JP2012090537A - 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】立体選択性、生成物阻害耐性等が向上した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを得るとともに、これらを利用して光学活性なエピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを効率よく製造する方法を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、以下の（ｉ）〜（ｌ）より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを用いることからなる；（ｉ）第２９番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、（ｊ）第１７９番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、（ｋ）第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、（ｌ）第２２１番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸変異。
【選択図】図１

Description

本発明は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及びその製造方法に関する。

ハロヒドリンエポキシダーゼは、ハロヒドリンハイドロゲンハライドリアーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼまたはハロアルコールデハロゲナーゼとも称され、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：４．５．１．−）である。ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性等から、３つのアイソザイム（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）が存在することが知られている（非特許文献１：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）。Ａ型ハロヒドリンエポキシダーゼとして、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＡ（非特許文献２：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＡＤ２株由来のＨｈｅＡ ＡＤ２（非特許文献１）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＰＹ１株由来のＤｅｈ−ＰＹ１（非特許文献３：Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｃｉ．，５０（６），６０５−６１２，２００４）等が知られている。また、Ｂ型ハロヒドリンエポキシダーゼとして、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（非特許文献２）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢ ＧＰ１（非特許文献１）、アースロバクター エリシー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｒｉｔｈｉｉ）Ｈ１０ａ株由来のＤｅｈＡ（非特許文献４：Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，５６８−５７４，１９９８）等が知られている。そして、Ｃ型ハロヒドリンエポキシダーゼとして、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＤＨ０９４株由来のＨｈｅＣ（特許文献１：特開平１０−２１０９８１号公報）、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣ（非特許文献１）、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＨａｌＢ（非特許文献５：Ｔｈｅｓｉｓ（１９９６）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｌｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）等が知られている。

エピハロヒドリンは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質である。例えば、（Ｒ）−エピハロヒドリンの開環シアノ化によって得られる（Ｒ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、Ｌ−カルニチンの合成原料として有用であることが知られている（特許文献２：特開昭５７−１６５３５２号公報）。少なくとも一部のハロヒドリンエポキシダーゼについては、上述した１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性に加え、シアン化合物の存在下にエピハロヒドリンを開環シアノ化して４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する反応を触媒することが明らかになっており、その反応を利用した例として、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献３：特開平３−０５３８８９号公報、特許文献４：特開２００１−２５３９７号公報）及びエピハロヒドリンから光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献５：特開平３−０５３８９０号公報）が知られている。

ところで、近年の遺伝子工学技術の進歩により、酵素タンパク質の構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加または挿入させるか、あるいは他のアミノ酸で置換した変異体を意図的に作製することが可能となっている。これら変異体は、該変異の種類によっては、変異の導入されていない酵素と比較して、活性、安定性、有機溶媒耐性、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、基質特異性、立体選択性等の性能が向上することが知られている。これら性能の向上は、活性あたりの酵素触媒製造コスト低減、酵素触媒の安定化、反応工程の簡略化、反応収率の向上等を通じて、酵素反応を利用した工業的生産における大幅な生産コスト低減をもたらすことがある。従って、多くの酵素において様々な性能が向上した有用な改良酵素の創製が行われている。ハロヒドリンエポキシダーゼにおいても、構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸で置換した変異体の報告がなされている。例えば、特許文献６（米国特許出願公開第２００５／０２７２０６４号明細書）には、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣの変異体５７０種類及びコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢの変異体１種類が記載されている。また、特許文献７（米国特許出願公開第２００６／００９９７００号明細書）には、アグロバクテリウム ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１株由来のＨｈｅＣの変異体１４２２種類及びコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢの変異体１種類が記載されている。これらのうちのいくつかの変異体については、エチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトからエチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレイトへの変換反応における活性が向上したことが示されている。さらに、特許文献８（国際公開第２００８／１０８４６６号パンフレット）には、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢの変異体２２株が記載されている。これらのうちのいくつかの変異体については、形質転換体当たりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が向上したことが示されている。

特開平１０−２１０９８１号公報 特開昭５７−１６５３５２号公報 特開平３−０５３８８９号公報 特開２００１−２５３９７号公報 特開平３−０５３８９０号公報 米国特許出願公開第２００５／０２７２０６４号明細書 米国特許出願公開第２００６／００９９７００号明細書 国際公開第２００８／１０８４６６号パンフレット

Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３（１７），５０５８−５０６６，２００１ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４ Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｃｉ．，５０（６），６０５−６１２，２００４ Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，５６８−５７４，１９９８ Ｔｈｅｓｉｓ（１９９６） Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｌｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ

ハロヒドリンエポキシダーゼを工業的に利用する場合には、酵素触媒として更なる高度化が望まれる。例えば、光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造を目的とする場合、既知のハロヒドリンエポキシダーゼにより製造される４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの光学純度は必ずしも十分に高いものではない。従って、より光学純度の高い４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成するような、立体選択性が向上したハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールを出発原料としてハロヒドリンエポキシダーゼにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造を行う場合、生成物（ハロゲン化物イオン及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル）の阻害による反応速度の低下が生じうる。従って、生成物阻害を受け難いハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。

