JP4262206B2

JP4262206B2 - 遺伝子組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる補酵素Ｑ１０製造の発酵方法

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Publication number: JP4262206B2
Application number: JP2005037844A
Authority: JP
Inventors: リュンチェンソー; ヨンキムサン; クルリージュン; チョルリーヒョン; ジンハスク; セオンコーボン; ヒュンヨージ
Original assignee: バイオエヌゲーネシーオー．，エルティーディー．
Priority date: 2004-02-16
Filing date: 2005-02-15
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2025-02-15
Also published as: JP2005230008A; KR100578282B1; KR20040027589A; US20050181490A1

Description

本発明は、補酵素Ｑ₁₀を高生産性で産生する形質転換微生物株に関し、またAgrobacterium tumefaciens種に属する形質転換微生物株を使用して補酵素Ｑ₁₀を製造する方法に関
する。

補酵素Ｑ₁₀（2,3-ジメトキシ-5-メチル-6-デカプレニル-1,4-ベンゾキノン）は、1957
年、Craneらによりウシ心臓ミトコンドリア成分として最初に見出された。1958年以来、Folkersらにより補酵素Ｑ₁₀の次式なる化学構造が解明されて来た。

補酵素Ｑ₁₀は、ビタミンに類似した性質を有する脂溶性キノン（「ユビキノン」とも呼ばれる）の一種であり、生物の健康状態を維持するための必須物質として知られている。生物の生存に必須である電子およびプロトンの輸送体として、補酵素Ｑ₁₀は、ミトコンドリア内膜でＡＴＰ合成を支えるため、細胞膜安定化により細胞骨格と代謝を維持するために様々な役割を演じている。さらに補酵素Ｑ₁₀は反応性の酸素種には抗酸化剤として作用し、ＤＮＡ、脂質、タンパク質などの酸化的障害を防止している。さらに心血管系疾患、癌疾患、神経病因性疾患などの諸症状を予防するか、または軽減するように機能する。

補酵素Ｑ₁₀を生産するには、３種の異なる製造方法が開発されてきた。すなわち、i)動植物組織から抽出する方法、ii)化学合成の方法およびiii)微生物を利用する発酵方法で
ある。これらのうち、微生物を使用する発酵方法は商業的に成立し、補酵素Ｑ₁₀を製造するための安全な方法と見なされてきた。

補酵素Ｑ₁₀は、微生物、例えばCryptococcus laurentii ＦＥＲＭ-Ｐ4834、Rhodotorula glutinis ＦＥＲＭ-Ｐ4835、Sporobolomyces salmonicolor ＦＥＲＭ-Ｐ4836、Trichosporon sp. ＦＥＲＭ-Ｐ4650、Aureobasidium sp.などにより産生されることが報告されている。

商業的に流通販売されている補酵素Ｑ₁₀は、微生物細胞から抽出する生物的方法を用いて、協和発酵、日清製粉、カネカ、味の素、メルクといった多数の会社から供給されている。しかしながらこれらの会社から製造される製品は、生産性が低く、かつ高コストである。このことは細胞内の補酵素Ｑ₁₀濃度が、採算スケールで抽出するには余りにも低いためである。

微生物における補酵素Ｑ₁₀の生合成では、多数の酵素が関与する複雑な多段階経路を経ることが求められる。もっとも３つの主要なステップが含まれていると一般的に考えられている。すなわちi)補酵素Ｑ₁₀の側鎖部分であるデカプレニル二リン酸を合成する段階、
ii)キノン環を形成する環化段階、ならびにiii)これらの２つの化合物を結合し、それら
の構成成分を順次変形することにより補酵素Ｑ₁₀を完成する段階である。

上記段階のうちで最も重要な段階は、補酵素Ｑ₁₀の側鎖を構成するデカプレニル二リン酸（decaprenyl diphosphate）の形成ステップであると考えられている。さらに1-デオキシ-Ｄ-キシルロース５−リン酸シンターゼ（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase;ＤＸＳ）もまた側鎖構成要素であるイソペンテニル二リン酸の生成に関わっている。それゆえ補酵素Ｑ₁₀の生産性を増強するためには、デカプレニルジホスフェートシンターゼ（ＤＰＳ）およびＤＸＳを発現する２つの遺伝子を宿主細胞に導入することが求められる。

