JP3073037B2 - ハロヒドリンエポキシダ−ゼ遺伝子を有する組換え体プラスミドおよび該プラスミドにより形質転換された微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、１，３−ジハロ−２−
プロパノールをエピハロヒドリンに変換する触媒活性お
よびその逆反応に触媒活性を有する酵素（以下、ハロヒ
ドリンエポキシダーゼと略す）遺伝子ＤＮＡをベクター
プラスミドに連結した組換え体プラスミドおよび該プラ
スミドを宿主微生物に導入した形質転換微生物、ならび
に該微生物によるエピハロヒドリンおよび４−ハロ−３
−ヒドロキシブチロニトリルの製造法に関する。エピハ
ロヒドリンは種々の有機薬品の原料として、また４−ハ
ロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは２種の異なる官能
基を有する化合物であることから、種々の医薬品や生理
活性物質の合成原料として有用な物質であり、特にＬ−
カルニチンの合成原料として有用であることが知られて
いる〔特開昭57-165352 号公報参照〕。

【０００２】

【発明の背景】ハロヒドリンエポキシダーゼはハロヒド
リンを対応するエポキシドに変換する酵素として従来か
ら知られており〔Biochemistry 7, 3213(1968), Bioche
mistry8, 4677(1969) および Appl. Environ. Microbio
l.45, 1148(1983) 参照〕、該酵素を産生する微生物と
して、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属が知ら
れている。一方、本発明者らは、先に、脱ハロゲン化酵
素の作用により、１，３−ジハロ−２−プロパノールか
ら４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する
方法（特願平1-185991号明細書参照）およびエピハロヒ
ドリンから４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを
製造する方法（特願平1-185992号明細書参照）を提案し
ている。しかしながら、これらの反応における微生物の
触媒活性は高くなく、工業的見地からは満足できるもの
ではない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子組換えの方法で
クローン化されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子に
よる１，３−ジハロ−２−プロパノールからエピハロヒ
ドリンへの変換反応においては、菌体内に多数の遺伝子
を存在させることができるため微生物の触媒能力を、従
来の方法に比して飛躍的に増大させることが期待でき
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ハロヒドリン
エポキシダーゼ活性を有する微生物由来の遺伝子ＤＮＡ
を取り出し、これをベクタ−に挿入し組換え体プラスミ
ドとし、さらに微生物に形質転換し、ハロヒドリンエポ
キシダーゼ活性を有する形質転換体を得て、完成された
ものである。本発明の形質転換体は、１，３−ジハロ−
２−プロパノールからのエピハロヒドリンへの変換以外
に、シアン化アルカリの存在下、１，３−ジハロ−２−
プロパノールならびにエピハロヒドリンからの１，３−
ジハロ−２−プロパノールへの変換に対しても優れた触
媒活性を有することが見出された。したがって、本発明
は、これら一連の反応をも包含する。また、これらの反
応において、光学活性体を得ることが可能である。

【０００５】すなわち、本発明は、(1) 微生物由来のハ
ロヒドリンエポキシダ−ゼ酵素遺伝子ＤＮＡをベクター
プラスミドに連結した組換え体プラスミド、

【０００６】(2) ハロヒドリンエポキシダ−ゼ酵素遺伝
子ＤＮＡが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列また
はその一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダ−ゼ活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む
上記 (1)項記載の組換え体プラスミド、

【０００７】(3) ハロヒドリンエポキシダ−ゼ酵素遺伝
子ＤＮＡが、配列番号：２で示されるアミノ酸配列また
はその一部の配列を有しハロヒドリンエポキシダ−ゼ活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む
上記 (1)項記載の組換え体プラスミド、

【０００８】(4) ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番
号：３で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列から
なる上記(2)項記載の組換え体プラスミド、

【０００９】(5) ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番
号：４で示されるＤＮＡ配列またはその一部の配列から
なる上記(3)項記載の組換え体プラスミド、

【００１０】(6) 上記 (1)〜 (5)項の少なくとも一つの
組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換微
生物、

【００１１】(7) 上記 (6)項記載の形質転換微生物を培
養し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌
体処理物を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用さ
せ、これをエピハロヒドリンに変換せしめることを特徴
とするエピハロヒドリンの製造法、

【００１２】(8) 上記 (6)項記載の形質転換微生物を培
養し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌
体処理物をシアン化アルカリの存在下で１，３−ジハロ
−２−プロパノールに作用させ、これを４−ハロ−３−
ヒドロキシブチロニトリルに変換せしめることを特徴と
する４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造
法、

【００１３】(9) 上記 (6)記載の形質転換微生物を培養
し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌体
処理物をシアン化アルカリの存在下でエピハロヒドリン
に作用させ、これを４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニ
トリルに変換せしめることを特徴とする４−ハロ−３−
ヒドロキシブチロニトリルの製造法、に関する。