そこで、本発明の目的は、これら課題を解決しうるハロヒドリンエポキシダーゼ、及びその製造方法、ならびにそれを用いたエピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列、特にＢ型アイソザイムに分類される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、所定位置のアミノ酸残基のいずれかまたは全部を他のアミノ酸に置換することにより、立体選択性、生成物阻害耐性等の属性が向上した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを創出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
（ａ）第２９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｂ）第１７９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｃ）第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｄ）第２２１番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異。
（２）配列番号２で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
（ｅ）第３７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｆ）第１８７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｇ）第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｈ）第２２９番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異。
（３）配列番号１で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、以下の（ｉ）〜（ｌ）より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
（ｉ）第２９番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
（ｊ）第１７９番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
（ｋ）第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
（ｌ）第２２１番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸変異。
（４）配列番号２で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
（ｍ）第３７番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
（ｎ）第１８７番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
（ｏ）第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
（ｐ）第２２９番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸配列。
（５）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、グループＢに分類されるものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（６）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来のものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子。
（８）（７）に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（９）（８）に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体または形質導入体。
（１０）（９）に記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物。
（１１）（１０）に記載の培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または（１０）に記載の培養物を、１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。
（１３）（１）〜（６）のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または（１０）に記載の培養物を、シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンと接触させることにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。

本発明によれば、立体選択性、生成物阻害耐性等が向上した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを得ることができるとともに、これらを利用して光学活性なエピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを効率よく製造することができる。

プラスミドｐＳＴＴ００２を示す図である。

以下に本発明の実施の形態について説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。

１．ハロヒドリンエポキシダーゼ
（１）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ
「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ」とは、自然界の生物より分離され得るハロヒドリンエポキシダーゼを指し、由来は限定されるものではない。また、当該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的または非意図的なアミノ酸の欠失または他のアミノ酸による置換もしくは挿入がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。

本発明において用いる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなる。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、公共の配列データベース、例えば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）においてハロヒドリンエポキシダーゼとして登録されているものを検索し、該当したもののアミノ酸配列を調べればよい。必要に応じて、遺伝子情報解析用ソフトウェアを用いて検索を行うことができる。また、公知文献で野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列について記載されているものがあればそれを参考にしてもよい。

野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性等から、３つのアイソザイム（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）に大別されることが知られている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）。本発明において用いる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、Ｂ型に属するものである。

Ｂ型に分類されるハロヒドリンエポキシダーゼ（「ＨｈｅＢ」ともいう）としては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１，１９９４）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢ ＧＰ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８３（１７），５０５８−５０６６，２００１）、アースロバクター エリシー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｒｉｔｈｉｉ）Ｈ１０ａ株由来のＤｅｈＡ（Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，５６８−５７４，１９９８）等が挙げられる。

これらハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）において、以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．により登録されている；
「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ１４３６２」：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢのアミノ酸配列、
「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＫ７３１７５」：マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢ ＧＰ１のアミノ酸配列。

本発明において、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列（ＨｈｅＢ）については、その遺伝子（ＨＨＥＢ）が２つの開始コドンを有するため、結果的に、Ｎ末端近傍の８アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のハロヒドリンエポキシダーゼが存在することが報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８（８），１４５１−１４５７，１９９４）。本発明において、両者（上記２種のハロヒドリンエポキシダーゼ）を区別して称するときは、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（１ｓｔ）」と称し、２番目の開始コドン（次に登場するメチオニン）から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるＨｈｅＢを「ＨｈｅＢ（２ｎｄ）」と称することとし、これらはいずれも野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるものとする。

本明細書においては、主にコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼＨｈｅＢを例に挙げて説明するが、前述のように、ハロヒドリンエポキシダーゼの由来は限定されず、また、本発明で示した変異の位置または変異するアミノ酸種若しくは塩基配列を操作することによって、いずれの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを得ることもできる。なお、本発明において、「高い相同性」というときは、例えば６０％以上の相同性をいい、好ましくは７５％以上の相同性であり、特に好ましくは９０％以上の相同性をいう。

（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、主として遺伝子組換え技術を利用して、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して第２９番目、１７９番目、１８３番目及び１８４番目、２２１番目（ＨｈｅＢ（２ｎｄ））並びに第３７番目、１８７番目、１９１番目及び１９２番目、２２９番目（ＨｈｅＢ（１ｓｔ））のうち少なくとも１つのアミノ酸について置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものであり、立体選択性、生成物蓄積能等が向上したハロヒドリンエポキシダーゼである。

本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、基質１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンから、エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させた場合の該生成物の光学純度が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより同基質から同生成物を生成させた場合の該生成物の光学純度よりも高くなるという属性を有するものが含まれる。すなわち、基質である１，３−ジハロ−２−プロパノール及び／またはエピハロヒドリンに対する立体選択性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上しているものが含まれる。立体選択性向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよい。

本発明において、「光学活性」とは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている物質の状態、またはいずれか一方の鏡像異性体のみから成っている物質の状態を言う。また、「光学純度」とは、「鏡像異性体過剰率（％ｅｅ）」にほぼ等しいものであるとし、次式で定義する。

光学純度≒鏡像異性体過剰率＝１００×（｜［Ｒ］−［Ｓ］｜）／（［Ｒ］＋［Ｓ］）（％ｅ．ｅ．）

ここで、［Ｒ］及び［Ｓ］は試料中の鏡像異性体のそれぞれの濃度を示す。また、本発明において、「立体選択性」とは、ハロヒドリンエポキシダーゼが、基質から生成物を生成する際に、いずれか一方の鏡像異性体が生成する反応を優先的に触媒する性質を言う。

本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、具体的には、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を含むハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である；
（ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換し、第２９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第１７９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第２２１番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第３７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｆ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１８７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｇ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
（ｈ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２２９番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異。

上記タンパク質のアミノ酸変異は、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において最もＮ末端側に位置する開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）を１番目と定義したときに、当該開始アミノ酸残基からＣ末端側に向かって何番目のアミノ酸残基におけるアミノ酸変異であるかによっても特定することができる。しかし、ＨｈｅＢ（２ｎｄ）は、ＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列におけるＮ末端近傍の８アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質に過ぎず、ＨｈｅＢ（１ｓｔ）及びＨｈｅＢ（２ｎｄ）の両アミノ酸配列における各アミノ酸残基の絶対的役割は実質的に同一である。

