislých enzymů, které vykazují přístupovou limitaci - ať již stericky, nebo vlivy nabíjením podmíněného způsobu - do substrátového kanálu vedoucího k aktivnímu centru. Analogickou přeměnou sekvence DNA pro enzym kódujícího genu a sice prostřednictvím výměny přístup limitujícího kódujícího kodónu kodónem, který kóduje zbytek aminokyseliny odstraňující přístupovou limitaci, se dosáhne značného zvýšení syntézní kapacity enzymu.

-2CZ 287619 B6

Pyruvátdekarboxyláza (PDC) získaná podle vynálezu je pro syntézu (R)-(-)-fenylacetylkarbinolu (PAC) mimořádně zajímavá, protože s její pomocí lze dosáhnout vysoké optické čistoty R-(-)-isomeru (»98 %) a dále PAC, která je provázena pouze malým procentem (23 %) 2-hydroxypropiofenonu. Získání a izolace enzymu ze sklizeného mikroorganismu je možné relativně jednoduchým způsobem (ve srovnání s droždím).

Při enzymatické acyloinové kondenzaci prostřednictvím PDC lze použít jako substrát lineární a/nebo rozvětvené α-ketokarbonové kyseliny a jako substrát a/nebo kosubstrát aldehydy aromatické, cyklické, s dlouhým řetězcem a/nebo řetězcem rozvětveným. Jako příklad lze zde uvést benzaldehyd, cyklohexanaldehyd, furfurol, aldehyd kyseliny skořicové, krotonaldehyd, pyruvát, kyselinu 2-ketomáselnou, kyselinu 2-ketopentanovou, kyselinu 2-keto-4-metylhexanovou, kyselinu 2-keto-4-metylpentanovou, kyselinu 2-keto-4,4-dimetylhexanovou, kyselinu 3-fenyl2-keto-propanovou.

Další zvláštnosti vynálezu vyplývají z patentových nároků a následujícího popisu podrobností provedení. Dále je vynález ilustrován pomocí obrázků jež jsou níže popsány.

Obrázek 1 znázorňuje reakční schéma pro PDC pro příklad pyruvát a benzaldehyd jako substrát a kosubstrát s hlavní cestou dekarboxylace a vedlejší reakce karboligázy s tvorbou PAC;

Obrázek 2 znázorňuje konstrukční schéma pro tvorbu expresního vektoru pPDC obsahujícího PDC ze Zymomonas mobilis.

Obrázek 3 znázorňuje schéma produkce PAC podle obrázku 1 optimalizované zachycením acetaldehydu prostřednictvím alkoholdehydrogenázy.

Příklad provedení

Příklad

1. Výroba PDC-mutantu PDC-W392A

1.1 Konstrukce expresního vektoru pPDC

Pro expresi PDC ze Zymomonas mobilis byl zvolen vektor pBTac2 (Boehringer, Mannheim). Transkripce cizího genu je kontrolována silným tacpromotorem, hybridem z trp- a lacUVpromotoru s 11 násobnou případně 3 násobnou účinností rodičovských promotorů. Sekvence operátoru a oblast vazby ribozomu pocházejí z genu lacZ. Regulace transkripce se takto provádí lac-represorem nadexpremierujícího (laciQ) bakteriálního kmene a je indukovatelná isopropylβ-d-tiogalaktosidem (IPTG). Vektor obsahuje jednu jedinou rozeznávací sekvenci restrikční endonukleázy EcoRI, následovanou iniciačním kodónem ATG a dále pak dalšími restrikčními rozeznávacími sekvencemi (sites), takže tento vektor může být použit univerzálně k expresi genových sekvencí jak s a nebo také bez vlastního iniciačního kodónu.