幾つかの微生物、例えばSchizosaccharomyces pombe、Gluconobacter suboxydansから
単離されたＤＰＳの遺伝子がE.coliに導入する試みがなされて来たが、そうした組換え体細菌では補酵素Ｑ₁₀の満足できる生産性が達成できなかった。補酵素Ｑ₁₀の産生のためにＤＸＳ遺伝子もE.coliに導入されたにも拘らず、補酵素Ｑ₁₀の生産性は依然として満足できるものではなかった。このためE.coliは補酵素Ｑ₁₀産生用微生物としてほとんど使用されない。もっともE.coliによる補酵素Ｑ₈産生の生産性は、ＤＸＳがE.coli内で過剰に発
現する場合には改善され得るという報告があった。

かくして補酵素Ｑ₁₀を大量に産生するためには、鍵となる酵素を過剰発現している細菌株を単離することが必要である。さらに、発酵の温度、ｐＨ、通気条件、撹拌条件、溶存酸素濃度を工業的スケールで制御することにより、補酵素Ｑ₁₀を含有するバイオマスおよびバイオマス中の補酵素Ｑ₁₀含有量をともに最大限に生産する発酵の諸条件を解決することも求められる。

本発明は、ＤＸＳおよびＤＰＳ遺伝子発現ベクター、pGPRX11ならびに形質転換され、
補酵素Ｑ₁₀を産生する該発現ベクターを宿す株、Agrobacterium tumefaciens BNQ（KCCM
−１０５５４）の構築を課題とする。また本発明は、好気的条件の下、前記組換え体を使用して補酵素Ｑ₁₀を調製する方法を提供することを課題とする。

本発明は、Agrobacterium tumefaciensから単離された、１-デオキシ-Ｄ-キシルロース
５-ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）の配列番号１の遺伝子である。
また本発明は配列番号２の１-デオキシ-Ｄ-キシルロース５-ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）でもある。

さらに本発明は、デカプレニルジホスフェートシンターゼ（ＤＰＳ）遺伝子と１-デオ
キシ-Ｄ-キシルロース５-ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）遺伝子が共に挿入された
組換え発現ベクター（ｐＧＰＲＸ１１）である。

本発明は組換え発現ベクター（ｐＧＰＲＸ１１）を宿す、Agrobacterium tumefaciens
形質転換体、ＢＮＱ-ｐＧＰＲＸ１１（受託番号ＫＣＣＭ-１０５５４）である。
本発明の方法は、補酵素Ｑ₁₀を最大限に産生するために、韓国微生物培養株センターに寄託され、受託番号ＫＣＣＭ-１０５５４を有するAgrobacterium tumefaciens形質転換体を使用し、少なくとも以下の工程を含む：
i) 30〜50ｇ/Ｌのコーン・スティープ粉、0.3〜0.7ｇ/ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、0.3〜0.7ｇ/Ｌ
のＫ₂ＨＰＯ₄、12〜18ｇ/Ｌの硫酸アンモニウム、1.5〜2.5ｇ/Ｌの乳酸、0.2〜0.3ｇ/Ｌ
の硫酸マグネシウムを含む生産培地上で、培地への通気速度が、培地単位体積当り毎分0.
8〜1.2空気体積であり、温度30〜34℃、ｐＨ6.0〜8.0の条件下で形質転換細胞を培養する工程；
ii) 生産培地から形質転換細胞および他の残存物を除去する工程；および
iii) 工程ii)の発酵培地から補酵素Ｑ₁₀を分離し回収する工程。

さらに発酵過程は、ｐＨ-スタット流加培養によって行われ、溶存酸素量を0.01〜10％
に調整される。

最適化された発酵条件の下、本発明の形質転換体を用いることにより、補酵素Ｑ₁₀含有量が最大限であるバイオマスを生産することができる。

本発明は次の２つの面からなる；ｉ)形質転換株の構築およびii) 発酵条件の最適化
形質転換株の構築を達成するために、以下のステップが要求される：
i) A. tumefaciensからのＤＸＳ遺伝子のクローニング
ii) Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＸＳ発現系の確立
iii) ＩＰＴＧ誘導によるＤＸＳ発現および発現ＤＸＳの活性確認
iv) ＤＰＳ遺伝子およびＤＸＳ遺伝子を含有する組換え発現ベクターｐＧＰＲＸ１１の構築
v) 前記組換えベクターを宿すA. tumefaciens ＢＮＱ-ｐＧＰＲＸ１１の組換え菌株の構築
発酵条件を最適化するために、本発明者らはA. tumefaciens ＢＮＱ-ｐＧＰＲＸ１１の組換え菌株についての最適条件、例えば温度、ｐＨ、撹拌条件、通気条件などを探索した。高濃度の補酵素Ｑ₁₀を産生し、バイオマス増量のための最適の条件を確立するためには、溶存酸素と流加培養の制御が要求される。さらに補酵素Ｑ₁₀産生の増強のためには、工業的スケールで培地の選択、例えばコーン・スティープ粉、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸などを含有する培地もまた求められる。

ＤＸＳ遺伝子を入手するためには、補酵素Ｑ₁₀を産生するA. tumefaciens株が用いられる。よって、A. tumefaciens の全長ＤＸＳ遺伝子が、そのサイズが約１．９ｋｂである
との想定で、他の微生物からの既に公知であるＤＸＳ遺伝子配列に基づいてクローンされる。ＤＸＳ遺伝子をクローンするために、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１-Ｂｌｕｅおよびクロー
ニングベクター、ｐＳＴＢlue-１が用いられる。さらにＥ．ｃｏｌｉにおけるＤＸＳの発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９および発現ベクターｐＱＥ３０（キアゲン社）もまた使用される。Ｅ．ｃｏｌｉおよびA. tumefaciensは、ともにＬＢ寒天プレートのみならずＬＢ培養基でも培養されてきた。Ｅ．ｃｏｌｉ培養は、220ｒｐｍ、37℃の条件下で12時間実施される。これに対し、A. tumefaciens培養は、240ｒｐｍ、30℃の条件下で16〜24時間実施される。

A. tumefaciensと統合されるＤＸＳ遺伝子を得るために、ｐＱＸ２２を鋳型として用いるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントがまず収集される。次に、ＤＰＳ遺伝子を得るために、ｐＱＤ２２（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ, 2003）を鋳型として用いるＰＣＲによって増幅されたＤＮＡフラグメントが収集される。獲得されたＤＮＡフラグメントは、ｐＳＴ１-Ｂｌｕｅベクターにクローンされる。最後にこれらのフラ
グメントは、A. tumefaciensの発現ベクターであるｐＧＡ748内にクローンされる。

ＤＰＳ遺伝子を宿しているｐＧＰ85およびＤＸＳ遺伝子を宿しているｐＧＸ22、これらの組換えベクターをＥ．Coli内にまず形質導入させて大量のプラスミドを確保した後、Ｄ
ＮＡ配列決定が測られる。完結した組換えベクターｐＧＰ85およびｐＧＸ22が、補酵素Ｑ₁₀生成株内に電気穿孔法により融合される。最終的に形質導入された株は、3μｇ/ｍｌテトラサイクリン含有ＬＢ選択培地において選抜される。ＤＰＳ遺伝子を挿入され、選択された形質導入株は、ＢＮＱ-ｐＧＰ85と命名され、他方、ＤＸＳ遺伝子を挿入され、選択
された形質導入株は、ＢＮＱ-ｐＧＸ22と命名される。

ところでＤＰＳおよびＤＸＳ遺伝子を同時に発現できるプラスミドを構築するために、リボソーム結合部位（RBS）を有するＤＸＳ遺伝子がＰＣＲにより入手される。ついで得
られたＰＣＲ産物はプラスミドｐＧＰ85中に挿入される。獲得され、ＤＰＳおよびＤＸＳ遺伝子をともに含有するプラスミドは、ｐＧＰＲＸ11と名づけられる。補酵素Ｑ₁₀を産生する形質転換株は、内部ＤＮＡ配列を含んでいる１対のプライマーを用いるコロニーＰＣＲによって確認される。

最終的には、形質転換株は、A. tumefaciensＢＮＱ-ｐＧＰＲＸ１１としてブダペスト
条約のもとに、韓国微生物培養株センター（韓国、ソウル、Seodaemun-Gu, Hongje 1-Dong, Yurim building 361-221）に、2004年1月2日に寄託され、受託番号ＫＣＣＭ-10554を
得た。

ＤＮＡのほとんどは、アガロースゲル電気泳動法（ＴＡＥ緩衝液、１％）により確認され、ＤＮＡバンドの精製はGeneclean II gel extractor（Q-バイオジーン社、米国）により行われる。ＤＮＡのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社）によって行われる。

形質転換株を培養するための増殖培地の組成が表１に示され、補酵素Ｑ₁₀大量産生のための生産培養基の組成が表２に示されている。

増殖培地での培養は、以下の手順で実施される：
i) 500ｍｌ容三角フラスコ中の増殖培地、100ｍｌへ上記株を接種すること；
ii) 200ｒpm、32℃の条件下で撹拌しながら、該株を16〜24時間培養すること；
さらに最適の培養条件を調べるために、本培養が5Lファーメンタ（コーバイオテク社）中でも実施される。そのとき本培養は、温度（25℃〜35℃）、ｐH（6.0〜8.0）、撹拌条
件（300〜600ｒｐｍ）および通気条件（0.5〜2.0ｖｖｍ）を変えながら、様々な条件下で約４日間、行われる。

バイオマス量を増量させるために、溶存酸素を制御する方法と流加培養法が採用される。最適の培養条件を決定するために、撹拌速度を変えることにより溶存酸素量が、0〜30
％範囲に調整される。また、バイオマス量を増加させるために、培地に炭素源を間欠的に添加することで、流加培養法が用いられる。ｐHスタットを用いる流加培養法が好ましい
。

最適培地の選択は、バイオマスにおける補酵素Ｑ₁₀の最大産生について実施される。各培地の組成、例えばコーン・スティープ粉、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、乳酸などの最適濃度もまた確立される。

以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、これらの実施例により本発明の範囲が限定されない。

・A. tumefaciensの分離および同定
ＬＢ固形培地上で土壌試料から得られたおよそ1×10⁶細菌より、補酵素Ｑ₁₀を産生する好ましい株が一次スクリーニングされた。次にそれらからの二次スクリーニングにより、高いバイオマス増殖速度および高い補酵素Ｑ₁₀生産性と見なされる５００細菌が分離され得た。最終的に補酵素Ｑ₁₀生産性が最も高い細菌がスクリーニングされた。補酵素Ｑ₁₀を高濃度で産生すると最終的にスクリーニングされたこの細菌の同定が、16ＳｒＲＮＡ配列決定により行われた（Jukes, T.H. & Cantor C.R., 1969）。

図１は、本発明である、補酵素Ｑ₁₀産生Agrobacterium tumefaciens BNQの16SリボソームRNA部分配列を示す。さらに類縁種からの16ＳｒRＮＡ配列間の相同性解析結果が、表３に示されている。

高濃度で補酵素Ｑ₁₀を産生する株の16ＳｒRＮＡ部分配列についての上記相同性解析に
おいて、実施例１で選択された株がA. tumefaciens株として同定され、A. tumefaciens BNQと名づけられた。

・A. tumefaciensＤＸＳ遺伝子のクローニング
ＤＸＳ遺伝子のクローニングのために、A. tumefaciensのｃＤＮＡが分離された。他の株からの最も近い公知ＤＸＳアミノ酸配列を参照して、１対のPCRプライマーが作製され
た。次はA. tumefaciensからのＤＸＳ遺伝子をクローニングするための１対のプライマーである。

上記プライマーは、A. tumefaciensのｃＤＮＡから873ｂｐのＤＮＡを増幅するために
使用された。種々の微生物に由来するＤＸＳのＤＮＡ配列との比較から、得られたPCR産
物は実在するＤＸＳと最も高い類似性を有することが判った。完全長のＤＸＳ遺伝子を入手するために、５'-および３'-RACE（ｃＤＮＡ末端部分の急速増幅）方法が使用され、それは５'-および３'-RACEキットを使用し、製造会社のマニュアル（ロシュ・ダイアグノシス GmbH、マンハイム、ドイツ）に従って行なわれた。ＤＸＳ遺伝子に特異的なプライマーが、各RACEのために作製された。

i) ５'-RACE用プライマー

ii) ３'-RACE用プライマー

これらのプライマーを使用するRACEの実施により、ＤＸＳを含有するｃＤＮＡが増幅された。ＤＸＳ遺伝子のオープンリーディングフレームを得るために、開始コドンにより開始され、終結コドンにより終結されるPCRプライマーが調製された。クローニング操作を
促進するために、BamHI制限部位が順方向プラマーに含まれ、HindIII制限部位もまた逆方向プライマーに含まれた。各プライマーのＤＮＡ配列は次の通りである。

これらのプライマーを使用するPCRにより5'位置および3'位置において、それぞれBamHI制限部位とHindIII制限部位とに隣接している、1920ｂｐのＤＸＳｃＤＮＡが得られた（
図２）。得られたｃＤＮＡは、翻訳され、ＤＸＳの既に知られているアミノ酸配列とも比較された。その結果、公知の配列と比較して37〜59％の類似性が示され、ＤＸＳアミノ酸配列に本質的に見出される要素、チアミンジホスフェートの結合領域、水素伝達に関係していると目されるヒスチジン残基が充分に保存されていることが確認された（図３）。

・A. tumefaciensに由来するＤＸＳ遺伝子のE.coliにおける発現システムの確立
ＤＸＳの活性を決定するために、この酵素は、A. tumefaciensからのＤＸＳ遺伝子のクローニング後、E.coliにおいて発現された。E.coli組換えタンパク質の発現システムの中で、よく知られたｐQEシステム（キアゲン社、米国）が、T５プロモーターを含むために
、このシステムが用いられた。

ＤＸＳ遺伝子フラゲメントは5'末端でBamHI制限部位を含み、また3'末端においてHindIII制限部位を含むために、両制限酵素、BamHI、HindIIIが同時に処理された。1.9ｋｂＤ
ＸＳ遺伝子が、抽出されてからアガロースゲル上で分離され精製された。それからこのようなBamHIおよびHindIIIの両制限酵素処理が発現ベクター、ｐQE３０（3.4ｋｂ）におい
ても実施された。その結果、1.9ｋｂのＤＸＳ遺伝子がクローンされ、ベクター中に挿入
されて、ｐQX11と名づけられた（図４）。

・IPTG誘導を通じて、ＤＸＳ遺伝子のE.coliでの発現と精製
ｐQX11ベクターを用いて形質転換されたE.coliJM109がインキュベートされ、それは続
いて30℃で、0.1mMのIPTGで、光学密度（600nm）が0.5になる2時間処理された。その後ＤＸＳ発現が誘導された。発現されたタンパク質の可溶性画分がNi-NTA樹脂と混合されてから、その混合物をカラムに通した。240ｍMイミダゾール含有緩衝液を用いて活性場所部分のみが専ら分離された。

注目の発現タンパク質は、10%SDS電気泳動法を用いて単離された。試験物質（1%SDS、5%β-メルカプトエタノール、10%グリセロール、ブロモフェノールブルー）がサンプル溶
液と混合され、煮沸された。検出には、色素、クーマシーブリリアントブルーR-250も使
用された。

ｐQE発現システムを用いたSDS-PAGEデータが図５に示されている。ＤＮＡ配列決定に基づくアミノ酸配列データによって、ＤＸＳの大きさは、68.05ｋDaであると推定され、こ
れはSDS-PAGEにおけるバンドにより確認された。

・ＤＸＳ活性の測定
ＤＸＳ活性を測定するために、20μgの精製ＤＸＳを、1mM塩化マグネシウム、1mMチア
ミンジホスフェート、1mMピルビン酸、2mMグリセルアルデヒド3-ホスフェートおよび5mM
メルカプトエタノールを含有する40mMのTris-HCl緩衝液（pH8.0）と混合した。それから
この混合物を37℃で1時間反応させた。反応混合物を13,000rpmで遠心分離した後、上清を回収した。次いで反応性生物をZorbax-NH₂カラム（アジレント・テクノロジー社、パロアルト、CA）および195nm紫外域検出器を有するHPLCにより分析した。溶出液は、100mMリン酸二水素カリウム、pH3.5であり、流速は1.3ml/分であった。

酵素反応の生成物の分析を通じて、ＤＸP（1-デオキシ-D-キシルロース-5-ホスフェー
ト）が期待通り生成したことがHPLCのクロマトグラフィーにより、確認された（図６）。さらにＤＸPは酵素反応においてTDP(チアミンジホスフェート)がないと生成しないことから、本発明者らは、A. tumefaciensからクローンされた遺伝子がＤＸＳであることを確認した。

・組換えプラスミドの構築
ＤＰＳおよびＤＸＳの遺伝子を含むｃＤＮＡを構築するために、本発明者らが以前に開発した、組換えプラスミドのｐQD22およびｐQX11を鋳型として用いるPCRを実施した。Ｄ
ＰＳのｃＤＮＡを増幅するための1対のプライマーは次の配列の通りである。ＤＰＳの5'
ＤＮＡフラグメントはHindIII制限部位を有しており、ＤＰＳの3'ＤＮＡフラグメントはMluI制限部位を有している。

ＤＸＳのｃＤＮＡを増幅するための1対のプライマーは次の配列の通りである。ＤＸＳ
の5'ＤＮＡフラグメントはHindIII制限部位を有しており、ＤＸＳの3'ＤＮＡフラグメン
トはEcoRI制限部位を有している。

PCR産物はアガロースゲル電気泳動において展開され、回収されたバンドが精製された
。次いで精製されたＤＮＡフラグメントは、クローニングベクターのｐSTBlue-1 (Novagen社)とライゲートした。組換えプラスミドはE.coli XL1-Blueに挿入され、一晩50mg/Lア
ンピシリン培地で培養された。

組換えプラスミドにおける挿入ＤＮＡは、制限地図の確認とともにＤＮＡ配列分析により確認された。ＤＰＳをコードするｃＤＮＡフラグメントは、制限酵素、HindIIIおよびMluIにより得られ、ＤＸＳをコードするｃＤＮＡフラグメントは制限酵素、HindIIIおよびEcoRIによって得られた。各々のｃＤＮＡセグメントは、A. tumefaciens用の発現ベクタ
ー、ｐGA748にライゲートされた。その後、E.coliは発現ベクターによって形質転換され
た。生成したプラスミドは、それぞれpGP85およびpGX22と名づけられた（図７）。

ＤＰＳおよびＤＸＳを同時に発現することができる発現ベクターを構築するために、鋳型としてRBS含有ＤＸＳプラスミド、ｐGX22を用いるPCRを実施した。ＤＸＳの5'ＤＮＡフラグメントはXhoI制限部位を有しており、ＤＸＳの3'ＤＮＡフラグメントはClaI制限部位を有している。

PCR産物は、制限酵素XhoIおよびClaIを用いて消化され、それはアガロースル電気泳動
の後において、はっきりと溶出された。ＤＸＳフラグメントは、プラスミドｐGP85にライゲートされ、E.coliは形質転換された。形質転換されたE.coliから抽出され、配列決定されたプラスミドは、pGPRX11と名づけられた

・電気穿孔法を用いる組換え微生物の調製
コンピーテント細胞を得るために、補酵素Ｑ₁₀産生細菌、BNQ605がLB培地で、細胞密度が5〜10×10⁷細胞/mlになるまで培養された。遠心分離後、得られた細胞は、EPB1緩衝液
（20mM Hepes pH7.2、5%グリセロール）で３回洗浄され、EPB2緩衝液（5mM Hepes pH7.2、15%グリセロール）に懸濁された。該細胞は−70℃で保存された。

7〜10μgの組換えプラスミド、pGP85、pGX22およびpGPRX11は、電気穿孔機（MicroPulser, バイオラド社）を使用して、0.5秒間に２５μF、2.5kVの電気刺激により、８０μlのコンピーテント細胞（上記で入手したもの）に挿入された。１ｍｌのLB液体培養基（broth）を加えて３０℃で２〜３時間インキュベートした後、これらの細胞は、３μg/ml テ
トラサイクリンを追加したLB固形培養基に置かれた。その後、該細胞は30℃で７２時間インキュベートされた。最終的に目的のDNAを挿入されるべき細胞群コロニーがスクリーニ
ングされた。

組換えプラスミドの挿入はコロニーPCRによって確認された。コロニーPCRのために使用
された1対のプライマーは、発現ベクターｐGA748のマルチクローニング部位（MCS）の前
部-および後部-ＤＮＡ配列に基づいている。プライマー配列は次の通りである。

コロニーPCRの結果から、組換え発現ベクター、pGP85およびpGX22はA. tumefaciens BNQ0605の補酵素Ｑ₁₀産生株に正常に挿入されたことが確認された。形質転換された株の中
で、pGP85で形質転換された株は、BNQ-pGP85と名づけられ、pGX22で形質転換された株は
、BNQ- pGX22と名づけられ、さらにpGPRX11で形質転換された株は、BNQ-ｐGPRX11（受託
番号KCCM-10554）と名づけられた。

・補酵素Ｑ₁₀産生能力の決定
実施例６で調製された組換え株、BNQ-pGP85、BNQ- pGX22およびBNQ-ｐGPRX11について
の補酵素Ｑ₁₀産生能力を決定するために、これらの株を、３μg/ml テトラサイクリン含有LB液体培養基5mlに接種し、30℃、240rpmで、一晩培養した。コントロールとして、プ
ラスミドｐGA748だけを挿入した正常株、BNQ-ｐGA748を用いて、上記と同様の条件下で培養した。補酵素Ｑ₁₀産生株の増殖と補酵素Ｑ₁₀産生能力の結果が表４に提示されている。

・基本的培養条件の最適化
上記で同定された組換え株、BNQ-ｐGPRX11を基本的培養条件下での最適化実験を行なうために使用した。諸条件、例えば温度（25℃〜35℃）、ｐH（6.0〜8.0）、撹拌条件（300〜600ｒｐｍ）および通気条件（0.5〜2.0ｖｖｍ）といった条件を変更するインキュベー
ションを実施することにより、バイオマスの増殖および補酵素Ｑ₁₀の生合成に対する最適の条件が、最適温度32℃、最適ｐＨ7.0、500rpmの撹拌条件、1.0vvmの通気速度であるこ
とが確認された。表５は、BNQ-ｐGPRX11株培養によって、細胞液体培養基、補酵素Ｑ₁₀量の比較を示す。

・溶存酸素の制御
実施例８で行なわれた基本的培養条件の下、培養基中の溶存酸素濃度は、24時間の培養後には約０に低下した。撹拌を調整することにより溶存酸素濃度が0〜10、10〜20、20〜30％に調整された場合、0〜10%の溶存酸素濃度が、最良のバイオマスの増殖および補酵素
Ｑ₁₀生合成をもたらした。この実験によれば、バイオマス量は54.1g/Lに、ならびに生合
成された補酵素Ｑ₁₀量は281.6mg/Lに増加した。表６は、溶存酸素濃度によるBNQ-ｐGPRX11の補酵素Ｑ₁₀産生を示す。

・流加培養
バイオマス量を増大させるために流加培養法が適用された。このため炭素源が枯渇するや否や、50g/L糖が間欠的に加えられた。この実験によると、バイオマス量は70.2 g/L、
生合成された補酵素Ｑ₁₀量は、352.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀
量は5.02 mg/g-細胞であった。表７は、回分培養と比較した場合の流加培養による補酵素Ｑ₁₀産生能力を示す。

・培養基中のコーン・スティープ粉の最適濃度
培養基中の窒素源として用いた、コーン・スティープ粉の最適濃度が実験によって測定された。実験結果から、20g/Lのコーン・スティープ粉を添加した場合、バイオマス量は71.2 g/L、生合成された補酵素Ｑ₁₀量は、438.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀量は6.16 mg/g-バイオマスであることが判った。表８は、コーン・スティープ粉の濃度に応じたバイオマス量、生合成された補酵素Ｑ₁₀量、バイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀量を示す。

・培養基中のリン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムの最適濃度
リン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムの最適濃度が実験により測定された。最適濃度は、リン酸二水素カリウムおよびリン酸二カリウムがそれぞれ1.6g/L、添加されたときに達成されることが確認された。この実験によると、バイオマス量は71.4 g/L、生合成された補酵素Ｑ₁₀量は、472.6mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀量は6.62 mg/g-細胞であることが判った。

・培養基中の硫酸アンモニウム最適濃度
実験によるとバイオマスに補酵素Ｑ₁₀産生するため、硫酸アンモニウムの最適濃度は、硫酸アンモニウムが15g/L添加された場合に達成された。96時間の培養後、バイオマス量
は79.2 g/L、生合成された補酵素Ｑ₁₀量は、548.2mg/Lであり、バイオマス単位量あたり
の補酵素Ｑ₁₀量は6.92mg/g-細胞であることが判った。表９は、硫酸アンモニウムの濃度
に応じたバイオマス量、生合成された補酵素Ｑ₁₀量およびバイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀量を示す。

・ｐH-スタットを使用する流加培養
炭素源についてｐH-スタットを用いる流加培養法ならびに炭素源を間欠的に供給する従来の流加培養法が実施された。バイオマス量および補酵素Ｑ₁₀量を増大させる最善の方式を見出すために上記２つの流加培養法が比較された。実験結果からは、炭素源についてｐH-スタットを用いる流加培養法の方が間欠的に供給する流加培養法よりも効率的であった。この実験によると、バイオマス量は88.2 g/L、生合成された補酵素Ｑ₁₀量は、642.1mg/Lであり、バイオマス単位量あたりの補酵素Ｑ₁₀量は7.30 mg/g-細胞、生産性は6.69mg/g-hrであった。

図１は、本発明の補酵素Ｑ₁₀産生Agrobacterium tumefaciensＢＮＱの１６ＳリボソームＲＮＡ部分配列を示す。図２は、A. tumefaciensからクローンされた１-デオキシ-Ｄ-キシルロース５-ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）全体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。酵素のサイズは６８ｋＤａである。図３−１は、クローンされた本発明ＤＸＳのアミノ酸配列ならびに他の微生物からのＤＸＳ配列の間において、比較のために整列させた後のアミノ酸相同性を示す。星印は同一箇所を示す。水素伝達に関係すると考えられているヒスチジン残基を有し、保存されたモチーフは、ボックスで示している。以下は各ＤＸＳが由来する微生物である。 ATUM:本発明者らによりクローンされたＤＸＳ、ECLI:E.coli、 HINF: H. influenzae、 BSUB:B.subtilis、 RCAP:R. capsulatus、 SYNE:Synechocystis sp. PCC6803、 ATHA: A. thaliana および CLA190:Streptomyces sp. strain CL190 図３−２は、クローンされた本発明ＤＸＳのアミノ酸配列ならびに他の微生物からのＤＸＳ配列の間において、比較のために整列させた後のアミノ酸相同性を示す。星印は同一箇所を示す。水素伝達に関係すると考えられているヒスチジン残基を有し、保存されたモチーフは、ボックスで示している。以下は各ＤＸＳが由来する微生物である。 ATUM:本発明者らによりクローンされたＤＸＳ、ECLI:E.coli、 HINF: H. influenzae、 BSUB:B.subtilis、 RCAP:R. capsulatus、 SYNE:Synechocystis sp. PCC6803、 ATHA: A. thaliana および CLA190:Streptomyces sp. strain CL190 図４は、組換えプラスミドｐQX11の構造を示す。図５は、ｐQX11を宿すE.coliで発現されたＤＸＳのSDS-PAGE分析を示す。レーンA:野生型E.coli、レーンB:IPTG処理を用いてｐQX11で形質転換されたE.coli、レーンC:発現ＤＸＳの精製された標準、レーンＤ:マーカー図６は、E.coliで発現されたＤＸＳ酵素の生成を表すクロマトグラムを示す。Ａ：野生型E.coliの細胞抽出液を用いた結果、Ｂ：精製ＤＸＳを用いた結果、Ｃ：チアミンジホスフェートを添加せずにＢと同一条件を用いた結果。図７は、組換えプラスミドｐＧＰ85およびｐＧＸ22の構造を示す。図８は、組換えプラスミドｐＧＰＲＸ１１の構造を示す。図９は、ｐＨ-スタットを使用する流加培養で、５Ｌファーメンタにおける、発酵時間の経過に従った補酵素Ｑ₁₀の産生および細菌細胞の増殖を示す。

Claims

補酵素Ｑ₁₀を最大限に産生するために、韓国微生物培養株センターに寄託されて受託番号ＫＣＣＭ-１０５５４を有するAgrobacterium tumefaciens形質転換細胞を使用し、以下の工程を含む発酵方法：
i) 形質転換細胞のAgrobacterium tumefaciens（ＫＣＣＭ-１０５５４）を、50ｇ/Ｌのスクロース、15ｇ/Ｌの酵母エキス、15ｇ/Ｌのペプトンおよび7.5ｇ/ＬのＮａＣｌを含有する増殖培地で培養させる工程；
ii) 30〜50ｇ/Ｌのコーン・スティープ粉、0.3〜0.7ｇ/ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、0.3〜0.7ｇ/ＬのＫ₂ＨＰＯ₄、12〜18ｇ/Ｌの硫酸アンモニウム、1.5〜2.5ｇ/Ｌの乳酸、0.2〜0.3ｇ/Ｌの硫酸マグネシウムを含む生産培地上で、培地への通気速度が、培地単位体積当り毎分0.8〜1.2空気体積であり、温度30〜34℃、ｐＨ6.0〜8.0の条件下で、前記細胞を培養する工程；
iii) 発酵培地から前記細胞および他の残存物を除去する工程；および
iv) 工程iii)の発酵培地から補酵素Ｑ₁₀を分離し回収する工程。