本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの好ましい態様としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｐ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる；
（ｉ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第２９番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
（ｊ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第１７９番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
（ｋ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
（ｌ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列の第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、第２２１番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸変異、
（ｍ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第３７番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
（ｎ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１８７番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
（ｏ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
（ｐ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列の第２２９番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸変異。

本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記（ａ）〜（ｈ）、好ましくは（ｉ）〜（ｐ）より選択されるアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるものであればよい。本発明において、アミノ酸の種類を３文字または１文字のアルファベット表記で表すことがある。さらに、数字の前または前後に、３文字または１文字のアルファベットを配して表記することがあり、この場合は、アミノ酸残基の箇所及び置換前後のアミノ酸の種類を表す。すなわち、数字は、特に断りがない限り、上述したように、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基（通常はメチオニン）を１番目と定義した場合に、何番目のアミノ酸残基であるかを示すものである。また、数字の前に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換前のアミノ酸の３文字または１文字表記を表し、数字の後に表示した３文字または１文字のアルファベットは、アミノ酸置換が生じた場合の置換後のアミノ酸の３文字または１文字表記を表すものとする。例えば、２９番目のグルタミン酸残基は「Ｇｌｕ２９」または「Ｅ２９」と表記し、１７９番目のグルタミン酸残基がグルタミンに置換された場合は「Ｇｌｕ１７９Ｇｌｎ」または「Ｅ１７９Ｑ」と表記することがある。

２．ハロヒドリンエポキシダーゼ活性
本発明において、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性を意味する。１，３−ジハロ−２−プロパノールは、下記一般式（１）で示される化合物である。

ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下、「ＤＣＰ」と称することがある）、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。

エピハロヒドリンは、下記一般式（２）で示される化合物である。

ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン（以下、「ＥＣＨ」と称することがある）、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。

本発明においては、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」は、時間あたりの１，３−ジハロ−２−プロパノールからのエピハロヒドリン生成量またはハロゲン化物イオン生成量を測定することにより求めることができる。エピハロヒドリン生成量は、例えば、液体クロマトグラフィやガスクロマトグラフィ等によって定量することができる。また、ハロゲン化物イオン生成量は、例えば、そのハロゲン化物イオンの生成に伴って低下するｐＨをある一定の値に保つように、連続的または断続的にアルカリ溶液を添加し、時間あたりに要したアルカリの量から便宜的に求めることができる。この方法により算出されるハロヒドリンエポキシダーゼ活性を特に「脱ハロ活性」と呼ぶことがある。また、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼに対する抗体を作製し、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡ法等の免疫学的手法によっても算出することが可能である。その他、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が形質転換体内における発現量と比例すると仮定する場合は、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が既知であるサンプルと比較すること等により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の分析手段によっても間接的に求めることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。

なお、少なくとも一部のハロヒドリンエポキシダーゼについては、上述の「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」に加え、シアン化合物の存在下にエピハロヒドリンを開環シアノ化して４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する反応を触媒する活性を有する。この場合におけるシアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム（以下、「ＫＣＮ」と称することがある）、シアン化ナトリウム、シアン酸またはアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ⁻）またはシアン化水素を生じる化合物またはその溶液等が挙げられる。また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、下記一般式（３）で示される化合物である。

ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、「ＣＨＢＮ」と称することがある）、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル等が挙げられ、好ましくは、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。

３．ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
（１）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、その遺伝子配列（塩基配列）が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）において、以下のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．により登録されている；
「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ９０３５０」：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢをコードする遺伝子の塩基配列、
「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ０４４０９４」：マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＧＰ１株由来のＨｈｅＢ ＧＰ１をコードする遺伝子の塩基配列。

本発明においては、これらを「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」と呼ぶものとする。ここで、当該野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子における「野生型」の語は、「ハロヒドリンエポキシダーゼ」に係る語であり、ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列が野生型であることを意味する。本発明における野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を構成する塩基配列は、形質転換体宿主において利用可能なコドンをコードするものであればよく、必ずしも由来生物ゲノムＤＮＡ上にコードされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列に限定はされない。なお、ＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をＨＨＥＢ（１ｓｔ）と称し、ＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする遺伝子をＨＨＥＢ（２ｎｄ）と称するものとする。ＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列は配列番号４に示され、ＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列は配列番号３に示される。

塩基配列が明らかになっている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を取得する方法としては、由来生物からゲノムＤＮＡを調製し、明らかにされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子配列情報をもとにプライマーを設計し、該プライマーを用いてＰＣＲ法でハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子を増幅する方法が挙げられる。由来生物として、例えば、Ｎ−１０７４株が挙げられ、当該株は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６（以下、本明細書において同様））に昭和６３（１９８８）年１１月１０日付で寄託されている。

また、公知の遺伝子配列情報を基に、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）等を利用して、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の全長を化学的に合成することも可能である。例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をいくつかの領域（例えば、５０塩基程度）に分割し、隣り合う領域とのオーバーラップ（例えば、２０塩基程度）を両端に有する複数のオリゴヌクレオチドを設計及び合成する。該オリゴヌクレオチドをＰＣＲ法で互いにアニールさせることにより野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を増幅することができる。

また、必要に応じて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子のコドンを変更してもよい。コドンを変更する手段としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載の部位特異的変位誘発法や、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ （インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等）（タカラバイオ社製））等を用いて行うことができる。この他、上述したように、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）を行う際に、コドンを変更したプライマーを用いることでコドンを変更することも可能である。

（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、前記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ酵素タンパク質をコードする遺伝子を意味する。本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼに対して前記１．（２）の項に記載のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子である。

