KR19990021965A

KR19990021965A - 아실로인의 수득 방법, 그 방법에 적합한 피루베이트 디카르복실라제와 그 제법 및 그 피루베이트 디카르복실라제를 코드화하는 피루베이트 디카르복실라제 유전자의 ｄｎａ서열

Info

Publication number: KR19990021965A
Application number: KR1019970708440A
Authority: KR
Inventors: 하이케 브룬; 마르티나 폴; 카트린 메쉬; 마리아-레기나 쿨라
Original assignee: 아달베르트 베. 플라텐타이히, 하; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 1999-03-25
Also published as: DE19523269C2; DE19523269A1; WO1996037620A2; CN1192244A; CZ369197A3; BR9608798A; WO1996037620A3; IN189539B; CZ287619B6; AU714414B2; CA2222493A1; US6004789A; AU5810296A; EP0828841A2; IN186507B; JPH11505710A

Abstract

본 발명은 생성자 유기물로부터의 분리에 의해 피루베이트 디카르복실라제를 수득하는 방법에 관한 것이다. 피루베이트 디카르복실라제는 ≥95% 거울상체 단위의 R-(-)-페닐아세틸카르비놀(I)을 2-히드록시프로피오페논에 대한 I의 생성비 ≥95%로 생성할 수 있고, ＞1 U/mg의 페닐아세틸카르비놀 생성에 관한 비활성을 갖는다. 본 발명의 목적은 R-(-)-페닐아세틸카르비놀의 형성에 대한 개선된 합성 능력을 지닌 피루베이트 디카르복실라제를 얻는 것이다. 그러한 목적으로 개발된 본 발명의 방법은 지모모나스 모빌리스로부터 피루베이트 디카르복실라제를 코드화하는 유전자를 구비한 생성자 유기체를 사용하여, 그 유전자의 DNA 서열 중에서 위치 1174-1176에 있는 트립토판 기를 코드화하는 코돈 TGG를 감소된 체적비의 아미노산 기를 코드화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 한다.

Description

아실로인의 수득 방법, 그 방법에 적합한 피루베이트 디카르복실라제와 그 제법 및 그 피루베이트 디카르복실라제를 코드화하는 피루베이트 디카르복실라제 유전자의 ＤＮＡ서열

아실로인 또는 α-히드록시케톤은 광학활성이 있는 C 원자를 구비한 화합물로서, 특히 에페드린의 경제적인 제조에 매우 유익한 (R)-(-)-페닐아세틸카르비놀(PAC)과 같은 복잡한 화합물을 합성하는 데에 중요한 역할을 담당한다. 그러한 화합물의 합성에 있어서, 관심을 모으고 있는 것은 벤즈알데히드의 존재하에 Saccharomyces cerevisiae 를 이용하여 피루베이트를 발효 변환시킴으로써 배양 방식으로 생성되는 R-거울상체(enantiomer)이다.

그와 같이 효모 세포에 의해 PAC를 합성할 경우, 효모 중에 존재하는 다수의 효소에 의해 다수의 부산물이 생성되고, 벤즈알데히드의 존재로 인해 세포의 성장이 억제된다.

또한, 그러한 변환에 있어서, 효모로부터 분리된 피루베이트 디카르복실라제(PDC)는 2-히드록시프로피오페논을 PAC로 이성질화시키는 것에 상당한 정도로 관여한다.

티아민디포스페이트와 Mg²⁺에 의존하는 PDC(예컨대, 4.1.1.1)는 광범위하게 유포되어 있고, 다수의 식물, 효모, 균류 및 몇 종의 박테리아 중에서 발견된다. 도 1로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 그러한 PDC는 피루베이트로부터 아세트알데히드로의 비산화성 디카르복실화 반응의 촉매로 작용하고, 부수적 반응으로서 히드록시케톤의 생성 하에 아실로인의 축합 반응을 실시한다.

그러한 효소 작용에 의한 변환은 α-케토카르복실산 대신에 알데히드를 출발 물질로 하여 실시되기도 하는데, 디카르복실화 반응에 의해 생성된 알데히드도 역시 보조 기질(co-substrate)로서 호모아실로인 R-CHOH-CO-R'의 생성 하에 축합 반응에 참여할 수 있다.

PDC는 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터 미리 분리되기도 한다. 그러나, 대비될 수 있는 조건 하에서 PAC의 생성과 관련하여 효모로부터 분리된 PDC를 지모모나스 모빌리스로부터 분리된 PDC와 비교하면, 지모모나스 모빌리스로부터 분리된 PDC의 합성 능력이 현저히 더 낮은 것으로 나타난다(에스. 브링거-마이어(S. Bringer-Meyer) 및 에이치. 샴(H. Sahm), Biocatalysis 1(1988) S. 321-331).