Násobné klónovací místo následují silné ribozomální RNA transkripční terminátory rmB, aby se zaručilo kontrolovatelné přerušení transkripce. Jako výchozí materiál pro klonování genu PDC ze Zymomonas mobilis (ATCC 29191) byl k dispozici vektor pZY134B (G. Sprenger, Institut fůr Biotechnologie 2, KFA-Jůlich). Tento plazmid obsahuje 3.2 kb velký fragment DNA ze Zymomonas mobilis s úplným genem PDC včetně nekódujících regionů (obrázek 2). Aby se umožnila ligace kódovaných sekvencí v expresním vektoru, bylo potřebné zavést ve směru 5‘ iniciačního kodónu novou restrikční rozeznávací sekvenci. Optimální vzdálenost iniciačního kodónu od Shine-Dalgarmovy-sekvence vektoru zajišťuje ligaci genu na EcoRI-site vektoru pBTac2. Elegantní a jednoduchou metodu k modifikaci sekvence DNA nabízí polymerázová

-3CZ 287619 B6 řetězová reakce (PCR). Opakované cykly tepelné denaturace dvojvlákna DNA a enzymatická syntéza pomocí termostabilní polymerázy DNA umožňují exponenciální zesílení (amplifíkaci) definovaných fragmentů DNA. Velikost a identita produktu je podmíněna východiskem (primerem) syntézy. Jestliže příměry obsahují modifikaci původní sekvence, například mutace, delece nebo také dodatkové báze (inzerce), budou tyto v důsledku toho k dispozici také v syntetickém fragmentu.

Touto metodou bylo zavedeno potřebné EcoRI-restrikční místo ve směru 5‘ iniciačního kodónu PDC genu, tak že během oligonukleotidové syntézy byla na 5‘-konci primeru komplementárního ke genu připojena rozeznávací sekvence enzymu. Protože některé endonukleázy mají silně sníženou aktivitu pro restrikci koncových sekvencí, byly na EcoRI-site vzestupně zavedeny čtyři další báze.

Pro PCR většinou používaná taq-polymeráza neobsahuje žádnou 3‘-5‘-exonukleázovou aktivitu (proof-reading). Jí syntetizovaná sekvence je v důsledku toho ovlivněna statistickou mírou chyby. I když toto lze volbou vhodných reakčních podmínek udržet na velmi nepatrné míře 1/100.000, podmiňuje to také nezbytnost sekvencování každého fragmentu, aby byla zajištěna integrita syntézy. Proto nebyl k amplifíkaci zvolen celý kódovaný region genu PDC (1712 bp), ale menší fragment (890 bp) od 5‘-konce až k jednotlivému restrikčnímu místu (EcoRV) (obrázek 2).

Produkt PCR byl potlačen odpovídajícími restrikčními endonukleázami EcoRI a EcoRV.

Chybějící druhá část PDC genu byla získána restrikcí pomocí ECoRV a BamHI z plazmidu pZY134B, přičemž takto vzniklý fragment (1.2 kb) na 3‘-konci obsahuje ještě asi 350 bp netranslatované sekvence PDC genu. Oba fragmenty byly separovány preparitivní elektroforézou na agarosovém gelu, izolovány a ligovány do EcoRI a BamHI linearizovaného, izolovaného pBTac2 (4.6 kb). Klonování se provádělo v E.coli JM 109, kmenem přeexprimujím Iac-represor.

1.2 Molekulárně biologické práce

Pro získání PDC mutované prostřednictvím výměny tryptofan/alanin v poloze 392 byl nejdříve u enzymu divokého typu existující kodón TGG (tryptofan) vyměněn za GCG (alanin) (výměna polohy 1174-1176 genu pyruvátdekarboxylázy ze Zymomonas mobilis). Zavedení cílené mutace se provádělo pomocí Ho et al. popsanou metodou podporovanou polymerázovou řetězovou reakcí (S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene 77 (1989) strana 51).

Jako východisko byl k dispozici PDC gen ze Zymomonas mobilis v expresním vektoru pPDC E.coli (viz obrázek 2). Izolace DNA se prováděla standardními metodami (J. Sambroch, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Sping Harbor Laboratory Press).