野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子及び上記アミノ酸変異導入後のアミノ酸残基を構成する塩基配列は、形質転換体宿主において利用可能なコドンをコードするものであればよく、必ずしも由来生物ゲノムＤＮＡ上にコードされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列に限定されない。なお、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて述べたＨｈｅＢ（１ｓｔ）をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるＨＨＥＢ（１ｓｔ）（配列番号４）、及びＨｈｅＢ（２ｎｄ）をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるＨＨＥＢ（２ｎｄ）（配列番号３）は、いずれも、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得るためのベースとなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子としても用いることができる。

本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子のさらに具体的かつ好ましい態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（２ｎｄ）である場合は、配列番号３に示される塩基配列に前記変異後のアミノ酸配列をコードするように改変した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が挙げられる。

本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子は、前記１．（２）の項に記載のアミノ酸変異が導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子であればよく、従って、前記１．（２）の項に記載の（ａ）〜（ｐ）の特徴を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子も含まれる。

さらに、本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子としては、前記（ａ）〜（ｐ）より選択されるいずれかのアミノ酸変異が導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。

このようなＤＮＡは、例えば、上記（ａ）〜（ｐ）より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ若しくはその相補配列、またはこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリ及びゲノムライブラリから得ることができる。ライブラリは、公知の方法で作製されたものを利用することができ、また市販のｃＤＮＡライブラリ及びゲノムライブラリを利用することもできる。

「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００ｍＭ〜２０００ｍＭ、温度が４０℃〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００ｍＭ〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、前記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを得るための条件を設定することができる。

ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、前記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡまたはその部分断片が挙げられる。

本発明において、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の調製を行う方法は、変異を導入する既知の如何なる方法でもよく、通常は、公知の方法で行うことができる。例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。これらの部位特異的変異誘発法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２（１９８５），Ｋｒａｍｅｒ ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７（１９８７）、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８５：２７６３−２７６６（１９８８）等に記載されている。

また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてＰＣＲを行うことで、目的変異が導入された遺伝子ＤＮＡ断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴＤＮＡを組み合わせたＰＣＲ法（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。また、ハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法等のランダムな変異導入法によっても、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得ることができる。

４．組換えベクター、形質転換体
（１）組換えベクター
上記の方法によって得た本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。あるいは、当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。すなわち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。

プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、トリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター等が挙げられ、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。枯草菌宿主において利用できるものとしては、グルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。ロドコッカス属細菌宿主において利用できるものとしては、発現ベクターｐＳＪ０３４に含まれるロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ９２−Ｂ１株由来のニトリラーゼ発現調節遺伝子に係るプロモーターが挙げられる。ｐＳＪ０３４はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、特開平１０−３３７１８５号公報に示す方法でｐＳＪ０２３より作製することができる。なお、ｐＳＪ０２３は、形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２」）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に平成９（１９９７）年３月４日付けで寄託されている。

ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特に限定されるものではなく、例えば、因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター、ｒｒｎＢターミネーター等が挙げられる。

また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列等のリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはＳＤ配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはＫｏｚａｋ配列をＰＣＲ法等により付加してもよい。ＳＤ配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列等が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作製して利用してもよい。

一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子等が挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

本発明において使用されるベクターは、上記の変異遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ等が挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌内での自律複製可能な領域を有するｐＴｒｃ９９Ａ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＵＣ１９（タカラバイオ、日本）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、オランダ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／）、ｐＥＴ−１２（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）、ｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ドイツ）等を用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーター、ｌａｃオペレーターを有する発現ベクターｐＴｒｃ９９ＡまたはｐＫＫ２３３−２等を用いることもできる。

上記の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターの具体的なものとしては、例えば、ｐＳＴＴ００２、Ｍ０００２、Ｍ１００２、Ｈ１００２、Ｈ１００７等が挙げられる。

（２）形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換または形質導入することで、形質転換体または形質導入体（以下、これらをまとめて「形質転換体」という）を作製する。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。

本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、ロドコッカス属細菌等の細菌、酵母（Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。

細菌を宿主とする場合、本発明においては、大腸菌、ロドコッカス属細菌を好ましい宿主として用いることができる。大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、Ｃ６００株等を挙げることができる。特に、上述したようなラクトースオペロンのｌａｃプロモーター及びその派生プロモーターを発現プロモーターとして用いる場合、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子を有する宿主を用いれば発現が誘導型となり（ＩＰＴＧ等で誘導）、ｌａｃＩレプレッサー遺伝子を有しない宿主を用いれば発現は構成型となるので、必要に応じた宿主を利用することができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）等から容易に入手可能である。枯草菌としては、例えば、バチルス ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等が挙げられる。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌としては、例えば、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１２６７４株、ロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」）、ロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＩＦＯ１２５３８株、等が挙げられる。好ましくはロドコッカス ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」）が挙げられる。なお、上記ＡＴＣＣ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから、ＩＦＯ株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から、ＦＥＲＭ株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターからそれぞれ入手可能である。

細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。

上記の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターにより得られる形質転換体は、本発明の範囲に含まれる。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換体の具体的なものとしては、例えば、本発明で例示するＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｄ１８３Ｖ＋Ｍ１８４Ｖ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ等が挙げられる。

５．改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法
本発明において、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記形質転換体を培養して得られる培養物自体として、または培養物から採取することにより製造することができる。本発明において、「培養物」とは、培養液、培養液上清、細胞または菌体、細胞または菌体の懸濁液、細胞または菌体の破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物等、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する形質転換体を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するもののいずれをも含む意味である。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記培養物中のいずれかに蓄積される。

本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。

形質転換体の培養条件は、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定されるものではないが、通常、培養温度は１０℃〜４５℃、好ましくは１０℃〜４０℃、さらに好ましくは１５℃〜４０℃、さらにより好ましくは２０℃〜３７℃で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５時間〜１２０時間、好ましくは５時間〜１００時間、さらに好ましくは１０時間〜１００時間、さらにより好ましくは１５時間〜８０時間程度行う。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば通常６〜９に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等が挙げられる。