본 발명은 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase; PDC)의 존재 하에 α-케토카르복실산 및/또는 알데히드를 그 효소에 의해 변환시킴으로써 아실로인(acyloin)을 수득하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 아실로인의 수득 방법에 적합한 PDC, 그 제법 및 그 PDC를 코드화하는 유전자를 포함하는 것이다.

이하, 본 발명의 다른 특징들을 청구 범위 및 첨부 도면을 참조로 한 이후의 실시예의 설명에서 상세히 후술하기로 한다. 각각의 첨부 도면은 다음과 같다:

도 1은 기질 및 공유 기질로서 피루베이트 및 벤즈알데히드가 예시된 PDC의 반응 개요를 카르복실화 반응 및 PAC의 생성을 수반하는 카르보리가제(carboligase) 부수 반응의 주경로와 함께 나타낸 도면이고,

도 2는 지모모나스 모빌리스로부터의 PDC를 함유하는 발현 매개체 pPDC의 생성을 위한 구조의 개요를 나타낸 도면이며,

도 3은 알코올디히드로제나제(alcoholdehydrogenase)에 의해 아세트알데히드를 탈취함으로써 도 1에 따른 PAC를 최적으로 제조하는 것을 나타낸 도면이다.

놀라웁게도, 지모모나스 모빌리스의 PDC 유전자를 유전 공학 기술에 의해 의도적으로 변이시킴으로써 PAC의 생성과 관련된 합성 능력이 개선될 뿐만 아니라, 2-히드록시프로피오페논에 비해 PAC의 생성에 관한 선택성이 높은 것을 특징으로 하는 PDC를 얻을 수 있음을 확인하였다.

서두에 전제한 형식의 본 발명에 따른 방법은 활성의 중심부쪽으로 안내된 기질 채널에서 트립토판(tryptophan) 기가 작은 입체 구조의 아미노산 기로 치환되는 효소를 PDC로서 사용하는 것을 기본적인 특징으로 하고 있다.

입체 구조가 작은 아미노산 기로서는, 특히 간단한 방향족 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 알기닌 또는 히스티딘이 사용되고, 세린 및 트레오닌도 사용될 수 있다.

유전 공학 기술에 의해 변이되는 신규의 PDC는 위치 392에 있는 트립토판을 코드화하는 코돈(codon) TGG를 지모모나스 모빌리스로부터의 PDC 유전자의 DNA 서열 위치 1174-1176에 공지의 방식으로 치환하고, PDC를 분리해낸 생성자 유기물, 예컨대 이. 콜리(E. coli) 중에 발현시킴으로써 얻게 된다. 예를 들면, 의도적인 돌연변이는 제9면에 기재된 프라이머(primer)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 실시된다. 돌연변이된 PDC의 발현 매개체(vector) pBTac2의 구조는 천연 형태의 효소의 이. 콜리 발현 매개체 pPDC로부터 출발하여 전개된다.

공지의 방식 대로 크로마토그래피법에 의해 원료 추출물로부터 세포를 수거하여 용해시킴에 따라, 돌연변이된 PDC가 수득된다.

본 발명에 따라 PDC를 변이시킴으로써, 그 PDC의 PAC 합성 능력이 4배 정도 개선된다. 그와 같이 합성 능력이 개선되는 이유는 효소의 활성 중심부쪽으로 안내되는 기질 채널의 출입 제한성이 완화되거나 배제됨으로 인해 용적이 큰 기질 분자의 활성 중심부쪽으로의 출입 및 생성된 생성물의 배출이 용이해지기 때문이다.

일반적으로, 활성 중심부쪽으로 안내되는 기질 채널로의 출입이 입체 구조 또는 전하의 영향에 의해 제한되는 형식의 티아민디포스페이트 의존성 효소에서 그와 유사한 방식으로 합성 능력의 최적화가 실현된다. 즉, 효소를 코드화하는 유전자의 DNA 서열을 유사하게 변이시킴으로써, 특히 출입 제한성을 코드화하는 코돈을 출입 제한성을 제거해 주는 아미노산 기를 코드화하는 코돈으로 치환함으로써, 효소의 합성 능력이 현저히 증대된다.