Jako templát pro syntézu obou se překrývajících jednotlivých fragmentů sloužil plazmid pPDC. Primery (příměrové sekvence podle přílohy) byly použity v koncentraci 0,2-0,4 nM. Reakce se prováděla taq polymerázou (Biomasters, Kolín nad Rýnem) ve výrobcem udávaném reakčním pufru, plus 1,5 mM MgCl₂ a po 0,2 mM nukleotidu v „Robo-Cycler“ (Stratgene) s následujícím teplotním programem: 2,5 minut 94 °C pro denaturaci, potom 30 cyklů s 1,5 minutovou denaturací při 94 °C, 1,2 minut temperování při 48 °C a 2 minutovém prodloužení při 72 °C, následované 10 minutami při 72 °C k dokončení reakce. Temperovací teplota se pohybovala mezi 48 °C a 56 °C, podle teoretické teploty tání použitého primeru. Teplota tání oligonukleotidů byla vypočtena na základě následujícího vzorce:

Tm = 2*(A+T) + 3*(C+G)

Fragmenty byly separovány elektroforeticky, izolovány, vysráženy pro koncentrování etanolem a opět zachyceny do tris-HCl-pufru, 10 mM, pH 7,4.

-4CZ 287619 B6

V druhé kombinované PCR bylo vždy použito jako templátu asi 50-100 ng překrývajících se fragmentů. Další reakční podmínky byly identické jako u první reakce. Volba teploty temperování se řídila podle teploty tání výsledného překrývaného regionu fragmentů. Další manipulace (restrikce, izolace, ligace) pro nahrazení DNA divokého typu v expresním vektoru pPDC mutovanými fragmenty se prováděly standardními metodami (J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning (1989) Spring Harbor Laboratory Press).

Sekvence použitých primerů

Číslování se vztahuje na 1. (5‘)-nukleotidovou PDC sekvenci s = smysl, as = antismysl (protismysl)

Mutované báze jsou podtrženy.

Primer pro syntézu jednotlivého 5‘-fragmentu

PDC867s

CTACTCCACCACTGGTTGGACG

PDC1186as

GAGGATTGAAGGAGAGTCACC

Primer pro syntézu jednotlivého 3‘-fragmentu

PDC1159s

GAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC

PBTAC453as

ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci v návaznosti na PDC sekvenci PDC)

Primer pro syntézu fuzního fragmentu

PDC867S

CTACTCCACCACTGGTTGGAGG

PBTAC453as

ATCTTCTCTATCCGCCAAACA (tento primer je komplementární k vektorové sekvenci na 3‘-konci navazující na sekvenci PDC)

-5CZ 287619 B6

DNA sekvence pro PDC ze Zymomonas mobilis atgagttata ctgtcggtac ctatttagcg gagcggcttg tccagattgg tctcaagcat 60 cacttcgcag tcgcgggcga ctacaacctc gtccttcttg acaacctgct tttgaacaaa 120 aacatggagc aggtttattg ctgtaacgaa ctgaactgcg gtttcagtgc agaaggttat 180 gctcgtgcca aaggcgcagc agcagccgtc gttacctaca gcgttggtgc gctttccgca 240 tttgatgcta tcggtggcgc ctatgcagaa aaccttccgg ttatcctgat ctccggtgct 300 ccgaacaaca acgaccacgc tgctggtcat gtgttgcatc acgctcttgg caaaaccgac 360 tatcactatc agttggaaat ggccaagaac atcacggccg ccgctgaagc gatttacacc 420 ccggaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgatcaaaa ctgctcttcg cgagaagaag 480 ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540 gcaagtgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagcat ccttgaatgc agcggttgac 600 gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660 cgcgctgctg gtgctgaaga agctgctgtt aaattcaccg acgctttggg cggtgcagtg 720 gctactatgg ctgctgccaa gagcttcttc ccagaagaaa atgccaatta cattggtacc 780 tcatggggcg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840 atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg gttggacgga tatccctgat 900 cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgttg tcaacggcat tcgcttcccc 960 agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020 tctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080 ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acattggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtt gctcagatgg ttčgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgc taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707