特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養または通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましく、この場合、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、及び大豆または小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５時間〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。特に、工業的規模での改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ生産を行う場合は、通気攪拌培養を利用することができる。さらに、通気攪拌培養の操作方式としては限定されることなく、当分野の技術常識に基づいて選択することができる。

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地またはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１日〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン及びペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

形質転換（導入）体が植物細胞または植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地、ＬＳ基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。

上記培養条件で培養すると、本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを上記培養物中、すなわち、培養液、培養上清、細胞、菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積させることができる。

培養後、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞のまま物質生産における触媒として用いることもできるし、あるいは菌体または細胞を破砕することにより、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することもできる。いずれの場合にも、必要であれば、遠心分離や膜濾過等の固液分離操作により、培地除去及び洗浄を行うことができる。固液分離操作の方法は限定されず、当分野の技術常識に基づいて選択することができる。

上記の培地除去及び洗浄操作を行った後、菌体または細胞を再度水、あるいは必要に応じて緩衝液、等張液に懸濁し、菌体または細胞懸濁液を調製することができる。菌体または細胞懸濁液は、そのまま物質生産における触媒として用いることもできるし、必要に応じ、例えば界面活性剤等による処理を行った後に用いることもできる。界面活性剤で処理した菌は、緩衝液で洗浄して用いてもよいし、洗浄せずそのまま用いてもよい。

また、上述した培地除去及び洗浄操作を行わずに、直接、菌体または細胞の界面活性剤等による処理を行うこともできる。

また、菌体または細胞は、固定化して用いることもできる。具体的には、例えば、培養後の細胞または菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。

一方、菌体または細胞を破砕することにより、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することもできる。菌体または細胞の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独または必要に応じ組み合わせて利用することができる。

得られた破砕液から菌体または細胞破砕残渣を除去する必要がある場合は、例えば、遠心分離や濾過（デッドエンド方式あるいはクロスフロー方式）等、当分野の技術常識に基づいて適切な方法を選択し、実施することにより除去することができる。

残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを含む粗酵素溶液とすることができる。その後、必要に応じて、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィ（例えばゲル濾過クロマトグラフィ（例えばＳｅｐｈａｄｅｘカラム）、イオン交換クロマトグラフィ（例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ（例えばｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、陰イオンクロマトグラフィ（例えばＭｏｎｏＱカラム）等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からハロヒドリンエポキシダーゼを単離精製することができる。

本発明の形質転換体が遺伝子組換え体であり、かつ、製造工程での形質転換体の環境への漏出、製品への混入、または使用後の取り扱い等で、二次的に微生物汚染を引き起こす可能性を危惧する場合には、必要に応じて不活化処理を行うことができる。不活化方法としては、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性または該活性回収率を低下させず、かつ、形質転換体を不活化できる方法であればいかなる方法でも良く、例えば、熱処理、菌体破砕処理、薬剤処理等の方法を単独または組み合わせて利用できる。

一方、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、上述したような遠心分離や濾過等により菌体または細胞を除去する。その後必要に応じて、例えば前述のようにタンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を単独または適宜組み合わせて用いることにより、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを精製することもできる。

形質転換体が植物細胞または植物組織である場合は、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。その後必要に応じて、例えば前述のようにタンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を単独または適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からハロヒドリンエポキシダーゼを単離精製することができる。単離したハロヒドリンエポキシダーゼは、上述の細胞または菌体と同様に、適当な担体に保持し固定化酵素として使用することもできる。

以上のようにして得られる培養物及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、本発明の範囲に含まれる。得られる培養物及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの生産収率は、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を測定し、培養装置あたり、培養液あたり、菌体（形質転換体）湿重量または乾燥重量あたり、酵素液中タンパク質重量あたり等の活性算出することにより求めることができる。

また、本発明においては、上記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子または改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターから改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを産生することが可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌等の抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴ^ＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−Ｍａｔｅ^ＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。

上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば前述のように適宜クロマトグラフィを選択して、精製することができる。

６．エピハロヒドリン及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
上述のようにして製造された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。すなわち、以下の（１）〜（３）に示す反応に供することができる。

（１）１，３−ジハロ−２−プロパノールのエピハロヒドリンへの変換
本変換反応は、１，３−ジハロ−２−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。「接触」とは、１，３−ジハロ−２−プロパノールと上記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または培養物とを同一の反応系または培養系に存在させること等が挙げられる。具体的には、細胞培養器に１，３−ジハロ−２−プロパノールを添加すること、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または上記培養物と１，３−ジハロ−２−プロパノールとを混合すること、あるいは細胞を１，３−ジハロ−２−プロパノールの存在下で培養すること等が挙げられる。

基質である１，３−ジハロ−２−プロパノールは、前述した一般式（１）で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。

変換反応液中の基質濃度は、０．０１％〜１５（Ｗ／Ｖ）％が好ましい。この範囲内であると酵素安定性の観点から好ましく、０．０１％〜１０％が特に好ましい。基質は反応液に一括添加あるいは分割添加することができる。分割添加により基質濃度を一定にすることが蓄積性の観点から望ましい。

反応液の溶媒としては、酵素活性の最適ｐＨ４〜１０の付近である水または緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸または酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液あるいはグッド緩衝液等が好ましい。

反応温度は、５℃〜５０℃、反応ｐＨは４〜１０の範囲で行うことが好ましい。反応温度は、より好ましくは１０℃〜４０℃である。反応ｐＨは、より好ましくはｐＨ６〜９である。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって適時選択するが、１時間〜１２０時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。尚、本反応においては、反応の進行に伴い生成するハロゲン化物イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度をより一層向上させることができる。このハロゲン化物イオンの除去は、硝酸銀等の添加によって行うことが好ましい。