본 발명의 출발점을 형성하는 과제 설정에 따라 그와 같이 얻어진 PDC는 PAC 합성에 있어서 상당한 관심을 모으고 있는 것인데, 그 이유는 그러한 PDC에 의해 R-(-)-이성질체(98%)의 광학적 순도가 높아지고, 낮은 백분율(2-3%)의 2-히드록시프로피오페논만을 수반하는 PAC를 얻을 수 있기 때문이다. 수거된 미세 유기물로부터 효소를 수득하고 분리하는 것도 상대적으로 간단하게(효모와 비교하여) 이루어질 수 있다.

PDC 효소 작용에 의한 아실로인 축합 반응에 있어서, 선형 및/또는 분기형 케토카르복실산이 기질로서 사용될 수 있고, 방향족, 고리형, 긴 사슬형 및/또는 분기형 알데히드가 기질 및/또는 공유 기질로서 사용될 수 있다. 그러한 것들의 예로서, 벤즈알데히드, 시클로헥산알데히드, 푸르푸랄(furfural), 신남 알데히드, 크로톤알데히드, 피루베이트, 2-케토부티르산, 2-케토펜탄, 2-케토-4-메틸헥산, 2-케토-4-메틸펜탄, 2-케토-4, 4-디메틸헥산, 3-페닐-2-케토-프로판을 들 수 있다.

1. PDC 돌연변이체 PDC-W392A의 제조

1.1 발현 매개체 pPDC의 구조

지모모나스 모빌리스로부터의 PDC를 발현시키기 위해, 매개체 pBTac2(뵈흘링거(Boehringer), 만하임(Mannheim))를 선택하였다. 외래 유전자의 전사는 부모 세대의 프로모터(promoter)의 11배 내지 3배의 효율을 지닌 trp-프로모터와 lacUV-프로모터로 구성된 잡종 세대인 강력한 tac-프로모터의 제어 하에 이루어진다. 오퍼레이터(operator)의 서열 및 리보좀의 결합 부위는 lacZ-유전자에 의해 결정된다. 따라서, 유전자 전사의 제어는 과도하게 발현된 (laciQ) 박테리아 숙주의 lac-억제 인자에 의해 실시되고, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)에 의해 유도될 수 있다. 매개체는 부위 한정 전송 누클레아제 EcoRI의 개별 인식 서열을 포함하는 한편, 개시 코돈 ATG 및 이어서 추가의 부위 한정 인식 서열(부위)(restriction recognition sequence (site))에 따르기 때문에, 그러한 매개체는 일반적으로 고유의 개시 코돈을 구비한 유전자 서열 뿐만 아니라 고유의 개시 코돈이 없는 유전자 서열을 발현시키는 데에도 사용될 수 있다.

다수의 클로닝(cloning) 장소에는 유전자 전사의 제어된 단절이 보장되도록 강력한 리보좀 RNA 전사 터미네이터(terminator) rrnB가 수반된다. 지모모나스 모빌리스로부터의 PDC 유전자(ATCC 29191)를 클로닝하기 위한 출발 물질로서는 매개체 pZY134B(지. 스프렝거(G. Sprenger), Inst f. Biotechnologie 2, KFA-Julich)가 사용된다(도 2 참조). 그러한 플라스미드(plasmid)는 완전한 PDC 유전자를 포함한 코드화되지 않은 부위(region)를 지닌 크기 3.2 kb의 지모모나스 모빌리스로부터의 DNA 단편(fragment)을 함유한다. 코드화된 서열이 발현 매개체 중에서 리게이션(ligation)될 수 있도록 하기 위해, 개시 코돈의 5'-방향으로 새로운 부위 한정 인식 서열이 도입된다. pBTac2 매개체의 EcoRI 장소에서 유전자를 리게이션함으로써, 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence)로부터 개시 코돈까지의 간격이 최적화된다. 폴리머라제(polymerase) 연쇄 반응(PCR)은 DNA 서열을 변경시키는 세련되고 간단한 방법을 제공한다. 열안정성 폴리머라제에 의한 DNA 이중 나선의 가열 변이 및 효소 합성의 반복적인 사이클에 의해, 지정된 DNA 단편이 지수 함수적으로 확장될 수 있다. 생성물의 크기 및 동질성은 합성의 출발점(프라이머)에 의해 달라진다. 프라이머는 원래의 서열의 변경, 예컨대 돌연변이, 삭제 또는 염기의 추가(삽입)를 포함하는 것이므로, 결과적으로 그 프라이머는 합성 단편 중에도 존재하게 된다.