1.3 Exprese a čištění

Expresí modifikované DNA v buňkách E.coli byl obdržen enzym podle (PDC-W392A). Mutovaný enzym (mutant) PDC-W392A byl exprimován podle následujícího postupu a vyčištěn z buněčného extraktu:

Buňky E.coli nesoucí expresní plazmid pro mutanty PDC-W392A byly v LB prostředí včetně 100pg/ml ampicilinu fermentovány pro selekci. Prostředí bylo naočkováno předkulturami ve stacionární fázi růstu v poměru 1:50 a inkubováno při 37 °C a 220 ot./min.

Indukce exprese se prováděla při OD600 z 0,6 přidáním 1 mM IPTG. Mutant PDC byl za těchto podmínek exprimován do 20 % rozpustného proteinu E.coli.

Pro výrobu postačujících množství enzymů byla provedena exprese jak je popsáno výše v 8 litrovém fermentoru. Byla nastavena hodnota pH 7,0 a proud vzduchu 101/h. Rychlost míchání činila 200 ot./min. Pro zabránění nadměrné tvorbě pěny byl přidáván podle potřeby polypropylenglykol. Buňky byly po 3 hodinové expresi sklizeny pomocí chlazeného kontinuálního odstřeďování. Následovalo potom semletí skleněnými perličkami. Za tím účelem byla

-6CZ 287619 B6 vytvořena 30% buněčná suspenze v Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, včetně 5 mM MgCl₂ a 0,1 mM ThDP a přidán dvojnásobný objem skleněných perliček (d = 0,3 mm). V závislosti na zpracovávaném objemu se provádělo rozpouštění v Eppendorfových nádobách v mlýně RetschMůhle nebo po vymrazení v dezintegrátoru S (maximální objem 80 ml). Mletí se provádělo 10 minut s maximálním výkonem. Suspenze byla odstředěna, skleněné perličky omyty pufřem a spojená odstředěná kapalina zfiltrována (1 gm). Vyčištění PDC mutantů se provádělo sloupcovou chromatografíí následovně:

1. Chromatografie na iontoměničích s výměnou aniontů

Surový extrakt (asi 110 ml, cca 1,0 - 1,5 g proteinu) byl dělen na Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) 2,6*9,5 cm) s rychlostí toku 5 ml/min za použití zařízení pro rychlou kapalinovou chromatografii (FPLC firmy Pharmacia). Enzym byl eluován za použití lineárního gradientu NaCl (0 - 200 mM) v 10 mM Mes/KOH, pH 6,5, 2 mM MgCl₂, 1,0 mM ThDP, při 100 mM NaCl. Frakce obsahující cílový protein byly identifikovány testem účinností (viz níže).

2. Hydrofobní interakční chromatografie (HIC)

Spojené frakce byly upraveny na obsah síranu amonného s 50% nasycením přídavkem určitého objemu nasyceného roztoku síranu amonného. Hydrofobní interakční chromatografie se prováděla na buthyl-sepharose (Pharmacia) (sloupec 5*8 cm) s rychlostí toku 2 ml/min. Materiál byl před nadávkováním uveden do rovnováhy (ekvilibrován) pomocí 40 % síranu amonného v 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM ThDP. Enzym se eluoval ve stejném pufru s klesajícím gradientem síranu amonného (40 - 0 %) při 24 %. Cílové frakce byly opět identifikovány pomocí testu aktivity (účinnosti) a spojeny (asi 160 ml).

3. Odsolení se provádělo Sephadexem G25 a přepufrováním na 50 mM Mes/KOH, 2 mM MgCl₂, 0,1 mM ThDP. Rychlost toku činila 20 ml/min. Poté byla provedena lyofilizace.