反応液中に生成、蓄積したエピハロヒドリンは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、酢酸エチル等の溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することによりエピハロヒドリンのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。

（２）１，３−ジハロ−２−プロパノールの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへの変換
本変換反応は、１，３−ジハロ−２−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。

基質である１，３−ジハロ−２−プロパノールは、前述した一般式（１）で示される化合物であり、好ましくは１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール等である。また、シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸またはアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ⁻）またはシアン化水素を生じる化合物またはその溶液を用いることができる。反応液中の基質濃度は、酵素安定性の観点から０．０１％〜１５（Ｗ／Ｖ）％が好ましく、０．０１％〜１０％が特に好ましい。また、シアン化合物の使用量は、酵素安定性の観点から基質の１倍量〜３倍量（モル）が好ましい。反応条件は、上記６．（１）と同様に行うことができる。

反応液中に生成、蓄積した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチル等の溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。

（３）エピハロヒドリンの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへの変換
本変換反応は、エピハロヒドリンを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行う。

基質であるエピハロヒドリンは、前述した一般式（２）で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。また、シアン化合物はシアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸またはアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ⁻）またはシアン化水素を生じる化合物またはその溶液を用いることができる。反応条件、採取及び精製方法は、上記６．（２）と同様に行うことができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

ランダム変異による改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング
（１）ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体ライブラリの作製
有用なハロヒドリンエポキシダーゼを取得するため、エラー誘発ＰＣＲによりランダム変異が導入されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリを作製し、該ライブラリからの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及びその遺伝子のスクリーニングを行った。

ハロヒドリンエポキシダーゼＨｈｅＢ（２ｎｄ）において、２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がリジンに置換されたタンパク質をコードする遺伝子が、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ上にクローニングされているプラスミドｐＳＴＴ００２を鋳型として、エラー誘発ＰＣＲによるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリの作製を次のように行った。以下の表の組成のＰＣＲ反応液を各５０μｌ調製した。

プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
ＤＨ−０９：ＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧ
（配列番号５：３３ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素ＢｓｐＨＩ認識部位（ＴＣＡＴＧＡ）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子ＨｈｅＢ（２ｎｄ）の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはＡＡＡでリジンをコードする）
Ｔｒｃ−０３：ＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣ
（配列番号６：２５ヌクレオチドからなり、ｐＴｒｃ９９Ａのマルチクローニングサイトの下流領域に対応する）
ＰＣＲ反応用チューブに調製した５０μｌのＰＣＲ反応液２系列を、以下の熱サイクル処理に供した。

熱サイクル処理を行った２系列のＰＣＲ反応液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）により精製した後、両系列とも制限酵素ＢｓｐＨＩとＰｓｔＩで二重消化を行った。各消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ｂａｎｄ ａｎｄ ＧｅｌＢａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）で精製した。

一方、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ）から購入できる発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）））により精製した。これを、上述のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むＰＣＲ増幅産物と各々混合した後、該混合液にＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ））を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベートすることで、各ＰＣＲ増幅産物と発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを結合した。

後述の方法にて予め調製しておいた大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌを、上記ライゲーション産物各１０μｌに加え、０℃で３０分間放置した。続いて、当該コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭ グルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液２００μｌをＬＢ Ａｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ、寒天２％を含有するＬＢ培地）に塗布し、３７℃で一晩培養した。各寒天培地上に出現したコロニーをハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリとした。

大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル調製は次のように行った。
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１％ＮａＣｌ）１ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に培養して前培養液を得た。該前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）４０ｍｌに加え、１８℃で２０時間培養して本培養液を得た。該本培養液を遠心分離（３７００×ｇ、１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、４０ｍＭ ＭｎＣｌ_２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３７００×ｇ、１０分間、４℃）して上清を除き、大腸菌菌体を得た。該大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ ｍｌのジメチルスルホキシドを加えて菌体懸濁液を得た。該菌体懸濁液を０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結処理し、−８０℃にて保存しておいたものを大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルとした。

（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング （一次評価）
実施例１（１）で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリを用い、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング（一次評価）を次のように行った。

９６ウェルプレート（ディープウェル）にＩＰＴＧを終濃度として１ｍＭ含むＬＢ Ａｍｐ培地をウェル当たり５００μｌづつ分注し、各ウェルにハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリのコロニーを植菌した。なお、９６ウェル中１〜２個のウェルについては、評価の対照として用いるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２コロニーを植菌した。３７℃、８００ｒｐｍで約１６時間培養した後、得られた培養液のうち２０μｌ×２サンプルずつを、平型９６ウェルプレートに分注した。遠心分離機（佐久間製作所５０Ａ−ＩＶＤ）及びロータ（佐久間製作所ＨＭ−２ＨＬＳ）を用い、平型９６ウェルプレートを遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間、４℃）に供した。培養液上清を除去した後、評価用反応液１（４００ｍＭ ＤＣＰ、８００ｍＭ Ｒ−ＣＨＢＮ、０．０２５％ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８．０））または評価用反応液２（２００ｍＭ（Ｓ）−ＣＨＢＮ、０．０２５％ＢＣＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８．０））各４０μｌを各ウェルに添加した。反応液と菌体を懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し（ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの生成に伴うｐＨ低下により、ＢＣＰの色が紫から黄色に変化する）、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の性質が見られた株を選抜した；
（Ｉ）評価用反応液１及び評価用反応液２において対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に速く変色する株、
（ＩＩ）評価用反応液１において対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に速く変色し、かつ評価用反応液２において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に遅い、または変色が無い株、
（ＩＩＩ）評価用反応液１において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に遅い、または無く、かつ評価用反応液２において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に早い株。
約８０００株のコロニーについて該一次評価を行い、合計９３株を選抜した。

