KR101180239B1

KR101180239B1 - 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈

Info

Publication number: KR101180239B1
Application number: KR1020097020892A
Authority: KR
Inventors: 다카노리 아키야마; 후지오 유; 후미아키 와타나베; 유야 다키카와; 에이지 사토
Original assignee: 미츠비시 레이온 가부시키가이샤
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2012-09-05
Also published as: JP5226509B2; JPWO2008108466A1; US8637272B2; WO2008108466A1; KR20090119927A; CN101636497B; CN101636497A; EP2130922A1; EP2518152A3; US20100136617A1; EP2518152A2; EP2130922A4

Abstract

공업적으로 유용한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈, 그의 제조방법, 및 그것을 사용한 에피할로하이드린 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 소정의 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II를 포함하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 특정한 아미노산 치환변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 것이다.

Description

개량형 할로하이드린 에폭시데이즈{IMPROVED HALOHYDRIN EPOXIDASE}

본 발명은 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및 그의 제조방법 등에 관한 것이다.

할로하이드린 에폭시데이즈는, 할로하이드린 하이드로젠-할라이드-라이에이즈, 할로하이드린 디할로지네이즈 또는 할로알코올 디할로지네이즈라고도 불리며, 1,3-다이할로-2-프로판올을 에피할로하이드린으로 변환하는 활성 및 그의 역반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소(EC number:4.5.1.-)이다. 할로하이드린 에폭시데이즈는, 아미노산 서열의 상동성 등으로부터, 3개의 그룹(그룹 A, 그룹 B, 그룹 C)으로 대별되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1: J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001). 그룹 A로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheA(비특허문헌 2: Biosci.Biotechnol.Biochem., 58(8), 1451-1457, 1994), 아르트로박터속(Arthrobacter sp.) AD2주 유래의 HheA_AD2(비특허문헌 1), 아르트로박터 속(Arthrobacter sp.) PY1주 유래의 Deh-PY1(비특허문헌 3: J.Health.Sci., 50(6), 605-612, 2004) 등을 들 수 있다. 그룹 B로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(비특허문헌 2), 마이코박테리움속(mycobacterium sp.) GP1주 유래의 HheB_GP1(비특허문헌 1), 아르트로박터 에리티(Arthrobacter erithii) H10a주 유래의 DehA(비특허문헌 4: Enz.microbiol.Technol., 22, 568-574, 1998) 등을 들 수 있다. 그룹 C로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) DH094주 유래의 HheC(특허문헌 1: 일본 특허공개 평10-210981호 공보), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC(비특허문헌), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 HalB(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val= 4960076#feature 4960076)(비특허문헌 5: Thesis(1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom) 등을 들 수 있다.

에피할로하이드린은 여러가지 의약품이나 생리 활성 물질의 합성 원료로서 유용한 물질이다. 예컨대, (R)-에피할로하이드린의 개환 사이아노화에 의하여 얻어지는 (R)-(-)-4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은, L-카르니틴의 합성 원료로서 유용한 것이 알려져 있다(특허문헌 2: 일본 특허공개 소57-165352호 공보). 적어도 일부의 할로하이드린 에폭시데이즈에 대해서는, 상술한 1,3-다이할로-2-프로판올을 에피할로하이드린으로 변환하는 활성 및 그의 역반응을 촉매하는 활성에 더 하여, 사이안 화합물의 존재하에 에피할로하이드린을 개환 사이아노화하여 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성하는 반응을 촉매하는 것이 밝혀져 있고, 그 반응을 이용한 예로서, 1,3-다이할로-2-프로판올로부터 광학 활성 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조하는 방법(특허문헌 3: 일본 특허공개 평3-053889호 공보, 특허문헌 4: 일본 특허공개 제2001-25397호 공보) 및 에피할로하이드린으로부터 광학 활성 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조하는 방법(특허문헌 5: 일본 특허공개 평3-053890호 공보)이 알려져 있다.

그런데, 자연계로부터 분리된 미생물의 균체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성은, 공업적 이용의 견지에서는 반드시 충분히 높은 것은 아니다. 이 과제를 해결하기 위해, 유전자 재조합 기술을 사용하여 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 향상시키는 시도가 행해지고 있다. 예컨대, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB를 코딩하는 유전자를 클론화한 여러가지 발현 플라스미드를 도입함으로써 얻어지는 여러가지 형질전환체를 사용하여, 효율적으로 광학 활성 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조할 수 있는 것이 나타나 있다(특허문헌 6: 일본 특허공개 평4-278089호 공보, 특허문헌 7: 일본 특허공개 평5-317066호 공보, 및 특허문헌 8: 일본 특허공개 제2007-049932호 공보). 이들 형질전환체에서는, 균체 내에 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 복제물(copy)을 많이 보유시킴으로써, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 크게 향상시키는 것에 성공하고 있다.

한편, 최근의 유전자 공학 기술의 진보에 의해, 효소 단백질의 구성 아미노 산의 1개 이상을 결실, 부가, 삽입, 또는 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 의도적으로 제작하는 것이 가능해져 있다. 이들 변이체는, 상기 변이의 종류에 따라서는, 변이가 도입되어 있지 않은 효소와 비교하여, 활성, 안정성, 유기용매 내성, 내열성, 내산성, 내알칼리성, 기질특이성 등의 성능이 향상되는 것이 알려져 있다. 이들 성능의 향상은, 활성당 효소 촉매 제조 비용 저감, 효소 촉매의 안정화, 반응 공정의 간략화, 반응 수율의 향상 등을 통해, 효소 반응을 이용한 공업적 생산에서의 대폭적인 생산 비용 저감을 가져오는 경우가 있다. 따라서, 많은 효소에 있어서 다양한 성능이 향상된 유용한 개량 효소의 제조가 행해지고 있다. 할로하이드린 에폭시데이즈에 있어서도, 구성 아미노산의 1개 이상을 결실, 부가, 삽입, 또는 다른 아미노산으로 치환한 변이체가 보고되어 있다. 예컨대, 특허문헌 9(국제공개 제2005/017141호 팜플렛)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 369종 및 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB의 변이체 1종류가 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 10(미국 특허출원공개 제2005/0272064호 명세서)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 570 종류 및 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB의 변이체 1종류가 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 11(미국 특허출원공개 제2006/0099700호 명세서)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 1422종류 및 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB의 변이체 1종류가 기재되어 있다. 이들 중 몇 개의 변이체에 대해서는, 에틸(R)-4-클로로-3-하이드록시뷰티레이트로부터 에틸(S)-4-사이아노-3-하이드록시뷰티레이트로의 변환 반응에 있어서의 활성이 향상된 것이 나타나 있다. 또한, 비특허문헌 6(J.Bacteriol., 183(17), 5058-5066, 2001)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 Ser132Ala, Ser132Cys, Tyr145Phe, Arg149Lys, Arg149Glu 및 Arg149Gln이 기재되어 있다. 비특허문헌 7(Enz.microbiol.Technol.,30, 251-258, 2002)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 C30A, C153S, C229A 및 C153S/C229A가 기재되어 있고, 변이체 C30A 및 C153S는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 안정성이 향상된 것이 나타나 있다. 비특허문헌 8(EmBO J., 22(19), 4933-4944, 2003)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 Asp80Asn 및 Asp80Ala가 기재되어 있다. 비특허문헌 9(Biochemistry, 42(47), 14057-14065, 2003)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 W139F, W192F, W238F 및 W249F가 기재되어 있다. 비특허문헌 10(Biochemistry, 44(17), 6609-6618, 2005)에는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 변이체 N176A, N176D 및 Y187F가 기재되어 있다. 이들은 모두 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 할로하이드린 에폭시데이즈 HheC의 변이체에 관한 것이다.

특허문헌 1: 일본 특허공개 평10-210981호 공보

특허문헌 2: 일본 특허공개 소57-165352호 공보

특허문헌 3: 일본 특허공개 평3-053889호 공보

특허문헌 4: 일본 특허공개 제2001-25397호 공보

특허문헌 5: 일본 특허공개 평3-053890호 공보

특허문헌 6: 일본 특허공개 평4-278089호 공보

특허문헌 7: 일본 특허공개 평5-317066호 공보

특허문헌 8: 일본 특허공개 제2007-049932호 공보

특허문헌 9: 국제공개 제2005/017141호 팜플렛

특허문헌 10: 미국 특허출원공개 제2005/0272064호 명세서

특허문헌 11: 미국 특허출원공개 제2006/0099700호 명세서

비특허문헌 1: J.Bacteriol., 183(17), 5058-5066, 2001

비특허문헌 2: Biosci.Biotechnol.Biochem., 58(8), 1451-1457, 1994

비특허문헌 3: J.Health.Sci., 50(6), 605-612, 2004

비특허문헌 4: Enz.microbiol.Technol., 22, 568-574, 1998

비특허문헌 5: Thesis(1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom

비특허문헌 6: J.Bacteriol., 183(17), 5058-5066, 2001

비특허문헌 7: Enz.microbiol., Technol.30, 251-258, 2002

비특허문헌 8: EmBO J., 22(19), 4933-4944, 2003

비특허문헌 9: Biochemistry, 42(47), 14057-14065, 2003

비특허문헌 10: Biochemistry, 44(17), 6609-6618, 2005

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

할로하이드린 에폭시데이즈를 공업적으로 사용하는 경우에는, 효소 촉매로서 추가적인 고도화가 요망된다. 예컨대, 상술한 바와 같이, 형질전환체 내에서의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 고복제화(multicopying)에 의해, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 어느 정도까지 높일 수 있지만, 경제성?실용성의 견지에서 추가적인 활성 향상이 요망된다. 따라서, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성의 향상을 가져오는 할로하이드린 에폭시데이즈가 요망된다. 또한, 광학 활성인 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조를 목적으로 하는 경우, 공지된 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 제조되는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 광학 순도는 반드시 충분히 높은 것은 아니다. 따라서, 보다 광학 순도가 높은 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성하도록, 입체 선택성이 향상된 할로하이드린 에폭시데이즈가 요망된다. 또한, 1,3-다이할로-2-프로판올을 출발 원료로 하여 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 제조하는 경우, 생성물(염화물 이온 및 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴)의 저해에 의한 반응 속도의 저하가 생길 수 있다. 따라서, 생성물 저해를 받기 어려운 할로하이드린 에폭시데이즈가 요망된다. 또한, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 저렴하게 제조하기 위해서는, 보통, 반응계 내의 기질 및/또는 생성물(4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴) 농도를 높게 하여 장치당 생산성을 향상시키는 것이 바람직하지만, 공지된 할로하이드린 에폭시데이즈에 의한 생성물 축적 농도는 반드시 충분히 높은 것은 아니다. 따라서, 고농도의 생성물을 축적할 수 있는 할로하이드린 에폭시데이즈가 요망된다.

그래서, 본 발명의 목적은, 이러한 과제를 해결할 수 있는 할로하이드린 에폭시데이즈 및 그의 제조방법, 및 그것을 사용한 에피할로하이드린 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행했다. 그 결과, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열, 특히 그룹 B로 분류되는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 있어서, 특정한 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환함으로써, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성, 입체 선택성, 생성물 저해 내성, 생성물 축적능 등의 속성이 향상된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 제조할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 아미노산 서열 I:

S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(서열번호 74)

(S는 세린 잔기, Y는 타이로신 잔기, A는 알라닌 잔기, R은 알지닌 잔기를 나타내고, α1 내지 α15는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기를 나타냄) 및

이하의 아미노산 서열 II:

L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(서열번호 75)

(L은 류신 잔기, R은 알지닌 잔기, E는 글루탐산 잔기를 나타내고, β16 내지 β21은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

를 포함하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 이하의 (A) 내지 (D)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈.

(A) 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(B) α14 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(C) α15 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(D) β21 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(2) 이하의 아미노산 서열 I:

이하의 아미노산 서열 II:

L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(서열번호 75)

를 포함하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 이하의 (E) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈.

(E) 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기가 라이신 또는 아스파라진으로 치환된 아미노산 변이

(F) α14 잔기가 알라닌, 시스테인 또는 세린으로 치환된 아미노산 변이

(G) α15 잔기가 알라닌, 세린 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 변이

(H) β21 잔기가 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 타이로신, 류신, 아이소류신 또는 메싸이오닌으로 치환된 아미노산 변이

상기 (1) 및 (2)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 있어서, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 예컨대 그룹 B로 분류되는 것을 들 수 있다.

상기 (1) 및 (2)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 있어서, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 예컨대 코리네박테리움(Corynebacterium)속 세균 또는 마이코박테리움(mycobacterium)속 세균 유래의 것 등을 들 수 있다.

상기 (1) 및 (2)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 있어서, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열로는, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

상기 (1) 및 (2)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 예컨대 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 이하의 (i) 내지 (iii)으로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 것 등을 들 수 있다.

(i) 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기, α14 잔기, α15 잔기 및 β21 잔기 이외의 아미노산 잔기로부터 선택되는 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(ii) 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기, 아미노산 서열 I에 포함되는 아미노산 잔기 및 아미노산 서열 II에 포함되는 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기로부터 선택되는 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실된 아미노산 변이

(iii) 개시 아미노산 잔기보다 2잔기 이상 C 말단측의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역 중 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II로 이루어지는 영역 이외의 영역 중에, 1개 또는 수개의 임의의 아미노산 잔기가 삽입된 아미노산 변이

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 인코딩하는 유전자.

(4) 상기 (3)에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 벡터.

(5) 상기 (4)에 기재된 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 얻어지는 형질전환체 또는 형질도입체.

(6) 상기 (5)에 기재된 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 얻어지는 배양물.

(7) 상기 (6)에 기재된 배양물로부터 채취되는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈.

(8) 상기 (5)에 기재된 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취하는 것을 특징으로 하는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 제조방법.

(9) 상기 (1), (2) 또는 (7)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및/또는 상기 (6)에 기재된 배양물을, 1,3-다이할로-2-프로판올과 접촉시킴으로써 에피할로하이드린을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 에피할로하이드린의 제조방법.

(10) 상기 (1), (2) 또는 (7)에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및/또는 상기 (6)에 기재된 배양물을, 사이안 화합물 존재하에서, 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린과 접촉시킴으로써 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성, 입체 선택성, 생성물 저해 내성, 생성물 축적능 등이 향상된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 얻을 수 있음과 동시에, 이들을 이용하여 에피할로하이드린 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 효율적으로 제조할 수 있다.

도 1은 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체(JM109/pST111, JM109/pSTK001 및 JM109/pSTT001) 및 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체(JM109/pSTK002, JM109/pSTK003, JM109/pSTT002 및 JM109/pSTT003) 유래의 조효소액을, SDS-PSGE로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 본 발명의 실시형태에 대하여 설명하지만, 본 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로서, 본 발명을 이 실시형태로만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은 그의 요지를 일탈하지 않는 한 여러가지 형태로 실시할 수 있다.

한편, 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허출원 제2007-057854호 명세서의 전체를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 예컨대 선행기술 문헌, 공개공보, 특허공보 및 그 밖의 특허문헌은 참조로서 본 명세서에 편입된다.

(I) 할로하이드린 에폭시데이즈 활성

본 발명에 있어서, 「할로하이드린 에폭시데이즈 활성」이란, 1,3-다이할로-2-프로판올을 에피할로하이드린으로 변환하는 활성 및 그의 역반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 1,3-다이할로-2-프로판올은, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

(상기 식에서, X₁ 및 X₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 할로젠 원자를 나타냄)

할로젠 원자로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드가 바람직하고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다. 구체적으로는 1,3-다이플루오로-2-프로판올, 1,3-다이클로로-2-프로판올(이하, 「DCP」라고 하는 경우가 있음), 1,3-다이브로모-2-프로판올, 1,3-다이아이오도-2-프로판올 등을 들 수 있고, 바람직하게는 1,3-다이클로로-2-프로판올, 1,3-다이브로모-2-프로판올이다.

에피할로하이드린은, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물이다.

(상기 식에서, X는 할로젠 원자를 나타냄)

할로젠 원자로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드가 바람직하고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다. 구체적으로는, 에피플루오로하이드린, 에피클로로하이드린(이하, 「ECH」라고 하는 경우가 있음), 에피브로모하이드린, 에피아이오도하이드린 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 에피클로로하이드린, 에피브로모하이드린이다.

본 발명에 있어서, 「할로하이드린 에폭시데이즈 활성」은, 시간당 1,3-다이 할로-2-프로판올로부터의 에피할로하이드린 생성량 또는 염화물 이온 생성량을 측정함으로써 구할 수 있다. 에피할로하이드린 생성량은, 예컨대 액체 크로마토그래피나 기체 크로마토그래피 등에 의해 정량할 수 있다. 또한, 염화물 이온 생성량은, 예컨대 그의 염화물 이온의 생성에 수반하여 저하되는 pH를 어느 일정한 값으로 유지하도록 연속적 또는 단속적으로 알칼리 용액을 첨가하여, 시간당 요구되는 알칼리의 양으로부터 편의적으로 구할 수 있다. 이 방법에 의해 산출되는 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 특히 「탈염소 활성」이라고 부르는 경우가 있다. 또한, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 대한 항체를 제작하여, 웨스턴 블러팅이나 ELISA법 등의 면역학적 수법에 의해서도 산출할 수 있다. 기타, 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 형질전환체 내에서의 발현량과 비례한다고 가정하는 경우는, 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 알려진 샘플과 비교하는 것 등에 의해, SDS-PAGE 등의 분석 수단에 의해서도 간접적으로 구할 수 있다. SDS-PAGE는 당업자라면 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다.

한편, 적어도 일부의 할로하이드린 에폭시데이즈에 대해서는, 상술한 「할로하이드린 에폭시데이즈 활성」에 더하여, 사이안 화합물의 존재하에 에피할로하이드린을 개환 사이아노화하여 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는다. 이 경우에 있어서의 사이안 화합물로는, 사이안화수소, 사이안화칼륨(이하, 「KCN」이라고 하는 경우가 있음), 사이안화나트륨, 사이안산 또는 아세톤사이안하이드린 등의 반응액 중에 첨가했을 때에 사이안 이온(CN-) 또는 사이안화수소를 생성하는 화합물 또는 그의 용액 등을 들 수 있다. 또 한, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물이다.

(상기 식에서, X는 할로젠 원자를 나타냄)

할로젠 원자로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드가 바람직하고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다. 구체적으로는, 4-플루오로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴(이하, 「CHBN」이라고 하는 경우가 있음), 4-브로모-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-아이오도-3-하이드록시뷰티로나이트릴 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-브로모-3-하이드록시뷰티로나이트릴이다.