【００１４】以下に本発明を具体的に説明する。本発明
におけるＤＮＡ供与体微生物として、具体的には、コリ
ネバクテリウムsp. N-1074（微工研条寄第2643号）、ミ
クロバクテリウム sp. N-4701（微工研条寄第2644号）
等が挙げられ、その菌学的性質はそれぞれ特開平2-2912
80号公報に記載されている。本発明で用いられるベクタ
ーとしては、プラスミドベクター（例えばpUC18 、pUC1
9 、pUC118、pUC119等）、ファージベクター（例えばλ
gt11等）のいずれでもよい。また、形質転換に用いる宿
主微生物としては、エシェリシア コリ(E. coli) JM10
5 株あるいは同 JM109株が挙げられるが、特にこれらに
限定されるものではなく、他の宿主生物を用いることも
できる。一例として、コリネバクテリウム sp. N-1074
（微工研条寄第2643号）のハロヒドリンエポキシダーゼ
遺伝子の E. coli JM109株 へのクローニングを、後記
実施例に示す。

【００１５】本発明の形質転換微生物の培養は、通常は
液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことが
できる。培地としては、例えばＬＢ培地が用いられる。
培養は10〜50℃の温度で、pH 2〜11の範囲で行われる。
微生物の生育を促進させるために通気攪拌を行ってもよ
い。培養により得られた形質転換微生物は、培養液ある
いは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質を添加
する方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗酵素・精
製酵素等の菌体抽出物等）あるいは常法により固定化し
た菌体または菌体処理物等の懸濁液に基質を添加する方
法、微生物の培養時に基質を培養液に添加して培養と同
時に反応を行う方法等により、次の (1)〜(3) に示す反
応に供することができる。

【００１６】(1) １，３−ジハロ−２−プロパノールの
エピハロヒドリンへの変換：この反応で使用する１，３
−ジハロ−２−プロパノールは１，３−ジクロロ−２−
プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール等
である。反応液中の基質濃度は特に限定するものではな
いが、 0.1〜10(W/V) ％が好ましく、基質は反応液に一
括して加えるかあるいは分割添加することができる。反
応温度は５〜50℃、反応 pH は４〜10の範囲で行うこと
が好ましい。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるい
はその他の反応条件等によって変わるが、通常１〜120
時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。
尚、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素
イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度を
より一層向上させ得ることが見出された。この塩素イオ
ンの除去は硝酸銀等の添加によって行うことができる。

【００１７】(2) １，３−ジハロ−２−プロパノールの
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへの変換：こ
の反応で使用する１，３−ジハロ−２−プロパノールも
１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロ
モ−２−プロパノール等である。また、シアン化アルカ
リはシアン化カリウム、シアン化ナトリウム等である。
反応液中の基質濃度は特に限定するものではないが、
0.1〜10(W/V) ％が好ましく、また、シアン化アルカリ
の使用量は、通常基質の１〜３倍量（モル）である。基
質は反応液に一括して加えるかあるいは分割添加するこ
とができる。反応温度は５〜50℃、反応 pHは４〜10の
範囲で行うことが好ましい。反応時間は基質等の濃度、
菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって変わる
が、通常１〜120 時間で終了するように条件を設定する
のが好ましい。

【００１８】(3) エピハロヒドリンの４−ハロ−３−ヒ
ドロキシブチロニトリルへの変換：この反応で使用する
エピハロヒドリンはエピクロロヒドリン、エピブロモヒ
ドリン等である。また、シアン化アルカリはシアン化カ
リウム、シアン化ナトリウム等である。反応液中の基質
濃度は特に限定するものではないが、 0.1〜10(W/V) ％
が好ましく、また、シアン化アルカリの使用量は、通常
基質の１〜３倍量（モル）である。基質は反応液に一括
して加えるかあるいは分割添加することができる。反応
温度は５〜50℃、反応 pH は４〜10の範囲で行うことが
好ましい。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいは
その他の反応条件等によって変わるが、通常１〜120 時
間で終了するように条件を設定するのが好ましい。

【００１９】かくして、反応液中に生成、蓄積したエピ
ハロヒドリンおよび４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニ
トリルは公知の方法を用いて採取および精製することが
できる。例えば、反応液から遠心分離などの方法を用い
て菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行
い、減圧下に溶媒を除去することによりエピハロヒドリ
ンおよび４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシ
ロップを得ることができる。また、これらのシロップを
減圧下に蒸留することによりさらに精製することもでき
る。

【００２０】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子組換えの方法で
クローン化されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を
菌体内に多数存在させることができるため、従来の方法
に比して飛躍的に触媒能力を増大させた微生物の提供が
でき、これにより、１，３−ジハロ−２−プロパノール
からのエピハロヒドリンへの変換、ならびに、シアン化
アルカリの存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール
またはエピハロヒドリンからの４−ハロ−３−ヒドロキ
シブチロニトリルへの変換を効率的に行うことが可能で
ある。

