NO330796B1 - Protein, polynukleotid, polynukleotidsekvens, rekombinant vektor, ikke-human vert, samt fremgangsmater for a produsere D-fenylmelkesyre hydrogenase, D-fenylmelkesyre og substansen PF1022 eller derivater derav - Google Patents
Protein, polynukleotid, polynukleotidsekvens, rekombinant vektor, ikke-human vert, samt fremgangsmater for a produsere D-fenylmelkesyre hydrogenase, D-fenylmelkesyre og substansen PF1022 eller derivater derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO330796B1 NO330796B1 NO20025126A NO20025126A NO330796B1 NO 330796 B1 NO330796 B1 NO 330796B1 NO 20025126 A NO20025126 A NO 20025126A NO 20025126 A NO20025126 A NO 20025126A NO 330796 B1 NO330796 B1 NO 330796B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- sequence
- phenyllactic
- seq
- protein
- acid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N (S)-3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-QMMMGPOBSA-N 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims description 20
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 title claims description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 58
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001903 2-oxo-3-phenylpropanoic acid Substances 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- HWDZIRSKXFAMFU-UHFFFAOYSA-N 3-(4-aminophenyl)pyruvic acid Chemical compound NC1=CC=C(CC(=O)C(O)=O)C=C1 HWDZIRSKXFAMFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- -1 nicotinamide adenine nucleotide phosphate Chemical class 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- NWCHELUCVWSRRS-SECBINFHSA-N (2r)-2-hydroxy-2-phenylpropanoic acid Chemical class OC(=O)[C@@](O)(C)C1=CC=CC=C1 NWCHELUCVWSRRS-SECBINFHSA-N 0.000 description 3
- UZKSXWXNLHBMHW-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-aminophenyl)-2-hydroxypropanoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C[C@H](O)C(O)=O)C=C1 UZKSXWXNLHBMHW-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNJCEALGCZSIGB-SECBINFHSA-N (2r)-2-hydroxy-4-phenylbutanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)CCC1=CC=CC=C1 JNJCEALGCZSIGB-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCUAFVVTHZALS-UHFFFAOYSA-N 3-(3-methoxyphenyl)piperidine Chemical compound COC1=CC=CC(C2CNCCC2)=C1 LXCUAFVVTHZALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N Chorismic acid Natural products O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 2
- 229930182843 D-Lactic acid Natural products 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N D-lactic acid Chemical compound C[C@@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 101150031761 Flnc gene Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940022769 d- lactic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 1
- VOXXWSYKYCBWHO-MRVPVSSYSA-N (R)-3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPKAIMDMNWBOKN-UHFFFAOYSA-N 2-Oxo-4-phenylbutyric acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 PPKAIMDMNWBOKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVGVDSSUAVXRDY-UHFFFAOYSA-N 3-(4-hydroxyphenyl)lactic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC1=CC=C(O)C=C1 JVGVDSSUAVXRDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000038880 D-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase family Human genes 0.000 description 1
- 108091065033 D-isomer specific 2-hydroxyacid dehydrogenase family Proteins 0.000 description 1
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N HO-Phe-OH Natural products OC(=O)C(O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N Lactic Acid Natural products CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010004210 PF 1022A Proteins 0.000 description 1
- YJNUXGPXJFAUQJ-LYWANRAQSA-N PF1022A Chemical group C([C@@H]1C(=O)N(C)[C@H](C(O[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O[C@H](C)C(=O)N(C)[C@@H](CC(C)C)C(=O)O1)=O)CC(C)C)C1=CC=CC=C1 YJNUXGPXJFAUQJ-LYWANRAQSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 108010075344 Tryptophan synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 1
- 229940030600 antihypertensive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N benomyl Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)NCCCC)C(NC(=O)OC)=NC2=C1 RIOXQFHNBCKOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N benzoxaprofen Natural products N=1C2=CC(C(C(O)=O)C)=CC=C2OC=1C1=CC=C(Cl)C=C1 MITFXPHMIHQXPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000355 copper sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 1
- KYOBSHFOBAOFBF-XVFCMESISA-N orotidine 5'-phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1C(O)=O KYOBSHFOBAOFBF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenylpyruvic acid Natural products OC(=O)C(O)=CC1=CC=C(O)C=C1 GQYBCIHRWMPOOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIGYFQSAFKLMAL-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CIGYFQSAFKLMAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150089778 pyr-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Område for oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelse vedrører et protein, et polynukleotid, en polynukleotidsekvens, en rekombinant vektor, en ikke-human vert, samt fremgangsmåter for å produsere D-fenylmelkesyre hydrogenase, D-fenylmelkesyre og substansen PF1022 eller derivat derav slik det er angitt i innledningen i de selvstendige patentkravene.
Bakgrunn og teknikkens stilling
D-fenylmelkesyre er en forløper for substansen PF1022 [syklo(D-laktyl-L-N-metylleucyl-D-3-fenyllaktyl-L-N-metyl-leucyl-D-laktyl-L-N-metylleucyl-D-3-fenyllaktyl-L-N-metyl-leucyl)] som produseres av den filamentøse soppstammen PF1022 ( Mycelia sterilia, FERM-BP-2671) som tilhører Agonomycetales (T. Sasaki, et al., J. Antibiotics, (1992) vol 45, p 692)). Nylig ble et enzym som direkte produserer substansen PF1022 og et gen som koder for dette enzym beskrevet (WO01/18179A1). Videre er det kjent at idet et fenylmelkesyrederivat tilsettes fra utsiden under dyrking av substans PF1022-produserende stamme i et væskemedium, kan en ny substans PF1022 produseres hvori det nye fenylmelkesyrederivat inkorporeres (WO 97/20945). I dette tilfellet er en forløper som kan tilsettes hensiktsmessig et (R)-2-hydroksyderivat.
Visse typer enzymer produsert av mikroorganismer er kjent til spesifikt å produsere optisk aktive forbindelser, så som D-melkesyre (H. Taguchi, et al., J. Biol. Chem.,
(1991), vol 266, p 12588)). Videre er det et antall rapporter på fremgangsmåter for å produsere industrielt nyttige forbindelser så som (R)-2-hydroksy-4-fenylsmørsyre ved anvendelse av visse typer enzymer eller mikroorganismer som produserer nyttige enzymer (Japansk Patent Nr 2750017, Japansk Patent Nr 2752754, Japansk Patent Nr 2774341, Japansk Patent Nr 2873236, Japansk Patent Publikasjon Nr 61271/1994, Japansk Patent Allmenn Tilgjengelig Publikasjon Nr 19774/1994, og Japansk Allmenn Tilgjengelig Publikasjon Nr 75797/1998).
WO01/18179 beskriver enzymer som syntetiserer sykliske depsipeptider og gener derav.
EP0780468 beskriver en metode for å tranfomrere stamme PF1022 som produserer et syklisk depsipeptid.
Publikasjonen av Hayao et al., 1991, (D-Lactate dehydrogenase is a member of the D-isomer-specific 2 -hydroxyacid dehydrogenase family. J. Biol. Chme, nr. 19, s. 12588-12594) omtaler genet som koder for D-melkesyre dehydrogenase fra Lactobacillus plantarum som har blitt sekvensert og uttrykt i E. coli.
WO01/18219 beskriver en promotor og en terminator som funksjonerer synkront med uttrykking av et endogent gen i filamentøs sopp.
Enzymatiske reaksjoner er kjennetegnet ved å karakterisere målforbindelser mer selektivt og effektivt enn kjemisk syntese. På den annen side er det nødvendig å søke etter enzymer som spesifikt virker på målforbindelser pga. at substratspesifisiteten for hvert enzym er begrenset. Så langt har det ikke vært noen rapporter på et dehydro-genaseenzym som er spesifikt for D-fenylmelkesyre avledet fra mikroorganismer.
Sammendrag av oppfinnelsen
Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har med suksess isolert et enzym som spesifikt reduserer fenylpyrodruesyre og produserer D-fenylmelkesyre, nemlig D-fenylmelkesyre dehydrogenase (D-PLDH), og et gen som koder for dette enzym. Videre har oppfinnerne med suksess i vesentlig grad klart å uttrykke dette gen i Escherichia coli.