(II) 할로하이드린 에폭시데이즈

(II-1) 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈

본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈(특히 바람직하게는, 그룹 B로 분류되는 것)에 변이(아미노산 변이)를 도입함으로써 개량된 것으로서, 그의 유래는 특별히 한정되지는 않는다. 여기서, 「야생형 할로하이드린 에폭시데이즈」란, 자연계의 생물로부터 분리될 수 있는 할로하이드린 에폭시데이즈를 가리키고, 상기 효소를 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 의도적 또는 비의도적인 아미노산의 결실 또는 다른 아미노산에 의한 치환 또는 삽입이 없고, 천연 유래의 속성을 유지한 상태의 할로하이드린 에폭시데이즈를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 이하의 아미노산 서열 I(19 아미노산 잔기):

이하의 아미노산 서열 II(10 아미노산 잔기):

L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(서열번호 75)

를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진다. 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가, 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 것인지 아닌지는, 공공의 서열 데이터 베이스, 예컨대 미국 생물공학정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)에 의해 제공되는 GenBank 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)에서 할로하이드린 에폭시데이즈로서 등록되어 있는 것을 검색하여, 해당된 것의 아미노 산 서열 중에, 상기 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II가 포함되는지 아닌지를 조사하면 된다. 필요에 따라, 유전자 정보 해석용 소프트웨어를 사용하여 행할 수 있다. 또한, 공지 문헌에서 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 아미노산 서열에 대해 기재되어 있는 것이 있으면 그것을 참고에도 좋다. 예컨대, J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001에 기재되어 있는 각종 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 아미노산 서열의 배열(alignment) 정보를 참고로 함으로써, 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II가 포함되는지 아닌지, 및 전체 아미노산 서열 중의 어느 위치에 포함되는지를 알 수 있다. 한편, 아미노산 서열 I에서의 세린 잔기, 타이로신 잔기, 알지닌 잔기 및 알라닌 잔기, 및 아미노산 서열 II에서의 류신 잔기, 알지닌 잔기 및 글루탐산 잔기는, 공지된 각종 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에서 고도로 보존되어 있다.

야생형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 아미노산 서열의 상동성 등으로부터, 3개의 그룹(그룹 A, 그룹 B, 그룹 C)으로 대별되는 것이 알려져 있다(J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001). 그 중에서도, 본 발명에서 사용하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 그룹 B에 속하는 것이 특히 바람직하다.

그룹 A로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheA(Biosci.Biotechnol.Biochem., 58(8), 1451-1457, 1994), 아르트로박터속(Arthrobacter sp.) AD2주 유래의 HheA_AD2(J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001) 및 아르트로박터속(Arthrobacter sp.) PY1주 유래의 Deh-PY1(J.Health.Sci., 50(6), 605-612, 2004) 등을 들 수 있다.

그룹 B로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(Biosci.Biotechnol.Biochem., 58(8), 1451, 1994), 마이코박테리움속(mycobacterium sp.) GP1주 유래의 HheB_GP1(J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001), 아르트로박터 에리티(Arthrobacter erithii) H10a주 유래의 DehA(Enz.microbiol.Technol., 22, 568-574, 1998) 등을 들 수 있다. 그룹 C로 분류되는 할로하이드린 에폭시데이즈로는, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) DH094주 유래의 HheC(일본 특허공개 평10-210981호 공보), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC(J.Bacteriology, 183(17), 5058-5066, 2001), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 HalB(Thesis(1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom) 등을 들 수 있다.

한편, 이들 할로하이드린 에폭시데이즈 중, 아미노산 서열이 밝혀져 있는 것에 대해서는, 미국 생물공학정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)에 의해 제공되는 GenBank 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/queU.fcgi?CMD=search&DB=protein)에서, 이하의 Accession No.로 등록되어 있다.

「Accession No. BAA14361」: 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheA의 아미노산 서열

「Accession No. AAK92100」: 아르트로박터속(Arthrobacter sp.) AD2주 유래의 HheA_AD2의 아미노산 서열

「Accession No. BAA14362」: 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB의 아미노산 서열

「Accession No. AAK73175」: 마이코박테리움속(mycobacterium sp.) GP1주 유래의 HheB_GP1의 아미노산 서열

「Accession No. AAK92099」: 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC의 아미노산 서열

「Accession No. AAD34609」: 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 HalB의 아미노산 서열

한편, 본 발명에서 주로 예시하는 코리네박테리움속(Coyrnebacterium sp.) N-1074주 유래의 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB에 대해서는, 그의 유전자(HheB)가 2개의 개시 코돈을 갖기 때문에, 결과적으로 N 말단 근방의 8 아미노산 잔기의 유무만이 다른 2종의 할로하이드린 에폭시데이즈가 존재하는 것이 보고되어 있다(Biosci.Biotechnol.Biochem., 58(8), 1451-1457, 1994). 본 발명에 있어서, 양자(상기 2종의 할로하이드린 에폭시데이즈)를 구별하여 부를 때는, 최초의 개시 코돈으로부터 번역된 아미노산 서열(서열번호 1)로 이루어지는 HheB를 「HheB(1^st)」 라고 부르고, 2번째의 개시 코돈으로부터 번역된 아미노산 서열(서열번호 2)로 이루어지는 HheB를 「HheB(2^nd)」라고 부르는 것으로 하고, 이들은 모두 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈인 것으로 한다.

여기서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HheB(1^st)에 있어서, 아미노산 서열 I은, 제126번째 내지 제144번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열에 상당하고, 아미노산 서열 II는, 제198번째 내지 제207번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열에 상당한다. 마찬가지로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 HheB(2^nd)에 있어서, 아미노산 서열 I은, 제118번째 내지 제136번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열에 상당하고, 아미노산 서열 II는, 제190번째 내지 제199번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 서열에 상당한다. 또한, HheB(2^nd)의 아미노산 서열은, 상술한 2개의 개시 코돈의 영향에 의해, HheB(1^st)의 아미노산 서열에 있어서의 N 말단 근방의 8 아미노산 잔기(구체적으로는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 제1번째 내지 제8번째의 아미노산 잔기)가 결실된 상태의 아미노산 서열로 이루어지는 것이다.

본 명세서에 있어서는, 주로 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB를 예로 들어 설명하지만, 전술한 바와 같이, 할로하이드린 에폭시데이즈의 유래는 한정되지 않고, HheB 이외의 할로하이드린 에폭시데이즈이더라도 상기 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II를 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 것이면, 마찬가지의 설명이 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 나타낸 변이의 위치 또는 변이하는 아미노산 종류 또는 염기 서열을 조작함으로써, 임의의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 얻을 수도 있다. 한편, 본 발명에 있어서, 「높은 상동성」이라고 할 때는, 예컨대 60% 이상의 상동성을 말하고, 바람직하게는 75% 이상의 상동성이며, 특히 바람직하게는 90% 이상의 상동성이다.

(II-2) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈

본 발명에 있어서의 「개량형 할로하이드린 에폭시데이즈」는, 주로 유전자 재조합 기술을 이용하여, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 적어도 하나의 아미노산 치환변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 것으로서, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성, 입체 선택성, 생성물 저해 내성, 생성물 축적능 등이 향상된 할로하이드린 에폭시데이즈이다.

본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에는, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 높은 것이 포함된다. 여기서 말하는 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 향상의 본질적인 원인으로는, 아미노산 치환변이에 기인하는 것이면 어떠한 것이어도 좋고, 예컨대 효소 단백질당 비활성 자체의 향상, 활성형 컨퍼메이션(conformation) 형성능의 향상, 형질전환체 내에서의 발현량 증가, 형질전환체 내에서의 효소의 안정성 향상, 대(對)기질내성의 향상, 생성물 저해 감수성의 저하 등을 들 수 있다.

한편, 「형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」이란, 「형질전환체 건조 균체 단위 중량당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」을 의미하며, 「균체 비활성」이라고도 한다(한편, 본 명세서 중, 건조 균체를 「DC」라고 하는 경우가 있음). 또한, 「가용성 단백질당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」이란, 「가용성 단백질 단위 중량당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」을 의미하며, 「단백 비활성」이라고도 한다. 또한, 본 발명에 있어서는, 편의적으로 일정량의 형질전환체로부터는 일정량의 가용성 단백질을 얻을 수 있는 것으로 하여, 「형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「균체 비활성」)은 「가용성 단백질당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「단백 비활성」)에 비례하는 것으로 된다. 즉, 「가용성 단백질당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「단백 비활성」)이 높으면(낮으면), 「형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「균체 비활성」)이 높은(낮은) 것으로 된다. 또한, 본 발명에 있어서, 「액 활성」이란, 단위 용액량당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 의미한다. 상기 용액으로는, 할로하이드린 에폭시데이즈를 생산하는 형질전환체를 배양하여 얻어지는 「배양물」로부터 얻을 수 있는 것을 함유하는 용액을 들 수 있다. 구체적으로는, 배양액, 배양액 상청(supernatant), 세포 또는 균체 현탁액, 세포 또는 균체 파쇄액, 조효소액 및 이들의 처리물 등을 들 수 있다. 「액 활성」을 그의 용액의 균 농도 또는 가용성 단백질 농도로 나눔으로써, 「형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「균체 비활성」) 또는 「가용성 단백질당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성」(「단백 비활성」)을 산출할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「활성 회수율」이란, 일정 한 조작 전의 활성을 100%로 하여, 조작 후에 회수된 활성의 상대비(%)를 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에는, 기질 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린으로부터, 에피할로하이드린 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성시킨 경우의 상기 생성물의 광학 순도가, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 동일한 기질로부터 동일한 생성물을 생성시킨 경우의 상기 생성물의 광학 순도보다도 높아지는 속성을 갖는 것이 포함된다. 즉, 기질인 1,3-다이할로-2-프로판올 및/또는 에피할로하이드린에 대한 입체 선택성이, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 향상되어 있는 것이 포함된다. 입체 선택성 향상의 본질적인 원인으로는, 아미노산 치환변이에 기인하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다.

한편, 본 발명에 있어서 「광학 활성」이란, 한 쪽의 거울상 이성체가 다른 쪽의 거울상 이성체보다도 많이 포함되어 있는 물질의 상태, 또는 어느 한쪽의 거울상 이성체만으로 이루어져 있는 물질의 상태를 말한다. 또한, 「광학 순도」, 「거울상 이성체 과잉율(%ee)」과 거의 같은 것으로서, 다음 식으로 정의한다.

광학 순도 ≒ 거울상 이성체 과잉율 = 100×(│[R]-[S]│)/([R]+[S])(%ee)

여기서, [R] 및 [S]는 시료 중의 거울상 이성체 각각의 농도를 나타낸다. 또한, 본 발명에 있어서 「입체 선택성」이란, 할로하이드린 에폭시데이즈가 기질로부터 생성물을 생성할 때에, 어느 한쪽의 거울상 이성체가 생성하는 반응을 우선 적으로 촉매하는 성질을 말한다.

또한, 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에는, 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린으로부터의 생성물인 염화물 이온 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴에 의한 반응 저해에 대한 내성이 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 향상되어 있는 것, 즉 생성물 저해 내성이 향상된 것이 포함된다. 생성물 저해 내성 향상의 본질적인 원인으로는, 아미노산 치환변이에 기인하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다.

또한, 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에는, 기질 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린으로부터, 에피할로하이드린 또는 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성시키는 경우에, 생성물을 고농도 생성 및 축적시킬 수 있는 속성을 갖는 것, 즉 생성물 축적능이 향상된 것이 포함된다. 생성물 축적능 향상의 본질적인 원인으로는, 아미노산 치환변이에 기인하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다.

본 발명에 있어서의 「개량형 할로하이드린 에폭시데이즈」는, 구체적으로는 상술한 아미노산 서열 I 및 아미노산 서열 II를 포함하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 이하의 (A) 내지 (D)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 것이다.

(B) 아미노산 서열 I 중의 α14 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(C) 아미노산 서열 I 중의 α15 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

(D) 아미노산 서열 II 중의 β21 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

한편, 상기 (A)에 있어서 「개시 아미노산 잔기」란, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈를 유전자(DNA 또는 mRNA) 중의 번역 개시 코돈이 인코딩하는 아미노산에 대응하는 아미노산 잔기를 의미하고, 즉 번역 후의 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에서의 N 말단 아미노산 잔기(보통은 메싸이오닌 잔기)를 의미한다.

상기 (A) 내지 (D)의 아미노산 변이는, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 있어서 가장 N 말단측에 위치하는 개시 아미노산 잔기(보통은 메싸이오닌 잔기)를 1번째라고 정의했을 때에, 상기 개시 아미노산 잔기로부터 C 말단측으로 향하여 몇 번째의 아미노산 잔기에서의 아미노산 변이인가에 의해서도 특정할 수 있다. 예컨대, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(1^st)인 경우는, (A)에 있어서의 「개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기」, (B)에 있어서의 「α14 잔기」, (C)에 있어서의 「α15 잔기」 및 (D)에 있어서의 「β21 잔기」는, 각각 (A) 2번째의 아미노산 잔기(알라 닌 잔기), (B) 141번째의 아미노산 잔기(트레오닌 잔기), (C) 144번째의 아미노산 잔기(페닐알라닌 잔기) 및 (D) 207번째의 아미노산 잔기(아스파르트산 잔기)에 해당한다. 또한, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(2^nd)인 경우는, (A)에 있어서의 「개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기」, (B)에 있어서의 「α14 잔기」, (C)에 있어서의 「α15 잔기」 및 (D)에 있어서의 「β21 잔기」는, 각각 (A) 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기), (B) 133번째의 아미노산 잔기(트레오닌 잔기), (C) 136번째의 아미노산 잔기(페닐알라닌 잔기) 및 (D) 199번째의 아미노산 잔기(아스파르트산 잔기)에 해당한다. 그러나, HheB(2^nd)는, 상술한 바와 같이, HheB(1^st)의 아미노산 서열에 있어서의 N 말단 근방의 8 아미노산 잔기가 결실된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 지나지 않아, HheB(1^st) 및 HheB(2^nd)의 양 아미노산 서열에 있어서의 각 아미노산 잔기의 절대적 역할은 실질적으로 동일하다.

본 발명에 있어서의 「개량형 할로하이드린 에폭시데이즈」의 바람직한 태양으로는, 예컨대 이하의 (E) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 것을 들 수 있다.

(E) 개시 아미노산 잔기(보통은 메싸이오닌 잔기)보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로서 라이신 또는 아스파라진으로 치환된 아미노산 변이

(F) 아미노산 서열 I 중의 α14 잔기가 다른 아미노산으로서 알라닌, 시스테인 또는 세린으로 치환된 아미노산 변이

(G) 아미노산 서열 I 중의 α15 잔기가 다른 아미노산으로서 알라닌, 세린 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 변이

(H) 아미노산 서열 II 중의 β21 잔기가 다른 아미노산으로서 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 타이로신, 류신, 아이소류신 또는 메싸이오닌으로 치환된 아미노산 변이

여기서, 상기 (E) 내지 (H)의 아미노산 변이는, 각각 순차적으로, 상술한 (A) 내지 (D)의 아미노산 변이의 구체적 태양을 예시한 것(자세하게는 「다른 아미노산」의 구체예를 나타낸 것)이다.

그 때문에, 상술한 (A) 내지 (D)의 경우와 마찬가지로, 상기 (E)에 있어서의 「개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기」, (F)에 있어서의 「α14 잔기」, (G)에 있어서의 「α15 잔기」 및 (H)에 있어서의 「β21 잔기」는, 각각 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 아미노산 서열에 있어서 가장 N 말단측에 위치하는 개시 아미노산 잔기(보통은 메싸이오닌 잔기)를 1번째라고 정의했을 때에, 상기 개시 아미노산 잔기로부터 C 말단측으로 향하여 몇 번째의 아미노산인지에 의해서도 특정할 수 있다. 즉, 예컨대, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(1^st)인 경우는, 상기 (E) 내지 (H) 의 아미노산 변이의 태양은 이하와 같이 특정할 수 있다.

(E) 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기)가 라이신 또는 아스파라진으로 치환된 아미노산 변이

(F) 141번째의 아미노산 잔기(트레오닌잔기)가 알라닌, 시스테인 또는 세린으로 치환된 아미노산 변이

(G) 144번째의 아미노산 잔기(페닐알라닌 잔기)가 알라닌, 세린 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 변이

(H) 207번째의 아미노산 잔기(아스파르트산 잔기)가 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 타이로신, 류신, 아이소류신 또는 메싸이오닌으로 치환된 아미노산 변이

또, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(2^nd)인 경우는, 상기 (E) 내지 (H)의 아미노기 변이의 태양은 이하와 같이 특정할 수 있다.

(F) 133번째의 아미노산 잔기(트레오닌잔기)가 알라닌, 시스테인 또는 세린으로 치환된 아미노산 변이

(G) 136번째의 아미노산 잔기(페닐알라닌 잔기)가 알라닌 또는 세린으로 치 환된 아미노산 변이

(H) 199번째의 아미노산 잔기(아스파르트산 잔기)가 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 아이소류신 또는 타이로신으로 치환된 아미노산 변이

본 발명에 있어서의 「개량형 할로하이드린 에폭시데이즈」의 보다 구체적이고 또한 바람직한 태양으로는, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(1^st)인 경우는, 서열번호 3 내지 15 및 76 내지 79로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 들 수 있다. 또한, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(2^nd)인 경우는, 서열번호 16 내지 28 및 80 내지 83으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 들 수 있다.

이하, 서열번호 3 내지 15 및 76 내지 79로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 변이(아미노산 치환)의 태양을 표 A에 나타내고, 서열번호 16 내지 28 및 80 내지 83으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 변이(아미노산 치환)의 태양을 표 B에 나타낸다. 여기서, 표 A 중, 「Ala2」, 「Thr141」, 「Phe144」 및 「Asp207」이라는 표기는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 치환의 대상이 되는 아미노산 잔기의 위치와 종류(3문자 표기)를 표시하고 있어, 예컨대 「Thr141」은 제141번째의 트레오닌 잔기를 의미한다. 또한, 이들 「Ala2」등의 하단의 표기는, 서열번호 3 내지 15 및 76 내지 79의 각 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 치환 후의 아미노산 잔기를 표시하고 있어, 예컨대 서열번호 3의 아미노산 서열이면, 「Ala2」의 하단에 「Lys」이라고 표기되어 있는 점으로부터, 제2번째의 알라닌 잔기가 라이신 잔기로 치환된 아미노산 서열인 것을 의미한다. 한편, 「-」라는 표기는 아미노산 치환이 없는 것을 의미한다. 또한, 아미노산 치환 후의 각 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열(후술함)의 서열번호를 표의 최우측란에 병기한다. 이상의 표 A 중의 표기의 설명은, 표 B에 대해서도 마찬가지로 적용된다.

본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 상기 (A) 내지 (D), 바람직하게는 (E) 내지 (H)로부터 선택되는 아미노산 변이를 하나 이상 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것이면 좋다. 따라서, 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에는, 상기 (A) 내지 (H)의 특징(즉, (A) 내지 (H)의 아미노산 변이)을 복수 조합하여 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것도 포함된다. 또한, 상기 (A) 내지 (H)의 아미노산 변이의 태양은 유지하면서, 추가로 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 베이스로 이루어지는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 대하여 이하의 (i) 내지 (iii)으로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈도 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 범위에 포함된다.