【００２１】

【実施例】実施例１ コリネバクテリウム sp. N-1074 （微工研条寄第2643
号）のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の E. coli J
M109株 へのクローニング： (1) コリネバクテリウム sp. N-1074 染色体ＤＮＡの調
製とＤＮＡライブラリーの作成：コリネバクテリウム s
p. N-1074 から Saito and Miuraの方法〔Biochim.Biop
hys. Acta 72, 619(1963) 参照〕により染色体ＤＮＡを
分離し、これを制限酵素 (BamHI あるいは BglII) で切
断後、ベクタープラスミド pUC18に挿し組換え体ＤＮＡ
のライブラリーを作成した。

【００２２】(2) 形質転換体の作成および組換え体ＤＮ
Ａの選別：工程(1) で調製した組換え体ライブラリーに
よる形質転換体を宿主生物としてE. coli JM109 株を用
いて塩化カルシウム法〔J. Mol. Biol. 53, 154 (197
0)〕により作成し、その中からハロヒドリンエポキシダ
ーゼ活性を示すようになったものを選別した。選別は以
下のようにして行った。アンピシリン(100μg/ml) とＩ
ＰＴＧ(1ml) を含むＬＢ寒天培地(1％バクトトリプト
ン、0.5 ％バクトイーストエキス、0.5 ％ＮａＣｌ、1.
5 ％寒天）に作成した形質転換体のコロニーを形成させ
た。10mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)、0.02％ブロモク
レゾールパープル、１％１，３−ジクロロ−２−プロパ
ノールを染み込ませたロ紙にコロニーを移し、室温にて
数時間放置した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持
つコロニーは塩酸を遊離しコロニー付近の pH は低下
し、pH指示薬であるブロモクレゾールパープルは青紫色
から黄色に変化するため、肉眼観察によりハロヒドリン
エポキシダーゼ遺伝子を持つ株を選別することができ
る。

【００２３】これらの形質転換株が実際にハロヒドリン
エポキシダーゼ活性を有しているかどうかは次のように
して調べることができる。これらの株をアンピシリン
(50μg/ml) とＩＰＴＧ(1mM) を含むＬＢ培地(1％バク
トトリプトン、0.5 ％バクトイーストエキス、0.5 ％Ｎ
ａＣｌ）にて37℃で一夜培養する。菌体を50mMトリス−
硫酸緩衝液(pH 8)で２回洗浄後、１％１，３−ジクロロ
プロパノールを含む1Mトリス−硫酸緩衝液(pH 8)に懸濁
し、20℃にてインキュベートした。一定時間後、生成す
るエピクロルヒドリンをガスクロマトグラフィーにて定
量した。こうして得られた形質転換株から再びプラスミ
ドＤＮＡを取り出し、選別された２種の目的のプラスミ
ドを得た。これらのプラスミドをpST001およびpST005、
ならびにこれらのプラスミドが導入された形質転換体を
JM109/pST001 およびJM109/pST005と称する。

【００２４】(3) 制限酵素地図の作成とハロヒドリンエ
ポキシダーゼ遺伝子の位置の決定：工程(2) で得られた
プラスミドについて制限酵素地図を作成した。その後、
より小さなＤＮＡ断片を持つプラスミドを作成した。こ
れらのプラスミドによって工程(2) と同様にして形質転
換された株のハロヒドリンエポキシダーゼ活性の有無に
よって目的遺伝子の含まれている箇所を決定した。この
過程で、pST001のBamHI-Bgl 1.3Kb 断片を含むpST015
(pUC118ベクター）およびpST005のBamHI-PstI1.1Kb 断
片を含む pST111(pUC118ベクター）プラスミドを作成し
た（図１）。これらのプラスミドが導入された形質転換
体をJM109/pST015およびJM109/pST111 と称する。

【００２５】(4) 塩基配列の決定：工程(3) で得られた
プラスミドpST015およびpST111のハロヒドリンエポキシ
ダーゼ遺伝子に関する部分のＤＮＡの塩基配列を決定し
た（配列番号：５および配列番号：６）。なお、ここで
得られた形質転換体 JM109/pST001 、JM109/pST005、JM
109/pST015 およびJM109/pST111は、工業技術院微生物
工業技術研究所（微工研）に、それぞれ微工研菌寄第11
961 号、微工研菌寄第11962 号、微工研菌寄第12064 号
および微工研菌寄第12065 号として寄託されている。