그러한 방법에 의해, 필요한 EcoRI에 의한 부위 한정이 PDC 유전자의 개시 코돈의 5'-방향으로 실시되는데, 그 이유는 올리고누클레오티드(oligonucleotide)를 합성하는 동안에 유전자와 짝을 이루는 프라이머의 5'-단부에 효소의 인식 서열이 연결되기 때문이다. 고유의 단부 누클레아제는 단부에 고정된 부위 한정 서열에 대해 현저히 감소된 활성을 나타내기 때문에, 4개의 추가의 염기를 상류측으로 EcoRI 부위에 접합하였다.

PCR에 주로 사용되는 Taq-폴리머라제는 3'-5'-엑소누클레아제 활성(교정)이 없는 것이다. 결과적으로, 그 합성된 서열은 통계적 오차율을 수반하게 된다. 그러한 오차율은 적절한 반응 조건의 선택에 의해 1/100,000로 낮게 유지될 수는 있지만, 그러한 오차율 때문에 합성의 완전 무결을 보장하기 위해서는 각각의 단편의 순서적 배열을 필요로 한다. 따라서, PDC 유전자의 코드화된 전체 부위(1712 bp)가 아니라, 5'-말단으로부터 개개의 한정된 부위(EcoRV)까지의 보다 작은 단편(890 bp)이 확장을 위해 선택된다(도 2 참조).

PCR 생성물은 해당하는 부위 한정 단부 누클레아제 EcoRI 및 EcoRV에 의해 소화된다.

PDC 유전자의 또 다른 오류 부분은 플라스미드 pZY134B로부터의 EcoRV 및 BamHI에 의한 부위 한정에 의해 얻어지는데, 그와 같이 생성된 단편(1.2 kb)은 3'-단부에 약 350 bp의 전사되지 않은 PDC 유전자 서열을 포함한다. 2개의 단편은 예비적인 한천 조각 전기 영동(electrophoresis)에 의해 나뉘어져서 분리되고, 선형화되어 분리된 pBTac2(4.6 kb)의 EcoRI 및 BamHI에 리게이션된다. 클로닝은 lac-억제 인자를 과도하게 발현시킨 숙주인 이. 콜리 제이엠(E. coli JM) 109에서 실시된다.

1.2 분자 생물학적 작업

트립토판/알라닌 교환에 의해 돌연변이된 PDC를 위치 392에서 얻기 위해, 우선 천연 형태의 효소에 존재하는 코돈 TGG(트립토판)를 GCG(알라닌)과 교환하였다(지모모나스 모빌리스로부터의 피루베이트 디카르복실라제 유전자의 위치 1174-1176를 교환). 의도적인 돌연변이의 도입은 호(Ho) 등이 기술한 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 지원되는 방법을 사용하여 실시된다(에스. 엔. 호(S. N. Ho), 에이치. 디. 헌트(H. D. Hunt), 알. 엠. 호튼(R. M. Horton), 제이. 케이. 풀린(J. K. Pullen), 엘. 알. 피스(L. R. Pease), Gene 77(1989) S. 51).

지모모나스 모빌리스로부터의 PDC 유전자는 이. 콜리-발현 매개체 pPDC에서의 출발 지점으로서 사용된다. DNA 분리는 표준 방법에 따라 실시된다(제이. 샘브로크(J. Sambroch), 이. 에프. 프리취(E. F. Fritsch), 티. 만니아티스(T. Maniatis), Molecular Cloning(1989) Sping Harbor Laboratory Press).

플라스미드 pPDC는 2개의 중첩된 개별 단편의 합성을 위한 모형으로서의 역할을 한다. 프라이머(첨부 부록에 따른 프라이머 서열)는 농도가 0.2-0.4 nM인 것을 사용하였다. 제조자에 의해 주어진 반응 완충액 및 추가의 MgCl₂1.5 mM 중의 Tag-폴리머라제(바이오마스터즈, 쾰른(Biomasters, Koln))와 로보-사이클러(Robo - Cycler) 중의 누클레오티드 0.2 mM 을 사용하여 다음의 온도 프로그램을 따라 반응을 실시하였다: 94℃에서의 2.5분 변이, 94℃에서의 1.5분 변이의 30 사이클, 48℃에서의 1.2분 어닐링(annealing), 72℃에서의 2분 팽창 및 이어서 72℃에서의 10분 동안의 반응 보완. 어닐링 온도는 사용된 프라이머의 이론적인 융점에 따라 48℃와 56℃ 사이에서 변경된다. 올리고누클레오티드의 융점은 다음의 식에 의해 산출된다:

Tm = 2T_m= 2 * (A + T) + 3 * (C + G)

단편들은 전기 영동에 의해 나뉘어져 분리되며, 에탄올에 의한 농축을 위해 침전되고 pH 7.4의 트리스-HCl-완충액 10 mM 중에 재흡수된다.