(i) 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기, 아미노산 서열 I 중의 α14 잔기, 아미노산 서열 I 중의 α15 잔기 및 아미노산 서열 II 중의 β21 잔기 이외의 아미노산 잔기로부터 선택되는 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 변이

상기 (i) 내지 (iii)의 태양에 있어서, 「1개 또는 수개」란, 예컨대 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도를 가리킨다.

한편, 본 발명에 있어서, 아미노산의 종류를 3문자 또는 1문자의 알파벳 표기로 나타내는 경우가 있다. 또한, 숫자의 앞 또는 전후에, 3문자 또는 1문자의 알파벳을 배치하여 표기하는 경우가 있어, 이 경우는 아미노산 잔기의 위치 및 치환 전후의 아미노산의 종류를 나타낸다. 즉, 숫자는, 특별한 언급이 없는 한, 상술한 바와 같이, 번역 개시 코돈에 의해 인코딩되는 아미노산 잔기(보통은 메싸이오닌)를 1번째라고 정의한 경우에, 몇 번째의 아미노산 잔기인지를 나타내는 것이다. 또한, 숫자의 앞에 표시한 3문자 또는 1문자의 알파벳은, 아미노산 치환 전의 아미노산의 3문자 또는 1문자 표기를 나타내고, 숫자의 뒤에 표시한 3문자 또는 1문자의 알파벳은, 아미노산 치환이 일어난 경우의 치환 후의 아미노산의 3문자 또는 1문자 표기를 나타내는 것으로 한다. 예컨대, 207번째의 아스파르트산 잔기는 「Asp207」 또는 「D207」로, 207번째의 아스파르트산 잔기가 히스티딘으로 치환된 경우는 「Asp207His」 또는 「D207H」로 표기하는 경우가 있다.

(III) 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자

(III-1) 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자

야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 중, 그의 유전자 서열(염기 서열)이 밝혀져 있는 것에 대해서는, 미국 생물공학정보센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)에 의해 제공되는 GenBank 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide)에 있어서, 이하의 Accession No.로 등록되어 있다.

「Accession No. D90349」: 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheA를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

「Accession No.AF397297」: 아르트로박터속(Arthrobactersp.) AD2주 유래의 HheA_AD2를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

「Accession No. D90350」: 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

「Accession No. AY044094」: 마이코박테리움속(mycobacterium sp.) GP1주 유래의 HheB_GP1를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

「Accession No. AF397296」: 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) AD1주 유래의 HheC를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

「Accession No. AF149769」: 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 HalB를 인코딩하는 유전자의 염기 서열

본 발명에 있어서는, 이들을 「야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자」라고 부르는 것으로 한다. 여기서, 상기 「야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자」에 있어서의 「야생형」이라는 단어는, 「할로하이드린 에폭시데이즈」에 관한 단어로서, 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열이 「야생형」인 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 「야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자」를 구성하는 염기 서열은, 형질전환체 숙주에서 이용 가능한 코돈을 인코딩하는 것이면 좋고, 반드시 유래 생물 게놈 DNA 상에 인코딩되어 있는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 염기 서열에 한정되는 것은 아니다. 한편, (II-1) 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈에서 말한 HheB(1^st)를 인코딩하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 HheB(1^st)라고 부르고, HheB(2^nd)를 인코딩하는 유전자를 HheB(2^nd)라고 부르는 것으로 한다. HheB(1^st)의 염기 서열은 서열번호 29로 표시되고, HheB(2^nd)의 염기 서열은 서열번호 30으로 표시된다.

염기 서열이 밝혀져 있는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 취득하는 방법으로는, 유래 생물로부터 게놈 DNA를 조제하여, 밝혀져 있는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 서열 정보를 바탕으로 프라이머를 설계하여, 상기 프라이머를 사용하여 PCR법으로 할로하이드린 에폭시데이즈를 인코딩하는 유전자를 증폭하는 방법을 들 수 있다. 유래 생물로서, 예컨대, N-1074주를 들 수 있고, 상기 주는, 수탁 번호 「FERM BP-2643」로서, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터(이바라키현 쯔꾸바시 히가시1-1-1 쥬오 제6(이하, 본 명세서에 있어서 동일함))에 1988년 11월 10일부로 기탁되어 있다. 또한, 공지된 유전자 서열 정보를 기초로, 합성 올리고 DNA를 조합시킨 PCR법(assembly PCR) 등을 이용하여, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 전장(全長)을 화학적으로 합성하는 것도 가능하다. 예컨대, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 몇 개의 영역(예컨대, 50염기 정도)으로 분할하고, 인접하는 영역과의 오버랩(예컨대, 20염기 정도)을 양단에 갖는 복수의 올리고 뉴클레오타이드를 설계 및 합성한다. 상기 올리고뉴클레오타이드를 PCR법으로 서로 어닐링시킴으로써 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 증폭할 수 있다.

또한, 필요에 따라, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 코돈을 변경할 수도 있다. 코돈을 변경하는 수단으로는, 예컨대, molecular cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997) 등에 기재된 부위 특이적 변위 유발법이나, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트(예컨대 QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제품), GeneTailor^TMSite-Directed Mutagenesis System(임비트로젠사 제품), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express KM 등: 다카라 바이오사 제품)) 등을 사용하여 행할 수 있다. 이밖에, 상술한 바와 같이, 합성 올리고 DNA를 조합시킨 PCR법(assembly PCR)을 행할 때에 코돈을 변경한 프라이머를 사용함으로써 코돈을 변경하는 것도 가능하다.

(III-2) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자

본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자란, (II-2)에서 말한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 효소 단백질을 인코딩하는 유전자를 의미한다. 본 발명의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자란, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈에 대하여 상기 (II-2)의 (A) 내지 (D)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 인코딩하는 유전자로서, 보다 바람직하게는, 상기 (II-2)의 (E) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 인코딩하는 유전자이다. 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 및 상기 아미노산 변이 도입 후의 아미노산 잔기를 구성하는 염기 서열은, 형질전환체 숙주에서 이용 가능한 코돈을 인코딩하는 것이면 좋고, 반드시 유래 생물 게놈 DNA 상에 인코딩되어 있는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 염기 서열에 한정되는 것은 아니다. 한편, 상기 (II-1)의 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈에서 말한 HheB(1^st)를 인코딩하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자인 HheB(1^st), 및 HheB(2^nd)를 인코딩하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자인 HheB(2^nd)는, 모두 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 얻기 위한 베이스가 되는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자로서도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 「개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자」의 보다 구체적이고 또한 바람직한 태양으로는, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(1^st)인 경우는, 서열번호 31 내지 43 및 84 내지 87로 표시되는 염기 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 들 수 있다. 또한, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 HheB(2nd)인 경우는, 서열번호 44 내지 56 및 88 내지 91로 표시되는 염기 서열을 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자는, 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 아미노산 변이가 하나 이상 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자이면 좋고, 따라서 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)의 특징(즉, (A) 내지 (H)의 아미노산 변이)을 복수 조합하여 갖는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)의 아미노산 치환의 태양은 유지하면서, 추가로 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 베이스가 되는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열에 있어서 상기 (II-2)의 (i) 내지 (iii)으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 변이가 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자도 본 발명에 있어서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자로는, 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와, 엄격한(stringent) 조건하에서 혼성화하는 DNA도 포함된다. 이러한 DNA는, 예컨대 상기 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 DNA 또는 그의 상보 서열, 또는 이들의 단편을 프로브로 하여, 콜로니 혼성화, 플라크(plaque) 혼성화, 서던 블러팅 등의 공지된 혼성화법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 라이브러리는 공지된 방법으로 제작된 것을 사용할 수 있고, 또한 시판되는 cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리를 사용할 수도 있다.

「엄격한 조건」이란, 혼성화 후의 세정시의 조건으로서 염 농도가 300 내지 2000mM, 온도가 40 내지 75℃, 바람직하게는 염 농도가 600 내지 900mM, 온도가 65℃인 조건을 의미한다. 예컨대, 2×SSC에서 50℃ 등의 조건을 들 수 있다. 당업자라면, 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건에 더하여, 그 밖의 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러가지 조건을 가미하여, 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와, 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA를 얻기 위한 조건을 설정할 수 있다.

혼성화법의 상세한 순서에 대해서는, molecular cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 등을 참조할 수 있다. 혼성화 하는 DNA로는, 예컨대 상기 (II-2)의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열을 인코딩하는 염기 서열에 대하여, 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60%, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 DNA 또는 그의 부분 단편을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 조제하는 방법은 변이를 도입하는 이미 알려진 어떠한 방법이어도 좋고, 보통은 공지된 방법으로 행할 수 있다. 예컨대, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 기초로, 시판되는 키트를 이용하여 부위 특이적인 치환을 생기게 하는 방법이나, 유전자 DNA를 선택적으로 개열(開裂)하고, 이어서 선택된 올리고뉴클레오타이드를 제거?부가하여 연결하는 방법 등을 들 수 있다. 이들 부위 특이적 변이 유발법은 「molecular cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press(1989)), 「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons(1987-1997)), Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82: 488-492(1985), Kramer and Fritz Method.Enzymol., 154: 350-367(1987), Kunkel, Method.Enzymol., 85: 2763-2766(1988) 등에 기재되어 있다. 최근에는, Kunkel법이나 Gapped duplex법을 기초로 한 부위 특이적 돌연변이 유발법을 사용한 변이 도입용 키트, 예컨대 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제품), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(임비트로젠사 제품), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express KM 등: 다카라 바이오(주)사 제품) 등을 사용하여 행할 수 있다. 또한, 목적으로 하는 변이 도입 위치가 대상 유전자 서열에 있어서 소화?연결이 용이한 제한효소 부위의 근처에 존재하는 경우, 목적 변이를 도입한 프라이머(합성 올리고 DNA)를 사용하여 PCR을 행함으로써 목적변이가 도입된 유전자 DNA 단편을 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 합성 올리고 DNA를 조합시킨 PCR법(assembly PCR)으로 신장시켜 합성 유전자로서 얻을 수도 있다. 또한, 하이드록실아민이나 아질산 등의 변이원으로 되는 약제를 접촉?작용시키는 방법, 자외선 조사에 의해 변이를 유발하는 방법, PCR(폴리머레이즈 연쇄 반응)을 사용하여 랜덤으로 변이를 도입하는 방법 등의 랜덤한 변이 도입법에 의해서도, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자로부터 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 얻을 수 있다.

(IV) 재조합 벡터, 형질전환체

(IV-1) 재조합 벡터

상기한 방법에 의해 얻은 본 발명의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 숙주로 발현시키기 위해, 유전자의 상류에 전사 프로모터를, 하류에 터미네이터를 삽입하여 발현 카세트(cassette)를 구축하고, 이 카세트를 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 또는, 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 도입하는 발현 벡터에 전사 프로모터와 터미네이터가 이미 존재하는 경우에는, 발현 카세트를 구축하지 않고, 벡터 중의 프로모터와 터미네이터를 이용하여 그의 사이에 상기 변이유전자를 삽입하면 바람직하다. 벡터에 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 삽입하기 위해서는, 제한효소를 사용하는 방법, 토포아이소머레이즈(topoisomerase)를 사용하는 방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 삽입시에 필요하면, 적당한 링커(linker)를 부가할 수도 있다. 한편, 본 발명에 있어서는, 이러한 삽입 조작을, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 조제 조작과 겸하여 행할 수도 있다. 즉, 다른 아미노산을 인코딩하는 염기 서열로 치환된 염기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 클로닝(클로닝)된 재조합 벡터를 주형으로 하여 PCR를 하여, 얻어진 증폭산물을 벡터에 삽입할 수 있다.

프로모터의 종류는 숙주에서 적절한 발현을 가능하게 하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 대장균(E. coli) 숙주에서 이용할 수 있는 것으로는, 트립토판 오페론의 trp 프로모터, 락토오스 오페론의 lac 프로모터, 람다 파지 유래의 PL 프로모터 및 PR 프로모터 등을 들 수 있고, tac 프로모터, trc 프로모터와 같이 개변, 설계된 서열도 사용할 수 있다. 고초균(Bacillus subtilis) 숙주에서 이용할 수 있는 것으로는, 글루콘산 합성효소 프로모터(gnt), 알칼린 프로테이즈 프로모터(apr), 중성 프로테이즈 프로모터(npr), α-아밀레이즈 프로모터(amy) 등을 들 수 있다. 로도코커스(Rhodococcus)속 세균 숙주에서 이용할 수 있는 것으로는, 발현 벡터 pSJ034에 포함되는 로도코커스?에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) SK92-B1주 유래의 나이트릴레이즈(nitrilase) 발현 조절 유전자에 관계된 프로모터를 들 수 있다. pSJ034는 로도코커스속 세균에서 나이트릴-하이드라테이즈를 발현하는 플라스미드로서, 일본 특허공개 평10-337185호 공보에 표시된 방법으로 pSJO23으로부터 제작할 수 있다. 한편, pSJ023은 형질전환체 ATCC12674/pSJ023(수탁 번호 「FERM BP-6232」)으로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 쯔꾸바시 히가시1-1-1 쥬오 제6)에 1997년 3월 4일부로 기탁되어 있다.

터미네이터는 반드시 필요하지는 않고, 그 종류도 특별히 한정되는 것은 아니며, 예컨대 p인자 비의존성인 것, 예컨대 리포프로테인 터미네이터, trp 오페론 터미네이터, rrnB 터미네이터 등을 들 수 있다.

또한, 아미노산으로의 번역에 있어서 중요한 염기 서열로서, SD 서열이나 Kozak 서열 등의 라이보좀 결합 서열이 알려져 있고, 이들의 서열을 변이 유전자의 상류에 삽입할 수도 있다. 원핵 생물을 숙주로 사용할 때에는 SD 서열을, 진핵 세포를 숙주로 사용할 때에는 Kozak 서열을 PCR법 등에 의해 부가할 수도 있다. SD 서열로는, 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열 등을 들 수 있지만, 대장균이나 고초균 등의 원하는 숙주 내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 16S 라이보좀 RNA의 3'말단 영역에 상보적인 서열이 4염기 이상 연속된 컨센서스(consensus) 서열을 DNA 합성에 의해 제작하여 사용할 수도 있다.

일반적으로, 벡터에는 목적으로 하는 형질전환체를 선별하기 위한 인자(선택 마커)가 포함된다. 선택 마커로는, 약제 내성 유전자나 영양 요구성 상보 유전자, 자화성(資化性) 부여 유전자 등을 들 수 있고, 목적이나 숙주에 따라 선택될 수 있다. 예컨대, 대장균에서 선택 마커로서 사용되는 약제 내성 유전자로는, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 유전자, 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는, 상기한 변이 유전자를 보유하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 각각의 숙주에 적합한 벡터를 사용할 수 있다. 벡터로는, 예컨대 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등을 들 수 있다. 예컨대, 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 대장균 내에서의 자율복제 가능한 영역을 갖는 pTrc99A(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS), Netherlands; http://www.cbs.knaw.nl/), pUC19(다카라 바이오, 일본), pKK233-2(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS), Netherlands; http://www.cbs.knaw.nl/), pET-12(Novagen사, Germany), pET-26b(Novagen사, Germany) 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라 이들 벡터를 개변한 것도 사용할 수 있다. 또한, 발현 효율이 높은 발현 벡터, 예컨대 trc 프로모터, lac 오퍼레이터를 갖는 발현 벡터 pTrc99A 또는 pKK233-2 등을 사용할 수도 있다.

상기한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 본 발명의 범위에 포함된다. 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 구체적인 것으로는, 예컨대 본 발명에서 예시하는 pSTK002, pSTK003, pSTT002, pSTT003, pSTT002-T133A, pSTT002-T136C, pSTT002-T133S, pSTT002-F136A, pSTT002-F136S, pSTT002-F136W, pSTT002-D199Q, pSTT002-D199E, pSTT002-D199H, pSTT002-D199S, pSTT002-D199T, pSTT002-D199Y, pSTT002-D199L, pSTT002-D199M, pSTT002-D199I 등을 들 수 있다.

(IV-1) 형질전환체

본 발명의 재조합 벡터를 숙주로 형질전환 또는 형질도입함으로써, 형질전환체 또는 형질도입체(이하, 이들을 합쳐 「형질전환체」라고 함)를 제작한다. 상기 형질전환체도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서 사용하는 숙주는, 상기 재조합 벡터가 도입된 후, 원하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현할 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 숙주로는, 예컨대 대장균, 고초균, 로도코커스속 세균 등의 세균, 효모(Pichia, Saccharomyces), 곰팡이(Aspergillus), 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 들 수 있다.

세균을 숙주로 하는 경우, 본 발명에 있어서는, 대장균, 로도코커스속 세균을 바람직한 숙주로 사용할 수 있다. 대장균으로는, 예컨대 대장균 K12주나 B주, 또는 그들 야생주 유래의 파생주인 JM109주, XL1-Blue주, C600주 등을 들 수 있다. 특히, 상술한 바와 같은 락토오스 오페론의 lac 프로모터 및 그의 파생 프로모터를 발현 프로모터로서 사용하는 경우, lacI 리프레서 유전자를 갖는 숙주를 사용하면 발현이 유도형으로 되고(IPTG 등으로 유도), lacI 리프레서 유전자를 갖지 않는 숙주를 사용하면 발현은 구성형으로 되기 때문에, 필요에 따라 숙주를 이용할 수 있다. 이들 균주는, 예컨대 아메리칸?타입 컬쳐?컬렉션(ATCC) 등으로부터 용이하게 입수 가능하다. 고초균으로는, 예컨대, 바실러스?서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 로도코커스(Rhodococcus)속 세균으로는, 예컨대 로도코커스?로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) ATCC999주, ATCC12674주, ATCC17895주, ATCC15998주, ATCC33275주, ATCC184, ATCC4001주, ATCC4273주, ATCC4276주, ATCC9356주, ATCC12483주, ATCC14341주, ATCC14347주, ATCC14350주, ATCC15905주, ATCC15998주, ATCC17041주, ATCC19149주, ATCC19150주, ATCC21243주, ATCC29670주, ATCC29672주, ATCC29675주, ATCC33258주, ATCC13808주, ATCC17043주, ATCC19067주, ATCC21999주, ATCC21291주, ATCC21785주, ATCC21924주, IFO14894주, IFO3338주, NCIMB11215주, NCIMB11216주, JCM3202주, 로도코커스?로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주(수탁 번호 「FERM BP-1478」), 로도코커스?글로베룰러스(Rhodococcus globerulus) IFO14531주, 로도코커스?루테우스(Rhodococcus luteus) JCM6162주, JCM6164주, 로도코커스?에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IFO12538주, IFO12320주, 로도코커스?에퀴(Rhodococcus equi) IFO3730주, JCM1313주를 들 수 있다. 바람직하게는 로도코커스?로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주(수탁 번호 「FERM BP-1478」)를 들 수 있다. 한편, 상기 ATCC주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터, IFO 주는 독립행정법인 제품평가기술 기반기구 바이오테크놀로지 본부 생물유전자원 부문(NBRC)으로부터, JCM주는 독립행정법인 이화학연구소 바이오리소스센터 미생물 재료 개발실로부터, FERM주는 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터로부터 각각 입수 가능하다.