Et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en D-fenylmelkesyre dehydrogenase. Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et gen som koder for D-fenylmelkesyre dehydrogenase.
Et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en rekombinant vektor og en transformant for å uttrykke D-fenylmelkesyre dehydrogenase, og en fremgangsmåte for å produsere D-fenylmelkesyre dehydrogenase.
Et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et masseproduksjonssystem for substansen PF1022 og derivater derav, og en fremgangsmåte for å produsere samme.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et protein kjennetegnet ved at at det omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av følgende sekvenser: (a) aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 2, og (b) en modifisert aminosyresekvens av aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 2 som har én eller flere modifiseringer valgt fra en substitusjon, en deletering, en addisjon og et innskudd, og som har D-fenylmelkesyre dehydrogenase aktivitet. Videre omfatter den foreliggende oppfinnelse et protein kjennetegnet ved at det kodes for av en nukleotidsekvens valgt blant gruppen som består av følgende sekvenser:
(c) DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1,
(d) en nukleotidsekvens som har minst 70% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet, (e) en nukleotidsekvens som hybridiserer med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 under stringente betingelser, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også et polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for proteinet i samsvar med krav 1.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også et polynukleotid kjennetegnet ved at det omfatter DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1.
Den foreliggende oppfinnelsen vedrører også en polynukleotidsekvens, kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen som består av de følgende sekvenser:
(c) DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1,
(d) en nukleotidsekvens som har minst 70% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet, (e) en modifisert DNA-sekvens av DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 som har én eller flere modifiseringer valgt fra en substituert, en deletering, en addisjon og et innskudd, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet, og (f) en nukleotidsekvens som hybridiserer med DNA sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 under stringente betingelser, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet.
En foretrukket utførelse av nevnte polynukleotid er kjennetegnet ved at d) er et polynukleotid som har minst 80% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1.
En foretrukket utførelse av nevnte polynukleotid er kjennetegnet ved at at d) er et polynukleotid som har minst 90% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en rekombinant vektor, kjennetegnet ved at den omfatter polynukleotidet ifølge et av kravene 3-7.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en ikke-human vert, kjennetegnet ved at den omfatter den rekombinante vektor i krav 8.
En foretrukket utførelse av nevnte vert uttrykker en D-fenylmelkesyre dehydrogenase.
En foretrukket utførelse av nevnte vert er en substans PF1022-produserende mikroorganisme.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å produsere en D-fenylmelkesyre hydrogenase, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene å dyrke verten ifølge krav 9, 10 eller 11, og oppta D-fenylmelkesyre dehydrogenase fra dyrkningsmediet.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å produsere D-fenylmelkesyre, et derivat derav eller en analog derav kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene å reagere fenylpyrodruesyre, et derivat derav eller en homolog derav, med proteinet ifølge krav 1, verten ifølge krav 9, 10 eller 11, et ekstrakt av verten, en kultur av verten, eller et enzym renset fra kulturen, og oppsamle nevnte D-fenylmelkesyre, derivat eller analog.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å produsere substansen PF1022 eller et derivat derav, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene å dyrke verten ifølge krav 11 og oppsamle substansen PF1022 eller derivatet derav fra dyrkningsmediet.
Kort beskrivelse av figuren
Fig. 1 viser en fremgangsmåte for å konstruere plasmid pDPLDH-1.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Deponering av mikroorganismer
Stammen PF1022 beskrevet i Eksempel 1-1 ble deponert ved The International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Tsukuba Central 6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan), den 24. januar 1989. Katalognummer er FERM BP-2671.
Escherichia coli (DH5a)-stammen transformert med plasmid pDPLDH-1 beskrevet i Eksempel 3-3 ble deponert ved The International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, den 12. april 2000. Katalognummer er FERM BP-7545.
Gen og protein
Det tilveiebringes en D-fenylmelkesyre dehydrogenase og et gen derav.
Et enzym virker på 2-okso-3-fenylpropionisk syre (noen ganger benevnt som «fenylpyrodruesyre» heretter) og reduserer den til å omdannes til (R)-2-hydroksy-3-fenylpropionisk syre. Derivater eller analoger av D-fenylmelkesyre kan fremstilles ved tidligere å modifisere substratet, fenylpyrodruesyre.
Eksempler av derivater av D-fenylmelkesyre inkluderer p-aminofenylmelkesyre, p-nitrofenylmelkesyre, og p-hydroksy-fenylmelkesyre. I dette tilfellet kan f.eks. p-aminofenylpyrodruesyre, p-nitrofenylpyrodruesyre og p-hydrok-syfenylpyrodruesyre anvendes som et substrat for å syntetisere D-fenylmelkesyrederivater.
Eksempler på analoger av D-fenylmelkesyre inkluderer (R)-2-hydroksy-4-fenylsmørsyre som anvendes som et materiale for antihypertensjonsmiddel. I dette tilfellet kan f.eks. 2-okso-4-fenylsmørsyre anvendes som et substrat for syntese av D-fenylmelkesyreanalogen.
I sekvens (b) kan antallet modifiseringer f.eks. være én til flere, mer spesifikt 1-6.
I sekvens (e) kan antallet modifiseringer f.eks. være én til flere dusin.
I sekvens (b) og sekvens (e) kan multiple modifiseringer, som kan være de samme eller forskjellige, introduseres. Sekvens (d) kan ha fortrinnsvis minst 80%, mer fortrinnsvis minst 90%, og mest fortrinnsvis minst 95% homologi til DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1.
I sekvens (f) angir termen «stringente betingelser» at en membran etter hybridisering vaskes ved en høy temperatur i en løsning av lav saltkonsentrasjon, f.eks. ved en 0,2xSSC-konsentrasjon (lxSSC:15 mM trinatriumcitrat, 150 mM natriumklorid) i en 0,1% SDS-løsning ved 60°C i 15 min.
For sekvens (b) kan det avgjøres om «den har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet» eller ikke, ved f.eks. å tilveiebringe et substrat for D-fenylmelkesyre dehydrogenase (f.eks. fenylpyrodruesyre) og et reduksjonstypeko-enzym, dvs. nikotinamid-adenin-nukleotidfosfat (NADPH), reagere et protein som skal testes, og deretter måle den fysiokjemiske forandring generert av enzymreaksjonen, så som en forandring i optisk tetthet av nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfatet og/eller en kvantitativ forandring i produktet, dvs. D-fenylmelkesyre (se Eksempel 3).
For sekvensene (d), (e) og (f) kan det evalueres om de «koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet» eller ikke, f.eks. undersøkes ved å uttrykke en nukleotidsekvens som skal testes i en vert, reagere det resulterende protein med et substrat for D-fenylmelkesyre dehydrogenase (f.eks. fenylpyrodruesyre) og et reduksjonstype-ko-enzym, dvs. nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) og deretter måle fysiokjemiske forand-ringer generert av enzymreaksjonen, så som en forandring i optisk tetthet av nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat og/ eller en kvantitativ forandring i produktet, dvs. D-fenylmelkesyre (se Eksempel 3).
Gitt aminosyresekvensen av et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan nukleotidsekvensene som koder for denne enkelt bestemmes, og forskjellige nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensen avbildet i SEKV. ID. NR. 2 kan selekteres. Således omfatter nukleotidsekvensene som koder for et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse enhver DNA-sekvens som koder for den samme aminosyresekvens og har degenerative kodoner, i tillegg til en del-eller alle av DNA-sekvensene i SEKV. ID. NR. 1, og videre inkludere RNA-sekvenser korresponderende til disse sekvenser.
Opprinnelsen til et enzym og et gen i samsvar med foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset, og enhver mikroorganisme som kan produsere et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan anvendes; substans PF1022-produserende mikroorganisme ( Mycelia sterilia, FERM BP-2671 er foretrukket).
Den N-terminale aminosyresekvens av et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan bestemmes, f.eks. ved å applisere enzymer på SDS-polyakrylamid-elektroforese, elektrisk overføre det resulterende enzymbånd til en poly-vinylidenfluorid (PVD)-membran eller lignende, og deretter analysere det med en proteinsekvenserings-maskin.