추가로 조합되는 PCR에서는, 중첩된 단편들의 각각의 약 50-100 ng가 모형으로서 사용된다. 추가의 반응 조건은 첫번째 반응에서와 동일하다. 단련 온도의 선택은 결과적으로 생성된 단편의 중첩 부위의 융점에 따라 조절된다. 발현 매개체 pPDC 중의 천연 형태의 DNA를 돌연변이된 단편에 의해 치환하기 위한 추가의 조작(부위 한정, 분리, 리게이션)은 표준 방법에 따라 실시된다(제이. 샘브로크(J. Sambroch), 이. 에프. 프리취(E. F. Fritsch), 티. 만니아티스(T. Maniatis), Molecular Cloning(1989) Sping Harbor Laboratory Press).

사용되는 프라이머의 서열

번호는 PDC 서열의 1. (5')-누클레오티드의 명칭을 나타내기 위해 붙인 것이고, s = 센스(sense), as = 안티-센스(anti-sense)이며, 돌연변이된 염기에는 밑줄이 표시되어 있다.

5'-개별 단편의 합성을 위한 프라이머

·PDC867s

CTACTCCACCACTGGTTGGACG

·PDC1186as

GAGGATTGAAGGAGAGTCACC

3'-개별 단편의 합성을 위한 프라이머

·PDC1159s

GAAACCGGTGACTCTGCGTTCAATGC

·PBTAC453as

ATCTTCTCTCATCCGCCAAACA

(이 프라이머는 3'-단부에서 PDC 서열에 연결되는 매개체 서열과 짝을 이룬다)