세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 칼슘 이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다. 효모를 숙주로 하는 경우는, 예컨대 사카로마이세스?세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스?폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아?파스토리스(Pichia pastoris) 등이 사용된다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 들 수 있다. 동물 세포를 숙주로 하는 경우는, 원숭이 세포 COS-7, Vero, CHO 세포, 마우스 L 세포, 랫트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다. 곤충 세포를 숙주로 하는 경우는, Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용된다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다. 식물 세포를 숙주로 하는 경우는, 담배 BY-2 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 식물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대 아그로박테리움법, 파티클 건(particle gun)법, PEG법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다.

상기한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 얻어지는 형질전환체는 본 발명의 범위에 포함된다. 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의한 형질전환체의 구체적인 것으로는, 예컨대 본 발명에서 예시하는 JM109/pSTK002, JM109/pSTK003, JM109/pSTT002, JM109/pSTT003, JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-T133C, JM109/pSTT002-T133S, JM109/pSTT002-F136A, JM109/pSTT002-F136S, JM109/pSTT002-F136W, JM109/pSTT002-D199Q, JM109/pSTT002-D199E, JM109/pSTT002-D199H, JM109/pSTT002-D199S, JM109/pSTT002-D199T, JM109/pSTT002-D199Y, JM109/pSTT002-D199L, JM109/pSTT002-D199M, JM109/pSTT002-D199I 등을 들 수 있다.

(V) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 제조방법

본 발명에 있어서, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 자체로서, 또는 배양물로부터 채취함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서, 「배양물」이란, 배양액, 배양액 상청, 세포 또는 균체, 세포 또는 균체 현탁액, 세포 또는 균체 파쇄액, 조효소액 및 이들의 처리물 등, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 생산하는 형질전환체를 배양함으로써 얻어지는 것 및 그들에 기인하는 것의 모두를 포함하는 의미이다. 본 발명의 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물은 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 보통의 방법에 따라서 행할 수 있다. 원하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는 상기 배양물 중의 어느 하나에 축적된다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 배지는, 숙주가 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하여, 형질전환체의 배양을 효율적으로 할 수 있는 배지라면, 천연 배지, 합성 배지의 모두를 사용할 수 있다. 탄소원으로는, 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 수크로스, 라피노스, 전분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그 밖의 함질소 화합물을 들 수 있다. 기타, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 콘 스팁 리쿼(corn steep liquor), 각종 아미노산 등을 사용할 수 있다. 무기물로는, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산아연, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 배양 중의 발포를 막기 위해 소포제를 첨가할 수도 있다. 또한, 필요에 따라 바이타민 등을 적절히 첨가할 수도 있다. 배양 중에는 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다.

배양 중, 벡터 및 목적 유전자의 탈락을 막기 위해 선택압을 건 상태에서 배양할 수도 있다. 즉, 선택 마커가 약제 내성 유전자인 경우에 상당하는 약제를 배지에 첨가할 수도 있고, 선택 마커가 영양 요구성 상보 유전자인 경우에 상당하는 영양 인자를 배지로부터 제거할 수도 있다. 또한, 선택 마커가 자화성 부여 유전자인 경우는, 상당하는 자화 인자를 필요에 따라 유일 인자로서 첨가할 수 있다. 예컨대, 암피실린 내성 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하는 경우, 필요에 따라 배양 중에 암피실린을 배지에 첨가할 수도 있다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 경우는, 필요에 따라 인듀서(inducer)를 배지에 첨가할 수도 있다. 예컨대, 아이소프로필-β-D-싸이오갈락토사이드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양할 때에는, IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌 아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양할 때에는, IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

형질전환체의 배양 조건은, 원하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 생산성 및 숙주의 생육이 방해되지 않는 조건이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통, 배양 온도는 10℃ 내지 45℃, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 37℃에서 행하고, 필요에 따라 배양 중에 온도를 변경할 수도 있다. 배양 시간은 5 내지 120시간, 바람직하게는 5 내지 100시간, 보다 바람직하게는 10 내지 100시간, 보다 더 바람직하게는 15 내지 80시간 정도 행한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 행하고, 대장균이라면 보통 6 내지 9로 조정한다. 배양 방법으로는, 고체 배양, 정치 배양, 진탕 배양(shaking culture), 통기교반 배양 등을 들 수 있다.

특히 대장균 형질전환체를 배양하는 경우에는, 진탕 배양 또는 통기교반 배양(jar fermenter)에 의해 호기적 조건하에서 배양하는 것이 바람직하고, 이 경우, 보통의 고체 배양법으로 배양할 수도 있지만, 가능한 한 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다. 배양에 사용하는 배지로는, 예컨대 효모 추출물, 트립톤, 폴리펩톤, 콘 스팁 리쿼, 대두 또는 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에, 염화나트륨, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 또는 황산망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 또한 필요에 따라 당질 원료, 바이타민 등을 적절히 첨가한 것이 사용된다. 한편, 배지의 최초 pH는 7 내지 9로 조정하는 것이 적당하다. 또한, 배양은 5℃ 내지 40℃, 바람직하게는 10℃ 내지 37℃에서 5 내지 100시간 행한다. 통기교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양, 유가 배양(feeding culture) 등에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 특히, 공업적 규모에서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 생산을 하는 경우는 통기교반 배양을 이용할 수 있다. 또한, 통기교반 배양의 조작 방식으로는 한정되지 않고, 회분식(batch culture), 반회분식(fed-batch culture, semi-batch culture) 및 연속식(continuous culture)의 모두를 행할 수 있다. 특히, 고농도 배양에 의해, 장치당, 시간당, 비용당, 또는 조작당 생산성을 높이고 싶은 경우에는, 반회분식 배양을 행할 수 있다. 반회분식으로 사용되는 유가(fed) 배지 성분은, 최초(batch) 배지 성분과 동일한 조성의 것을 사용할 수도 있고, 조성을 변경할 수도 있지만, 최초 배지와 비교하여 배지 성분 농도는 보다 고농도인 것이 바람직하다. 유가 배지의 부피는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 보통, 최초 배지의 1/2 이하의 부피를 첨가시킬 수 있다. 유가 배지를 첨가해가는 방법(feeding mode)으로는, 예컨대, 정류적 유가법(constant), 지수적 유화법(exponential), 단계적 증가 유화법(stepwise increase), 비증식 속도 제어 유화법(specific growth-rate control), pH 스타트 유화법(pH-stat), DO 스타트 유화법(DO-stat), 글루코스 농도 제어 유화법(glucose concentration control), 아세트산 농도 모니터링 유화법(acetate concentration monitoring), 퍼지 신경회로 유화법(fuzzy neural network) 등을 들 수 있지만(Trends in Biotechnology(1996), 14, 98-105), 원하는 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 얻어지면 특별히 한정되는 것은 아니다. 한편, 반회분식 배양 실시시의 배양 종료 시기는, 유화 배지의 투입 종료 후로 한정될 필요는 없고, 필요에 따라 배양을 계속하여, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 가장 높은 시점에서 배양 종료 할 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지, DMEM 배지 또는 이들의 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 보통 5% CO 존재하에, 37℃에서 1 내지 30일 행한다. 배양 중에는 필요에 따라 카나마이신 및 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 형질전환(도입)체가 식물 세포 또는 식물 조직인 경우, 배양은 보통의 식물 배양용 배지, 예컨대 MS 기본 배지, LS 기본 배지 등을 사용함으로써 행할 수 있다. 배양 방법은, 보통의 고체 배양법, 액체 배양법의 모두를 채용할 수 있다.

형질전환체가 식물 세포 또는 식물 조직인 경우, 배양은 보통의 식물 배양용배지, 예컨대 MS 기본 배지, LS 기본 배지 등을 사용함으로써 행할 수 있다. 배양 방법은, 보통의 고체 배양법, 액체 배양법의 모두를 채용할 수 있다.

상기 배양 조건으로 배양하면, 본 발명의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 상기 배양물 중, 즉, 배양액, 배양 상청, 세포, 균체, 또는 세포나 균체의 파쇄물 중 적어도 어느 하나에 축적시킬 수 있다.

배양 후, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포 자체로 물질 생산에서의 촉매로서 사용할 수도 있고, 또는 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 원하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취할 수도 있다. 어느 쪽의 경우에도, 필요하다면, 원심 분리나 막여과 등의 고체 액체 분리조작에 의해 배지 제거 및 세정을 할 수 있다. 원심 분리는 균체 또는 세포를 침강시키는 원심력을 공급할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 원통형이나 분리판형 등을 이용할 수 있다. 원심력으로는, 예컨대 500G 내지 20,000G 정도로 행할 수 있다. 또한, 본 공정에 이용할 수 있는 막여과는, 목적으로 하는 고체 액체 분리를 달성할 수 있으면 정밀 여과(MF)막, 한외 여과(UF)막 중 어느 것이라도 좋지만, 보통 정밀 여과(MF)막을 사용하는 것이 바람직하다. 정밀 여과는, 예컨대 유동 방향에 근거하면, 데드 앤드(dead-end) 방식이나 크로스 플로우(tangential flow) 방식으로 분류할 수 있고, 압력을 가하는 방법에 근거하면, 중력식, 가압식, 진공식, 원심력식 등으로 분류할 수 있으며, 조작 양식에 근거하면, 회분식과 연속식 등으로 분류할 수 있지만, 고체 액체 분리조작을 행할 수 있는 것이면 그 중 어느 것이라도 이용할 수 있다. MF 막의 재질로는, 고분자막, 세라믹막, 금속막, 및 그들의 복합형으로 대별될 수 있고, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 및 고체 액체 분리조작 시의 상기 활성 회수율을 저하시키는 것이 아니라면 특별히 한정은 되지 않지만, 특히 고분자막, 예컨대 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리불화바이닐리덴, 폴리염화바이닐, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리아크릴로나이트릴, 혼합 셀룰로스에스터, 구리암모니아법 재생 셀룰로스에스터, 폴리이미드, 나일론, 테플론(등록상표) 등이 바람직하다. 막의 공경으로는, 균체 또는 세포를 포착하여 농축 조작이 가능하면 되고, 보통 0.1 내지 0.5μm 정도의 것을 사용할 수 있다.

상기한 원심분리 및 막여과에 의한 고체 액체 분리조작시에는, 물 또는 필요에 따라 완충액, 등장액을 첨가하여 희석 세정을 행할 수도 있다. 사용되는 완충액은, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 및 고체 액체 분리조작시의 상기 활성 회수율을 저하시키는 것이 아니라면 특별히 한정은 되지 않고, 예컨대 염 농도는 5 내지 500mM, 바람직하게는 5 내지 150mM 정도이고, pH는 5 내지 9 정도인 것이면 좋다. 완충액 성분으로는, 예컨대 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인(Tris), 인산나트륨 또는 칼륨염, 시트르산염, 아세트산염 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 예컨대 20mM Tris-황산 완충액(pH 8), 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7) 등을 들 수 있다. 또한, 등장액으로는, 예컨대 0.7 내지 0.9% 염화나트륨 용액 등을 들 수 있다. 기타, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 안정화 할 수 있는 물질 등이 있으면 그들을 첨가할 수도 있다.

상기한 배지 제거 및 세정 조작을 행한 후, 균체 또는 세포를 다시 물, 또는 필요에 따라 완충액, 등장액에 현탁하여, 균체 또는 세포 현탁액을 조제할 수 있다. 균체 또는 세포 현탁액은, 그대로 물질 생산에 있어서의 촉매로서 사용할 수도 있지만, 필요에 따라 처리를 행한 후에 사용할 수 있다. 처리 방법으로는, 예컨대 상술한 배양으로부터 얻어지는 배양물에 계면활성제를 최종 농도 0.01% 내지 10%가 되도록 가하고, 할로하이드린 에폭시데이즈가 실활하지 않는 온도에서 교반하면 바람직하다. 계면활성제의 최종 농도는 0.05% 내지 1%로 하는 것이 바람직하고, 0.1% 내지 0.5%로 하는 것이 특히 바람직하다. 처리 온도는 0℃ 내지 40℃로 하는 것이 바람직하고, 4℃ 내지 20℃로 하는 것이 특히 바람직하다. 처리 시간은 균체 처리의 효과가 인지되는 시간 내이면 되고, 15분 내지 24시간으로 하는 것이 바람직하고, 30분 내지 2시간으로 하는 것이 특히 바람직하다. 계면활성제로는, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 사용할 수 있다. 음이온성 계면활성제로는 도데실황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 양이온성 계면활성제로는 염화벤제토늄 등을 사용할 수 있다. 비이온성 계면활성제로는, 트라이톤 X100 등을 사용할 수 있다. 계면활성제로 처리한 균은 버퍼로 세정하여 사용할 수도 있고, 세정하지 않고 그대로 사용할 수도 있다. 또한, 상술한 배지 제거 및 세정 조작을 하지 않고, 직접, 균체 또는 세포의 계면활성제 등에 의한 처리를 할 수도 있다. 또한, 균체 또는 세포는 고정화하여 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 예컨대 배양 후의 세포 또는 균체를 아크릴아마이드 등의 겔로 포함한 것, 알루미나, 실리카, 제올라이트, 규조토 등의 무기 담체에 담지한 것 등을 들 수 있다.

한편, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 원하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취할 수도 있다. 균체 또는 세포의 파쇄방법으로는, 초음파 처리, 프렌치 프레스나 균질화기에 의한 고압 처리, 비드밀에 의한 마쇄(磨碎) 처리, 충격파쇄 장치에 의한 충돌 처리, 라이소자임, 셀룰레이즈, 펙티네이즈 등을 사용하는 효소 처리, 동결융해 처리, 저장액 처리, 파지(phage)에 의한 용균유도 처리 등을 들 수 있고, 어느 하나의 방법을 단독으로 또는 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다. 공업적 규모로 균체 또는 세포의 파쇄를 하는 경우는, 조작성, 회수율, 비용등을 감안하여, 주로 고압 처리나 마쇄 처리, 충돌 처리를 이용하는 것이 바람직하고, 경우에 따라서는 이들 물리적 파쇄 조작에 효소 처리 등을 조합시킬수도 있다. 각 파쇄 처리 방법에 있어서, 균체 또는 세포로부터의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 회수율이 충분히 높은 것이면 조작 조건은 특별히 한정되는 것은 아니다. 충분히 높은 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 회수율이란, 예컨대 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 이상이다.

비드밀에 의한 마쇄 처리를 하는 경우, 사용되는 비드는, 예컨대 밀도 2.5 내지 6.0g/cm³, 크기 0.1 내지 1.0mm의 것을 보통 80 내지 85% 정도 충전함으로써 파쇄를 행할 수 있고, 운전 방식으로는 회분식, 연속식 중 어느 것이라도 채용할 수 있다. 균체 또는 세포 농도도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 세균이라면 6 내지 12% 정도, 효모라면 14 내지 18% 정도로 하면 좋다.

고압 처리를 하는 경우, 처리 압력은, 균체 또는 세포로부터의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 회수율이 충분히 높은 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 40 내지 150MPa 정도의 압력으로 파쇄를 행할 수 있다. 균체 또는 세포 농도도 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 20% 이하 정도이면 좋다. 필요에 따라, 장치를 직렬로 배치하거나, 복수 스테이지 구조의 장치를 사용하거나 함으로써, 다단층 처리를 행하여 파쇄 및 조작 효율을 향상시킬 수도 있다. 보통, 처리압력 10MPa 당 2 내지 3℃의 온도 상승이 생긴다는 점에서, 필요에 따라 냉각 처리를 하는 것이 바람직하다.

충돌 처리의 경우, 예컨대 피파쇄 균체 또는 세포 슬러리를 미리 분무 급속동결 처리(동결 속도: 예컨대 1분간당 수천℃) 등에 의해 동결 미세입자(예컨대, 50μm 이하)로 해 두고, 이것을 고속(예컨대, 약 300m/s)의 반송 가스에 의해 충돌판에 충돌시킴으로써 균체 또는 세포를 파쇄할 수 있다.

상기와 같은 균체 또는 세포 파쇄 처리의 결과, 세포 내의 핵산이 유출됨으로써 처리액의 점도가 상승하여 핸들링이 곤란해지는 경우, 또는 후단의 잔사 분리 공정에서 활성 회수율 향상에 효과가 있는 경우는, 필요에 따라, 핵산 제거 또는 핵산 분해에 의해 처리액의 점도 저감이나 잔사 분리 공정에서의 활성 회수율의 향상을 기대할 수 있다. 세포 파쇄액 중의 핵산을 제거 또는 분해하는 방법으로는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 또는 상기 활성 회수율을 저하시키지 않고, 또한 핵산을 제거 또는 분해할 수 있는 방법이면 어떠한 방법이라도 좋지만, 예컨대 생화학 실험 강좌 5권 200 내지 201페이지에 기재되어 있는 것처럼, 세포 파쇄액에 프로타민황산 또는 스트렙토마이신을 첨가함으로써 핵산을 침전시키는 방법, 핵산 분해효소로 핵산을 분해하는 방법, 덱스트란-폴리에틸렌글라이콜을 사용하여 액액 분리를 하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 물리적 파쇄 처리를 더 추가하는 것도 유효한 경우가 있다. 이들 방법 중, 특히 공정의 번잡화를 피하면서 신속히 핵산을 분해하고 싶은 경우에는 핵산 분해효소로 핵산을 분해하는 방법을 채용할 수 있다. 핵산 분해효소 처리에 사용하는 핵산 분해효소는, 적어도 디옥시라이보핵산(DNA)에 작용하여, 핵산 분해반응 촉매 능력을 갖고, DNA 중합도를 낮추는 것이면 어떠한 것이어도 되고, 상기 형질전환체 세포 내에 원래 존재하는 핵산 분해효소를 사용할 수도 있지만, 별도의 외인성 핵산 분해효소를 첨가할 수도 있다. 별도 첨가하는 핵산 분해효소로는, 예컨대 소 비장(脾臟) 유래 DNaseI(다카라 바이오, 일본), 돼지 비장 유래 DNaseII(와코쥰야쿠, 일본), Serratia marcescens 유래 핵산 분해효소 Benzonase(등록상표) Nuclease(다카라 바이오, 일본), Nuclease from Staphylococcus aureus(와코쥰야쿠, 일본) 등을 들 수 있다. 첨가하는 효소량은, 효소의 종류나 유닛 수(U)의 정의에 따라 다르지만, 당업자라면 적절히 설정할 수 있다. 필요에 따라, 핵산 분해효소에 요구되는 마그네슘 등의 보인자를 상기 효소 용액에 첨가할 수도 있다. 처리 온도는, 사용하는 핵산 분해효소에 따라 다르지만, 상온 생물종 유래의 핵산 분해효소라면, 보통 20 내지 40℃의 온도로 설정하면 바람직하다.

