JP4262206B2 - 遺伝子組換えAgrobacteriumtumefaciensによる補酵素Q10製造の発酵方法 - Google Patents
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Description
する。
年、Craneらによりウシ心臓ミトコンドリア成分として最初に見出された。1958年以来、Folkersらにより補酵素Q10の次式なる化学構造が解明されて来た。
ある。これらのうち、微生物を使用する発酵方法は商業的に成立し、補酵素Q10を製造するための安全な方法と見なされてきた。
ii)キノン環を形成する環化段階、ならびにiii)これらの2つの化合物を結合し、それら
の構成成分を順次変形することにより補酵素Q10を完成する段階である。
単離されたDPSの遺伝子がE.coliに導入する試みがなされて来たが、そうした組換え体細菌では補酵素Q10の満足できる生産性が達成できなかった。補酵素Q10の産生のためにDXS遺伝子もE.coliに導入されたにも拘らず、補酵素Q10の生産性は依然として満足できるものではなかった。このためE.coliは補酵素Q10産生用微生物としてほとんど使用されない。もっともE.coliによる補酵素Q8産生の生産性は、DXSがE.coli内で過剰に発
現する場合には改善され得るという報告があった。
補酵素Q10を産生する該発現ベクターを宿す株、Agrobacterium tumefaciens BNQ(KCCM
−10554)の構築を課題とする。また本発明は、好気的条件の下、前記組換え体を使用して補酵素Q10を調製する方法を提供することを課題とする。
5-ホスフェートシンターゼ(DXS)の配列番号1の遺伝子である。
また本発明は配列番号2の1-デオキシ-D-キシルロース 5-ホスフェートシンターゼ(DXS)でもある。
キシ-D-キシルロース 5-ホスフェートシンターゼ(DXS)遺伝子が共に挿入された
組換え発現ベクター(pGPRX11)である。
形質転換体、BNQ-pGPRX11(受託番号KCCM-10554)である。
本発明の方法は、補酵素Q10を最大限に産生するために、韓国微生物培養株センターに寄託され、受託番号KCCM-10554を有するAgrobacterium tumefaciens形質転換体を使用し、少なくとも以下の工程を含む:
i) 30〜50g/Lのコーン・スティープ粉、0.3〜0.7g/LのKH2PO4、0.3〜0.7g/L
のK2HPO4、12〜18g/Lの硫酸アンモニウム、1.5〜2.5g/Lの乳酸、0.2〜0.3g/L
の硫酸マグネシウムを含む生産培地上で、培地への通気速度が、培地単位体積当り毎分0.
8〜1.2空気体積であり、温度30〜34℃、pH6.0〜8.0の条件下で形質転換細胞を培養する工程;
ii) 生産培地から形質転換細胞および他の残存物を除去する工程;および
iii) 工程ii)の発酵培地から補酵素Q10を分離し回収する工程。
に調整される。
形質転換株の構築を達成するために、以下のステップが要求される:
i) A. tumefaciensからのDXS遺伝子のクローニング
ii) E.coliにおけるDXS発現系の確立
iii) IPTG誘導によるDXS発現および発現DXSの活性確認
iv) DPS遺伝子およびDXS遺伝子を含有する組換え発現ベクターpGPRX11の構築
v) 前記組換えベクターを宿すA. tumefaciens BNQ-pGPRX11の組換え菌株の構築
発酵条件を最適化するために、本発明者らはA. tumefaciens BNQ-pGPRX11の組換え菌株についての最適条件、例えば温度、pH、撹拌条件、通気条件などを探索した。高濃度の補酵素Q10を産生し、バイオマス増量のための最適の条件を確立するためには、溶存酸素と流加培養の制御が要求される。さらに補酵素Q10産生の増強のためには、工業的スケールで培地の選択、例えばコーン・スティープ粉、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸などを含有する培地もまた求められる。
との想定で、他の微生物からの既に公知であるDXS遺伝子配列に基づいてクローンされる。DXS遺伝子をクローンするために、E.coli XL1-Blueおよびクロー
ニングベクター、pSTBlue-1が用いられる。さらにE.coliにおけるDXSの発現のために、E.coli JM109および発現ベクターpQE30(キアゲン社)もまた使用される。E.coliおよびA. tumefaciensは、ともにLB寒天プレートのみならずLB培養基でも培養されてきた。E.coli培養は、220rpm、37℃の条件下で12時間実施される。これに対し、A. tumefaciens培養は、240rpm、30℃の条件下で16〜24時間実施される。