Den indre aminosyresekvens av et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan bestemmes f.eks. ved delvis oppkutting av enzymet med en proteinase eller lignende, og deretter utføre de ovenfor angitte trinn etter SDS-polyakrylamid-gelelektroforese og et isoleringstrinn ved anvendelse av revers fasekromatografi.
Et gen i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan oppnås f.eks. som følger.
Et genomisk DNA ekstraheres fra en substans PF1022-produserende mikroorganisme og spaltes med egnede restrik-sjonsenzymer, hvoretter et bibliotek omfattende det genomiske DNA av substans PF1022-produserende mikroorganisme konstrueres ved anvendelse av en fag-vektor.
Alternativt kan totalt RNA ekstraheres fra substans PF1022-produserende mikroorganisme, cDNA korresponderende til mRNA fremstilles av en revers transkriptasereaksjon ved anvendelse av en oligo-dT som en primer, hvoretter et bibliotek omfattende cDNA'en av substansen PF1022-produserende mikroorganisme konstrueres ved anvendelse av en fag-vektor .
Egnede primere syntetiseres basert på den N-terminale aminosyresekvens og den interne aminosyresekvens i D-PLDH. Polymerasekjedereaksjonen (PCR) utføres ved anvendelse av disse primere, og det genomiske DNA eller cDNA avledet fra substansen PF1022-produserende mikroorganisme som et templat, og således mangfoldiggjøres DNA-fragmentet av D-PLDH-genet. Det genomiske bibliotek eller cDNA-biblioteket screenes ved anvendelse av dette DNA-fragment som en probe. På denne måte kan hele regionen av D-fenylmelkesyre dehydrogenasegenet eller en region nødvendig for ekspresjon isoleres. Etter bestemmelse av basesekvensene for disse DNAfragmenter, kan egnede restriksjonsenzym-spaltingssteder introduseres oppstrøms for translasjons-start-kodon og nedstrøms for translasjonsstopp-kodon med PCR eller lignende for å oppnå et genfragment som inne-holder D-fenylmelkesyre dehydrogenasegenet eksklusivt.
Rekombinant vektor
Det tilveiebringes en rekombinant vektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for D-fenylmelkesyre dehydrogenase .
Fremgangsmåten og metoden for å konstruere en rekombinant vektor i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan være enhver av dem som vanligvis anvendes innen feltet genetisk engineering.
Eksempler på vektoren som anvendt heri inkluderer vektorer som kan inkorporeres i et vertskromosom-DNA, og vektorer som har en selvreplikerbar autonom replikasjonssekvens som kan foreligge som et plasmid i en vertscelle, f.eks. pUV-vektorer (f.eks. pUC18 og pUC118), pBluescriptvektorer (f.eks. pBluescript II KS+), og plasmider så som pBR322. Én eller flere kopier av genet kan foreligge i en vertscelle .
En rekombinant vektor kan konstrueres f.eks. ved operativt å ligere en promotor og en terminator, oppstrøms- og ned-strøms for nukleotidsekvensen som koder for en D-fenylmelkesyre dehydrogenase, respektivt, og dersom ønskelig operativt ligere en genmarkør og/eller andre regulatoriske sekvenser.
Ligering av en promotor og en terminator til et gen i samsvar med foreliggende oppfinnelse og innsetting av en ekspresjonsenhet til en vektor kan utføres med kjente me-toder.
En promotor og en terminator som kan anvendes er ikke begrenset. Eksempler inkluderer regulatoriske sekvenser av gener av glykolyseenzymer, så som 3-fosfoglycerat-kinase og glutaraldehyd-3-fosfat dehydrogenase; regulatoriske sekvenser av gener av aminosyresyntetiserende enzymer, så som tryptofansyntase; regulatoriske sekvenser av gener av hydrolytiske enzymer, så som amylase, protease, lipase og cellulase; regulatoriske sekvenser av gener for oksida-sjonsreduksjonsenzymer, så som nitratreduktase, orotidin- 5'fosfat dehydrogenase og alkohol dehydrogenase, og regulatoriske sekvenser av gener avledet av en substans PF1022produserende mikroorganisme, så som Abpl beskrevet i WO 01/18219A1, som er sterkt uttrykt i substansen PF1022-produserende mikroorganisme.
Et protein ifølge foreliggende oppfinnelse kan uttrykkes som et fusjonsprotein ved å ligere et gen i samsvar med foreliggende oppfinnelse til et fremmed gen som koder for en translasjonsregion i et annet protein.
Introduksjonen av en genmarkør kan utføres f.eks. ved å introdusere et egnet restriksjonsenzymspaltingssete inn i en regulatorisk sekvens med en PCR-metode, innsette denne inn i en plasmidvektor, og ligere et selektivt markørgen som et medikamentresistent gen og/eller et gen komplemen-terende til et ernæringskrav.
En selektiv markør kan hensiktsmessig selekteres avhengig av teknikken for å selektere en transformant. F.eks. kan et medikamentresistent gen eller et gen komplementært til et ernæringskrav anvendes. Eksempler på det medikament-resistente genet inkluderer gener som gir resistens til destomycin, benomyl, oligomycin, hygromycin, G418, pleo-mycin, fosfinotricin, ampicillin, kanamycin eller lignende. Eksempler på gener som komplementerer et ernæringsmessig krav inkluderer argB, pyr4, trpC, TRP1, niaD, LEU2 og URA3.
Produksjon av transformant og D- fenylmelkesyre dehydrogenase
I samsvar med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en vert transformert med den ovenfor angitte vektor.
En vert som kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke bestemt begrenset, og enhver mikroorganisme som kan anvende en vert for genetisk rekombinasjon kan be-nyttes . Eksempler på verten som kan anvendes inkluderer mikroorganismer, nemlig visse bakterier eller fungi, fortrinnsvis Escherichia coli, lactobacillus, aktinymycetes, gjær og filamentøs fungi, nærmere bestemt filamentøs fungi som kan produsere substansen PF1022, og mest fortrinnsvis stammen PF1022 ( Mycelia sterilia, FERM BP-2671) og varian-ter derav.
En rekombinant vektor for genekspresjon kan introduseres inn i en vert med en ordinær metode. Eksempler på fremgangsmåten for introduseringen inkluderer elektro-poreringsmetoder, polyetylenglykolmetoder, aglobakterie-metoder, litiummetoder og kalsiumkloridmetoder. En fremgangsmåte som er egnet for hver vert kan selekteres. Poly-etylenglykolmetoden er foretrukket idet en substans PF1022 produserende mikroorganisme anvendes som en vert.
En transformant kan dyrkes i samsvar med en enhver ordinær metode ved å anvende et medium, dyrkningsbetingelser og lignende som er hensiktsmessig selektert. Som et medium kan konvensjonelle komponenter anvendes. Som en karbon-kilde kan det anvendes glukose, sukrose, stivelsessirup, dekstrin, stivelse, glyserol, molasses, animalske- og vegetabilske oljer, og lignende. Som nitrogenkilde kan det anvendes organiske eller uorganiske nitrogenforbindelser så som soyabønne-pulver, hvetekim, farma-media, cornsteep-liquor, bomullsfrø, buljong, polypepton, maltekstrakt, gjærekstrakt, ammoniumsulfat, natriumnitrat og urea. Dersom nødvendig kan natrium, kalsium, magnesium, kobolt, klorin, fosforsyre, svovelsyre og andre uorganiske salter som kan produsere ioner, så som kaliumklorid, kalsiumkar-bonat, dikaliumhydrogenfosfat, magnesiumsulfat, mono-kaliumfosfat, sinksulfat, manganes-sulfat, og kobber- sulfat, effektivt tilsettes. Dersom nødvendig kan forskjellige vitaminer så som tiamin (f.eks. tiaminhydro-klorid), aminosyrer så som glutaminsyre (f.eks. natrium-glutamat) og asparagin (f.eks. DL-asparagin), nuklein-syrekomponenter så som nukleotider, og selektive medika-menter så som antibiotika tilsettes. Videre kan organiske og uorganiske substanser hensiktsmessig tilsettes for å fremme mikrobiell vekst og for å styrke produksjon av et enzym ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dyrkningen kan utføres ved en ristekulturmetode under en aerob betingelse, en agiteringsdyrkningsmetode med lufting, eller en aerob neddykket dyrkningsmetode. Spesielt kan en aerob neddykket dyrkningsmetode være fordelaktig. Noen verter kan dyrkes med en aerob dyrkningsmetode.