얻어진 파쇄액으로부터 균체 또는 세포 파쇄 잔사를 제거해야 하는 경우는, 예컨대 원심분리나 여과(데드 앤드 방식 또는 크로스 플로우 방식) 등에 의해 제거할 수 있다.

원심분리 조작은 전술한 바와 같이 행할 수 있다. 균체 또는 세포 파쇄 잔사가 미세하여 용이하게 침강하기 어려운 경우는, 필요에 따라 응집제를 사용하여 잔사 침전 효율을 높일 수도 있다. 유기 고분자 응집제는, 이온성에 근거하면, 양이온계 응집제, 음이온계 응집제, 양성계 응집제, 비이온계 응집제를 들 수 있고, 성분에 근거하면, 아크릴계, 폴리에틸렌이민, 축합계 폴리양이온(폴리아민), 다이메틸다이알릴암모늄클로라이드, 키토산 등을 들 수 있지만, 본 발명에서 사용하는 응집제는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 또는 상기 활성 회수율을 저하시키지 않고, 또한 잔사 분리 효율을 향상시킬 수 있는 것이면 어떠한 응집제여도 좋다. 아크릴계 응집제의 성분으로 되는 아크릴계 수용성 모노머로는, 예컨대 아크릴아마이드, 아크릴산나트륨, 아크릴아마이드2메틸-프로페인설폰산나트륨, 다이메틸아미노에틸-메타크릴레이트, 메타크릴로일옥시에틸트라이에틸암모늄-클로라이드, 메타크릴로일옥시에틸벤질다이메틸-암모늄클로라이드, 다이메틸아미노에틸-아크릴레이트, 아크릴로일옥시에틸트라이메틸암모늄클로라이드, 다이메틸아미노프로필-아크릴아마이드, 아크릴아마이드프로필-트라이메틸암모늄-클로라이드, 폴리아미딘-클로라이드 등을 들 수 있고, 이들 모노머의 단일 중합물, 다양한 조성에 의한 공중합물 또는 고분자 변성물을 아크릴계 응집제로서 들 수 있다. 특히 대표적인 양이온계 고분자 응집제로는, 폴리아미노알킬메타크릴레이트류, 폴리아미노알킬메메타크릴레이트와 아크릴아마이드의 공중합물류, 폴리아크릴아마이드의 만니히(mannich) 변성물류, 폴리다이메틸다이알릴암모늄염류, 폴리바이닐이미다졸린류, 폴리아크릴아마이드류, 아민계 중축합물류 등을 들 수 있고, 이미 많은 상품이 시판되어 있다. 그 주된 것으로는, 예컨대 샌폴리(Sanpoly) K-601, K-602(주성분: 폴리아민, 산쿄화성), 큐리플럭(Kuriflock) LC-599(주성분: 폴리아민 및 폴리아마이드, 구리타공업), 하이몰락(Hymolock) M-166, M-566, M-966(주성분: 아크릴아마이드 변성물, 교리츠 유기공업), 유니플로커(Uniflocker) UF-301, UF-304, UF-305(주성분: 폴리아크릴아마이드, 유니티카), UF-330, UF-340(주성분: 아미노메타크릴산에스터, 유니티카), UF-505(주성분: 다이 사이안아민, 유니티카), 류플럭(Ryufloc0) C-110(주성분: 폴리아민, 다이니폰잉크화학), 퓨리플럭(Purifloc) C-31(주성분: 폴리아민, 다우케미컬)을 들 수 있다. 또한, 다이아니트릭스사(일본) 제품인 K-400 시리즈, KM-200 시리즈, KM-1200 시리즈, KAm-200 시리즈, KD-200 시리즈, KP-000 시리즈, KP-100 시리즈, KP-200 시리즈, KP-300 시리즈, KP-500 시리즈, KP-1200 시리즈, KA-000 시리즈, KA-200 시리즈, KA-300 시리즈, KA-400 시리즈, KA-600 시리즈, KA-700 시리즈, KA-800 시리즈 등도 들 수 있다. 이들 응집제는 단독으로 또는 2종 이상을 병용하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 응집제는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 또는 상기 활성 회수율을 저하시키지 않고, 또한 잔사 분리 효율을 향상시킬 수 있는 것이면 상술한 어떠한 응집제여도 좋지만, 구체적으로는, 예컨대 다이아니트릭스사(일본) 제품인 K-403B, K-408, K-415 등을 들 수 있다. 응집제의 첨가량으로는, 응집제의 종류나 균체 또는 파쇄액의 액 형상에 의해서도 달라지지만, 예컨대 파쇄한 미생물 건조 중량% 농도의 1/200 내지 1/5의 농도, 바람직하게는 1/100 내지 1/10 농도이다. 첨가 방법으로는, 예컨대 응집제를 미리 물에 용해한 후, 균체 또는 세포 파쇄액에 첨가하여 적어도 5분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 10시간 정도, 정치 또는 교반하면 바람직하다. 그 때의 온도로는, 예컨대 0℃ 내지 60℃, 특히 0℃ 내지 50℃, 더욱 0℃ 내지 40℃가 바람직하다. 또한, pH의 조정이 필요한 경우에는, 적절히 무기염 최종 농도가 5 내지 200mM이 되도록 첨가하여 완충액화 할 수도 있고, 필요에 따라 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 안정화하는 물질을 첨가할 수도 있다.

여과에 의해 잔사 분리를 행하는 경우, 목적으로 하는 잔사 분리를 달성할 수 있다면, 정밀 여과(MF)막, 한외 여과(UF)막 중 어떠한 막이라도 사용할 수 있지만, 보통 정밀 여과(MF)막을 사용하는 것이 바람직하다. 정밀 여과막은, 전술한 바와 같이, 잔사 분리 조작을 할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 막의 공경으로는, 균체 또는 세포 잔사를 포착하고, 또한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 여액측에 회수될 수 있는 것이면 되고, 예컨대 0.1 내지 0.5μm 정도의 것을 사용할 수 있다. 또한, 여과 조제, 필요에 따라 응집제를 사용하면, 공경 0.5μm 이상의 막 또는 여과지를 이용할 수도 있다. 여과 조제로는, 규조토나 셀룰로스 분말, 활성탄 등을 들 수 있다. 응집제는 상술한 바와 같다.

잔사를 제거한 후에 얻어진 상청은, 세포 추출액 가용성 획분(劃分)이며, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 포함하는 조효소 용액으로 할 수 있다. 그 후, 필요에 따라, 단백질의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예컨대 황산암모늄 침전, 각종 크로마토그래피(예컨대, 겔 여과 크로마토그래피(예컨대, Sephadex 컬럼), 이온 교환 크로마토그래피(예컨대, DEAE-Toyopearl), 어피니티 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피(예컨대, butyl Toyopearl), 음이온 크로마토그래피(예컨대, MonoQ 컬럼) 등), SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 상기 배양물 중에서 할로하이드린 에폭시데이즈를 단리 정제할 수 있다.

본 발명의 형질전환체가 유전자 재조합체이고, 또한 제조 공정에서의 형질전환체의 환경에의 누출, 제품에의 혼입, 또는 사용 후의 취급 등으로, 2차적으로 미생물 오염을 야기할 가능성이 염려되는 경우에는, 필요에 따라 불활성화 처리를 행할 수 있다. 불활성화 방법으로는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 또는 상기 활성 회수율을 저하시키지 않고, 또한 형질전환체를 불활성화 할 수 있는 방법이면 어떠한 방법이어도 되고, 예컨대 열 처리, 균체파쇄 처리, 약제 처리 등의 방법을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대, 균체파쇄 처리의 전 또는 후에, 약제 처리를 함으로써 불활성화를 할 수 있다. 사용하는 약제로는, 형질전환체의 숙주 종류에 따라 다르지만, 예컨대 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일, 브롬화세틸트라이메틸암모늄 등의 양이온계 계면활성제, 염산알킬다이아미노에틸글라이신 등의 양성 이온계 계면활성제 등을 들 수 있다. 또한, 에탄올 등의 알코올류, 2-머캅토에탄올 등의 싸이올류, 에틸렌다이아민 등의 아민류, 시스테인, 오르니틴, 시트룰린 등의 아미노산류 등도 들 수 있다. 약제의 농도는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 또는 상기 활성 회수율을 저하시키지 않고, 또한 불활성화 할 수 있는 농도이면 되지만, 예컨대 미생물 건조 중량% 농도의 1/100 내지 1/2의 농도, 바람직하게는 1/10 내지 1/5 농도 정도가 바람직하다. 처리 온도는 0 내지 50℃, 바람직하게는 0 내지 40℃에서 행해진다. 또한, pH는 5 내지 9 정도, 바람직하게는 6 내지 8 정도에서 행해진다.

한편, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈가 균체 외 또는 세포 외에서 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 상술한 바와 같은 원심분리나 여과 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 필요에 따라 황산암모늄 침전에 의한 추출 등에 의해 상기 배양물 중에서 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취하고, 추가로 필요에 따라 투석, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등)를 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써 정제할 수도 있다.

형질전환체가 식물 세포 또는 식물 조직인 경우는, 셀룰레이즈, 펙티네이즈 등의 효소를 사용한 세포용해 처리, 초음파 파쇄 처리, 마쇄 처리 등에 의해 세포를 파괴한다. 그 후, 필요하다면, 단백질의 단리 정제에 사용되는 일반적인 생화학적 방법, 예컨대 황산암모늄 침전, 각종 크로마토그래피(예컨대, 겔 여과 크로마토그래피(예컨대, Sephadex 컬럼), 이온 교환 크로마토그래피(예컨대, DEAE-Toyopearl), 어피니티 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피(예컨대, butyl Toyopearl), 음이온 크로마토그래피(예컨대, MonoQ 컬럼) 등), SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용함으로써, 상기 배양물 중에서 할로하이드린 에폭시데이즈를 단리 정제할 수 있다. 단리된 할로하이드린 에폭시데이즈는 상술한 세포 또는 균체와 같이, 적당한 담체로 유지하여 고정화 효소로서 사용할 수도 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 배양물 및 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는 본 발명의 범위에 포함된다. 얻어지는 배양물 및 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 생산수율은, (I) 기재의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 측정하여, 배양장치당, 배양액당, 균체(형질전환체) 습(濕) 중량 또는 건조 중량당, 효소액 중 단백질 중량당 등의 활성을 산출함으로써 구할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 또는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로부터 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에서는, 살아있는 세포를 전혀 사용하지 않고 무세포 단백질 합성계를 채용하여 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 생산할 수 있다. 무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공용기 내에서 단백질을 합성하는 계이다. 한편, 본 발명에서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 하여 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다. 이 경우, 상기의 숙주에 대응하는 생물은, 하기의 세포 추출액에서 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예컨대 맥아, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 한편, 이들의 세포 추출액은 농축된 것이어도 되고 농축되지 않는 것이어도 된다. 세포 추출액은, 예컨대 한외 여과, 투석, 폴리에틸렌글라이콜(PEG) 침전 등에 의해 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 무세포 단백질 합성은, 시판되는 키트를 사용하여 행할 수도 있다. 그러한 키트로는, 예컨대 시약 키트 PROTEIOS^TM(도요보), TNT^TM System(프로메가), 합성 장치의 PG-Mate^TM(도요보), RTS(로쉐?다이아그노스틱스) 등을 들 수 있다.

상기한 바와 같이 무세포 단백질 합성에 의해 얻어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 예컨대 전술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

(VI) 에피할로하이드린 및 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법

상술한 바와 같이 하여 제조된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는 효소 촉매로서 물질 생산에 이용할 수 있다. 즉, 이하의 (VI-1) 내지 (VI-3)에 나타내는 반응에 제공할 수 있다.

(VI-1) 1,3-다이할로-2-프로판올의 에피할로하이드린으로의 변환

본 변환 반응은, 1,3-다이할로-2-프로판올을, 상술한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및/또는 상술한 배양에 의해 얻어지는 배양물과 접촉시킴으로써 행할 수 있다.

기질인 1,3-다이할로-2-프로판올은, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물이다. 할로젠 원자로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드가 바람직하고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다. 구체적으로는 1,3-다이플루오로-2-프로판올, 1,3-다이클로로-2-프로판올, 1,3-다이브로모-2-프로판올, 1,3-다이아이오도-2-프로판올 등을 들 수 있고, 바람직하게는 1,3-다이클로로-2-프로판올, 1,3-다이브로모-2-프로판올이다.

변환 반응액 중의 기질 농도는 0.01 내지 15(W/V)%가 바람직하다. 이 범위 내이면 효소 안정성의 관점에서 바람직하고, 0.01 내지 10%가 특히 바람직하다. 기질은 반응액에 일괄 첨가 또는 분할 첨가할 수 있다. 분할 첨가에 의해 기질 농도를 일정하게 하는 것이 축적성의 관점에서 바람직하다.

반응액의 용매로는, 효소 활성의 최적 pH 4 내지 10의 부근인 물 또는 완충액이 바람직하다. 완충액으로는, 예컨대 인산, 붕산, 시트르산, 글루타르산, 사과산, 말론산, o-프탈산, 석신산 또는 아세트산 등의 염 등으로 구성되는 완충액, Tris 완충액 또는 Good's 완충액 등이 바람직하다.

반응 온도는 5 내지 50℃, 반응 pH는 4 내지 10의 범위에서 행하는 것이 바람직하다.

반응 온도는 보다 바람직하게는 10 내지 40℃이다. 반응 pH는 보다 바람직하게는 pH 6 내지 9이다. 반응 시간은 기질 등의 농도, 균체 농도 또는 그 밖의 반응 조건 등에 의해 적절히 선택하지만, 1 내지 120시간에 종료하도록 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 한편, 본 반응에 있어서는, 반응의 진행에 따라 생성되는 염소 이온을 반응계 내에서 제거함으로써, 광학 순도를 보다 한층 향상시킬 수 있다. 이 염소 이온의 제거는 질산은 등의 첨가에 의해 행하는 것이 바람직하다.

반응액 중에 생성, 축적된 에피할로하이드린은 공지된 방법을 사용하여 채취 및 정제할 수 있다. 예컨대, 아세트산에틸 등의 용매로 추출을 하고, 감압하에서 용매를 제거함으로써 에피할로하이드린의 시럽을 얻을 수 있다. 또한, 이들 시럽을 감압하에서 증류함으로써 추가로 정제할 수도 있다.

(VI-2) 1,3-다이할로-2-프로판올의 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴로의 변환

기질인 1,3-다이할로-2-프로판올은, 상술한 화학식 1로 표시되는 화합물이고, 바람직하게는 1,3-다이클로로-2-프로판올, 1,3-다이브로모-2-프로판올 등이다.

또한, 사이안 화합물로는, 사이안화수소, 사이안화칼륨, 사이안화나트륨, 사이안산 또는 아세톤사이안하이드린 등의 반응액 중에 첨가했을 때에 사이안 이온(CN-) 또는 사이안화수소를 생성하는 화합물 또는 그의 용액을 사용할 수 있다. 반응액 중의 기질 농도는, 효소 안정성의 관점에서 0.01 내지 15(W/V)%가 바람직하고, 0.01 내지 10%가 특히 바람직하다.

또한, 사이안 화합물의 사용량은, 효소 안정성의 관점에서 기질의 1 내지 3배량(몰)이 바람직하다.

반응 조건은, 상기 (VI-1)과 마찬가지로 행할 수 있다.

반응액 중에 생성, 축적된 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴은, 공지된 방법을 사용하여 채취 및 정제할 수 있다. 예컨대, 반응액으로부터 원심분리 등의 방법을 사용하여 균체를 제거한 후, 아세트산에틸 등의 용매로 추출을 하고, 감압하에서 용매를 제거함으로써 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 시럽을 얻을 수 있다. 또한, 이들 시럽을 감압하에서 증류함으로써 추가로 정제할 수도 있다.

(VI-3) 에피할로하이드린의 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴로의 변환

본 변환 반응은, 에피할로하이드린을, 상술한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및/또는 상술한 배양에 의해 얻어지는 배양물과 접촉시킴으로써 행한다.

기질인 에피할로하이드린은, 상술한 화학식 2로 표시되는 화합물이다. 할로젠 원자로는, 불소, 염소, 브롬, 요오드가 바람직하고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다. 구체적으로는, 에피플루오로하이드린, 에피클로로하이드린, 에피브로모하이드린, 에피아이오도하이드린 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 에피클로로하이드린, 에피브로모하이드린이다.

또한, 사이안 화합물은 사이안화수소, 사이안화칼륨, 사이안화나트륨, 사이안산 또는 아세톤사이안하이드린 등의 반응액 중에 첨가했을 때에 사이안 이온(CN-) 또는 사이안화수소를 생성하는 화합물 또는 그의 용액을 사용할 수 있다.

반응 조건, 채취 및 정제 방법은, 상기 (VI-2)와 마찬가지로 행할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환된, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 취득 및 그의 평가

(1) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체의 제작(발현 벡터 pKK233-2)

코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈인 HheB(2^nd)에 있어서, 번역 개시 코돈에 의해 인코딩되는 아미노산 잔기의 1잔기 하류의 아미노산 잔기(2번째의 아미노산 잔기)가 각각 라이신 및 아스파라진으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 발현 플라스미드(발현 벡터 pKK233-2) 및 상기 발현 플라스미드를 포함하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체를 이하와 같이 제작했다.

우선, 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 HheB(2^nd)를 PCR에 의해 증폭했다. PCR 반응액 조성(전체량 50㎕)은 이하의 표대로 하여, 3계열 조제했다(3계열의 차이는 센스 프라이머가 각각 다르다는 것임).

프라이머로서 사용한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 이하와 같다.

DH-08: GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC(서열번호 57: 28 뉴클레오타이드로 이루어지고, 그의 서열 중에 제한효소 NcoI 인식부위(CCATGG) 및 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 HheB(2^nd)의 번역 개시 코돈 이후를 가지며, 2번째의 아미노산에 대응하는 코돈은 GCT로서 알라닌을 인코딩함)

DH-09: GATCATGAAAAACGGAAGACTGGCAGGCAAGCG(서열번호 58: 33 뉴클레오타이드로 이루어지고, 그의 서열 중에 제한효소 BspHI 인식부위(TCATGA) 및 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 HheB(2^nd)의 번역 개시 코돈 이후를 가지며, 2번째의 아미노산에 대응하는 코돈은 AAA로서 라이신을 인코딩함)

DH-10: GATCATGAACAACGGAAGACTGGCAGGCAAGCG(서열번호 59: 33 뉴클레오타이드로 이루어지고, 그의 서열 중에 제한효소 BspHI 인식부위(TCATGA) 및 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 HheB(2^nd)의 번역 개시 코돈 이후를 가지며, 2번째의 아미노산에 대응하는 코돈은 AAC로서 아스파라진을 인코딩함)

DH-07: CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG(서열번호 60: 32 뉴클레오타이드로 이루어지고, 그의 서열 중에 제한효소 Sse8387I 겸 PstI 인식부위(CCTGCAGG) 및 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 HheB(2^nd) 종결 코돈 하류 영역을 가짐)

또한, 주형으로서 사용한 pST111은, 일본 특허공고 평5-317066호 공보에 기재되어 있고, pST111을 포함하는 재조합 벡터에 의한 대장균 형질전환체 JM109/pST111은 수탁 번호 「FERM BP-10922」로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 1991년 3월 1일부로 기탁되어 있다.