【００２６】実施例２ アンピシリン (50μg/ml) と1mM ＩＰＴＧを含むＬＢ培
地に、それぞれJM109/pST015およびJM109/pST111を接種
し37℃にて16時間振盪培養を行った。こうして得られた
培養液から遠心分離により菌体を回収し、50mMトリス−
硫酸緩衝液(pH8.0)50mlで２回洗浄後、50mlの1Mトリス
−硫酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁し菌体懸濁液を調製した。
得られた菌体懸濁液に１％(W/V)(＝77.5mM) となるよう
に１，３−ジクロロ−２−プロパノールを添加し、20℃
にて10時間反応させた。反応の進行はガスクロマトグラ
フィーで１，３−ジクロロ−２−プロパノールおよびエ
ピクロルヒドリンの濃度を測定することにより調べた。
反応終了時のエピクロルヒドリンの生成量を調べたとこ
ろ、それぞれ 7.2mMおよび 5.0mMであった。

【００２７】実施例３ 実施例２と同様にして得たJM109/pST015の菌体懸濁液50
mlに等量のｎ−ヘキサンと1gの１，３−ジクロロ−２−
プロパノールを添加し、20℃で５時間反応させた。反応
終了後ｎ−ヘキサンを分液し、ｎ−ヘキサン中のエピク
ロルヒドリン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定
したところ18.6mMのエピクロルヒドリンが生成してい
た。

【００２８】実施例４ 実施例２と同様の培地に、JM109/pST111を接種し、37℃
で16時間振盪培養を行った。この培養液 100mlから遠心
分離により菌体を集め、50mMトリス−硫酸緩衝液(pH 8.
0) 100mlで３回洗浄後、同緩衝液に懸濁して菌体懸濁液
を調製した。この菌体懸濁液を用いて以下に示す反応溶
液(100ml) を調製し、20℃で反応を行った。 反応溶液組成： 100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0) 50mM １，３−ジクロロ−２−プロパノ−ル 菌体懸濁液 反応開始10分後の反応液中のエピクロルヒドリンの生成
量をガスクロマトグラフィ−により分析したところ、1
2.6mMのエピクロルヒドリンが生成していた。また、反
応液から遠心分離により菌体を除去した後、反応溶液か
ら酢酸エチルによりエピクロルヒドリンを抽出しｐ−ト
ルエンスルフォン酸を用いてエステル誘導体とし高速液
体クロマトグラフィ−による光学異性体の分析を行っ
た。その結果、生成したエピクロルヒドリンは、（Ｒ）
−エピクロルヒドリンでありその光学純度は50％e.e.で
あった。

【００２９】実施例５ 実施例４と同様にして調製した菌体懸濁液を用いて以下
に示す反応溶液を調製し20℃で反応を行った。 反応溶液組成： 100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0) 50mM １，３−ジクロロ−２−プロパノ−ル 硝酸銀 3.1g/l 菌体懸濁液 反応開始20分後の反応液中のエピクロルヒドリンの生成
量をガスクロマトグラフィ−により分析したところ、1
3.8mMのエピクロルヒドリンが生成していた。また、実
施例４と同様にして光学異性体の分析を行ったところ、
光学純度は100％e.e.の（Ｒ）−エピクロルヒドリンの
生成が確認された。

【００３０】実施例６ 実施例２と同様の培地に、それぞれJM109/pST015および
JM109/pST111を接種し37℃にて14時間振盪培養を行っ
た。これらの培養液をそれぞれ遠心分離して菌体を集
め、50mMトリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)50mlで２回洗浄
後、50mlの100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁し
菌体懸濁液を調製した。得られた菌体懸濁液に１，３−
ジクロロ−２−プロパノールおよびシアン化カリウムを
それぞれ50mMおよび150mM になるように添加し、20℃に
て２時間反応させた。反応終了後、反応液から菌体を遠
心分離によって除去し、上清中の生成４−クロロ−３−
ヒドロキシブチロニトリルをガスクロマトグラフィーに
て定量した。その結果、JM109/pST015およびJM109/pST1
11について、それぞれ約15mMおよび10mMの４−クロロ−
３−ヒドロキシブチロニトリルが生成していた。

【００３１】実施例７ 実施例２と同様の培地に、JM109/pST111を接種し、37℃
で16時間振盪培養を行った。この培養液 100mlから遠心
分離により菌体を集め、50mMトリス−硫酸緩衝液(pH 8.
0) 100mlで３回洗浄後、同緩衝液に懸濁して菌体懸濁液
を調製した。この菌体懸濁液を用いて以下に示す反応溶
液(100ml) を調製し、20℃で反応を行った。 反応溶液組成： 100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0) 50mM １，３−ジクロロ−２−プロパノ−ル 100mM ＫＣＮ 菌体懸濁液 反応開始30分後の反応液中の４−クロロ−３−ヒドロキ
シブチロニトリルの生成量をガスクロマトグラフィ−に
より分析したところ、24.2mMの４−クロロ−３−ヒドロ
キシブチロニトリルが生成していた。また、反応液から
遠心分離により菌体を除去した後、反応溶液から酢酸エ
チルにより４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
を抽出し、（Ｒ）−（−）−α−メトキシ−α−トリフ
ルオロメチルフェニルアセチルクロリドを用いて、その
エステル誘導体とし、高速液体クロマトグラフィ−によ
る光学異性体の分析を行った。その結果、生成した４−
クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、（Ｒ）−４
−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルであり、その
光学純度は95％e.e.であった。