Et pH-område for medium er f.eks. 6-8. Dyrkningen kan utføres ved en ristedyrkningsmetode under en aerob betingelse, eller en agiteringsdyrkningsmetode med lufting. En egnet dyrkningstemperatur er lS^C til 60<*>0, fortrinnsvis ca. 20°C til 40°. Dyrkningstid er f.eks. 60-240 timer, fortrinnsvis ca. 8-168 timer.
Dyrkningen termineres idet mengden av D-fenylmelkesyre dehydrogenase i medium når dets topp, og D-fenylmelkesyre-dehydrogenase isoleres og renses fra kulturen.
Et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan isoleres og renses fra kulturen ved å knuse de dyrkede mikrobielle celler og behandle den resulterende cellefrie ekstrakt ved anvendelse av ordinære rensemetoder. F.eks. knuses mikrobielle celler gjenvunnet ved sentrifugering eller filtrering av kulturen ved fysiske måter, f.eks. ved ultrasonisk behandling, anvendelse av sjøsand, eller en morter og støter, eller en maler ved anvendelse av en ballmølle, en Frenchpress, en fryse-crusher, en blander, en mikser eller lignende, hvoretter debris fjernes ved sentrifugering for å oppnå et cellefritt ekstrakt. I tilfellet hvor cellene gjenvunnet fra kulturen ved sentrifugering eller filtrering ikke umiddelbart knuses, kan disse lagres ved frysing eller lyofilisering, og knuses ved behov. Deretter kan et enzym som har aktiviteten oppnås ved å behandle det cellefrie ekstrakt ved anvendelse av ordinære rensemetoder, så som ammonium-sulfatfraksjoneringsmetoden, en ionebyttekromatografi-metode, en affinitetskromatografimetode, en adsorpsjons-kromatografimetode og en gelfiltreringsmetode, enkeltvis eller i kombinasjon.
I samsvar med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et masseproduksjonssystem for D-fenylmelkesyre dehydrogenase. Eksempler på en vert som kan anvendes som et system for masseproduksjon av D-fenylmelkesyre dehydrogenase inkluderer Escherichia coli, lactobacillus, aktinomycetes, gjær og filamentøs fungi.
Et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse trans-formerer fenylpyrodruesyre til D-fenylmelkesyre. På den andre side syntetiseres substansen PF1022 fra 4 molekyler av L-leucin, 2 molekyler av D-melkesyre og 2 molekyler av D-fenylmelkesyre ved et syklisk depsipeptid-syntetiserende enzym. Således korresponderer D-fenylmelkesyre som et råmateriale for syntetisering av substansen PF1022. Derfor kan substansen PF1022 produseres i store mengder dersom D-fenylmelkesyre er rikelig uttrykt i substansen PF1022-produserende mikroorganisme. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et masseproduksjonssystem for substansen PF1022, kjennetegnet ved at systemet transformeres slik at det uttrykker et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Substansen PF1022 er nyttig som et ormefor- drivende middel for dyr (T. Sasaki, et al., J. Antibiotics, (1992) vol 45, p 692)).
En substans PF1022-produserende mikroorganisme som er nyttig som et system for masseproduksjon av substans PF1022 er fortrinnsvis en substans PF1022-produserende filamentøs fungi, mest fortrinnsvis substansen PF1022-produserende stamme Mycelia sterilia (FERM BP-2671).
En PF1022-produserende mikroorganisme kan videre transformeres av et som ikke er et enzymgen i samsvar med foreliggende oppfinnelse. F.eks. kan produksjonen av substans PF1022 forbedres ved å introdusere et gen av et enzym som virker i reaksjonsskjemaet for syntetisere substansen PF1022, noen ganger sammen med en egnet promotor. Et eksempel på et slikt gen er et syklisk depsipeptidsyntetiserende enzym (WO 01/18179A1).
I en vert som ikke syntetiserer et substrat hvorpå et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse virker, dvs. fenylpyrodruesyre, derivat eller homolog substans derav, D-fenylmelkesyre, derivat eller homolog substans derav kan produseres ved å tilsette det manglende substrat, derivat eller homolog substans av substratet til kulturen eller ved å transformere verten med et gen som koder for det manglende substrat, derivat eller homolog substans av substratet. Et eksempel på et slikt enzymgen er et gen involvert i biosyntesereaksjonsveien fra korismisk syre til p-aminofenylpyrodruesyre (WO 01/23542A1).
I en vert hvori genet er involvert i den biosyntetiske reaksjonsvei fra korismisk syre til p-aminofenylpyrodruesyre, syntetiseres p-aminofenylpyrodruesyre og et enzym i samsvar med foreliggende oppfinnelse omdanner p-aminofenylpyrodruesyre til p-aminofenylmelkesyre. Som et resultat utgjør den omdannede p-aminofenylmelkesyre et råmateriale for substans PF1022-produksjonen, slik at et substrat PF1022-derivat hvori en benzenring modifiseres med en aminogruppe ved para-posisjon, dvs. [syklo (D-laktyl-L-Nmetylleucyl-D-3-(4-aminofenyl)laktyl-L-N-metylleucyl-D-laktyl-L-N-metylleucyl-D-3-fenyllaktyl-L-N-metylleucyl) ] syntetiseres. Et substans-PF1022-derivat modifisert med en funksjonell gruppe så som en aminogruppe er nyttig som råmateriale for å syntetisere et sterkt aktivt substans-PF1022-derivat.
En rekombinant vektor anvendt for transformasjon er fortrinnsvis en ekspresjonsvektor hvor en regulatorisk sekvens (f.eks. promotor og terminator) som fungerer i PF1022-produserende mikroorganisme, er operativt ligert til et enzymgen i samsvar med foreliggende oppfinnelse, eller mest fortrinnsvis en ekspresjonsvektor hvori en regulatorisk sekvens, som fungerer i stammen PF1022 ( Mycelia sterilia, FERM BP-2671), er operativt ligert til et enzymgen i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Eksempel på en nyttig promotor for å forsterke ekspre-sjonen er Abpl-promotor (WO 01/18219A1).
EKSEMPEL
Den foreliggende oppfinnelse illustreres videre ved hjelp av de påfølgende eksempler som ikke er tiltenkt å begrense oppfinnelsen.
Eksempel 1: Isolering og rensing av D- PLDH
1. Fremstilling av mikrobielle celler.
Substansen PF1022-produserende mikroorganisme ( Mycelia sterilia, FERM BP-2671) ble underlagt UV-bestråling eller NTG-behandling for å indusere mutering, og den resul terende substans PF1022-produserende stamme 432-26, hvor PF1022-produktiviteten var forbedret, ble inokulert i 50 ml såmedium [1% gjærekstrakt, 1% maltekstrakt, 2% polypepton, 2,5% glukose, 0,1% dikaliumhydrogenfosfat, 0,05 magnesiumsulfat (pH 7,0)] (WO 01/18179A1) i en egnet beholder, og dyrket ved 26<<>>C i 3 dager med risting for å fremstille en primær såkultur. Denne kultur ble inokulert inn i 500 ml medium beskrevet i WO 97/20945 i en egnet beholder, og inkubert ved 2 6*0 i 3 dager ved anvendelse av en rotasjonsrister for å fremstille en sekundær såkultur. Denne kultur ble inokulert inn i 500 ml av det samme medium i en egnet beholder, og inkubert ved 26<*>0 i 4-6 dager ved anvendelse av en rotasjonsrister. Etter dyrkning, ble den resulterende kultur filtrert med sug ved anvendelse av kommersiell nylonduk og en Buchner-trakt og på samme tid ble mikrobielle celler vasket med deionisert vann. En kake av mikrobielle celler ble oppnådd og umiddelbart frosset ved -SO^C og tørket i en frysetørker i 2 netter. De frysetørkede celler således fremstilt, ble lagret ved -80°C i en lufttett beholder.