조제한 50㎕의 PCR 반응액을 각각 이하의 열사이클 처리하였다.

열사이클 처리를 한 3계열의 PCR 반응액을 GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit(GE 헬스케어 바이오사이언스)에 의해 각각 정제한 후, 계열 1의 PCR 증폭산물에 대해서는 제한효소 NcoI와 PstI로, 계열 2 및 계열 3의 PCR 증폭산물에 대해서는 제한효소 BspHI와 PstI로 각각 2중 소화를 행했다. 각각의 소화산물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리 후, 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 전장을 포함하는 밴드(약 0.8kb)를 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)로 정제했다. 한편, pKK233-2(Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS), Netherlands; http://www.cbs.knaw.nl/)의 유도체이며, WO2006/41226호 팜플렛에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있는 발현 벡터 pKK233-2(+Sse)를, 제한효소 NcoI와 PstI로 소화 후, 페놀 추출?클로로폼 추출?에탄올 침전(molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))에 의해 정제했다. 이것을 상술한 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 전장을 포함하는 3종의 PCR 증폭산물과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액에 Solution I(DNA Ligation Kit ver.2(다카라 바이오)을 첨가하여 라이게이션 혼합물을 만들었다. 이 혼합물을 12시간, 16℃에서 인큐베이션 함으로써 PCR 증폭산물과 발현 벡터 pKK233-2(+Sse)를 결합했다.

미리 조제해 둔 대장균 JM109주 컴피턴트 셀(대장균 JM109주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 0.5% NaCl) 1㎖에 접종하고 37℃, 5시간 호기적으로 전(前)배양한 후, 전배양액 0.4㎖를 SOB 배지 40㎖(2% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO₄, 1mM MgCl₂)에 가하여 18℃에서 20시간 배양하고, 얻어진 배양물을 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 집균한 후, 냉 TF용액(20mM PIPES-KOH(pH 6.0), 200mM KCl, 10mM CaCl₂, 40mM MnCl₂)을 13㎖ 가하여 0℃에서 10분간 방치하고, 다시 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃) 하여 상청을 제거하고, 얻어진 대장균 균체를 냉 TF용액 3.2㎖에 현탁하고, 0.22㎖의 다이메틸설폭사이드를 가하여 0℃에서 10분간 방치한 후, 액체 질소를 사용하여 -80℃에서 보존해 둔 것) 200㎕를, 상기 라이게이션 산물 10㎕에 가하여, 0℃에서 30분 방치했다. 계속해서, 상기 컴피턴트 셀에 42℃에서 30초간 열 쇼크를 주고, 0℃에서 2분간 냉각했다. 그 후, SOC 배지(20mM 글루코스, 2% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM MgSO₄, 1mM MgCl₂)를 1㎖ 첨가하여, 37℃에서 1시간 진탕 배양했다. 배양 후의 배양액을 각 200㎕씩, LB Amp 한천 배지(암피실린 100mg/L, 1.5% 한천을 함유하는 LB 배지)에 도포하여, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 한천 배지 상에 생육한 형질전환체 콜로니 복수개를, 1.5㎖의 LB Amp 배지(암피실린 100mg/L를 함유하는 LB 배지)에서 37℃로 하룻밤 배양했다. 얻어진 배양액을 각각 집균 후, Flexi Prep(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용하여 재조합 플라스미드를 회수했다. 캐필러리 DNA 시퀀서 CEQ2000(베크만?코울터)을 사용하여, 첨부된 메뉴얼에 따라, 3종의 플라스미드 중에 클로닝 되어 있는 PCR 증폭산물의 염기 서열을 해석하여, PCR 반응에서의 에러 변이가 생기지 않은 것을 확인했다. 계열 1의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTK001로, 계열 2의 PCR 증폭 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTK002로, 계열 3의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTK003으로 명명하고, 또한 그들 플라스미드를 포함하는 대장균 JM109주 형질전환체를 JM109/pSTK001, JM109/pSTK002 및 JM109/pSTK003으로 각각 명명했다.

상기 각 플라스미드의 특징은 이하와 같다.

pSTK001: 2번째의 아미노산 잔기가 알라닌 잔기인 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pKK233-2상에 클로닝되어 있음

pSTK002: 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기)가 라이신으로 치환되어 있는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pKK233-2상에 클로닝되어 있음

pSTK003: 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기)가 아스파라진으로 치환되어 있는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pKK233-2상에 클로닝되어 있음

(2) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체의 제작(발현 벡터 pTrc99A)

코리네박테리움속(Corynebacterium sp.) N-1074주 유래의 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈인 HheB(2^nd)에 있어서, 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기(2번째의 아미노산 잔기)가 각각 라이신 및 아스파라진으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 발현 플라스미드(발현 벡터 pTrc99A) 및 상기 발현 플라스미드를 포함하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체를 제작했다. 제작은, 실시예 1(1)에서 사용하는 발현 벡터 pkk233-2의 대신에 pTrc99A를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1(1)과 같이 행했다. 계열 1의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTT001로, 계열 2의 PCR 증폭 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTT002로, 계열 3의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pSTT003으로 명명하고, 또한 그들 플라스미드를 포함하는 대장균 JM109주 형질전환체를 JM109/pSTT001, JM109/pSTT002 및 JM109/pSTT003으로 각각 명명했다.

상기 각 플라스미드의 특징은 이하와 같다.

pSTT001: 2번째의 아미노산 잔기가 알라닌 잔기인 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pTrc99A 상에 클로닝되어 있음

pSTT002: 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기)가 라이신으로 치환되어 있는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pTrc99A 상에 클로닝되어 있음

pSTT003: 2번째의 아미노산 잔기(알라닌 잔기)가 아스파라진으로 치환되어 있는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 인코딩하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자가 발현 벡터 pTrc99A 상에 클로닝되어 있음

(3) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체의 평가

실시예 1(1) 및 (2)에서 제작한 형질전환체 6주(JM109/pSTK001, JM109/pSTK002, JM109/pSTK003, JM109/pSTT001, JM109/pSTT002, JM109/pSTT003) 및 일본 특허공고 평5-317066호 공보에 기재된 JM109/pST111의 합계 7주를, IPTG(아이소프로필-1-싸이오-D-β-D-갈락토사이드)의 평가를 다음과 같이 행했다. LB Amp 배지를 바서만(Wassermann) 시험관에 1㎖씩 분주하고, 각 시험관에 2차 평가 선발주 6주 및 JM109/pST111의 콜로니를 각각 식균했다. 37℃, 210rpm으로 약 8시간 배양한 후, 얻어진 각 배양액 100㎕를 IPTG를 최종 농도로서 1mM 포함하는 LB Amp 배지(500㎖용(容) 삼각 플라스크 중의 100㎖)에 식균하여, 37℃, 210rpm으로 24시간 배양했다. 얻어진 배양액으로부터 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 각 균체를 회수하고, 20mM Tris-황산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 균 농도가 12.5gDC/L이 되도록 동일한 완충액에 현탁했다. 얻어진 균체 현탁액의 1㎖를, 초음파 파쇄기 VP-15S(다이테크, 일본)를 사용하여, 출력 컨트롤 4, DUTY CYCLE 40%, PULS, TIMER=B 모드 10s의 조건으로 빙냉하면서 3분간 파쇄했다. 파쇄한 균체 현탁액을 원심분리(23,000×g, 5분간, 4℃) 하여, 상청을 조효소액으로서 채취했다. 얻어진 조효소액을, 각각 파쇄 전의(균체 현탁액 시점에서의) 균 농도로서 6.25gDC/L이 되도록, 20mM Tris-황산 완충액(pH 8.0)으로 희석했다. 희석한 각 형질전환체 유래의 조효소액을 등량의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동용 샘플 버퍼(0.1M Tris-HCl(pH 6.8), 4%w/v SDS, 12%v/v β머캅토에탄올, 20%v/v 글라이세롤, 미량 브로모페놀블루)와 혼합하고, 5분간 끓여 변성 처리를 행했다. 10% 폴리아크릴아마이드겔을 제작하여, 변성 처리가 끝난 샘플을 1레인당 5㎕씩 가하여 전기영동 분석을 행했다(도 1). 할로하이드린 에폭시데이즈는 30kDa 세기의 밴드로서 각각 관찰되었다(도 1 중의 화살표). 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)를 발현하는 JM109/pST111 유래 조효소액과 비교하여, 동 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK001 유래 조효소액 및 JM109/pSTT001 유래 조효소액은 발현량이 증가되어 있는 것이 확인되었다(이는 발현 벡터의 차이에 의한 것으로 생각됨). 한편, JM109/pSTK001 유래 조효소액 및 JM109/pSTT001 유래 조효소액과 비교하여, 2번째의 아미노산 잔기가 아스파라진으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK003 유래 조효소액 및 JM109/pSTT003 유래 조효소액은, 각각 더욱 발현량이 증가되어 있고, 또한 2번째의 아미노산 잔기가 라이신으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK002 유래 조효소액 및 JM109/pSTT002 유래 조효소액은 각각 더욱 대폭 발현량이 증가되어 있는 것이 확인되었다.

계속해서, 상기 조효소액을 사용하여, 이하의 방법에 의해 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)을 측정했다. 100㎖의 활성 측정용 반응액(50mM DCP, 50mM Tris-황산(pH 8))을 조제하고, 온도를 20℃로 조정했다. 상기 반응액에, 희석한 각 형질전환체 유래의 조효소액을 첨가하여 반응을 시작했다. 할로하이드린 에폭시데이즈 활성에 의한 염화물 이온의 유리에 수반하는 pH의 저하를, pH 자동 컨트롤러를 사용하고, 0.01 규정의 수산화 나트륨 수용액을 사용하여, pH를 8로 유지하도록 연속적으로 조정했다. 10분간의 반응의 사이에 pH를 8로 유지하기위해 투입된 0.01 규정의 수산화 나트륨 수용액의 양으로부터, 염화물 이온 생성량을 산출하여, 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)(U)을 산출했다. 1U는 상기 조건하에서 DCP로부터 1분간당 1μmol 염화물 이온의 탈리하는 효소량에 상당하는 것으로 정의하고, 활성 측정에 사용한 각 조효소액의 활성, 및 상기 활성을 활성 측정에 사용한 각 조효소액의 액량으로 나눔으로써 각 조효소 용액의 액 활성을 산출했다. 또한, 상기 초음파 처리에 의해 균체가 완전히 파쇄되어 있는 것으로 가정하여, 상기 액 활성을 파쇄 전의(균체 현탁액 시점에서의) 균 농도로 나눔으로써 균체 비활성을 산출했다. 각 형질 전환체에 대한 균체 비활성의 결과를 표 1에 나타내었다. 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK001 및 JM109/pSTT001과 비교하여, 2번째의 아미노산 잔기가 아스파라진으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK003 및 JM109/pSTT003은 각각 균체 비활성이 약 12배 및 약 5배로 향상되어 있고, 또한 2번째의 아미노산 잔기가 라이신으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)를 발현하는 JM109/pSTK002 및 JM109/pSTT002는 각각 균체 비활성이 약 25배 및 약 17배로 향상되어 있는 것이 확인되었다. 즉, 개시 아미노산 잔기보다 1잔기 C 말단측의 아미노산 잔기(서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 제2번째의 아미노산 잔기)가 다른 아미노산으로 치환된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체는, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성이 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 높은 것이 확인되었다.

[실시예 2]

랜덤 변이에 의한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝

(1) 할로하이드린 에폭시데이즈 변이체 라이브러리의 제작

보다 유용한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 취득하기 위해, 에러 유발 PCR에 의해 랜덤 변이가 도입된 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이체 라이브러리를 제작하여, 상기 라이브러리로부터의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 및그의 유전자의 스크리닝을 행했다.

실시예 1(2)에서 제작한 pSTT002를 주형으로 사용하여, 에러 유발 PCR에 의한 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이체 라이브러리의 제작을 다음과 같이 행했다. 이하의 표의 조성의 PCR 반응액을 100㎕ 조제했다.

프라이머로서 사용한 Trc-03의 서열은 이하와 같다.

Trc-03: GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(서열번호 61: 25 뉴클레오타이드로 이루어지고, pTrc99A의 멀티클로닝 사이트의 하류 영역에 대응함)

조제된 100㎕의 PCR 반응액을 10㎕×10개의 PCR 반응용 튜브에 분주한 후, 각각을 이하의 열사이클 처리하였다.

열사이클 처리를 행한 10개의 PCR 반응액을 혼합하여, 실시예 1(2)와 같이, PCR 반응액의 정제와 제한효소 소화(NcoI와 PstI에 의한 2중 소화) 및 겔로부터의 정제, 발현 벡터 pTrc99A의 제한효소 소화(NcoI와 PstI에 의한 2중 소화) 및 정제, 라이게이션 반응 및 형질전환을 행했다. 플레이트상에 출현한 콜로니를 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이체 라이브러리로 했다.

(2) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝(일차 평가)

실시예 2(1)에서 제작한 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이체 라이브러리를 사용하여, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝(일차 평가)을 다음과 같이 행했다. 96웰 플레이트(딥웰)에, IPTG를 최종 농도로서 1mM 포함하는 LB Amp 배지를 웰당 500㎕씩 분주하고, 각 웰에 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이체 라이브러리의 콜로니를 식균했다. 한편, 96웰 중 1 내지 2개의 웰에 대해서는, 평가의 대조로서 사용하는 JM109/pSTT002 콜로니를 식균했다. 37℃, 800rpm으로 약 16시간 배양한 후, 얻어진 배양액 중 20㎕를 평형 96웰 플레이트에 분주했다. 원심분리기(사쿠마제작소 50A-IVD) 및 로터(사쿠마제작소 HM-2HLS)를 사용하여, 평형 96웰 플레이트를 원심분리(3000rpm, 5분간, 4℃) 하였다. 배양액 상청을 제거한 후, 평가용 반응액 1(400mM DCP, 800mM (R)-CHBN, 0.025% 브로모크레졸 퍼 플(BCP), 50mM Tris-황산(pH 8)) 40㎕를 각 웰에 첨가했다. 현탁 후, 실온에서 정치하여, 반응액의 정색(呈色) 변화를 경시적으로 관찰하여(할로하이드린 에폭시데이즈 활성에 의한 염화물 이온의 생성에 수반하는 pH 저하에 의해, BCP의 색이 자색으로부터 황색으로 변화됨), 대조인 JM109/pSTT002 보다도 상당히 빨리 변색이 보인 주를 선발했다. 약 20,000주의 콜로니에 대하여 상기 일차 평가를 행하여, 77주를 선발했다.

(3) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝(2차 평가)

실시예 2(2)에서 선발된 일차 평가 선발주 77주에 대하여, 다음과 같이 2차 평가를 행했다. 일차 평가 선발주 77주에 대하여, 실시예 2(2)와 같이, 96웰 플레이트(딥웰)에 의한 배양을 한 후, 얻어진 각 배양액에 대하여(20㎕, 15㎕, 10㎕, 5㎕)×2샘플씩을 평형 96웰 플레이트에 분주했다. 원심분리기(사쿠마제작소 50A-IVD) 및 로터(사쿠마제작소 HM-2HLS)를 사용하여, 평형 96웰 플레이트를 원심분리(3000rpm, 5분간, 4℃) 하였다. 배양액 상청을 제거한 후, 각 배양액 침전(균체)에 대하여, 실시예 2(2)에 기재된 평가용 반응액 1 및 평가용 반응액 2(400mM DCP, 0.025% 브로모크레졸 퍼플(BCP), 50mM Tris-황산(pH 8)) 40㎕를 각 웰에 첨가했다. 현탁 후, 실온에서 정치하여, 반응액의 정색 변화를 경시적으로 관찰하여, 평가용 반응액 1을 첨가한 계에서 대조인 JM109/pSTT002 보다도 상당히 빨리 변색이 보인 주, 및 각 주에 대하여 평가용 반응액 1 첨가계에서의 정색 속도와 평가용 반응액 2 첨가계에서의 정색 속도의 차이가 적은 주를 선발했다. 일차 평가 선발주 77주에 대하여 상기 2차 평가를 하여, 20주를 선발했다.

(4) 2차 평가 선발주의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이 확인

실시예 2(3)에서 선발한 2차 평가 선발주 20주에 대하여, 각 주가 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 변이를 해석했다. 실시예 2(3)에서 얻어진 각 주 배양액으로부터, Flexi Prep(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용하여 플라스미드 회수하고, 캐필러리 DNA 시퀀서 CEQ2000(베크만?코울터)을 사용하여, 첨부된 메뉴얼에 따라, 각 플라스미드 중의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 염기 서열을 해석했다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

해석을 행한 20주 중, 12주(#1007, #1009, #1014, #1019, #1023, #1024, #1034, #1037, #1038, #1066, #1068, #1072)가 아미노산 치환변이 F136S를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를, 2주(#1002, #1005)가 아미노산 잔환 변이 T133A를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를, 2주(#1020, #1055)가 아미노산 치환변이 V75A를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를, 1주(#1018)가 아미노산 치환변이 D199H를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를, 1주(#1029)가 아미노산 치환변이 V25I를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를, 1주(#1057)가 아미노기 치환변이 H57R 및 Y87F를 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈를 각각 발현하고 있는 것이 확인되었다. 각 형질전환체, 그들이 발현하고 있는 할로하이드린 에폭시데이즈 및 그것을 인코딩하는 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를 표 2와 같이 명명했다.

(5) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝(3차 평가)

실시예 2(3)에서 선발되어, 실시예 2(4)에서 그의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이가 확인된 6주(JM109/pSTT002-V25I, JM109/pSTT002-H57R+Y87F, JM109/pSTT002-V75A, JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-F136S 및 JM109/pSTT002-D199H) 및 대조로 하는 JM109/pSTT002의 합계 7주에 대하여, 다음과 같이 3차 평가를 했다. LB Amp 배지를 바서만 시험관에 1㎖씩 분주하고, 각 시험관에 2차 평가 선발주 6주 및 JM109/pSTT002의 콜로니를 각각 식균했다. 37℃, 210rpm으로 약 8시간 배양한 후, 얻어진 각 배양액 100㎕를, IPTG를 최종 농도로서 1mM 포함하는 LB Amp 배지(500㎖용 삼각 플라스크 중의 100㎖)에 식균하여, 37℃, 210rpm에서 16시간 배양했다. 얻어진 각 배양액 100㎖로부터 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 각 균체를 회수하여, 20mM Tris-황산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 균 농도가 12.5gDC/L이 되도록 동 완충액에 현탁했다. 얻어진 균체 현탁액을 사용하여, 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 한 반응액을 사용한 방법, 및 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 하고, 또한 (R)-CHBN을 최종 농도 800mM이 되도록 첨가한 반응액을 사용한 방법에 의해, (R)-CHBN 비존재하 및 (R)-CHBN 존재하에 있어서의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)을 각각 측정했다. 1U를 상기 각 조건하에서 DCP로부터 1분간당 1μmol 염화물 이온의 탈리하는 효소량에 상당하는 것으로 정의하여 활성 측정에 사용한 각 균체 현탁액의 활성을, 상기 활성을 활성 측정에 사용한 각 균체 현탁액의 액량으로 나눔으로써 각 균체 현탁액의 액 활성을 산출했다. 또한, 상기 액 활성을 균 농도로 나눔으로써 각 주의 균체 비활성을 산출했다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

JM109/pSTT002-H57R+Y87F, JM109/pSTT002-V75A, JM109/pSTT002-F136S 및 JM109/pSTT002-D199H에 대해서는, (R)-CHBN 비존재하에서의 균체 비활성이 JM109/pSTT002의 상기 균체 비활성보다도 높은 것이 확인되었다. 또한, JM109/pSTT002-H57R+Y87F, JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-F136S 및 JM109/pSTT002-D199H에 대해서는, (R)-CHBN 존재하에서의 균체 비활성이 JM109/pSTT002의 상기 균체 비활성보다도 높은 것이 확인되었다. 즉, 이들 형질전환체가 발현하는 할로하이드린 에폭시데이즈는, (R)-CHBN 비존재하 또는 (R)-CHBN 존재하에서의, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 향상을 가져오는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈인 것이 확인되었다.

[실시예 3]

부위 특이적 랜덤 변이에 의한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝

(1) 부위 특이적 랜덤 변이체 라이브러리의 제작

실시예 2(5)에서 발견된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 중, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 향상 효과를 가져오는 아미노산 변이 위치로서, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(2^nd)(서열번호 2)의 133번째의 트레오닌 잔기(T133), 136번째의 페닐알라닌 잔기(F136) 및 199번째의 아스파르트산 잔기(D199)가 발견되었다. 이들 위치의 아미노산을 랜덤으로 변이시켜, 보다 유용한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 취득을 시도했다.

T133, F136 및 D199를 20 필수 아미노산으로 변이시킬 수 있는 랜덤 프라이머로서 이하의 것을 제작했다.

MDH-14: CGCTGGCCTACAGCNNNGCGCGTTTCGCT(서열번호 62: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)(서열번호 1)의 141번째의 아미노산 또는 HheB(2^nd)의 133번째(서열번호 2)의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 랜덤 염기(NNN: N은 아데닌, 싸이민, 구아닌 또는 사이토신 중 어느 하나)인 센스 프라이머)

MDH-15: AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG(서열번호 63: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-14의 상보 서열을 갖는 안티센스 프라이머)

MDH-16: CAGCACGGCGCGTNNNGCTCAGCGCGGGT(서열번호 64: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)(서열번호 1)의 144번째의 아미노산 또는 HheB(2^nd)(서열번호 2)의 136번째의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 랜덤 염기(NNN: N은 아데닌, 싸이민, 구아닌 또는 사이토신 중 어느 하나)인 센스 프라이머)

MDH-17: ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG(서열번호 65: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-16의 상보 서열을 갖는 안티센스 프라이머)

MDH-18: CGACTGCCCGAGAGNNNGCGCTGCTCGCG(서열번호 66: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)(서열번호 1)의 207번째의 아미노산 또는 HheB(2^nd)(서열번호 2)의 199번째의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 랜덤 염기(NNN: N은 아데닌, 싸이민, 구아닌 또는 사이토신 중 어느 하나)인 센스 프라이머)

MDH-19: CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG(서열번호 67: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-18의 상보 서열을 갖는 안티센스 프라이머)

상기의 프라이머 및 주형 pSTT002를 사용하여, Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE사)에 의해 부위 특이적 변이 도입을 행했다. 반응액 조성(전체량 50㎕)은 이하의 표대로 했다(계열 1은 T133 랜덤 변이체, 계열 2는 F136 랜덤 변이체, 계열 3은 D199 랜덤 변이체의 취득을 각각 목적으로 함).

각 계열에 사용한 프라이머의 조합은 다음과 같다.

계열 1: 센스 프라이머 MDH-14, 안티센스 프라이머 MDH-15

계열 2: 센스 프라이머 MDH-16, 안티센스 프라이머 MDH-17

계열 3: 센스 프라이머 MDH-17, 안티센스 프라이머 MDH-18

상기 조성의 각 반응액에 대하여, 이하의 표의 열사이클 처리를 행했다.

첨부된 메뉴얼에 따라, 열사이클 처리를 한 각 반응액에 DpnI를 1㎕ 첨가하여, 37℃에서 1시간 인큐베이션 했다. DpnI 처리액을 사용하여, 실시예 2(1)과 같이 형질전환을 했다. 플레이트상에 출현한 콜로니를 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 부위 특이적(T133, F136, D199) 변이체 라이브러리로 했다.

(2) 부위 특이적 랜덤 변이체로부터의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝

실시예 3(1)에서 제작한 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 부위 특이적(T133, F136, D199) 변이체 라이브러리로부터, 보다 유용한 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 스크리닝을 행했다. 96웰 플레이트(딥웰)에, IPTG를 최종 농도로서 1mM 포함하는 LB Amp 배지를 웰당 500㎕씩 분주하고, 실시예 3(1)에서 제작한 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 부위 특이적(T133, F136, D199) 변이체 라이브러리의 각 계열에 대하여 200콜로니를 각 웰에 식균 했다. 한편, 평가의 대조로서 사용하는 JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-F136S, JM109/pSTT002-D199H 및 JM109/pSTT002를 더불어 식균했다. 37℃, 800rpm으로 약 16시간 배양한 후, 얻어진 배양액 중 20㎕를 평형 96웰 플레이트에 분주했다. 원심분리기(사쿠마제작소 50A-IVD) 및 로터(사쿠마제작소 HM-2HLS)를 사용하여, 평형 96웰 플레이트를 원심분리(3000rpm, 5분간, 4℃) 하였다. 배양액 상청을 제거한 후, 실시예 2(2)에 기재된 평가용 반응액 1 및 평가용 반응액 3(200mM (S)-CHBN, 0.025% 브로모크레졸 퍼플(BCP), 50mM Tris-황산(pH 8)) 40㎕를 각 웰에 첨가했다. 현탁 후, 실온에서 정치하여, 반응액의 정색 변화를 경시적으로 관찰하여, 평가용 반응액 1을 첨가한 계에서 대조인 JM109/pSTT002 보다도 상당히 빨리 변색이 보인 주, 평가용 반응액 3을 첨가한 계에서 대조인 JM109/pSTT002 보다도 상당히 빨리 변색이 보인 주, 및 각 주의 평가용 반응액 1 첨가계에 있어서의 정색 속도와 평가용 반응액 3 첨가계에 있어서의 정색 속도의 비율이, 대조인 JM109/pSTT002의 상기 비율과 다른 주를 선발했다. 각 계열 U200 콜로니에 대하여 상기 평가를 행하여, 계열 1(T133 랜덤 변이체 라이브러리)로부터 7주, 계열 2(F136 랜덤 변이체 라이브러리)로부터 7주, 계열 3(D199 랜덤 변이체 라이브러리)으로부터 19주를 선발했다.

(3) 부위 특이적 랜덤 변이 라이브러리 선발 주의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자 변이 확인

실시예 3(2)에서 선발한 계열 1(T133 랜덤 변이체 라이브러리)로부터의 7주, 계열 2(F136 랜덤 변이체 라이브러리)로부터의 7주, 계열 3(D199 랜덤 변이체 라이브러리)으로부터의 19주, 합계 33주에 대하여, 각 주가 갖는 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 변이를 해석했다. 실시예 3(2)에서 얻어진 각 주 배양액으로부터, Flexi Prep(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용하여 플라스미드 회수하고, 캐필러리 DNA 시퀀서 CEQ2000(베크만?코울터)을 사용하여, 첨부된 메뉴얼에 따라, 각 플라스미드 중의 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자의 염기 서열을 해석했다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

해석을 행한 33주가 발현되어 있는 할로하이드린 에폭시데이즈 및 그것을 인코딩하는 할로하이드린 에폭시데이즈 유전자를, 아미노산 치환변이의 태양으로서 이미 취득된 것과의 중복을 고려하여, 표 2와 같이 명명했다.

[실시예 4]

개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의한 (R)-CHBN 합성 반응

(1) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 조효소액의 조제

실시예 2 및 실시예 3에서 취득된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 합성된 (R)-CHBN의 광학 순도를 조사하기 위해, 우선 각 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체로부터 조효소액을 조제했다. 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 15주의 형질전환체주(JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-T136C, JM109/pSTT002-T133S, JM109/pSTT002-F136A, JM109/pSTT002-F136S, JM109/pSTT002-F136W, JM109/pSTT002-D199Q, JM109/pSTT002-D199E, JM109/pSTT002-D199H, JM109/pSTT002-D199S, JM109/pSTT002-D199T, JM109/pSTT002-D199M, JM109/pSTT002-D199L, JM109/pSTT002-D199I, JM109/pSTT002-D199Y) 및 대조로 하는 JM109/pSTT002의 합계 16주에 대하여, 다음과 같이 3차 평가를 했다. LB Amp 배지를 바서만 시험관에 1㎖씩 분주하고, 각 시험관에 2차 평가 선발주 15주 및 JM109/pSTT002의 콜로니를 각각 식균했다. 37℃, 210rpm으로 약 8시간 배양한 후, 얻어진 각 배양액 100㎕를 IPTG를 최종 농도로서 1mM 포함하는 LB Amp 배지 (500㎖용 삼각 플라스크 중의 100㎖)에 식균하여, 37℃, 210rpm으로 16시간 배양했다. 얻어진 각 배양액 100㎖로부터 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 각 균체를 회수하고, 20mM Tris-황산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 균 농도가 12.5gDC/L이 되도록 동 완충액에 현탁했다. 얻어진 균체 현탁액의 3㎖를, 초음파 파쇄기 VP-15S(다이테크, 일본)를 사용하여, 출력 컨트롤 4, DUTY CYCLE 40%, PULS, TIMER=B모드 10s의 조건으로 빙냉하면서 10분간 파쇄했다. 파쇄된 균체 현탁액을 원심분리(23,000×g, 5분간, 4℃) 하여, 상청을 조효소액으로서 채취했다. 얻어진 각 조효소액에 대하여, 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 한 반응액을 사용한 방법에 의해, 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)을 각각 측정했다. 1U를 상기 각 조건하에서 DCP로부터 1분간당 μmol 염화물 이온의 탈리하는 효소량에 상당하는 것으로 정의하고, 활성 측정에 사용한 각 균체 현탁액의 활성을, 상기 활성을 활성 측정에 사용한 각 균체 현탁액의 액량으로 나눔으로써 각 균체 현탁액의 액 활성을 산출했다.

(2) 분석방법

후술하는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의한 (R)-CHBN의 합성 반응에서 실시하는 반응액 중의 DCP, ECH 및 CHBN 농도 분석 및 생성 CHBN의 광학 순도 분석은 이하와 같이 행했다.

<반응액 중의 DCP, ECH 및 CHBN 농도 분석>

반응액 중의 DCP, ECH 및 CHBN 농도 분석은 역상계(逆相系) HPLC에 의해 행했다. 역상계 HPLC 분석 조건을 하기 표에 나타낸다.

반응 종료액 100㎕를, 상기 표에 기재된 이동층 400㎕에 의해 희석 혼합한 후, 상기 표에 기재된 분석 조건에 의해 분석을 했다. 미리, 농도가 알려진 DCP, ECH 및 CHBN 용액을 사용하여 검량선을 작성하고, 상기 검량선를 사용하여 반응액 중의 DCP, ECH 및 CHBN 농도를 구했다.

<생성 CHBN의 광학 순도 분석>

생성 CHBN의 광학 순도 분석은, CHBN을 에스터화한 후, 순상계(順相系) HPLC에 의해 행했다. 순상계 HPLC 분석 조건을 하기 표에 나타낸다.

반응 종료액 약 400㎕에 등량의 다이아이소프로필에터(이하, IPE라 하는 경우가 있음)를 가하여 추출을 행했다. IPE 층을 분취하고, 소량의 무수 황산나트륨을 가하여 교반했다. IPE 층을 100㎕ 분취하고, 10㎕의 (R)-α-메톡시-α-(트라이플루오로메틸)페닐아세틸클로라이드(이하, (R)-MTPA라 하는 경우가 있음) 및 40㎕의 피리딘을 첨가했다. 실온에서 하룻밤 반응시킨 후, IPE를 첨가하여 약 400㎕로 했다. 1규정의 염산을 400㎕ 가하고 추출을 2회 행한 후, 분취된 IPE 층에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 400㎕ 가하고 추출을 2회 행했다. 분취된 IPE 층에 소량의 무수 황산나트륨을 가하고 교반한 후, 흡입기(Aspirator)에 의해 IPE 층을 휘발시켰다. 잔존물을 상기 표에 기재된 이동층에 의해 현탁한 후, 상기 표에 기재된 분석 조건에 의해 분석을 행했다. (R)-CHBN-(R)-MTPA 에스터 및 (S)-CHBN-(R)-MTPA 에스터 영역의 면적비로부터 각 농도를 산출하여, 본 명세서에서 설명한 요령(상술함)으로 CHBN의 광학 순도를 산출했다.

(3) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의한 (R)-CHBN의 합성

실시예 4(1)에서 조제한 각 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체 유래 조효소액을 사용하여, 사이안화칼륨 존재하에, DCP로부터의 CHBN 합성 반응을 행했다. 반응액 기본 조성은 이하의 표와 같이 하고, 반응 스케일은 2㎖로 했다.

반응은 20℃에서 3시간 행했다. 반응 종료 후, 실시예 4(2)에 기재된 분석 조건에 의해, 반응액 중의 DCP, ECH 및 CHBN 농도 및 생성 CHBN의 광학 순도를 분석했다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

야생형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체주 JM109/pSTT002 유래 조효소액을 사용한 반응에서는 CHBN이 77mM 밖에 축적되지 않았던 것에 비해, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 각 형질전환체주 유래 조효소액을 사용한 반응에서로는 87 내지 149mM의 CHBN이 축적되어 있었다. 따라서, 이들 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 고농도의 생성물을 축적할 수 있음을 나타내었다.

또한, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체주 JM109/pSTT002 유래 조효소액을 사용하여 합성된 (R)-CHBN의 광학 순도가 91.6%ee였던 것에 비해, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체주(JM109/pSTT002-T133A, JM109/pSTT002-T133C, JM109/pSTT002-D199Q, JM109/pSTT002-D199E, JM109/pSTT002-D199H, JM109/pSTT002-D199S, JM109/pSTT002-D199T, JM109/pSTT002-D199L, JM109/pSTT002-D199M, JM109/pSTT002-D199I 및 JM109/pSTT002-D199Y) 유래 조효소액을 사용하여 합성된 (R)-CHBN의 광학 순도는 93.1%ee 내지 97.8%ee로서, 이들 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 합성되는 (R)-CHBN은, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 합성되는 (R)-CHBN 보다도 광학 순도가 높은 것이 확인되었다. 따라서, 이들 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는 DCP 및/또는 중간체 ECH에 대한 입체 선택성이 향상되어 있다고 생각되었다.

[실시예 5]

염화물 이온 존재하에서의 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 확인

염화물 이온은 1,3-다이할로-2-프로판올과 사이안 화합물로부터 할로하이드린 에폭시데이즈에 의해 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 합성할 때의 생성물로서, 할로하이드린 에폭시데이즈에 의한 상기 합성 반응을 저해할 수 있다. 고농도의 염화물 이온 존재하에서의, 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 및 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성을 조사하여 비교했다. 실시예 4에서 조제한 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체주 JM109/pSTT002 유래 조효소액 및 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체주 JM109/pSTT002-D199H 유래 조효소액을 사용하여, 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 한 반응액을 사용한 방법, 및 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 하고, 또한 염화나트륨을 최종 농도 100mM 또는 200mM이 되도록 첨가한 반응액을 사용한 방법에 의해, 염화나트륨 비존재하(0mM) 및 존재하(100mM 및 200mM)에서의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)을 측정하고, 각 형질전환체 유래 조효소액의 염화나트륨 비존재하(0mM)에서의 상기 활성을 100%로 하여 상대 활성값을 산출했다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

야생형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체주 JM109/pSTT002 유래 조효소액의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성은, 염화물 이온 100mM 및 200mM의 존재하에서는 각각 44% 및 40%로 저하되어 버렸던 것에 비해, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체주 JM109/pSTT002-D199H 유래 조효소액의 할로하이드린 에폭시데이즈 활성은, 염화물 이온 100mM 및 200mM의 존재하에서도 각각 91% 및 78%의 잔존 활성을 나타내었다. 따라서, 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 염화물 이온에 의한 반응 저해에 대한 내성이 야생형 할로하이드린 에폭시데이즈 보다도 향상되어 있음이 확인되었다.

[실시예 6]

개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 형질전환체(로도코커스속 세균 숙주)의 제작 및 그의 평가

(1) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체(로도코커스속 세균 숙주)의 제작

개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체(로도코커스속 세균 숙주)를 제작하여, 상기 형질전환체의 평가를 행했다. 우선, 일본 특허공개 제2007-49932호 공보에 기재된 발현 플라스미드 pJHB057을 주형으로 하여, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)(서열번호 1)의 141번째의 트레오닌 잔기의 알라닌으로의 치환변이(T141A), 144번째의 페닐알라닌 잔기의 세린으로의 치환변이(F144S) 및 207번째의 아스파르트산 잔기의 히스티딘으로의 치환변이(D207H)가 각각 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 발현 플라스미드를 제작했다. 변이 도입에 사용하는 프라이머로서, 이하의 것을 제작했다.

MDH-05: CGCTGGCCTACAGCGCGGCGCGTTTCGCT(서열번호 68: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)의 141번째의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 GCG(알라닌을 인코딩함)인 센스 프라이머)

MDH-06: AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG(서열번호 69: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-05의 상보서열을 갖는 안티센스 프라이머)

MDH-07: CAGCACGGCGCGTTCCGCTCAGCGCGGGT(서열번호 70: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)의 144번째의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 TCC(세린을 인코딩함)인 센스 프라이머)

MDH-08: ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG(서열번호 71: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-07의 상보서열을 갖는 안티센스 프라이머)

MDH-09: CGACTGCCCGAGAGCACGCGCTGCTCGCG(서열번호 72; 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, 할로하이드린 에폭시데이즈 HheB(1^st)의 207번째의 아미노산을 인코딩하는 코돈이 CAC(히스티딘을 인코딩함)인 센스 프라이머)

MDH-10: CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG(서열번호 73: 29 뉴클레오타이드로 이루어지고, MDH-09의 상보 서열을 갖는 안티센스 프라이머)

상기한 프라이머 및 주형 pJHB057을 사용하여, QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE사)에 의해 부위 특이적 변이 도입을 행했다. 반응액 조성(전체량 50㎕)은 이하의 표대로 하였다(계열 1은 T141A 변이체, 계열 2는 F144S 변이체, 계열 3은 D207H 변이체의 취득을 각각 목적으로 함).

각 계열에 사용한 프라이머의 조합은 다음과 같다.

계열 1: 센스 프라이머 MDH-05, 안티센스 프라이머 MDH-06

계열 2: 센스 프라이머 MDH-07, 안티센스 프라이머 MDH-08

계열 3: 센스 프라이머 MDH-09, 안티센스 프라이머 MDH-10

첨부된 메뉴열에 따라, 열사이클 처리를 행한 각 반응액에 DpnI를 1㎕ 첨가하여, 37℃에서 1시간 인큐베이션 했다. DpnI 처리액을 사용하여, 실시예 2(1)과 같이 대장균의 형질전환을 했다. 한천 배지상에 생육한 형질전환체 콜로니 복수개를 1.5㎖의 LB Amp 배지(암피실린 100 mg/L를 함유하는 LB 배지)에서 37℃로 하룻밤 배양했다. 얻어진 배양액을 각각 집균한 후, Flexi Prep(GE 헬스케어 바이오사이언스)을 사용하여 재조합 플라스미드를 회수했다. 캐필러리 DNA 시퀀서 CEQ2000(베크만?코울터)을 사용하여, 첨부된 메뉴얼에 따라, 3종의 플라스미드 중에 클로닝되어 있는 PCR 증폭산물의 염기 서열을 해석하여, PCR 반응에서의 에러변이가 생기지 않은 것을 확인했다. 계열 1의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pJHB057-T141A로, 계열 2의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pJHB057-F144S로, 계열 3의 PCR 증폭산물 유래 DNA 단편이 클로닝된 플라스미드를 pJHB057-D207H로 명명하고, 또한 그들 플라스미드를 포함하는 대장균 JM109주 형질전환체를, JM109/pJHB057-T141A, JM109/pJHB057-F144S 및 JM109/pJHB057-D207H로 각각 명명했다(상기 아미노산 잔기의 위치를 나타내는 숫자는, HheB(1^st)(서열번호 1)에 있어서의 아미노산 잔기의 위치를 나타내는 숫자로 하고 있음).

얻어진 pJHB057-T141A, pJHB057-F144S 및 pJHB057-D207H를 사용하여, 일본 특허공개 제2007-49932호 공보에 기재된 방법으로, 로도코커스?로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주(수탁 번호 「FERM BP-1478」)의 형질전환을 행했다. 얻어진 콜로니의 플라스미드를 각각 확인하여, 3종의 형질전환체 J1/pJHB057-T141A, J1/pJHB057-F144S 및 J1/pJHB057-D207H를 얻었다.

(2) 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 발현하는 형질전환체(로도코커스속 세균 숙주)의 평가

실시예 6(1)에서 얻어진 3종의 형질전환체(J1/pJHB057-T141A, J1/pJHB057-F144S 및 J1/pJHB057-D207H)의 평가를 다음과 같이 행했다. 상기 3주의 형질전환체 및 대조로 하는 J1/pJHB057의 합계 4주를, 각각 GGPK 배지(1.5% 글루코스, 1% 글루탐산 나트륨, 0.1% 박토 이스트 추출물, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄?7H₂O, 카나마이신 50㎍/㎖, pH 7.2) 100㎖에 식균하여, 30℃에서 72시간 진탕 배양했다. 얻어진 각 배양액 100㎖로부터 원심분리(3,700×g, 10분간, 4℃)에 의해 각 균체를 회수하고, 20mM Tris-황산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 후, 균 농도가 12.5gDC/L이 되도록 동 완충액에 현탁했다. 얻어진 균체 현탁액의 3㎖를, 초음파 파쇄기 VP-15S(다이테크, 일본)를 사용하여, 출력 컨트롤 4, DUTY CYCLE 40%, PULS, TIMER=B모드 10s의 조건으로 빙냉하면서 10분간 파쇄했다. 파쇄된 균체 현탁액을 원심분리(23,000×g, 5분간, 4℃) 하여, 상청을 조효소액으로서 채취했다. 얻어진 각 조효소액에 대하여, 실시예 1(3)에 기재된 방법에 있어서 반응액의 DCP 농도를 400mM로 한 반응액을 사용한 방법에 의해, 할로하이드린 에폭시데이즈 활성(탈염소 활성)을 각각 측정했다. 1U를 상기 각 조건하에서 DCP로부터 1분간당 μmol 염화물 이온의 탈리하는 효소량에 상당하는 것으로 정의하고, 활성 측정에 사용한 각 조효소액의 활성을, 상기 활성을 활성 측정에 사용한 각 조효소액의 액량으로 나눔으로써 각 조효소액의 액 활성을 산출했다. 또한, 상기 액 활성을 단백농도로 나눔으로써 각 주의 단백당 비활성을 산출했다. 단백 농도는, 바이오-라드 프로테인 어쎄이(Bio-Rad)를 사용하여 측정했다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

HheB(1^st)(서열번호 1)에 있어서의 141번째의 트레오닌 잔기의 알라닌으로의 치환변이(T141A), 144번째의 페닐알라닌 잔기의 세린으로의 치환변이(F144S) 및 207번째의 아스파르트산 잔기의 히스티딘으로의 치환변이(D207H)가 각각 도입된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈는, 로도코커스속 세균을 숙주로 하는 경우에도, 형질전환체당 할로하이드린 에폭시데이즈 활성 향상을 가져오는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈인 것이 확인되었다.

서열표 프리 텍스트(Sequence listing free text)

서열번호 3 내지 28: 변이 펩티드

서열번호 31 내지 56: 변이 DNA

서열번호 57 내지 61: 합성 DNA

서열번호 62: 합성 DNA

서열번호 62: n은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 15 내지 17)

서열번호 63: 합성 DNA

서열번호 63: m은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 13 내지 15)

서열번호 64: 합성 DNA

서열번호 64: n은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 14 내지 16)

서열번호 65: 합성 DNA

서열번호 65: n은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 14 내지 16)

서열번호 66: 합성 DNA

서열번호 66: n은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 15 내지 17)

서열번호 67: 합성 DNA

서열번호 67: n은 a, c, g 또는 t를 나타냄(존재 위치: 13 내지 15)

서열번호 68 내지 73: 합성 DNA

서열번호 74: Xaa는 임의의 아미노산 잔기를 나타냄(존재 위치: 2 내지 13, 15, 16, 19)

서열번호 75: Xaa는 임의의 아미노산 잔기를 나타냄(존재 위치: 2, 5 내지 8, 10)

서열번호 76 내지 83: 변이 펩티드

서열번호 84 내지 91: 변이 DNA

SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Halohydrin epoxidase <130> PCT08-0006 <150> JP 2007-057854 <151> 2007-03-07 <160> 91 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Corynebacterium <400> 1 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> Corynebacterium <400> 2 Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala 1 5 10 15 Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly 20 25 30 Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala 35 40 45 Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn 50 55 60 Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu 65 70 75 80 Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Thr Ile Val His Pro Leu His Arg 85 90 95 Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys 100 105 110 Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala 115 120 125 Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala 130 135 140 Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala 145 150 155 160 Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala 165 170 175 Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg 180 185 190 Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser 195 200 205 Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly 210 215 220 Trp Ala Thr 225 <210> 3 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 3 Met Lys Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 4 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 4 Met Asn Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 5 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 5 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 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Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 6 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 6 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Cys Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 7 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 7 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Ser Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 8 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 8 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Ala 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 9 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variant peptide <400> 9 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp 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Corynebacterium <400> 29 atggctaacg gaaggaaaag ggaaatggct aacggaagac tggcaggcaa gcgggtccta 60 ctcacgaacg ccgatgccta catgggtgag gccacggtcc aggtgttcga ggaggagggc 120 gcagaggtca tcgctgacca caccgacttg acgaaggtcg gcgcggcgga ggaggtcgtc 180 gagagggctg ggcacatcga tgtcctggtg gccaacttcg cggtcgacgc ccacttcggg 240 gtgaccgtgc tggagaccga cgaggagctg tggcagacgg cctacgagac catcgtgcac 300 ccgctgcatc ggatctgccg tgcggtgctc ccgcagttct acgagcggaa caagggcaag 360 atcgttgtct acggaagtgc cgcagcgatg cggtaccagg aaggtgcgct ggcctacagc 420 acggcgcgtt tcgctcagcg cgggtacgtc accgccctcg gtcccgaggc agcgaggcac 480 aacgtcaacg tgaacttcat cgcccagcac tggacccaaa acaaggagta cttctggccc 540 gagcgcatcg ccaccgacga gttcaaggag gatatggcgc gccgagttcc cctgggtcgg 600 ctcgcgactg cccgagagga cgcgctgctc gcgttgttcc tggcctcgga cgagagtgac 660 ttcatcgtcg gcaagtcgat cgagttcgac ggcggctggg ccacctga 708 <210> 30 <211> 684 <212> DNA <213> Corynebacterium <400> 30 atggctaacg gaagactggc aggcaagcgg gtcctactca cgaacgccga tgcctacatg 60 ggtgaggcca 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gtg ctg gag acc gac gag gag ctg tgg cag acg gcc tac gag 288 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 acc atc gtg cac ccg ctg cat cgg atc tgc cgt gcg gtg ctc ccg cag 336 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 ttc tac gag cgg aac aag ggc aag atc gtt gtc tac gga agt gcc gca 384 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg ctg gcc tac agc gcg gcg cgt ttc 432 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Ala Ala Arg Phe 130 135 140 gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac 480 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc cag cac tgg acc caa aac aag gag 528 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc acc gac gag ttc aag gag gat atg 576 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 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gcc gca gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg 384 Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala 115 120 125 ctg gcc tac agc acg gcg cgt ttc gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc 432 Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala 130 135 140 ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc 480 Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala 145 150 155 160 cag cac tgg acc caa aac aag gag tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc 528 Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala 165 170 175 acc gac gag ttc aag gag gat atg gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg 576 Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg 180 185 190 ctc gcg act gcc cga gag gag gcg ctg ctc gcg ttg ttc ctg gcc tcg 624 Leu Ala Thr Ala Arg Glu Glu Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser 195 200 205 gac gag agt gac ttc atc gtc ggc aag tcg atc gag ttc gac ggc ggc 672 Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly 210 215 220 tgg gcc acc 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gtg ctc ccg cag ttc tac gag cgg aac aag ggc aag 336 Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys 100 105 110 atc gtt gtc tac gga agt gcc gca gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg 384 Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala 115 120 125 ctg gcc tac agc acg gcg cgt ttc gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc 432 Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala 130 135 140 ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc 480 Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala 145 150 155 160 cag cac tgg acc caa aac aag gag tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc 528 Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala 165 170 175 acc gac gag ttc aag gag gat atg gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg 576 Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg 180 185 190 ctc gcg act gcc cga gag cac gcg ctg ctc gcg ttg ttc ctg gcc tcg 624 Leu Ala Thr Ala Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser 195 200 205 gac gag agt gac ttc atc gtc ggc aag tcg atc gag ttc gac ggc ggc 672 Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly 210 215 220 tgg gcc acc tga 684 Trp Ala Thr 225 <210> 54 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <400> 54 atg gct aac gga aga ctg gca ggc aag cgg gtc cta ctc acg aac gcc 48 Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala 1 5 10 15 gat gcc tac atg ggt gag gcc acg gtc cag gtg ttc gag gag gag ggc 96 Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly 20 25 30 gca gag gtc atc gct gac cac acc gac ttg acg aag gtc ggc gcg gcg 144 Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala 35 40 45 gag gag gtc gtc gag agg gct ggg cac atc gat gtc ctg gtg gcc aac 192 Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn 50 55 60 ttc gcg gtc gac gcc cac ttc ggg gtg acc gtg ctg gag acc gac gag 240 Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu 65 70 75 80 gag ctg tgg cag acg gcc tac gag acc atc gtg cac ccg ctg cat cgg 288 Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Thr Ile Val His Pro Leu His Arg 85 90 95 atc tgc cgt gcg gtg ctc ccg cag ttc tac gag cgg aac aag ggc aag 336 Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys 100 105 110 atc gtt gtc tac gga agt gcc gca gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg 384 Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala 115 120 125 ctg gcc tac agc acg gcg cgt ttc gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc 432 Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala 130 135 140 ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc 480 Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala 145 150 155 160 cag cac tgg acc caa aac aag gag tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc 528 Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala 165 170 175 acc gac gag ttc aag gag gat atg gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg 576 Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg 180 185 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165 170 175 acc gac gag ttc aag gag gat atg gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg 576 Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg 180 185 190 ctc gcg act gcc cga gag act gcg ctg ctc gcg ttg ttc ctg gcc tcg 624 Leu Ala Thr Ala Arg Glu Thr Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser 195 200 205 gac gag agt gac ttc atc gtc ggc aag tcg atc gag ttc gac ggc ggc 672 Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly 210 215 220 tgg gcc acc tga 684 Trp Ala Thr 225 <210> 56 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(684) <400> 56 atg gct aac gga aga ctg gca ggc aag cgg gtc cta ctc acg aac gcc 48 Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala 1 5 10 15 gat gcc tac atg ggt gag gcc acg gtc cag gtg ttc gag gag gag ggc 96 Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly 20 25 30 gca gag gtc atc gct gac cac acc gac ttg acg aag gtc ggc gcg gcg 144 Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala 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gtc gag agg gct ggg 192 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 cac atc gat gtc ctg gtg gcc aac ttc gcg gtc gac gcc cac ttc ggg 240 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 gtg acc gtg ctg gag acc gac gag gag ctg tgg cag acg gcc tac gag 288 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 acc atc gtg cac ccg ctg cat cgg atc tgc cgt gcg gtg ctc ccg cag 336 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 ttc tac gag cgg aac aag ggc aag atc gtt gtc tac gga agt gcc gca 384 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg ctg gcc tac agc acg gcg cgt ttc 432 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac 480 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc cag cac tgg acc caa aac aag gag 528 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc acc gac gag ttc aag gag gat atg 576 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg ctc gcg act gcc cga gag ctg gcg 624 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Leu Ala 195 200 205 ctg ctc gcg ttg ttc ctg gcc tcg gac gag agt gac ttc atc gtc ggc 672 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 aag tcg atc gag ttc gac ggc ggc tgg gcc acc tga 708 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235 <210> 86 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(708) <400> 86 atg gct aac gga agg aaa agg gaa atg gct aac gga aga ctg gca ggc 48 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 aag cgg gtc cta ctc acg aac gcc gat gcc tac atg ggt gag gcc acg 96 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala 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Val Asp Ala His Phe Gly Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu 65 70 75 80 gag ctg tgg cag acg gcc tac gag acc atc gtg cac ccg ctg cat cgg 288 Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Thr Ile Val His Pro Leu His Arg 85 90 95 atc tgc cgt gcg gtg ctc ccg cag ttc tac gag cgg aac aag ggc aag 336 Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys 100 105 110 atc gtt gtc tac gga agt gcc gca gcg atg cgg tac cag gaa ggt gcg 384 Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala 115 120 125 ctg gcc tac agc acg gcg cgt ttc gct cag cgc ggg tac gtc acc gcc 432 Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala 130 135 140 ctc ggt ccc gag gca gcg agg cac aac gtc aac gtg aac ttc atc gcc 480 Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala 145 150 155 160 cag cac tgg acc caa aac aag gag tac ttc tgg ccc gag cgc atc gcc 528 Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala 165 170 175 acc gac gag ttc aag gag gat atg gcg cgc cga gtt ccc ctg ggt cgg 576 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Claims

서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여,

i) 2번째 아미노산 잔기가 라이신 또는 아스파라진으로 치환되거나, 또는

ii) 2번째 아미노산 잔기가 라이신으로 치환되고,

하기 iii) 내지 v)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 변이가 추가적으로 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈:

iii) 133번째 아미노산 잔기가 알라닌, 시스테인 또는 세린으로 치환된 아미노산 변이,

iv) 136번째 아미노산 잔기가 알라닌, 세린 또는 트립토판으로 치환된 아미노산 변이, 및

v) 199번째 아미노산 잔기가 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 타이로신, 류신, 아이소류신 또는 메싸이오닌으로 치환된 아미노산 변이.
서열번호 1의 아미노산 서열에 대하여 하기 i) 내지 iii)로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 변이가 도입된 아미노산 서열로 이루어지는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈:

i) 141번째 잔기가 알라닌으로 치환된 아미노산 변이,

ii) 144번째 잔기가 세린으로 치환된 아미노산 변이, 및

iii) 207번째 잔기가 히스티딘으로 치환된 아미노산 변이.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 할로하이드린 에폭시데이즈가, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 또는 아르트로박터 에리티(Arthrobacter erithii)속 세균 유래의 것인 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈.
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제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 인코딩하는 유전자.
제 7 항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 8 항에 기재된 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 얻어지는 형질전환체 또는 형질도입체.
제 9 항에 기재된 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 얻어지는 배양물.
제 10 항에 기재된 배양물로부터 채취되는 개량형 할로하이드린 에폭시데이 즈.
제 9 항에 기재된 형질전환체 또는 형질도입체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를 채취하는 것을 특징으로 하는, 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를, 1,3-다이할로-2-프로판올과 접촉시킴으로써 에피할로하이드린을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 에피할로하이드린의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를, 사이안 화합물 존재하에서, 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린과 접촉시킴으로써 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법.
제 10 항에 기재된 배양물을, 또는 상기 배양물로부터 채취되는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를, 또는 상기 배양물과 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 모두를, 1,3-다이할로-2-프로판올과 접촉시킴으로써 에피할로하이드린을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 에피할로하이드린의 제조방법.
제 10 항에 기재된 배양물을, 또는 상기 배양물로부터 채취되는 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈를, 또는 상기 배양물과 상기 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 모두를, 사이안 화합물 존재하에서, 1,3-다이할로-2-프로판올 또는 에피할로하이드린과 접촉시킴으로써 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 4-할로-3-하이드록시뷰티로나이트릴의 제조방법.
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