【００３２】実施例８ 実施例２と同様の培地に、それぞれJM109/pST015および
JM109/pST111を接種し37℃にて14時間振盪培養を行っ
た。これらの培養液をそれぞれ遠心分離して菌体を集
め、50mMトリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)50mlで２回洗浄
後、50mlの100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁し
菌体懸濁液を調製した。得られた菌体懸濁液にエピクロ
ロヒドリンおよびシアン化カリウムをそれぞれ50mMおよ
び100mM になるように添加し、20℃にて80分間反応させ
た。反応終了後、反応液から菌体を遠心分離によって除
去し、上清中の生成４−クロロ−３−ヒドロキシブチロ
ニトリルをガスクロマトグラフィーにて定量した。その
結果、JM109/pST015およびJM109/pST111について、それ
ぞれ約22mMおよび27mMの４−クロロ−３−ヒドロキシブ
チロニトリルが生成していた。

【００３３】実施例９ 実施例２と同様の培地に、JM109/pST111を接種し、37℃
で16時間振盪培養を行った。この培養液 100mlから遠心
分離により菌体を集め、50mMトリス−硫酸緩衝液(pH 8.
0) 100mlで３回洗浄後、同緩衝液に懸濁して菌体懸濁液
を調製した。この菌体懸濁液を用いて以下に示す反応溶
液(100ml) を調製し、20℃で反応を行った。 反応溶液組成： 100mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0) 50mM エピクロルヒドリン 100mM ＫＣＮ 菌体懸濁液 反応開始30分後の反応液中の４−クロロ−３−ヒドロキ
シブチロニトリルの生成量をガスクロマトグラフィ−に
より分析したところ、18.6mMの４−クロロ−３−ヒドロ
キシブチロニトリルが生成していた。また、反応液から
遠心分離により菌体を除去した後、反応溶液から酢酸エ
チルにより４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル
を抽出し、（Ｒ）−（−）−α−メトキシ−α−トリフ
ルオロメチルフェニルアセチルクロリドを用いてそのエ
ステル誘導体とし、高速液体クロマトグラフィ−による
光学異性体の分析を行った。その結果、生成した４−ク
ロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは（Ｒ）−４−ク
ロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルであり、その光学
純度は66％e.e.であった。

【００３４】

【図面の簡単な説明】

図１は組換え体プラスミドpST001、pST005、pST015およ
びpST111の制限酵素地図を示す。

【配列表】

【００３５】配列番号：１ 配列の長さ：244 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： Met Lys Ile Ala Leu Val Thr His Ala Arg His Phe Ala Gly Pro Ala 1 5 10 15 Ala Val Glu Ala Leu Thr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Val Cys His Asp 20 25 30 Ala Thr Phe Ala Asp Ala Ala Glu Arg Gln Arg Phe Glu Ser Glu Asn 35 40 45 Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala Glu Gln Lys Pro Glu Arg Leu Val Asp 50 55 60 Ala Thr Leu Gln His Gly Glu Ala Ile Asp Thr Ile Val Ser Asn Asp 65 70 75 80 Tyr Ile Pro Arg Pro Met Asn Arg Leu Pro Ile Glu Gly Thr Ser Glu 85 90 95 Ala Asp Ile Arg Gln Val Phe Glu Ala Leu Ser Ile Phe Pro Ile Leu 100 105 110 Leu Leu Gln Ser Ala Ile Ala Pro Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ala Ser 115 120 125 Val Ile Phe Ile Thr Ser Ser Val Gly Lys Lys Pro Leu Ala Tyr Asn 130 135 140 Pro Leu Tyr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Val Ala Leu Val Glu Ser 145 150 155 160 Ala Ala Lys Thr Leu Ser Arg Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Ile Gly 165 170 175 Pro Asn Phe Phe Asn Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Thr Ser Asp Trp Glu 180 185 190 Asn Asn Pro Glu Leu Arg Glu Arg Val Glu Arg Asp Val Pro Leu Gly 195 200 205 Arg Leu Gly Arg Pro Asp Glu Met Gly Ala Leu Ile Thr Phe Leu Ala 210 215 220 Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ile Val Gly Gln Phe Phe Ala Phe Thr Gly 225 230 235 240 Gly Tyr Leu Pro