융합 단편(fusion fragmenet)의 합성을 위한 프라이머

·PDC867s

CTACTCCACCACTGGTTGGAGG

·PBTAC453as

ATCTTCTCTATCCGCCAAACA

ATGAGTTATA CTGTCGGTAC CTATTTAGCG GAGCGGCTTG TCCAGATTGG

TCTCAAGCAT CACTTCGCAG TCGCGGGCGA CTACAACCTC GTCCTTCTTG

ACAACCTGCT TTTGAACAAA AACATGGCGA AGGTTTATTG CYGTAACGAA

CTGAACTGCG GTTTCAGTGC AGAAGGTTAT GCTCGTGCCA AAGGCGCAGC

AGCAGCCGTC GTTACCTACA GCGTTGGTGC GCTTTCCGCA TTTGATGCTA

TCGGTGGCGC CTATGCAGAA AACCTTCCGG TTATCCTGAT CTCCGGTGCT

CCGAACAACA ACGACCACGC TGCTGGTCAT GTGTTGCATC ACGCTCTTGG

CAAAACCGAC TATCACTATC AGTTGGAAAT GGCCAAGAAC ATCACGGCCG

CCGCTGAAGC GATTTACACC CCGGAAGAAG CTCCGGCTAA AATCGATCAC

GTGATCAAAA CTGCTCTTCG CGAGAAGAAG CCGGTTTATC TCGAAATCGC

TTGCAACATT GCTTCCATGC CCTGCGCCGC TCCTGGACCG GCAAGTGCAT

TGTTCAATGA CGAAGCCAGC GACGAAGCAT CCTTGAATGC AGCGGTTGAC

GAAACCCTGA AATTCATCGC CAACCGCGAC AAAGTTGCCG TCCTCGTCGG

CAGCAAGCTG CGCGCTGCTG GTGCTGAAGA AGCTGCTGTT AAATTCACCG

ACGCTTTGGG CGGTGCAGTG GCTACTATGG CTGCTGCCAA GAGCTTCTTC

CCAGAAGAAA ATGCCAATTG CATTGGTACC TCATGGGGCG AAGTCAGCTA

TCCGGGCGTT GAAAAGACGA TGAAAGAAGC CGATGCGGTT ATCGCTCTGG

CTCCTGTCTT CAACGACTAC TCCACCACTG GTTGGACGGA TATCCCTGAT

CCTAAGAAAC TGGTTCTCGC TGAACCGCGT TCTGTCGTTG TCAACGGCAT

TCGCTTCCCC AGCGTTCATC TGAAAGACTA TCTGACCCGT TTGGCTCAGA

AAGTTTCCAA GAAAACCGGT TCTTTGGACT TCTTCAAATC CCTCAATGCA

GGTGAACTGA AGAAAGCCGC TCCGGCTGAC CCGAGTGCTC CGTTGGTCAA

CGCAGAAATC GCCCGTCAGG TCGAAGCTCT TCTGACCCCG AACACGACGG

TTATTGCTGA AACCGGTGAC TCTTGGTTCA ATGCTCAGCG CATGAGCTC

CCGAACGGTG CTCGCGTTGA ATATGAAATG CAGTGGGGTC ACATTGGTTG

GTCCGTTCCT GCCGCCTTCG GTTATGCCGT CGGTGCTCCG GAACGTCGCA

ACATCCTCAT GGTTGGTGAT GGTTCCTTCC AGCTGACGGC TCAGGAAGTT

GCTCAGATGG TTCGCCTGAA ACTGCCGGTT ATCATCTTCT TGATCAATAA

CTATGGTTAC ACCATCGAAG TTATGATCCA TGATGGTCCG TACAACAACA

TCAAGAACTG GGATTATGCC GGTCTGATGG AAGTGTTCAA CGGTAACGGT

GGTTATGACA GCGGTGCTGC TAAAGGCCTG AAGGCTAAAA CCGGTGGCGA

ACTGGCAGAA GCTATCAAGG TTGCTCTGGC AAACACCGCA GGCCCAACCC

TGATCGAATG CTTCATCGGT CGTGAAGACT GCACTGAAGA ATTGGTCAAA

TGGGGTAAGC GCGTTGCTGC CGCCAACAGC CGTAAGCCTG TTAACAAGCT

CCTCTAG

1.2 발현 및 정제

변이된 DNA를 이. 콜리-세포 중에서 발현시킴으로써 본 발명에 따른 효소(PDC-W392A)를 얻었다. 돌연변이된 효소(돌연변이체) PDC-W392A를 다음의 과정에 따라 발현시켜 세포 추출물로부터 정제하였다:

돌연변이체 PDC-W392A를 담고 있는 이. 콜리-세포의 발현 플라스미드를 도태를 위해 암피실린(ampicillin) 100㎍/㎖를 함유하는 LB-배지에서 발효시켰다. 그러한 배지를 정상기에서의 예비 배양에 의해 1:50의 비율로 접종하고, 37℃ 및 220 rpm에서 배양하였다.

발현은 0.6의 OD600에서 IPTG 1 mM를 첨가함으로써 유도된다. 그러한 조건 하에서, 20%의 수용성 단백질에 의해 PDC 돌연변이체를 이. 콜리 중에 과도 발현시켰다.

충분한 양의 효소를 생성하기 위해, 전술한 바와 같은 발현을 8 리터의 발효기에서 실시하였다. pH 값을 7.0으로, 공기류를 10 l/h로 설정하였다. 교반 속도는 200 rpm이었다. 과잉의 거품을 방지하기 위해, 필요에 따라 폴리프로필렌글리콜을 첨가하였다. 3시간 동안의 발현 후에, 연속적인 냉각 원심 분리에 의해 세포를 수거하였다. 세포의 용해는 유리 구슬을 사용한 분쇄에 의해 실시된다. 그와 관련하여, MgCl₂5 mM ThDP 0.1 mM을 포함하는 pH 6.5의 Mes/KOH-완충액 중에서 30%의 세포 현탁액을 만들어서 2배의 체적의 유리 구슬(d = 0.3 ㎜)과 혼합한다. 용해는 처리되는 체적에 따라 레취(Retsch)-분쇄기에 있는 에펜도르프(Eppendorf) 용기 중에서 또는 분쇄기 S(최대 체적 80 ㎖) 중에서 실시된다. 분쇄는 최대의 출력으로 10분 이상 실시된다. 현탁액은 원심 분리되고, 유리 구슬은 완충액에 의해 세척되며, 정제된 원심 분리물은 여과된다(1 ㎛). PDC 돌연변이체의 정제는 다음과 같이 컬럼 크로마토그래피에 의해 실시된다.

1. 음이온 교환 크로마토그래피

원료 추출물(약 110 ㎖, 약 1.0-1.5 g의 단백질)을 파마시아(Pharmacia) 사의 HPLC 장치의 사용 하에 유량이 5 ㎖/min인 Q-세파로즈(sepharose) 박스 흐름(2.6 * 9.5 ㎝)(파마시아)에서의 크로마토그래피로 처리하였다. 효소는 pH 6.5의 Mes/KOH 10 mM, MgCl₂2 mM 및 ThDP 0.1 mM 중에서 선형적인 NaCl 구배(0-200 mM)를 둠으로써 NaCl 100 mM에서 용리된다. 목표의 단백질을 함유하는 부분을 활성 시험(아래 참조)에 의해 확인하였다.