（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング （二次評価）
実施例１（２）で選抜された９３株及び対照とするＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２の計９４株について、次のように二次評価を行った。

ＩＰＴＧを終濃度として１ｍＭ含むＬＢ Ａｍｐ培地をワッセルマン試験管に１ｍｌずつ分注し、各試験管に一次評価選抜株９３株及び対照とするＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２のコロニーをそれぞれ植菌した。３７℃、２１０ｒｐｍで約１６時間培養した後、得られた培養液を１．５ｍｌマイクロチューブに移し、遠心分離機（ＴＯＭＹ ＭＸ−３０１）及びロータ（ＴＭＡ−２００、ロータラックＡＲ００５−２４）を用い、１．５ｍｌマイクロチューブを遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）に供した。培養液上清を除去した後、各菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液の全量を、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール４、ＤＵＴＹ ＣＹＣＬＥ４０％、ＰＵＬＳ、ＴＩＭＥＲ＝Ｂモード１０ｓの条件で氷冷しながら１０分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた各粗酵素液４０μｌ×４サンプルを９６ウェルプレートに分注し、実施例１（２）に記載の方法において評価用反応液１、評価用反応液２に加え、評価用反応液３（４００ｍＭ ＤＣＰ、０．０２５％ＢＣＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８．０））及び評価用反応液４（２００ｍＭ（Ｒ）−ＣＨＢＮ、０．０２５％ＢＣＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸（ｐＨ８．０））の４種を用いた方法により、二次評価を行った。

実施例１（２）と同様に反応液の呈色変化を経時的に観察し、評価用反応液４において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に遅い、または変色が無い株の中から、以下の（ＩＶ）〜（ＶＩ）の性質が見られた株を選抜した；
（ＩＶ）評価用反応液１及び／または評価用反応液３において対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に速く変色する株、
（Ｖ）評価用反応液１及び／または評価用反応液３において対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に速く変色し、かつ評価用反応液２において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に遅い、または変色が無い株、
（ＶＩ）評価用反応液１及び／または評価用反応液３において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に遅い、または変色が無く、かつ評価用反応液２において変色が対照であるＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２よりも有意に早い株。
一次評価選抜株９３株について該二次評価を行い、１０株を選抜した。

（４）二次評価選抜株のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異確認
実施例１（３）で選抜した二次評価選抜株１０株について、各株が有するハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の変異を解析した。実施例１（３）で得られた各株培養液から、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いてプラスミド回収し、キャピラリーＤＮＡシークエンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター）を用い、添付のマニュアルに従って、各プラスミド中のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を解析した。
その結果を表３に示した。

改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによる（Ｒ）−ＣＨＢＮ合成反応
（１）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ粗酵素液の調製
実施例１（３）で選抜され、実施例１（４）でそのハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異が確認された１０株（ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｄ１８３Ｖ＋Ｍ１８４Ｖ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｎ１０９Ｒ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ３０Ｄ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｖ１１４Ｉ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｒ１９２Ｑ＋Ｄ１９９Ｇ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｓ１３２Ｎ＋Ｄ１９９Ｇ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ）及び対照とするＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２の計１１株について、各株を用いて合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度を調べるため、まず各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体より粗酵素液を調製した。ＬＢ Ａｍｐ培地をワッセルマン試験管に１ｍｌずつ分注し、各試験管に二次評価選抜株１０株及び対照とするＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２のコロニーをそれぞれ植菌した。３７℃、２１０ｒｐｍで約８時間培養した後、得られた各培養液１００μｌを、ＩＰＴＧを終濃度として１ｍＭ含むＬＢ Ａｍｐ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）に植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで１６時間培養した。得られた各培養液１００ｍｌから遠心分離（３７００×ｇ、１０分間、４℃）により各菌体を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、菌濃度が１２．５ｇＤ．Ｃ．／ｌとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の３ｍｌを、実施例１（３）に記載の方法で超音波破砕及び遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた各粗酵素液を、それぞれ破砕前の（菌体懸濁液時点での）菌濃度として６．２５ｇＤ．Ｃ．／ｌとなるよう、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、本粗酵素液を用いて以下の方法によりハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）を測定した。１００ｍｌの活性測定用反応液（５０ｍＭ ＤＣＰ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−硫酸緩衝液（ｐＨ８．０））を調製して、温度を２０℃に調整した。該反応液に上記粗酵素液を添加し、反応を開始した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの遊離に伴うｐＨの低下を、ｐＨ自動コントローラを用いて０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液の投入によりｐＨを８に保つよう連続的に調整した。１０分間の反応の間に、ｐＨを８に保つために投入された０．０１規定の水酸化ナトリウム水溶液の量から、塩化物イオン生成量を算出し、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）（Ｕ）を算出した。１Ｕを上記条件下でＤＣＰから１分間当たり１μｍｏｌ塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義し、活性測定に用いた各粗酵素液の活性、及び該活性を活性測定に用いた各粗酵素液の液量で除することにより各粗酵素液の液活性を算出した。

（２）分析方法
後述する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによる（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成反応において実施する反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析及び生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、以下のように行った。

＜反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析＞
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析は、逆相ＨＰＬＣにより行った。逆相ＨＰＬＣ分析条件を表４に示す。

反応終了液１００μｌを、上表記載の移動相５ｍｌにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度を求めた。

＜生成ＣＨＢＮの光学純度分析＞
生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、ＣＨＢＮをエステル化後、順相系ＨＰＬＣにより行った。順相系ＨＰＬＣ分析条件を表５に示す。