【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：235 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr 20 25 30 Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala Glu Val Ile Ala Asp His Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu Glu Val Val Glu Arg Ala Gly 50 55 60 His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe Ala Val Asp Ala His Phe Gly 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu 85 90 95 Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln 100 105 110 Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala 115 120 125 Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe 130 135 140 Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu Gly Pro Glu Ala Ala Arg His 145 150 155 160 Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln His Trp Thr Gln Asn Lys Glu 165 170 175 Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met 180 185 190 Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly 210 215 220 Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp Ala Thr 225 230 235

【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：732 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： ATG AAG ATC GCC CTC GTG ACT CAT GCA CGG CAT TTT GCA GGC CCC GCC 48 GCC GTC GAG GCG CTT ACG CGG GAT GGC TAT ACC GTG GTT TGC CAC GAC 96 GCG ACG TTC GCT GAT GCA GCT GAA CGA CAG CGT TTC GAG TCG GAG AAC 144 CCG GGC ACC GTC GCG CTC GCC GAG CAG AAG CCC GAG CGT CTG GTC GAC 192 GCC ACG CTG CAG CAC GGG GAA GCG ATC GAC ACG ATC GTC TCG AAC GAT 240 TAC ATT CCG CGC CCG ATG AAT CGG CTC CCG ATC GAG GGA ACG AGC GAG 288 GCC GAC ATC CGA CAG GTG TTC GAG GCG CTC AGC ATC TTC CCG ATC CTG 336 CTC CTG CAG TCG GCC ATC GCG CCG CTA CGG GCT GCA GGC GGC GCC TCC 384 GTT ATC TTC ATC ACG TCC TCA GTT GGC AAG AAG CCG CTC GCC TAC AAC 432 CCT CTC TAT GGG CCC GCG CGC GCC GCT ACC GTC GCG CTT GTC GAA TCG 480 GCA GCG AAG ACG CTG TCC CGT GAC GGA ATC TTG CTC TAC GCG ATC GGT 528 CCG AAC TTC TTC AAC AAC CCG ACG TAC TTC CCG ACG TCG GAT TGG GAG 576 AAC AAC CCC GAG CTC CGG GAG CGT GTC GAG CGG GAC GTG CCG CTC GGT 624 CGC CTC GGC CGT CCG GAC GAG ATG GGT GCG CTG ATC ACC TTC CTC GCT 672 TCG CGT CGT GCA GCG CCC ATC GTG GGG CAG TTC TTC GCT TTC ACC GGT 720 GGC TAT CTG CCC 732

【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：705 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： ATG GCT AAC GGA AGG AAA AGG GAA ATG GCT AAC GGA AGA CTG GCA GGC 48 AAG CGG GTC CTA CTC ACG AAC GCC GAT GCC TAC ATG GGT GAG GCC ACG 96 GTC CAG GTG TTC GAG GAG GAG GGC GCA GAG GTC ATC GCT GAC CAC ACC 144 GAC TTG ACG AAG GTC GGC GCG GCG GAG GAG GTC GTC GAG AGG GCT GGG 192 CAC ATC GAT GTC CTG GTG GCC AAC TTC GCG GTC GAC GCC CAC TTC GGG 240 GTG ACC GTG CTG GAG ACC GAC GAG GAG CTG TGG CAG ACG GCC TAC GAG 288 ACC ATC GTG CAC CCG CTG CAT CGG ATC TGC CGT GCG GTG CTC CCG CAG 336 TTC TAC GAG CGG AAC AAG GGC AAG ATC GTT GTC TAC GGA AGT GCC GCA 384 GCG ATG CGG TAC CAG GAA GGT GCG CTG GCC TAC AGC ACG GCG CGT TTC 432 GCT CAG CGC GGG TAC GTC ACC GCC CTC GGT CCC GAG GCA GCG AGG CAC 480 AAC GTC AAC GTG AAC TTC ATC GCC CAG CAC TGG ACC CAA AAC AAG GAG 528 TAC TTC TGG CCC GAG CGC ATC GCC ACC GAC GAG TTC AAG GAG GAT ATG 576 GCG CGC CGA GTT CCC CTG GGT CGG CTC GCG ACT GCC CGA GAG GAC GCG 624 CTG CTC GCG TTG TTC CTG GCC TCG GAC GAG AGT GAC TTC ATC GTC GGC 672 AAG TCG ATC GAG TTC GAC GGC GGC TGG GCC ACC 705