2. 소수성 상호 작용 크로마토그래피

정제된 부분을 충분한 체적의 황산암모늄 용액의 첨가에 의한 50% 포화도의 황산암모늄 성분으로 조절하였다. 유량이 2 ㎖인 부틸세파로즈(파마시아)(컬럼 5 * 8 ㎝)에서 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 실시하였다. 원료를 그 투입 이전에 Mes/KOH 50 mM, MgCl2 2 mM 및 ThDP 0.1 mM 중에서 40%의 황산암모늄으로 평형화시켰다. 효소는 하강하는 황산암모늄 구배(40-0%)를 지닌 동일한 완충액 중에서 24%에서 용리된다. 목표의 부분을 활성 시험에 의해 재확인하고 정제하였다(약 160 ㎖).

3. 세파덱스(Sephadex) G25에 의한 탈염 및 Mes/KOH 50 mM, MgCl₂2 mM 및 ThDP 0.1 mM에 의한 완충을 실시한다. 유량은 20 ㎖/min이었다. 이어서, 친수화시켰다.

1.3 활성 시험(디카르복실화 반응)

효모(E. C. 1.1.1.1)로부터의 조효소 알코올-디히드로제나제에 의한 NADH 산화를 추적하는 일련의 효소 시험에서 효소의 활성을 확인하였다. 반응 출발 물질은 pH 6.5의 Mes/KOH 50 mM, MgSO₄20 mM 및 ThDP 1.5 mM 중에서 피루베이트 16.9 mM, NADH 0.18 mM 및 ADH 10 U를 함유하였다. PDC의 효소 단위(1U)는 30℃에서 1분 내에 1 μ㏖의 기질의 변이에 대한 촉매 작용을 하는 효소의 양에 해당한다. 효소의 활성은 다음과 같이 계산된다.

= 6.31 * mMol^-1* ㎝^-1

V = 총체적

v = 시료 체적

d = 배수로의 층 두께(1 ㎝)

△E/min = 분당 흡광 감소율

f = 시료의 희석률

2. PAC 합성을 위한 PDC-W392A의 사용

기질로서의 α-케토카르복실산 또는 알데히드와 보조 기질로서의 또 다른 알데히드로부터 출발하여 PDC 또는 PDC 돌연변이체에 의해 키랄(chiral) 아실로인을 수득할 수 있다.

다음과 같은 용례들을 예로 들기로 한다:

피루베이트 및 벤즈알데히드로부터 출발하는 PAC 합성

합성 출발 물질은 pH 6.5의 Mes/KOH 완충액 50 mM, MgSO₄20 mM 및 ThDP 1.5 mM 중에서 피루베이트 40 mM, 벤즈알데히드 10 U/㎖를 함유하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응을 실시하고, 생성된 PAC(6.2 mM)를 HPLC에 의해 검출하였다.

아세트알데히드 및 벤즈알데히드로부터 출발하는 PAC 합성

PAC 합성의 출발 물질은 피루베이트 대신에 아세트알데히드 40 mM을 함유하였다. 그 이외에는 전술된 바와 같이 처리하였다. 1시간 후에 PAC 3.7 mM이 생성되었다.

결합된 3-효소 시스템에서의 PDC-W392A에 의한 PAC 합성

효소 작용에 의한 변이를 도 3에 따라 실시하였다. 효모(E. C. 1.1.1.1)로부터의 알코올디히드로제나제(ADH)의 사용에 의해, 아세트알데히드의 연속적인 제거 및 그것이 원인이 된 PDC-W392A의 비활성화가 가능하다. 칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터의 포르메이트디히드로제나제(FDH)는 NADH의 재생에 사용된다. 효소 작용에 의한 PAC 합성을 pH 6.5의 50 mM Mes/KOH 완충액 20 ㎖, MgSO₄20 mM 및 ThDP 1.5 mM 중에서 실시하였다.

합성 출발 물질은 PDC-W392A 1.3 U/㎖, ADH 2 U/㎖ 및 FDH 2.5 U/㎖를 함유하였다. 최초의 피루베이트 농도는 70 mM이었다. 또한, 출발 물질은 NADH 2 mM 및 포르메이트 200 mM을 함유하였다. 120 분 후에 2.1 M 피루베이트 용액 0.7 ㎖ 및 8 M 포르메이트 0.125 ㎖를 새로이 첨가하였다. 효소 작용에 의한 변이가 원인이 되어 발생하는 pH 상승을 포름산으로 적정하였다. 7시간 후에 PAC 6.8 mM이 생성되었다.