反応終了液約４００μｌに等量の酢酸エチルを加えて抽出を行った。酢酸エチル相を分取し、少量の無水硫酸マグネシウムを加えて攪拌した。酢酸エチル相を全量なすフラスコに分取してロータリーエバポレータ（東京理化機械）にセットし、５０℃、２５０ｔｏｒｒ、６０分間濃縮した。残存物に２０μｌのジクロロメタンと２０μｌのピリジン、及び２０μｌの（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（以下、（＋）−ＭＴＰＡと称することがある）を添加した。室温で一晩反応させた後、４００μｌのジイソプロピルエーテル（以下、ＩＰＥと称することがある）を添加し、１規定の塩酸を加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を分取し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を４００μｌ加えて抽出を行った。ＩＰＥ相を１．５ｍｌチューブに分取し、アスピレータによりＩＰＥ相を揮発させた。残存物をｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝４：１の混合液に懸濁した後、表５に記載の分析条件により分析を行った。（Ｒ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステル及び（Ｓ）−ＣＨＢＮ−（＋）−ＭＴＰＡエステルのエリア面積比から各濃度を算出し、本明細書において説明した要領（前述）でＣＨＢＮの光学純度を算出した。

（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによるＤＣＰからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
実施例２（１）で調製した各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体由来粗酵素液のうち、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｄ１８３Ｖ＋Ｍ１８４Ｖ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ及び対照とする形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２由来粗酵素液を用い、シアン化カリウム存在下、ＤＣＰまたはＥＣＨからのＣＨＢＮ合成反応を行った。反応液基本組成は以下の表のようにし、反応スケールは０．５ｍｌで行った。

反応は２０℃にて３時間行った。反応終了後、実施例２（２）に記載の分析条件により、反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度及び生成ＣＨＢＮの光学純度を分析した。結果を表７に示した。

対照とする形質転換体株ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２由来の粗酵素液を用いて合成された（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は９１．７％ｅ．ｅ．であった。これに対し改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する４種の形質転換体株（ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｄ１８３Ｖ＋Ｍ１８４Ｖ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ）由来の粗酵素液を用いて合成された（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は９２．７〜９４．０％ｅ．ｅ．であり、光学純度が向上していることが確認された。従って、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、ＤＣＰ及び／または中間体ＥＣＨに対する立体選択性が向上していると言える。

（４）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによるＥＣＨからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
実施例２（１）で調製した各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体由来粗酵素液のうち、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ及び対照とする形質転換体ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２由来粗酵素液を用い、シアン化カリウム存在下、ＥＣＨからのＣＨＢＮ合成反応を行った。反応液基本組成は以下の表のようにし、反応スケールは０．５ｍｌで行った。

反応は２０℃にて３時間行った。反応終了後、実施例２（２）に記載の分析条件により、反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度及び生成ＣＨＢＮの光学純度を分析した。結果を表９に示した。

対照とする形質転換体株ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２由来の粗酵素液を用いて合成された（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は７８．９％ｅ．ｅ．であった。これに対し改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する３種の形質転換体株（ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ２９Ｋ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｅ１７９Ｑ、ＪＭ１０９／ｐＳＴＴ００２−Ｆ２２１Ｌ）由来の粗酵素液を用いて合成された（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は８１．３〜８７．７％ｅ．ｅ．であり、光学純度が向上していることが確認された。従って、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、ＥＣＨに対する立体選択性が向上していると言える。

本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、立体選択性に優れており、本発明の酵素を利用することにより、光学活性エピハロヒドリンまたは４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを効率よく製造することができる。

Ｎ−１０７４株：受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−２６４３」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に昭和６３（１９８８）年１１月１０日付で寄託されている。

ｐＳＪ０２３：形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２」）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に平成９（１９９７）年３月４日付けで寄託されている。

Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ１株（受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託されている。

［配列表の説明］
配列番号１：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（２ｎｄ）のアミノ酸配列
配列番号２：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨｈｅＢ（１ｓｔ）のアミノ酸配列
配列番号３：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨＨＥＢ（２ｎｄ）の塩基配列
配列番号４：コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）Ｎ−１０７４株由来のＨＨＥＢ（１ｓｔ）の塩基配列

Claims (13)

1. 配列番号１で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
   （ａ）第２９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｂ）第１７９番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｃ）第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｄ）第２２１番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異。
2. 配列番号２で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
   （ｅ）第３７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｆ）第１８７番目のＧｌｕが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｇ）第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔが、それぞれ独立に他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異、
   （ｈ）第２２９番目のＰｈｅが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異。
3. 配列番号１で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、第２番目のＡｌａがＬｙｓに置換され、且つ、以下の（ｉ）〜（ｌ）より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
   （ｉ）第２９番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
   （ｊ）第１７９番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
   （ｋ）第１８３番目のＡｓｐ及び１８４番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
   （ｌ）第２２１番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸変異。
4. 配列番号２で表される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ；
   （ｍ）第３７番目のＧｌｕがＬｙｓに置換されたアミノ酸変異、
   （ｎ）第１８７番目のＧｌｕがＧｌｎに置換されたアミノ酸変異、
   （ｏ）第１９１番目のＡｓｐ及び１９２番目のＭｅｔがＶａｌに置換されたアミノ酸変異、
   （ｐ）第２２９番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されたアミノ酸配列。
5. 野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、グループＢに分類されるものである、請求項１〜４のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
6. 野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌またはマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌由来のものである、請求項１〜５のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子。
8. 請求項７に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
9. 請求項８に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体または形質導入体。
10. 請求項９に記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物。
11. 請求項１０に記載の培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
12. 請求項１〜６のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または請求項１０に記載の培養物を、１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。
13. 請求項１〜６のいずれかに記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／または請求項１０に記載の培養物を、シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンと接触させることにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
    

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