2. Ekstrahering og rensing av D-PLDH.
En blanding av 2 jil 0,1 M f enylpyrodruesyre, 2 fil 0,1 M NADPH, bufferløsning A (10 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, pH=8) og et valgfritt volum av en enzymprøveløsning for å utgjøre et totalt volm av 100 \ il ble reagert ved 26<>C i 2 timer. Etter terminering av reaksjonen ved varmebehandling ble reaksjonsløsningen analysert ved anvendelse av HPLC (kolonne: L-kolonne ODS 4,6 0x150 mm (Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan), mobilfase: 0,1 M natrium-sulfat: acetonitril (3,9:1) isokratisk, gjennomstrømnings-hastighet: 1 ml/min., temperatur: 40<,C, UV-deteks j on: 210 nm)) og mengden av fenylmelkesyre produsert ble defi-nert som aktiviteten av dette enzym. Videre ble optisk aktivitet av enzymreaksjonsproduktet analysert ved anvendelse av en annen HPLC (kolonne: CHIRALPAK WH 0,4 6 0x25 cm (Daicel Chemical Industries, Ltd.), mobilfase: vandig 25 mM kobbersulfatløsning, gjennomstrømnings-hastighet: 1 ml/min., temperatur: 4CC, UV-deteksjon: 210 nm) .
De følgende trinn ble alle utført ved A°C. Ca. 40 g frysetørkede celler oppnådd i Eksempel 1-1 ble malt natten over i en ballmølle (ytre diameter av panne: 210 0 mm, balldiameter: 35 0 mm, Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.). Det resulterende finfordelte cellepulver ble grundig suspendert i 1,5 1 av en ekstraheringsbufferløsning (50 mM Tris-HC1, 10 mM DTT, 50 mM kaliumklorid, pH=8), tilsatt til cellene. Cellesuspensjonen ble forsiktig omrørt i ca. 1 time ved anvendelse av en magnetisk rører. Deretter ble cellesuspensjonen sentrifugert ved 8000 rpm i 30 min., for å gjenvinne ca. 1,2 liter supernatant ved anvendelse av en høyhastighetsavkjølt sentrifuge SCR20B (rotor nr RPR9, Hitachi Koki Co., Ltd.). Den gjenvunnede supernatant ble påført en kolonne (26 0x300 mm) fylt med Red Sepharose CL6B (Amersham Pharmacia) som en vehikkel. Kolonnen ble vasket med bufferløsning A inntil en ikke-adsorbert fraksjon ble fullstendig fjernet, hvoretter et protein eluert med bufferløsning A inneholdende 1 M kaliumklorid ble fraksjonert. En sammenstilt aktiv fraksjon ble underlagt gelkromatografi ved anvendelse av en kolonne (26 0x950 mm) fylt med Superdex 200 (Amersham Pharmacia), som en vehikkel. Den aktive fraksjon ble umiddelbart applisert på MonoQ10/10 (Amersham Pharmacia). Etter vasking av kolonnen med bufferløsning A, ble adsorberte proteiner eluert ved anvendelse av 0-0,3 M kaliumkloridgradient. Den resul terende sammenføyde aktive fraksjon ble fortynnet 10 ganer med bufferløsning A og ble forsynt til en kolonne (16 0x100 mm) fylt med AMP-agarose (Amersham Pharmacia). En ikke-adsorbert fraksjon ble gjenvunnet, og umiddelbart forsynt på en kolonne (5 0x50 mm) fylt med hydroksyapa-titt. En ikke-adsorbert fraksjon ble gjenvunnet, og adsorbert igjen på MonoQ10/10. Proteiner ble eluert ved anvendelse av 0-0,2 M kaliumkloridgradient. Polyakrylamid-elektroforese at den aktive fraksjon inneholdt omtrent et enkelt protein med en molekylvekt på ca. 38 kDa. 3. Bestemmelse av interndel aminosyresekvens av D-PLDH.
Proteinet oppnådd i Eksempel 1-2 ble konsentrert og isolert ved anvendelse av SDS-polyakrylamidgelelektro-forese, og elektrisk overført på en PVDF-membran. Proteinet overført på PVDF-membranen ble farget med Coomassie Brilliant Blue for å bekrefte dets nærvær og lokalisering. Et stykke av PVDF-membranen hvor proteinet var til stede ble kuttet ut og underlagt analyse av N-terminale aminosyresekvens ved anvendelse av en protein-sekvenserer, som imidlertid resulterte i feil.
Proteinet oppnådd i Eksempel 1-2 ble konsentrert og isolert ved anvendelse av SDS-polyakrylamidgelelektro-forese og gelen ble farget med Coomassie Brilliant Blue. Et stykke av gelen inneholdende proteinet av interesse ble kuttet ut. Denne gel ble repeterende vasket med 200 \ il av en avfargingsløsning (0,2 M ammoniumbikarbonat, 50% acetonitril, pH=8,0) i et lite testrør for å vaske ut Coomassie Brilliant Blue fra gelen, hvoretter gelen ble tørket under redusert trykk. Til den halvtørre gel ble det tilsatt 5 \ il av bufferløsning B (0,2 M ammoniumbikarbonat, 0,02% Tween 20, pH=8) og deretter et 1/100 molart volum av trypsin. Samblandingen fikk stå til henstand i ca. 10 min. for å dispersere enzymet i gelen, hvoretter 200 \ il buf f erløsning B ble tilsatt og proteinet oppkuttet med enzymet ved 37<*>C i 48 timer. Enzymreaksjonen ble terminert ved trifluoreddiksyre, og reaksjonsløsningen ble gjenvunnet. Gelen ble grundig vasket med 200 fil vaskeløsning (0,1% trifluoreddiksyre, 60% acetonitril) og vasken ble blandet med tidligere gjenvunnet reaksjonsløsning. Vaskingen ble ytterligere repetert 2 ganger for å gjenvinne trypsin-kuttet. Det gjenvunnede trypsinoppkuttete ble tørket under redusert trykk, hvoretter 60 (il destillert vann ble tilsatt for å lage en peptidfragmentprøve oppkuttet av trypsin. Denne prøve ble underlagt kromatografi for fraksjonering (kolonne: C18, 0,21 0x220 mm, gradient: 0,1% trifluoreddiksyre, 5% acetonitril -0,085% trifluoreddiksyre, 35% acetonitril) ved anvendelse av et Modell 172 jt-preparativt HPLC-system (Perkin-Elmer Applied Biosystem). Av peptid-fragmenttoppene som ble oppnådd ble to peptidfragmenter analysert for aminosyresekvenser og de følgende sekvenser ble bestemt.
Eksempel 2: Isolering av cDNA for D- PLDH
1. Isolering av cDNA og konstruksjon av cDNAbibliotek.
Substans PF1022-produserende mikroorganisme ( Mycelia sterilia , FERM BP-2671) ble underlagt UV-bestråling eller NTG-behandling for å indusere mutering, og den resulterende substans PF1022-produserende stamme 432-26, hvor PF1022produktiviteten var forbedret, ble inokulert i 10 ml såmedium [1% næringsstoff, 1% maltekstrakt, 2% polypepton, 2,5% glukose, 0,1% dikaliumhydrogenfosfat, 0,05% magnesiumsulfat (pH=7,0)] (WO 01/18179A1) i et testrør, og inkubert ved 26<>C i 3 dager med risting. Såkulturen ble inokulert i 50 ml av medium beskrevet i WO 97/20945 i en egnet beholder, og inkubert ved 2 6<>C i 6 dager ved anvendelse av en rotasjonsrister, hvoretter cellene ble gjenvunnet med sentrifugering. Cellene som ble oppnådd på denne måte ble frosset med nitrogen i væskeform, og deretter knust med en morter og støter. Total RNA ble isolert fra de knuste cellene ved anvendelse av ISOGEN (Nippon Gene) i samsvar med den vedlagte protokoll. Videre ble mRNA renset fra hel-RNA ved anvendelse av mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia) i samsvar med vedlagte protokoll.
cDNA ble syntetisert fra mRNA ved anvendelse av en Time Saver cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia) i samsvar med vedlagte protokoll. Dette cDNA ble innsatt i en fag-vektor, Lambda ZAP II (Stratagene Co.). Den rekombinante fagvektor som ble oppnådd ble underlagt in vitro-pakking ved anvendelse av Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene Co.) i samsvar med vedlagte protokoll. Deretter ble Escherichia coli XLl-Blue MRF'-stamme infisert med dette rekombinante fag, og dyrket på en plate for å danne plakk. cDNA-biblioteket som ble konstruert hadde en plakk-dannende enhet på 6,8xl0<8>. Videre ble dette cDNA-bibliotek mangfoldiggjort i samsvar med protokoll med-følgende Lambda ZAP II. Escherichia coli XLl-Blue MRF'-stamme ble infisert med det rekombinante fag i dette mang-foldiggjorte cDNA-bibliotek og dyrket på en plate for å danne plakk.