グメントは、A. tumefaciensの発現ベクターであるpGA748内にクローンされる。
NA配列決定が測られる。完結した組換えベクターpGP85およびpGX22が、補酵素Q10生成株内に電気穿孔法により融合される。最終的に形質導入された株は、3μg/mlテトラサイクリン含有LB選択培地において選抜される。DPS遺伝子を挿入され、選択された形質導入株は、BNQ-pGP85と命名され、他方、DXS遺伝子を挿入され、選択
された形質導入株は、BNQ-pGX22と命名される。
られたPCR産物はプラスミドpGP85中に挿入される。獲得され、DPSおよびDXS遺伝子をともに含有するプラスミドは、pGPRX11と名づけられる。補酵素Q10を産生する形質転換株は、内部DNA配列を含んでいる1対のプライマーを用いるコロニーPCRによって確認される。
条約のもとに、韓国微生物培養株センター(韓国、ソウル、Seodaemun-Gu, Hongje 1-Dong, Yurim building 361-221)に、2004年1月2日に寄託され、受託番号KCCM-10554を
得た。
ム社)によって行われる。
i) 500ml容三角フラスコ中の増殖培地、100mlへ上記株を接種すること;
ii) 200rpm、32℃の条件下で撹拌しながら、該株を16〜24時間培養すること;
さらに最適の培養条件を調べるために、本培養が5Lファーメンタ(コーバイオテク社)中でも実施される。そのとき本培養は、温度(25℃〜35℃)、pH(6.0〜8.0)、撹拌条
件(300〜600rpm)および通気条件(0.5〜2.0vvm)を変えながら、様々な条件下で約4日間、行われる。
%範囲に調整される。また、バイオマス量を増加させるために、培地に炭素源を間欠的に添加することで、流加培養法が用いられる。pHスタットを用いる流加培養法が好ましい
。
LB固形培地上で土壌試料から得られたおよそ1×106細菌より、補酵素Q10を産生する好ましい株が一次スクリーニングされた。次にそれらからの二次スクリーニングにより、高いバイオマス増殖速度および高い補酵素Q10生産性と見なされる500細菌が分離され得た。最終的に補酵素Q10生産性が最も高い細菌がスクリーニングされた。補酵素Q10を高濃度で産生すると最終的にスクリーニングされたこの細菌の同定が、16SrRNA配列決定により行われた(Jukes, T.H. & Cantor C.R., 1969)。
おいて、実施例1で選択された株がA. tumefaciens株として同定され、A. tumefaciens BNQと名づけられた。
DXS遺伝子のクローニングのために、A. tumefaciensのcDNAが分離された。他の株からの最も近い公知DXSアミノ酸配列を参照して、1対のPCRプライマーが作製され
た。次はA. tumefaciensからのDXS遺伝子をクローニングするための1対のプライマーである。
使用された。種々の微生物に由来するDXSのDNA配列との比較から、得られたPCR産
物は実在するDXSと最も高い類似性を有することが判った。完全長のDXS遺伝子を入手するために、5'-および3'-RACE(cDNA末端部分の急速増幅)方法が使用され、それは5'-および3'-RACEキットを使用し、製造会社のマニュアル(ロシュ・ダイアグノシス GmbH、マンハイム、ドイツ)に従って行なわれた。DXS遺伝子に特異的なプライマーが、各RACEのために作製された。
促進するために、BamHI制限部位が順方向プラマーに含まれ、HindIII制限部位もまた逆方向プライマーに含まれた。各プライマーのDNA配列は次の通りである。
図2)。得られたcDNAは、翻訳され、DXSの既に知られているアミノ酸配列とも比較された。その結果、公知の配列と比較して37〜59%の類似性が示され、DXSアミノ酸配列に本質的に見出される要素、チアミンジホスフェートの結合領域、水素伝達に関係していると目されるヒスチジン残基が充分に保存されていることが確認された(図3)。
DXSの活性を決定するために、この酵素は、A. tumefaciensからのDXS遺伝子のクローニング後、E.coliにおいて発現された。E.coli組換えタンパク質の発現システムの中で、よく知られたpQEシステム(キアゲン社、米国)が、T5プロモーターを含むために
、このシステムが用いられた。
XS遺伝子が、抽出されてからアガロースゲル上で分離され精製された。それからこのようなBamHIおよびHindIIIの両制限酵素処理が発現ベクター、pQE30(3.4kb)におい
ても実施された。その結果、1.9kbのDXS遺伝子がクローンされ、ベクター中に挿入
されて、pQX11と名づけられた(図4)。
pQX11ベクターを用いて形質転換されたE.coliJM109がインキュベートされ、それは続
いて30℃で、0.1mMのIPTGで、光学密度(600nm)が0.5になる2時間処理された。その後DXS発現が誘導された。発現されたタンパク質の可溶性画分がNi-NTA樹脂と混合されてから、その混合物をカラムに通した。240mMイミダゾール含有緩衝液を用いて活性場所部分のみが専ら分離された。
液と混合され、煮沸された。検出には、色素、クーマシーブリリアントブルーR-250も使
用された。
れはSDS-PAGEにおけるバンドにより確認された。
DXS活性を測定するために、20μgの精製DXSを、1mM塩化マグネシウム、1mMチア
ミンジホスフェート、1mMピルビン酸、2mMグリセルアルデヒド3-ホスフェートおよび5mM
メルカプトエタノールを含有する40mMのTris-HCl緩衝液(pH8.0)と混合した。それから
この混合物を37℃で1時間反応させた。反応混合物を13,000rpmで遠心分離した後、上清を回収した。次いで反応性生物をZorbax-NH2カラム(アジレント・テクノロジー社、パロアルト、CA)および195nm紫外域検出器を有するHPLCにより分析した。溶出液は、100mMリン酸二水素カリウム、pH3.5であり、流速は1.3ml/分であった。
ト)が期待通り生成したことがHPLCのクロマトグラフィーにより、確認された(図6)。さらにDXPは酵素反応においてTDP(チアミンジホスフェート)がないと生成しないことから、本発明者らは、A. tumefaciensからクローンされた遺伝子がDXSであることを確認した。
DPSおよびDXSの遺伝子を含むcDNAを構築するために、本発明者らが以前に開発した、組換えプラスミドのpQD22およびpQX11を鋳型として用いるPCRを実施した。D
PSのcDNAを増幅するための1対のプライマーは次の配列の通りである。DPSの5'
DNAフラグメントはHindIII制限部位を有しており、DPSの3'DNAフラグメントはMluI制限部位を有している。
の5'DNAフラグメントはHindIII制限部位を有しており、DXSの3'DNAフラグメン
トはEcoRI制限部位を有している。
。次いで精製されたDNAフラグメントは、クローニングベクターのpSTBlue-1 (Novagen社)とライゲートした。組換えプラスミドはE.coli XL1-Blueに挿入され、一晩50mg/Lア
ンピシリン培地で培養された。
ー、pGA748にライゲートされた。その後、E.coliは発現ベクターによって形質転換され
た。生成したプラスミドは、それぞれpGP85およびpGX22と名づけられた(図7)。
の後において、はっきりと溶出された。DXSフラグメントは、プラスミドpGP85にライゲートされ、E.coliは形質転換された。形質転換されたE.coliから抽出され、配列決定されたプラスミドは、pGPRX11と名づけられた
コンピーテント細胞を得るために、補酵素Q10産生細菌、BNQ605がLB培地で、細胞密度が5〜10×107細胞/mlになるまで培養された。遠心分離後、得られた細胞は、EPB1緩衝液
(20mM Hepes pH7.2、5%グリセロール)で3回洗浄され、EPB2緩衝液(5mM Hepes pH7.2、15%グリセロール)に懸濁された。該細胞は−70℃で保存された。
トラサイクリンを追加したLB固形培養基に置かれた。その後、該細胞は30℃で72時間インキュベートされた。最終的に目的のDNAを挿入されるべき細胞群コロニーがスクリーニ
ングされた。
された1対のプライマーは、発現ベクターpGA748のマルチクローニング部位(MCS)の前
部-および後部-DNA配列に基づいている。プライマー配列は次の通りである。
で、pGP85で形質転換された株は、BNQ-pGP85と名づけられ、pGX22で形質転換された株は
、BNQ- pGX22と名づけられ、さらにpGPRX11で形質転換された株は、BNQ-pGPRX11(受託
番号KCCM-10554)と名づけられた。
実施例6で調製された組換え株、BNQ-pGP85、BNQ- pGX22およびBNQ-pGPRX11について
の補酵素Q10産生能力を決定するために、これらの株を、3μg/ml テトラサイクリン含有LB液体培養基5mlに接種し、30℃、240rpmで、一晩培養した。コントロールとして、プ
ラスミドpGA748だけを挿入した正常株、BNQ-pGA748を用いて、上記と同様の条件下で培養した。補酵素Q10産生株の増殖と補酵素Q10産生能力の結果が表4に提示されている。
上記で同定された組換え株、BNQ-pGPRX11を基本的培養条件下での最適化実験を行なうために使用した。諸条件、例えば温度(25℃〜35℃)、pH(6.0〜8.0)、撹拌条件(300〜600rpm)および通気条件(0.5〜2.0vvm)といった条件を変更するインキュベー
ションを実施することにより、バイオマスの増殖および補酵素Q10の生合成に対する最適の条件が、最適温度32℃、最適pH7.0、500rpmの撹拌条件、1.0vvmの通気速度であるこ
とが確認された。表5は、BNQ-pGPRX11株培養によって、細胞液体培養基、補酵素Q10量の比較を示す。
実施例8で行なわれた基本的培養条件の下、培養基中の溶存酸素濃度は、24時間の培養後には約0に低下した。撹拌を調整することにより溶存酸素濃度が0〜10、10〜20、20〜30%に調整された場合、0〜10%の溶存酸素濃度が、最良のバイオマスの増殖および補酵素
Q10生合成をもたらした。この実験によれば、バイオマス量は54.1g/Lに、ならびに生合
成された補酵素Q10量は281.6mg/Lに増加した。表6は、溶存酸素濃度によるBNQ-pGPRX11の補酵素Q10産生を示す。
バイオマス量を増大させるために流加培養法が適用された。このため炭素源が枯渇するや否や、50g/L糖が間欠的に加えられた。この実験によると、バイオマス量は70.2 g/L、
生合成された補酵素Q10量は、352.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Q10
量は5.02 mg/g-細胞であった。表7は、回分培養と比較した場合の流加培養による補酵素Q10産生能力を示す。
培養基中の窒素源として用いた、コーン・スティープ粉の最適濃度が実験によって測定された。実験結果から、20g/Lのコーン・スティープ粉を添加した場合、バイオマス量は71.2 g/L、生合成された補酵素Q10量は、438.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Q10量は6.16 mg/g-バイオマスであることが判った。表8は、コーン・スティープ粉の濃度に応じたバイオマス量、生合成された補酵素Q10量、バイオマス単位量あたりの補酵素Q10量を示す。
リン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムの最適濃度が実験により測定された。最適濃度は、リン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムがそれぞれ1.6g/L、添加されたときに達成されることが確認された。この実験によると、バイオマス量は71.4 g/L、生合成された補酵素Q10量は、472.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Q10量は6.62 mg/g-細胞であることが判った。
実験によるとバイオマスに補酵素Q10産生するため、硫酸アンモニウムの最適濃度は、硫酸アンモニウムが15g/L添加された場合に達成された。96時間の培養後、バイオマス量
は79.2 g/L、生合成された補酵素Q10量は、548.2mg/Lであり、バイオマス単位量あたり
の補酵素Q10量は6.92mg/g-細胞であることが判った。表9は、硫酸アンモニウムの濃度
に応じたバイオマス量、生合成された補酵素Q10量およびバイオマス単位量あたりの補酵素Q10量を示す。
炭素源についてpH-スタットを用いる流加培養法ならびに炭素源を間欠的に供給する従来の流加培養法が実施された。バイオマス量および補酵素Q10量を増大させる最善の方式を見出すために上記2つの流加培養法が比較された。実験結果からは、炭素源についてpH-スタットを用いる流加培養法の方が間欠的に供給する流加培養法よりも効率的であった。この実験によると、バイオマス量は88.2 g/L、生合成された補酵素Q10量は、642.1mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Q10量は7.30 mg/g-細胞、生産性は6.69mg/g-hrであった。
Claims (1)
- 補酵素Q10を最大限に産生するために、韓国微生物培養株センターに寄託されて受託番号KCCM-10554を有するAgrobacterium tumefaciens形質転換細胞を使用し、以下の工程を含む発酵方法:
i) 形質転換細胞のAgrobacterium tumefaciens(KCCM-10554)を、50g/Lのスクロース、15g/Lの酵母エキス、15g/Lのペプトンおよび7.5g/LのNaClを含有する増殖培地で培養させる工程;
ii) 30〜50g/Lのコーン・スティープ粉、0.3〜0.7g/LのKH2PO4、0.3〜0.7g/LのK2HPO4、12〜18g/Lの硫酸アンモニウム、1.5〜2.5g/Lの乳酸、0.2〜0.3g/Lの硫酸マグネシウムを含む生産培地上で、培地への通気速度が、培地単位体積当り毎分0.8〜1.2空気体積であり、温度30〜34℃、pH6.0〜8.0の条件下で、前記細胞を培養する工程;
iii) 発酵培地から前記細胞および他の残存物を除去する工程;および
iv) 工程iii)の発酵培地から補酵素Q10を分離し回収する工程。
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