1.4 Test účinnosti (dekarboxylační reakce)

Stanovení enzymatické účinnosti bylo provedeno spojeným enzymatickým testem, přičemž se fotometricky sledovala oxidace NADH pomocným enzymem alkoholdehydrogenázou z droždí (E.C. 1.1.1.1). Reakční vsázka obsahovala 16,9 mM pyruvátu, 0,18 mM NADH a 10 U ADH v 50 mM Mes/KOH, pH 6,5, 20 mM MgSO₄, 1,5 mM ThDP. Enzymová jednotka PDC (1 U) odpovídá množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 gmolu substrátu během jedné minuty při 30 °C. Enzymatická účinnost se vypočte podle vzorce:

AE/min*V*f c (U/ml) =--------------------e*d*v a(NADH) = 6,3 1 * mMol-1 * cm-1

V = celkový objem v = objem vzorku d = tloušťka vrstvy kyvety (1 cm)

ΔΕ/min = extinkční pokles za minutu f = zřeďovací faktor vzorku

2. Použití PDC-W392 A pro syntézu PAC

Získávání chirálních acyloinů se může provádět tak, že se vychází z α-ketokarbonové kyseliny případně aldehydu jako substrátu a dalšího aldehydu jako kosubstrátu pomocí PDC nebo mutantu PDC.

Jako příklad lze uvést následující použití:

Syntéza PAC vycházející z pyruvátu a benzaldehydu

Syntézní vsázka obsahovala 40 mM pyruvátu, 70 mM benzaldehydu a lOU/ml PDC-W392A v 50 mM Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO₄, 1,5 mM ThDP. Reakce se prováděla hodinu při 37 °C a vzniklá PAC (6,2 mM) se detekovala pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC).

Syntéza PAC vycházející z acetaldehydu a benzaldehydu

Syntézní vsázka PAC obsahovala místo pyruvátu 40 mM acetaldehydu. Jinak se postupovalo jak je popsáno výše. Po jedné hodině vzniklo 3,7 mM PAC.

Syntéza PAC pomocí PDC-W392A ve spojeném 3-enzymovém systému

Enzymatická přeměna se prováděla podle obrázku 3. Použití alkoholdehydrogenázy (ADH) z droždí (E.C. 1.1.1.1) umožňuje kontinuální odstraňování acetaldehydu a tím podmíněnou inaktivaci PDC-W392A. Formiátdehydrogenáza (FDH) zCandida boidinii (E.C. 1.2.1.2) slouží pro regeneraci NADH. Enzymatická syntéza PAC se prováděla v 20 ml Mes/KOH-pufru, 50 mM, pH 6,5, 20 mM MgSO₄,1,5 mM ThDP.

Vsázka obsahovala:

l,3U/ml PDC-W392A, 2U/ml ADH, 2,5 U/ml FDH. Počáteční koncentrace pyruvátu činila 70 mM. Dále obsahovala vsázka 2 mM NADH a 200 mM mravenčanu. Po 120 minutách bylo znovu přidáno 0,7 ml 2,1 M roztoku pyruvátu a 0,125 ml 8 M roztoku mravenčanu sodného.

V důsledku enzymatické přeměny zvýšené pH bylo titrováno kyselinou mravenčí. Po 7 hodinách vzniklo 6,8 mM PAC.

Zpracování a analytika enzymatických reakčních produktů:

Oddělení reakčních produktů se provádělo pomocí preparativní vysoce účinné kapalinové chromatografie v obrácené fázi (reversed-phase HPLC). Jako stacionární fáze byl použit sloupec C8-MOS Hypersil, 250 x 4,6 mm. Eluce se prováděla za isokratických podmínek kyselinou octovou/acetonitrilem 0,5 %/12,5 % (obj/obj) s rychlostí toku 1,5 ml/min. Doby eluce za těchto podmínek činily: PAC 4,77 min a 2-hydroxypropiofenon 5,41 min. Přiřazení vzniklých enantiomerů jako R-(-)-PAC se provádělo polarimetricky pomocí standardu z výroby PAC (Knoll AG).

Enantiomerový poměr PAC byl určen pomocí chirální plynové chromatografie jako » 98 %.