2. Isolering av partielt DNA-fragment av D-PLDH-gen.
De følgende to primere ble syntetisert basert på sekvensene av peptidfragmentene 1 og 2 oppnådd i Eksempel 1-3.
Ved anvendelse av disse primere ble PCR utført ved å benytte det genomiske DNA isolert fra substansen PF1022-produserende mikroorganisme (FERM BP-2671) som et templat, ved fremgangsmåten beskrevet i WO 01/18179A1. PCR ble ut-ført i 100 (il reaksjonsløsning ved anvendelse av 80 ng genomisk DNA som et templat, og ved tilsetning av 2,5 enheter av ExTaq DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), de medfølgende bufferløsninger og dNTP-blanding, og de to typer primere hver med en final konsentrasjon på 0,5 |iM, under følgende betingelser: ved 94^ i 5 min. [ved 94^ i 1 min., ved 58°C i 1 min., ved 72<*>C i 30 sek.] x 40 sykluser, og ved 72<*>C i 7 min.; lagring ved 4^. Analyse av reak-sjonsløsningen ved hjelp av 2% agarosegel-elektroforese viste at et DNA-fragment på ca. 550 bp ble mangfoldiggjort. Dette DNA-fragment ble gjenvunnet fra agarosegelen ved anvendelse av en kommersiell Sephaglas Band Prep Kit (Amersham Pharmacia). Det gjenvunnede DNA-fragment og pT7Blue T-Vector (Novagen, Inc.) ble ligert ved anvendelse av et DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) i samsvar med medfølgende protokoll.
Basissekvensen av DNA-fragmentet som ble klonet ble bestemt ved anvendelse av et DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) og et ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer) i samsvar med medfølgende protokoll. Som et resultat viste basesekvensen seg for det isolerte DNA-fragment å være homolog til det D-a-keto-syre-spesifikke dehydrogenasegen, og var meget sannsynlig en del av D-PLDH-genet av interesse.
3. Kloning av hele regionen av cDNA av D-PLDH.
De følgende to primere ble nylig syntetisert basert på sekvensene i DNA-fragmentene oppnådd i Eksempel 2-2.
Et PCR-produkt, som ble mangfoldiggjort med PCR med primeren 3 og primer 4 ved anvendelse av DNA-fragmentet oppnådd i Eksempel 2-2 som et templat, ble anvendt som en probe i screening av cDNA-biblioteket. PCR'en ble utført i 100 (il reaksjonsløsning ved anvendelse av 500 ng pT8Blue plasmid vector, hvori DNA-fragmentet oppnådd i Eksempel 2-2 ble innsatt, som et templat, og tilsetning av 2,5 enheter av ExTaq DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), den medfølgende bufferløsning og dNTP-blandingen, og de to typer primere hver i en final konsentrasjon på 0,5 (|M, under følgende betingelser: ved 94<*>0 i 5 min., [ved 94<*>0 i 1 min., ved 60°C i 1 min., ved 72<>C i 30 sek.] x 40 sykluser, og ved 72<>C i 7 min.; lagring ved 4<>C. Den resulterende reaksjonsløsning ble underlagt 2% agarosegelelektroforese, som bekreftet nærvær av et DNA-fragment på ca. 530 bp. Dette DNA-fragment ble gjenvunnet fra agarosegelen ved anvendelse av Sephaglas Band Prep Kit (Amersham Pharmacia). Det gjenvunnede DNA-fragment ble merket ved anvendelse av ECL Direct DNA/RNA LAbeling Detecting System (Amersham Pharmacia) i samsvar med vedlagte protokoll, og anvendt som en nukleinsyreprobe for hybridisering.
En blotte-membran Hibond N+ (Amersham Pharmacia) ble plassert på platen fremstilt i Eksempel 2-1, hvorpå plakk ble dannet, for å kopiere plakkene. Denne membran ble be handlet i samsvar med metoden ifølge Makabe (Kazuhiro Makabe, Visual Experimental Note Series, Biotechnology Experiments Illustrated, 1997, vol 4, i Cell Technology SUpp., pp 125-133, utgitt av Shujunsha) for å immobilisere DNA'en til membranen. I denne behandling ble membranen vasket med 5xSSC. Ved anvendelse av et ECL Direct DNA/RNA Labeling Detecting System (Amersham Pharmacia) ble den merkede nukleinsyreprobe og fag-DNA'en immobilisert på membranen, hybridisert i samsvar med vedlagte protokoll, og deretter ble plakkene hvori den merkede nukleinsyre var hybridisert detektert. På denne måte ble en positiv fag inneholdende en 5'-oppstrømsregion og en 3'-nedstrøms-region homolog til proben selektert.
Den positive fag ble behandlet i samsvar med protokollen vedlagt Lambda ZAP II (Stratagene Co.) for å fremstille et plasmid hvori cDNA-genet for D-PLDH var innsatt.
4. Bestemmelse av basesekvens.
Sekvensering ble utført ved anvendelse av plasmidet, hvori cDNA-genet for D-PLDH som var isolert, var innsatt, som et templat, og primer 5: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEKV.
ID. NR. 9), og/eller primer 6: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'
(SEKV. ID. NR. 10) ble benyttet som primere. Sekven-seringen ble utført av et DNA Sequencing Kit dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) og et ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer) i samsvar med vedlagte protokoll. Fra de resultatene som ble oppnådd, ble regioner hvor basesekvensene ikke var kjent videre underlagt sekvensering ved anvendelse av primere nylig designert basert på allerede sekvenserte base-sekvenser. På denne måte ble basesekvensen for 1509-bp cDNA-genet for D-PLDH innsatt i plasmidet, bestemt.
Analysen av denne sekvens viste at en 1011-bp åpen lese-ramme (ORF) var til stede. Proteinet ekstrapolert fra denne ORF hadde 336 aminosyreenheter og en molekylvekt på 36,5 kDa, og var homolog til D-melkesyre dehydrogenase, eller lignende. Den høyeste homologi ble vist med glycerat dehydrogenase og homologien var 37%. Basesekvensen og aminosyresekvensen av ORF'en for D-PLDH-genet ifølge foreliggende oppfinnelse som således var isolert er vist i SEKV. ID. NR. 1 og SEKV. ID. NR. 2 i sekvenslisten, respektivt.
Eksempel 3: Masseproduksjon av D- PLDH ved masse-ekspresjon av D- PLDH- genet.
1. Fremstilling av D-PLDH-genet for genekspresjon.
PCR ble utført ved anvendelse av plasmidet fremstilt i Eksempel 2-3 som et templat, primer 7: 5'-AAGCTTGTAAGGAGA-TATACATGGCCCAAGCACAACAA-3' (SEKV. ID. NR. 11) hvortil var tilsatt et Hindlll-sete ved 5'-enden, et stoppkodon rett bak, og ytterligere et ribosombindende sete like bak, og primer 8: 5'-ATGCAAGCTTTAGTAACCCTATACTTGG-3' (SEKV. ID.