【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：829 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： GAATTCCAGA ACCAATTGAG AGGAAATGAA CA ATG AAG ATC GCC CTC GTG ACT 53 Met Lys Ile Ala Leu Val Thr 1 5 CAT GCA CGG CAT TTT GCA GGC CCC GCC GCC GTC GAG GCG CTT ACG CGG 101 His Ala Arg His Phe Ala Gly Pro Ala Ala Val Glu Ala Leu Thr Arg 10 15 20 GAT GGC TAT ACC GTG GTT TGC CAC GAC GCG ACG TTC GCT GAT GCA GCT 149 Asp Gly Tyr Thr Val Val Cys His Asp Ala Thr Phe Ala Asp Ala Ala 25 30 35 GAA CGA CAG CGT TTC GAG TCG GAG AAC CCG GGC ACC GTC GCG CTC GCC 197 Glu Arg Gln Arg Phe Glu Ser Glu Asn Pro Gly Thr Val Ala Leu Ala 40 45 50 55 GAG CAG AAG CCC GAG CGT CTG GTC GAC GCC ACG CTG CAG CAC GGG GAA 245 Glu Gln Lys Pro Glu Arg Leu Val Asp Ala Thr Leu Gln His Gly Glu 60 65 70 GCG ATC GAC ACG ATC GTC TCG AAC GAT TAC ATT CCG CGC CCG ATG AAT 293 Ala Ile Asp Thr Ile Val Ser Asn Asp Tyr Ile Pro Arg Pro Met Asn 75 80 85 CGG CTC CCG ATC GAG GGA ACG AGC GAG GCC GAC ATC CGA CAG GTG TTC 341 Arg Leu Pro Ile Glu Gly Thr Ser Glu Ala Asp Ile Arg Gln Val Phe 90 95 100 GAG GCG CTC AGC ATC TTC CCG ATC CTG CTC CTG CAG TCG GCC ATC GCG 389 Glu Ala Leu Ser Ile Phe Pro Ile Leu Leu Leu Gln Ser Ala Ile Ala 105 110 115 CCG CTA CGG GCT GCA GGC GGC GCC TCC GTT ATC TTC ATC ACG TCC TCA 437 Pro Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Ile Phe Ile Thr Ser Ser 120 125 130 135 GTT GGC AAG AAG CCG CTC GCC TAC AAC CCT CTC TAT GGG CCC GCG CGC 485 Val Gly Lys Lys Pro Leu Ala Tyr Asn Pro Leu Tyr Gly Pro Ala Arg 140 145 150 GCC GCT ACC GTC GCG CTT GTC GAA TCG GCA GCG AAG ACG CTG TCC CGT 533 Ala Ala Thr Val Ala Leu Val Glu Ser Ala Ala Lys Thr Leu Ser Arg 155 160 165 GAC GGA ATC TTG CTC TAC GCG ATC GGT CCG AAC TTC TTC AAC AAC CCG 581 Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Ile Gly Pro Asn Phe Phe Asn Asn Pro 170 175 180 ACG TAC TTC CCG ACG TCG GAT TGG GAG AAC AAC CCC GAG CTC CGG GAG 629 Thr Tyr Phe Pro Thr Ser Asp Trp Glu Asn Asn Pro Glu Leu Arg Glu 185 190 195 CGT GTC GAG CGG GAC GTG CCG CTC GGT CGC CTC GGC CGT CCG GAC GAG 677 Arg Val Glu Arg Asp Val Pro Leu Gly Arg Leu Gly Arg Pro Asp Glu 200 205 210 215 ATG GGT GCG CTG ATC ACC TTC CTC GCT TCG CGT CGT GCA GCG CCC ATC 725 Met Gly Ala Leu Ile Thr Phe Leu Ala Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ile 220 225 230 GTG GGG CAG TTC TTC GCT TTC ACC GGT GGC TAT CTG CCC TAACCCGCGC 774 Val Gly Gln Phe Phe Ala Phe Thr Gly Gly Tyr Leu Pro 235 240 CGGTACGGCA ACAGGAAGGA CTGTCTGACA CGGTTCGTCC TCCCAACGCG CCGGC 829