효소 작용에 의한 반응 생성물의 재처리 및 분석

반응 생성물을 준비된 역상 HPLC에 의해 용리하였다. 정적인 상으로서 250 × 4.6 ㎜의 C8-MOS-Hypersil 칼럼을 사용하였다. 용리는 유량 1.5㎖/min의 초산/아세토니트릴 0.5%/12.5% (v/v)에 의한 등조성 조건하에서 실시되었다. 그러한 조건 하에서의 용리 시간은 PAC 4.77분 및 2-히드록시프로피오페논 5.41분이었다. 생성된 거울상체를 R-(-)-PAC로서 부속시키는 것은 PAC 생성물의 표준(크놀 악티엔게젤샤프트: Knoll AG)에 의거하여 편광계에 의해 실시되었다.

PAC 중의 거울상체 비율은 키랄 가스 크로마토그래피에 의해 98%로 확인되었다.

Claims

≥95% 거울상체 단위의 R-(-)-페닐아세틸카르비놀(I)을 2-히드록시프로피오페논에 대비된 I의 생성비 ≥95%로 생성할 수 있고, ＞1 U/mg의 페닐아세틸카르비놀 생성에 관한 비활성을 갖는 피루베이트 디카르복실라제를 생성자 유기물로부터의 분리에 의해 수득하는 방법에 있어서,

지모모나스 모빌리스로부터 피루베이트 디카르복실라제를 코드화하는 유전자를 구비한 생성자 유기체를 사용하여, 그 유전자의 DNA 서열 중에서 위치 1174 -1176 에 있는 트립토판 기를 코드화하는 코돈 TGG를 감소된 체적비의 아미노산 기를 코드화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는 피루베이트 디카르복실라제 의 수득 방법.
제 1 항에 있어서, 코돈 TGG를 간단한 아미노산 기를 코드화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는 수득 방법.
제 2 항에 있어서, 코돈 TGG를 방향족 아미노산 기를 코드화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는 수득 방법.
제 3 항에 있어서, 코돈 TGG를 알라닌 기를 코드화하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는 수득 방법.
벤즈알데히드의 존재 하에 피루베이트를 2-히드록시프로피오페논에 대한 생성비가 ≥95%인 ≥95% 거울상체 단위의 R-(-)-페닐아세틸카르비놀(I)로 변이시킬 수 있고, ＞1 U/mg의 생성물 생성에 관한 비활성을 가지며, 위치 392에 있는 트립토판 기가 보다 더 작은 크기의 아미노산 기로 치환되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 하나의 항에 따라 수득된 피루베이트 디카르복실라제.
제 5 항에 있어서, 위치 392에 있는 트립토판 기가 알라닌 기로 치환되는 것을 특징으로 하는 피루베이트 디카르복실라제.
PDC의 존재 하의 효소 작용에 의한 α-케토카르복실산 및/또는 알데히드의 아실로인 축합 반응에 의해 아실로인을 수득하는 방법에 있어서,

제 5 항 또는 제 6 항에 따른 PDC를 효소로 사용하는 것을 특징으로 하는 효소 작용에 의한 아실로인 수득 방법.
제 7 항에 있어서, 디카르복실화 반응에 의해 생성된 과잉의 알데히드를 알코올-디히드로제나제 및 NADH에 의해 동시에 감소시키는 상태에서 α-케토카르복실산을 출발 물질로 하는 아실로인 축합 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 수득 방법.
제 8 항에 있어서, 변이 시에 생성되는 NAD를 즉석에서 포르메이트-디히드로제나제에 의해 NADH로 재생시키는 것을 특징으로 하는 수득 방법.
활성의 중심부로 안내되는 기질 채널의 출입 제한성이 있는 티아민디포스페이트 의존성 효소 유전자의 DNA 서열에 있어서,

출입 제한성을 코드화하는 코돈 대신에 출입 제한성을 제거하는 아미노산 기를 코드화하는 코돈이 도입되는 것을 특징으로 하는 티아민디포스페이트 의존성 효소 유전자의 DNA 서열.
제 10 항에 있어서, 지모모나스 모빌리스로부터의 PDC 유전자의 DNA 서열은 위치 1174-1176에서 보다 적은 크기의 아미노산 기를 코드화하는 코돈을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 11 항에 있어서, 위치 1174-1176에서 방향족 아미노산을 코드화하는 코돈을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
제 12 항에 있어서, 위치 1174-1176에서 알라닌 기를 코드화하는 코돈을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.