NR. 12) hvortil kun et Hindlll-sete ble tilsatt ved 5'-enden, for å mangfoldiggjøre D-PLDH-genet hvori Hindlll-seter ble introdusert til begge ender. PCR'en ble utført i 20 fil reaksjonsløsning ved anvendelse av 80 ng av plasmid-DNA som et templat, 1 enhet TaKaRa LA-Taq DNApolymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), den medfølgende bufferløsning og dNTP-blanding, 25 mM magnesiumklorid og 100 pM primere, under de følgende betingelser: ved 94<*>0 i 1 min. [ved 98aC i 15 sek., ved 68°C i 3 min.] x 30 sykluser, og ved 72°C i 10 min. Den resulterende reaksjonsløsning ble underlagt 1% agarosegelelektroforese for å bekrefte nærvær av et ca. 100-bp DNA-fragment, som ble gjenvunnet fra agarosegelen ved anvend-else av et Sephaglas Band Prep Kit (Amersham Pharmacia). Det gjenvunnede PCR-produkt og pT7B BlueT- Vector (Novagen, Inc.) ble ligert ved anvendelse av et DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) i samsvar med vedlagte protokoll. Et plasmid ligert med DF-PLDH ble introdusert inn i Escherichia coli DH 5a og mangfoldiggjort, og plasmid DNA'et ble gjenvunnet ved anvendelse av Concert Rapid Plasmid Purification Systems (Gibco BRL Products).
Gensekvensen for D-PLDH som ble mangfoldiggjort på denne måte ble bekreftet ved anvendelse av primeren avledet fra D-PLDH-genet anvendt i Eksempel 2-4 og en primer avledet fra basesekvensen fra pT7-plasmidvektoren. Sekvensering ble utført ved anvendelse av en DNA Sequencing Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PerkinElmer) og en ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer) i samsvar med vedlagte protokoll.
Etter bekreftelse av sekvensen, ble 24 (il av en DNAløsning inneholdende pT7-plasmidvektoren hvortil ca. 12 (ig av D-PLDH-genet ble ligert, 3 (il av Hindlll (Toyobo Co., Ltd.), og 3 (il av den tilhørende bufferløsning grundig blandet, og blandingen ble reagert ved 37<*>C i 18 timer. Deretter ble reaksjonsløsningen underlagt 1% agarosegelelektroforese for å bekrefte et ca. 1000-bp DNA-fragment. Dette fragment ble gjenvunnet fra agarosegelen ved anvendelse av Sephaglas Band Prep Kit (Amersham Pharmacia) for å oppnå D-PLDH-genet for ekspresjon.
2. Konstruksjon for genekspresjonsvektor.
En løsning inneholdende ca. 2,5 (ig kommersiell pUC119 (Takara Chuzo Co., Ltd.) ble reagert med Hindlll (Toyobo Co., Ltd.) og den medfølgende bufferløsning ved 37<*>C i 18 timer, hvoretter DNA ble gjenvunnet ved fenolekstrahering. Til denne DNA ble det tilsatt 3 (il alkalisk fosfatase C75
(Takara Shuzo Co., Ltd.), 3 (il av den vedlagte bufferløs-ning, og 24 (il sterilt vann, og deretter ble blandingen reagert ved 50°C i 30 min. for å fjerne den terminale fosforsyre. Det defosforylerte DNA ble gjenvunnet ved fenolekstrahering og oppløst i 3 (il TE-buf f erløsning (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8). Plasmid pDPLDH-1 ble konstruert ved å ligere 5 (il av D-PLDH-gen for ekspresjon fremstilt i Eksempel 3-1 og 0,5 (il av pUC119-vektoren som ble oppkuttet med Hindlll og defosforylert ved termini, ved anvendelse av et DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) i samsvar med vedlagte protokoll (Fig. 1).
3. Ekspresjon av D-PLDH i Escherichia coli.
Celler av Escherichia coli DH 5a (Toyobo Co., Ltd.)
hvori dDPLDH-1 ble introdusert, ble spredt på et LB-agar-medium inneholdende 50 (tg/ml ampicillin. Etter dyrkning statisk ved 37<*>C i 18 timer, ble vokste E. coli DH 5a-celler inokulert i 2 ml LB medium inneholdende 50 (ig/ml ampicillin, og dyrket ved 37<*>C i 18 timer med risting for å fremstille en såkultur. En andel av såkulturen ble inokulert inn i 2 ml hvert av det samme medium i 10 testrør. Ristekultur ble startet ved 37°C, og etter 5 timer ble IPTG tilsatt til en final konsentrasjon av 1 mM, og ristekul-turen fikk fortsette videre i 2 timer. Etter dyrking ble cellene gjenvunnet ved sentrifugering, vasket med buffer-løsning A beskrevet i Eksempel 1-2 og deretter suspendert i 2,5 ml av bufferløsning A. Den resulterende suspensjon ble behandlet i en ultrasonikator under iskalde betingelser, celledebris ble fjernet ved sentrifugering, og supernatanten, en rå-enzymløsning, ble således oppnådd. Escherichia coli DH 5a som ble transformert ved anvendelse av pUC119 uten D-PLDH-genet ble anvendt som en kontroll.
En 150 (il porsjon av buf f erløsning A inneholdende 250 (il NADPH og 250 (il f enylpyrodruesyre ble dispensert inn i brønner en 96-brønns mikrotiterplate, 50 (il hver av rå-enzymløsningen ble tilsatt, og blandet umiddelbart ved anvendelse av en pipette, og en forandring ved absorpsjon ved 340 nm ved 26°C ble målt. Målingene ble utført ved anvendelse av Absorption Microassay Reader BioLumin 960 (Molecular Dynamics) for å spore en nedgang i absorpsjon i forhold til tid etter starten av reaksjonen. Mengden av enzymet som oksiderte 1 (Utiol av NADPH pr. minutt ble satt til å være 1 enhet. Resultater er vist i Tabell 1 som enzymaktiviteten av rå-enzymløsningen.
Verdiene som er vist ble omdannet til [enhet/ml rå-enzym-løsning],
Escherichia coli DH5a transformert med pDPLDH-1 viste således en D-PLDH-aktivitet ca. 13 ganger høyere enn E. coli DH5a transformert med pUC119. Resultatet av ana-lyser ved anvendelse av en optisk delende kolonne bekreftet at produktet av stammen som bærer D-PLDH-genet var D-fenylmelkesyre. Genet i samsvar med foreliggende oppfinnelse ble bekreftet til å være D-PLDH-genet.
Videre ble den oppnådde rå-enzymløsning prosessert ved anvendelse av MonoQ10/10 under betingelser beskrevet i
Eksempel 1-2 for å fremstille en partielt renset enzym-løsning. Denne partielt rensede enzymløsning ble applisert på en 96-brønns mikrotiter med forskjellige konsentra-sjoner av substratet, fenylpyrodruesyre, for å måle enzymaktivitet. Videre ble enzymaktiviteten også målt med et alternativt substrat, pyrodruesyre, i stedet for fenylpyrodruesyre. Resultater av målingen er vist i Tabell 2, hvor reaksjonshastigheten med pyrodruesyre ble satt til 100.
Således ble det bekreftet at enzymet i samsvar med foreliggende oppfinnelse var klart forskjellig i dets karakteristika fra kjente melkesyre dehydrogenaser og lignende (Japanese Patent No 2750017; H. Taguchi, et al., J. Biol. Chem., (1991) vol 266, p 12588)) og var således et nytt enzym både med hensyn til aminosyresekvens og enzymatiske karakteristika.
Claims (14)
1. Protein,karakterisert vedat det omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av følgende sekvenser: (a) aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 2, og (b) en modifisert aminosyresekvens av aminosyresekvensen i SEKV. ID. NR. 2 som har én eller flere modifiseringer valgt fra en substitusjon, en deletering, en addisjon og et innskudd, og som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet.
2. Protein,karakterisert vedat det kodes for av en nukleotidsekvens valgt blant gruppen som består av følgende sekvenser: (c) DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1, (d) en nukleotidsekvens som har minst 70% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1, og som koder for et protein som har D-fenyl melkesyre dehydrogenaseaktivitet, (f) en nukleotidsekvens som hybridiserer med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 under stringente betingelser, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet.
3. Polynukleotid,karakterisert vedat det koder for proteinet i samsvar med krav 1.
4 . Polynukleotid i samsvar med krav 3,karakterisert vedat det omfatter DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1.
5. Polynukleotidsekvens,karakterisertved at den er valgt fra gruppen som består av de følgende sekvenser: (c) DNA-sekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 1, (d) en nukleotidsekvens som har minst 70% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet, (e) en modifisert DNA-sekvens av DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 som har én eller flere modifiseringer valgt fra en substituert, en deletering, en addisjon og et innskudd, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet, og (f) en nukleotidsekvens som hybridiserer med DNA sekvensen i SEKV. ID. NR. 1 under stringente betingelser, og som koder for et protein som har D-fenylmelkesyre dehydrogenaseaktivitet.