【００４０】配列番号：６ 配列の長さ：843 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム(Corynebacterium) 株名：N-1074 配列： GTCGACTAGA GAAGGTATTC CGACTGCTGC GGTGCCTGGC ACCGCAGCAA AAGATTCAAG 60 GATTCTCGAA GAAAGGAAAA GGGAA ATG GCT AAC GGA AGG AAA AGG GAA ATG 112 Met Ala Asn Gly Arg Lys Arg Glu Met 1 5 GCT AAC GGA AGA CTG GCA GGC AAG CGG GTC CTA CTC ACG AAC GCC GAT 160 Ala Asn Gly Arg Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Leu Thr Asn Ala Asp 10 15 20 25 GCC TAC ATG GGT GAG GCC ACG GTC CAG GTG TTC GAG GAG GAG GGC GCA 208 Ala Tyr Met Gly Glu Ala Thr Val Gln Val Phe Glu Glu Glu Gly Ala 30 35 40 GAG GTC ATC GCT GAC CAC ACC GAC TTG ACG AAG GTC GGC GCG GCG GAG 256 Glu Val Ile Ala Asp His Thr Asp Leu Thr Lys Val Gly Ala Ala Glu 45 50 55 GAG GTC GTC GAG AGG GCT GGG CAC ATC GAT GTC CTG GTG GCC AAC TTC 304 Glu Val Val Glu Arg Ala Gly His Ile Asp Val Leu Val Ala Asn Phe 60 65 70 GCG GTC GAC GCC CAC TTC GGG GTG ACC GTG CTG GAG ACC GAC GAG GAG 352 Ala Val Asp Ala His Phe Gly Val Thr Val Leu Glu Thr Asp Glu Glu 75 80 85 CTG TGG CAG ACG GCC TAC GAG ACC ATC GTG CAC CCG CTG CAT CGG ATC 400 Leu Trp Gln Thr Ala Tyr Glu Thr Ile Val His Pro Leu His Arg Ile 90 95 100 105 TGC CGT GCG GTG CTC CCG CAG TTC TAC GAG CGG AAC AAG GGC AAG ATC 448 Cys Arg Ala Val Leu Pro Gln Phe Tyr Glu Arg Asn Lys Gly Lys Ile 110 115 120 GTT GTC TAC GGA AGT GCC GCA GCG ATG CGG TAC CAG GAA GGT GCG CTG 496 Val Val Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Met Arg Tyr Gln Glu Gly Ala Leu 125 130 135 GCC TAC AGC ACG GCG CGT TTC GCT CAG CGC GGG TAC GTC ACC GCC CTC 544 Ala Tyr Ser Thr Ala Arg Phe Ala Gln Arg Gly Tyr Val Thr Ala Leu 140 145 150 GGT CCC GAG GCA GCG AGG CAC AAC GTC AAC GTG AAC TTC ATC GCC CAG 592 Gly Pro Glu Ala Ala Arg His Asn Val Asn Val Asn Phe Ile Ala Gln 155 160 165 CAC TGG ACC CAA AAC AAG GAG TAC TTC TGG CCC GAG CGC ATC GCC ACC 640 His Trp Thr Gln Asn Lys Glu Tyr Phe Trp Pro Glu Arg Ile Ala Thr 170 175 180 185 GAC GAG TTC AAG GAG GAT ATG GCG CGC CGA GTT CCC CTG GGT CGG CTC 688 Asp Glu Phe Lys Glu Asp Met Ala Arg Arg Val Pro Leu Gly Arg Leu 190 195 200 GCG ACT GCC CGA GAG GAC GCG CTG CTC GCG TTG TTC CTG GCC TCG GAC 736 Ala Thr Ala Arg Glu Asp Ala Leu Leu Ala Leu Phe Leu Ala Ser Asp 205 210 215 GAG AGT GAC TTC ATC GTC GGC AAG TCG ATC GAG TTC GAC GGC GGC TGG 784 Glu Ser Asp Phe Ile Val Gly Lys Ser Ile Glu Phe Asp Gly Gly Trp 220 225 230 GCC ACC TGAGAGACGT CACAGCCCCC TCGGGCAGGC GCTCGTCGTC GTTGTAGCTG CAG 843 Ala Thr 235

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列ま
   たは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸
   が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、
   ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有するポリペプチド
   をコードするＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組
   換え体プラスミド。
2. 【請求項２】 配列番号：２で示されるアミノ酸配列ま
   たは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸
   が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、
   ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有するポリペプチド
   をコードするＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組
   換え体プラスミド。
3. 【請求項３】 ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有す
   るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号：
   ３で示されるＤＮＡ配列からなる請求項１記載の組換え
   体プラスミド。
4. 【請求項４】 ハロヒドリンエポキシダ−ゼ活性を有す
   るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号：
   ４で示されるＤＮＡ配列からなる請求項２記載の組換え
   体プラスミド。
5. 【請求項５】 請求項１〜４記載の少なくとも一つの組
   換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換微生
   物。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換微生物を培養
   し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌体
   処理物を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用さ
   せ、これをエピハロヒドリンに変換せしめることを特徴
   とするエピハロヒドリンの製造法。
7. 【請求項７】 請求項５記載の形質転換微生物を培養
   し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌体
   処理物をシアン化アルカリの存在下で１，３−ジハロ−
   ２−プロパノールに作用させ、これを４−ハロ−３−ヒ
   ドロキシブチロニトリルに変換せしめることを特徴とす
   る４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造法。
8. 【請求項８】 請求項５記載の形質転換微生物を培養
   し、得られる形質転換微生物の培養液、菌体または菌体
   処理物をシアン化アルカリの存在下でエピハロヒドリン
   に作用させ、これを４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニ
   トリルに変換せしめることを特徴とする４−ハロ−３−
   ヒドロキシブチロニトリルの製造法。