6. Polynukleotid i samsvar med krav 5,karakterisert vedat d) er et polynukleotid som har minst 80% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1.
7. Polynukleotid i samsvar med krav 5,karakterisert vedat d) er et polynukleotid som har minst 90% sekvensidentitet med DNA-sekvensen i SEKV. ID. NR. 1.
8. Rekombinant vektor,karakterisertved at den omfatter polynukleotidet ifølge et av kravene 3-7.
9. Ikke-human vert,karakterisert vedat den omfatter den rekombinante vektor i krav 8.
10. Vert i samsvar med krav 9, karakteriser t ved at uttrykker en D-fenylmelkesyre dehydrogenase.
11. Vert i samsvar med krav 9 eller 10,karakterisert vedat den er en substans PF1022-produserende mikroorganisme.
12. Fremgangsmåte for å produsere en D-fenylmelkesyre hydrogenase,karakterisert vedat den omfatter trinnene å dyrke verten ifølge krav 9, 10 eller 11, og oppta D-fenylmelkesyre dehydrogenase fra dyrkningsmediet.
13. Fremgangsmåte for å produsere D-fenylmelkesyre, et derivat derav eller en analog derav,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene å reagere fenylpyrodruesyre, et derivat derav eller en homolog derav, med proteinet ifølge krav 1, verten ifølge krav 9, 10 eller 11, et ekstrakt av verten, en kultur av verten, eller et enzym renset fra kulturen, og oppsamle nevnte D-fenylmelkesyre, derivat eller analog.
14. Fremgangsmåte for å produsere substansen PF1022 eller et derivat derav,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene å dyrke verten ifølge krav 11 og oppsamle substansen PF1022 eller derivatet derav fra dyrkningsmediet.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000125449 | 2000-04-26 | ||
| PCT/JP2001/003645 WO2001081563A1 (fr) | 2000-04-26 | 2001-04-26 | Nouvelle (r)-2-hydroxy-3-phenylpropionate (d-phenyl-lactate) deshydrogenase et gene codant pour celle-ci |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20025126D0 NO20025126D0 (no) | 2002-10-25 |
| NO20025126L NO20025126L (no) | 2002-12-20 |
| NO330796B1 true NO330796B1 (no) | 2011-07-18 |
Family
ID=18635406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20025126A NO330796B1 (no) | 2000-04-26 | 2002-10-25 | Protein, polynukleotid, polynukleotidsekvens, rekombinant vektor, ikke-human vert, samt fremgangsmater for a produsere D-fenylmelkesyre hydrogenase, D-fenylmelkesyre og substansen PF1022 eller derivater derav |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6916641B2 (no) |
| EP (1) | EP1291417B1 (no) |
| JP (1) | JP4679785B2 (no) |
| KR (1) | KR100808307B1 (no) |
| CN (1) | CN1254536C (no) |
| AT (1) | ATE354650T1 (no) |
| AU (2) | AU5260801A (no) |
| CA (1) | CA2407059C (no) |
| DE (1) | DE60126767T2 (no) |
| NO (1) | NO330796B1 (no) |
| NZ (1) | NZ522584A (no) |
| WO (1) | WO2001081563A1 (no) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1752988A1 (fr) | 2005-08-09 | 2007-02-14 | Nagravision S.A. | Méthode de traitement de contenus à accès conditionnel par une unité d'utilisateur |
| CN103403157B (zh) * | 2011-01-31 | 2015-08-05 | 旭化成化学株式会社 | 苯丙酮酸还原酶及使用该酶制造光学活性苯基乳酸及4-羟基苯基乳酸的制造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19545639A1 (de) * | 1995-12-07 | 1997-06-12 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von substituierten Arylmilchsäure-haltigen Cyclodepsipeptiden mit 24 Ringatomen |
| AU782525B2 (en) * | 1999-09-07 | 2005-08-04 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Regulatory sequences functioning in filamentous fungi |
| DE60028217T2 (de) * | 1999-09-07 | 2007-04-26 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Zyklische depsipeptid-synthasen, deren gene und system zur massenproduktion von zyklischen depsipeptiden |
-
2001
- 2001-04-26 US US10/258,472 patent/US6916641B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-26 NZ NZ522584A patent/NZ522584A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 WO PCT/JP2001/003645 patent/WO2001081563A1/ja active IP Right Grant
- 2001-04-26 KR KR1020027014361A patent/KR100808307B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 CN CNB018116477A patent/CN1254536C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-26 AU AU5260801A patent/AU5260801A/xx active Pending
- 2001-04-26 EP EP01925976A patent/EP1291417B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-26 CA CA2407059A patent/CA2407059C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-26 DE DE60126767T patent/DE60126767T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-26 JP JP2001578634A patent/JP4679785B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-26 AT AT01925976T patent/ATE354650T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 AU AU2001252608A patent/AU2001252608B2/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-10-25 NO NO20025126A patent/NO330796B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6916641B2 (en) | 2005-07-12 |
| NO20025126D0 (no) | 2002-10-25 |
| CA2407059A1 (en) | 2001-11-01 |
| JP4679785B2 (ja) | 2011-04-27 |
| NO20025126L (no) | 2002-12-20 |
| DE60126767T2 (de) | 2007-10-31 |
| WO2001081563A1 (fr) | 2001-11-01 |
| EP1291417A4 (en) | 2004-06-09 |
| CN1437651A (zh) | 2003-08-20 |
| US20030186410A1 (en) | 2003-10-02 |
| AU5260801A (en) | 2001-11-07 |
| CA2407059C (en) | 2010-08-24 |
| DE60126767D1 (de) | 2007-04-05 |
| NZ522584A (en) | 2004-02-27 |
| KR100808307B1 (ko) | 2008-02-27 |
| KR20020093081A (ko) | 2002-12-12 |
| EP1291417B1 (en) | 2007-02-21 |
| CN1254536C (zh) | 2006-05-03 |
| AU2001252608B2 (en) | 2005-09-29 |
| EP1291417A1 (en) | 2003-03-12 |
| ATE354650T1 (de) | 2007-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7700319B2 (en) | Production of 3-hydroxypropionic acid using beta-alanine/pyruvate aminotransferase | |
| CN107406821B (zh) | 用于生产3-羟基丙酸的突变宿主细胞 | |
| KR20200134333A (ko) | 발효에 의한 히스타민 생산을 위해 조작된 생합성 경로 | |
| CN110129305B (zh) | 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体 | |
| US7285404B1 (en) | Cyclic depsipeptide synthetase and method for recombinant production | |
| NO330796B1 (no) | Protein, polynukleotid, polynukleotidsekvens, rekombinant vektor, ikke-human vert, samt fremgangsmater for a produsere D-fenylmelkesyre hydrogenase, D-fenylmelkesyre og substansen PF1022 eller derivater derav | |
| US20220042000A1 (en) | Methods for preparing n-acetyl-l-methionine | |
| KR20090119927A (ko) | 개량형 할로하이드린 에폭시데이즈 | |
| JP5000189B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法 | |
| US20020061578A1 (en) | Phosphohexuloisomerase and gene therefor | |
| KR101541034B1 (ko) | Ｄ―갈락토네이트 고생산 대장균 균주 및 이의 용도 | |
| WO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| US7901923B2 (en) | Microorganism of Enterobacteriacae genus harboring genes associated with L-carnitine biosynthesis and method of producing L-carnitine using the microorganism | |
| CN109280651B (zh) | 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法 | |
| JP5296166B2 (ja) | コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法 | |
| JP2010022334A (ja) | 立体選択性を有するニトリルヒドラターゼ遺伝子 | |
| CA2485489A1 (en) | Nucleotide sequence coding for a mannitol 2-dehydrogenase and method for the production of d-mannitol | |
| JP2012228221A (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| JP2012090537A (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| EA013412B1 (ru) | Новый ген sms 27 | |
| NZ750131B2 (en) | Microorganism having acyltransferase activity and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |