CN113444702A

CN113444702A - 烯酮还原酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN113444702A
Application number: CN202110656803.2A
Authority: CN
Inventors: 陈小龙; 褚定军; 陈翰驰; 朱林江; 冯佳程; 陆跃乐; 谢晓强
Original assignee: Aurisco Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Aurisco Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113444702B

Abstract

本发明公开了烯酮还原酶突变体及其在不对称加氢制备布瓦西坦中间体的应用。所述突变体是通过对氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的野生型烯酮还原酶进行突变改造后得到的突变体。该烯酮还原酶突变体在不对称还原4‑丙基‑2(5H)‑呋喃酮(化合物II)制备目标产物布瓦西坦中间体(R)‑4‑正丙基二氢呋喃‑2(5H)‑酮(化合物I)中表现出显著性的优点。将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以化合物II为底物，在NAD(P)⁺/NAD(P)H辅酶循环系统辅助下，进行不对称C＝C加氢还原反应，制备布瓦西坦中间体(化合物I)，其底物转化率>99％，布瓦西坦中间体产物的ee值>99％，表现出良好的工业应用性能。

Description

烯酮还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及医药中间体技术领域，具体涉及应用生物酶法不对称生物合成布瓦西坦中间体，更具体地，涉及烯酮还原酶突变体及其应用。

背景技术

布瓦西坦(Brivaracetam)(化学名称为(2S)-2-((4R)-2-氧代-4-丙基-1-吡咯烷基)-丁酰胺，化学结构式如下所示)是由比利时优时比(UCB)公司开发的第三代抗癫痫药物(商品名为

)。于2016年1月14日和2016年2 月18日分别在欧洲和美国上市，用于成人及16岁及以上青少年癫痫患者的部分发作，伴有或不伴有继发性全身性发作的辅助治疗。作用机制与左乙拉西坦一致，但与脑内突出囊泡蛋白(SV2A)结合力强于左乙拉西坦10倍；药代动力学参数、药理学特性及安全性也明显优于左乙拉西坦。目前左乙拉西坦的市场表现良好，如2011-2015年间左乙拉西坦的平均年销售额超过10亿美元。而优于左乙拉西坦临床表现的布瓦西坦，具有良好的市场预期，开发其新的合成技术，具有重要的经济价值和社会意义。

已报道的布瓦西坦的合成方法包括化学法不对称合成、化学法手性拆分、酶法手性拆分和酶法不对称合成。由于布瓦西坦存在两个手性中心，酶法不对称合成被认为是最具技术竞争优势的方法。近几年，酶法C＝C不对称加氢合成布瓦西坦中间体的方法也陆续报道，包括CN107604018A、CN109852644A、 CN111154735A、CN111286509A和CN112143764A。CN107604018A虽然公开了烯酮还原酶对底物4-正丙基呋喃-2(3H)-酮(化合物II)的C＝C不对称加氢法而制备布瓦西坦中间体(R)-4-正丙基二氢呋喃-2(5H)-酮(化合物I)的应用，但是缺乏关键酶信息，其实际应用效果未知。CN111154735A也公开了应用烯酮还原酶制备化合物I方法所涉及的酶相关信息和产物ee值，但是底物转化率未知。CN109852644A和CN112143764A选择了不同的底物，即不同的布瓦西坦中间体合成路线。总体上，以化合物II为底物的酶法不对称加氢制备布瓦西坦中间体化合物I，已有报道的方法中，其底物转化率未知，酶催化效率不明确等问题。

现有技术虽然存在对烯酮还原酶突变体进行突变改造的技术，例如CN111041009A公开了一种烯烃还原酶OYE1突变体，其在116位和/或37位氨基酸位点具有取代突变，与本申请序列存在一定差异；The role of threonine 37in flavin reactivityof the old yellow enzyme公开了在第37位进行OYE1改造，The Effects of Active SiteMutations on Old Yellow Enzyme 1公开了在第116 和37位的突变株改造，上述现有技术虽然存在一定的改进基础但仍然存在活性不高的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种烯酮还原酶突变体及其应用。

在一个方面，本发明提供了一种烯酮还原酶突变体，其由氨基酸序列如 SEQ IDNO:2所示的野生型烯酮还原酶在选自第73、117、119、197、252、 253、296、297、376之中的一个或多个位点进行突变获得。

所述突变的方式为将上述位点的氨基酸突变为A、G、V、L、I、P、F、 Y、W、S、T、C、M、N、Q、D、E、K、R、H中的一种。优选的突变为丙氨酸A突变。

在一个实施方案中，突变进一步优选为在第296位进行突变。

进一步的，所述第296位的突变选自P296A、P296C、P296D、P296E、 P296F、P296G、P296H，P296L，P296I，P296M，P296N，P296Q， P296R，P296S，P296T，P296V，P296W，P296K，P296Y中的一个。优选 P296A。

进一步的，所述烯酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQID NO:3保持同等功能的70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上85％以上、86％以上、87％以上、 88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、 95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的变体，以及氨基酸片段或在严格条件下杂交的序列。

在一个方面，本发明提供了编码所述烯酮还原酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者与SEQ ID NO:4保持同等功能的70％以上、 71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、 78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的变体，以及氨基酸片段或在严格条件下杂交的序列。

在一个方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含编码本发明烯酮还原酶突变体的基因。

在一个方面，本发明提供了一种重组菌，所述重组菌包含编码本发明烯酮还原酶突变体的基因。

在一个方面，本发明提供了烯酮还原酶突变体或编码所述烯酮还原酶突变体的基因在酶催化不对称还原4-丙基-2(5H)-呋喃酮(化合物II)制备布瓦西坦中间体(R)-4-正丙基二氢呋喃-2(5H)-酮(化合物I)中的应用。

上述应用包括：构建含有所述突变体编码基因的重组菌，以重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶制剂为催化剂，对化合物II进行不对称加氢反应，获得化合物I。

所述不对称加氢反应是在NAD(P)⁺/NAD(P)H辅酶循环系统协同作用下进行，所述辅酶循环系统选自醇脱氢酶/异丙醇、甲酸脱氢酶/甲酸盐、葡萄糖脱氢酶/葡萄糖。

在不对称加氢反应体系中，含烯酮还原酶突变体的细胞用量为5～50g/L 的湿细胞，辅酶细胞的用量为2～5g/L的湿细胞，化合物II用量为0.1％～1.0％， NAD(P)⁺用量为0.05～0.2mM，异丙醇用量为1％～10％，水解过程控制 pH7.0～9.0，温度20℃～40℃。

本发明比较了多种不同来源的烯酮还原酶的催化活性后，确定来源巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)(NCBI登录号：Q02899)的烯酮还原酶OYE1 (亦称老黄酶1)具有最优的催化活性，即催化化合物II不对称加氢合成化合物I。随后对OYE1进行半理性设计和突变改造，获得了在野生型序列的基础上第73、117、119、197、252、253、296、297、376进行突变的变体，并且获得了最优突变位点即第296位，并进一步在第296位进行了突变筛选，P296A、P296C、P296D、P296E、P296F、P296G、P296H、P296L、P296I、 P296M、P296N、P296Q、P296R、P296S、P296T、P296V、P296W、P296K、 P296Y，获得了催化活性显著提高的OYE1突变体OYE1-P296A，简称 OYE296A。

所述烯酮还原酶突变体OYE296A的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。应用该酶的三维晶体结构(PDB ID:1OYA)，进行与底物的分子对接模拟分析，结合酶催化机理(Williams,RE,et al.Microbiology(2002),148,1607–1614)，进行半理性设计与突变改造，即针对老黄酶OYE1底物结构口袋中潜在的关键作用氨基酸残基进行丙氨酸突变分析，再对特定位点进行饱和突变，从而筛选得到烯酮还原酶突变株OYE296A。

所述的烯酮还原酶突变株OYE296A的核苷酸序列可根据其氨基酸序列进行人工合成，其优选序列为SEQ ID NO:4。所述的突变株OYE296A基因序列及重组表达质粒的构建如下：首先根据烯酮还原酶OYE1的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，进行密码子优化并进行基因人工合成，其优选的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；将OYE1基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a上，构建重组表达质粒pET28a-OYE1；通过定点突变的方法，在296位引入突变，即第296位脯氨酸突变为丙氨酸，得到重组表达质粒pET28a-OYE1-P296A，从而获得烯酮还原酶突变株OYE296A的核苷酸序列SEQ ID NO:4。

所述的烯酮还原酶突变体的应用，是将含有该烯酮还原酶突变体 OYE296A基因克隆到表达载体并通过宿主细胞进行过量表达，制备得到含有序列氨基酸序列为SEQ ID NO:3的烯酮还原酶突变体OYE296A，并将其应用于催化化合物II的不对称加氢反应制备目标产物布瓦西坦中间体，即化合物I，原理如图1所示。

所述的表达质粒和宿主细胞，其优选的表达载体为pET28a，优选的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。将重组表达质粒pET28a-OYE1-P296A转化E.coli BL21(DE3)菌株，得到表达OYE296A工程菌株E.coli BL21(DE3) (pET28a-OYE1-P296A)，简称E.coli IEF-OYE296A。

本发明的烯酮还原酶突变体的应用方法，是将工程菌株E.coli OYE296A 发酵后得到OYE296A发酵液，经过细胞破碎得到粗酶液或者收集全细胞作为 OYE296A酶的制剂，用于催化反应。

所述的催化反应体系包含：细胞湿重为5-50g/L的OYE296A粗酶液， NAD(P)⁺/NAD(P)H辅酶循环系统，0.05-1.0mmol/L的辅酶NAD(P)⁺， 0.01％-1.0％的底物化合物II(优选0.3％)，过程控制pH6.0-8.5(优选pH7.0)，温度为25℃-40℃(优选30℃)。

所述的NAD(P)⁺/NAD(P)H辅酶循环系统为常用的辅酶循环系统，包括醇脱氢酶/异丙醇、甲酸脱氢酶/甲酸盐、葡萄糖脱氢酶/葡萄糖等，优选短乳杆菌 (Lactobacillusbrevis)来源的醇脱氢酶lbADH和异丙醇。

本发明提供的烯酮还原酶突变体，催化还原0.01％-1.0％的化合物II制备布瓦西坦中间体，其底物化合物II的转化率>99％，产物布瓦西坦中间体化合物I的ee值>99％。

有益的效果

与现有的酶法不对称还原化合物II制备目标产物布瓦西坦中间体化合物I 的技术相比，如CN107604018A、CN109852644A、CN111154735A等，本发明申请的创新性包括：①底物投料量较高；②实现底物的高转化率(>99％) ③具有良好的产物ee值(>99％)。

我们比较了多种来源的烯酮还原酶的催化活性，即以化合物II为底物，进行不对称加氢制备化合物I，并确定了来自巴氏酵母老黄酶(属于烯酮还原酶)OYE1具有最佳的催化活性。

并通过半理性设计和突变改造，筛选得到催化性能提高的突变体，其催化速率和底物转化率显著提高，优化的突变体实现了底物转化率大于99％和产物 ee值大于99％的技术效果，表现出良好的工业应用特性。

附图说明

图1为烯酮还原酶不对称加氢制备布瓦西坦中间体的反应式；

图2为烯酮还原酶OYE1的底物结合口袋及与底物分子对接的示意图；

图3为野生型OYE1催化不对称加氢反应样品的GC分析图谱；

图4为外消旋化合物I的手性柱分析的GC色谱图；

图5为突变体OYE296A催化反应化合物II不对称加氢反应的终点样品的GC色谱图；

图6为野生型酶OYE1与突变体OYE296A底物通到入口的三维结构示意图。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。

发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L、 KH₂PO₄3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L、卡那霉素50μg/L、pH7.0。

pH 7.0磷酸缓冲溶液(200mM)：Na₂HPO₄·12H₂O 67.8g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.82g/L。

实施例1不同来源的烯酮还原酶重组表达系统的构建

从NCBI数据库中筛选了13个候选的烯酮还原酶，分析对化合物II的C＝C 不对称加氢的催化活性，其NCBI的登录号如表1所示。根据这些酶的氨基酸序列，发送给基因合成公司(华大基因青兰生物科技有限公司)，经过密码子优化后，进行人工合成基因，并克隆到表达载体pET28a的NdeI/BamHI之间，获得重组质粒，如pET28a-OYE1。

将各个酶基因的重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中，具体操作如下：取50ng的重组质粒，加入到100μL的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激45s，冰水孵育3min。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃孵育60min。取200 μL菌液，均匀涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于 37℃过夜培养。经过菌落PCR验证为阳性克隆后，经过含有50μg/mL卡那霉素的LB平板划线纯化和LB液体培养基的摇床培养，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到验证正确的阳性克隆子。最终获得各个酶的重组表达的大肠杆菌工程菌，用于酶的表达和酶催化活性分析。

实施例2辅酶循环系统的重组大肠杆菌工程菌的构建

应用辅酶NAD(P)⁺/NAD(P)H的循环系统，避免使用价格昂贵的NADH原料，改用价格相对较低的NAD(P)⁺为原料，且用量显著下降，降低生产成本。选择基于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源的醇脱氢酶lbADH和异丙醇的辅酶循环系统。将lbADH的氨基酸序列(NCBI ID：WP_011668302)发送给基因合成公司(华大基因青兰生物科技有限公司)，经密码子优化后人工合成 lbADH的基因并克隆到表达载体pET28a的NdeI/BamHI之间，获得辅酶循环的重组质粒pET28a-lbADH。将以上重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)菌株中，得到表达辅酶循环系统的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) (pET28a-lbADH)，将其分别命名为E.coli IEF-lbADH。

实施例3烯酮还原酶和醇脱氢酶lbADH的表达与纯化

将实施例1制备的烯酮还原酶的表达菌株经过平板划线活化，挑取单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L 的大肠杆菌发酵培养基中，37℃培养3h，加入终浓度为1.0mM IPTG，控制发酵温度25℃，继续发酵6h，获得湿菌体的含量为5g/L的发酵液。

离心发酵液，用pH7.5，50mM Tris-HCl缓冲液重新悬浮，采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快纯化。

采用Takara公司的金属镍螯合琼脂糖凝胶(His60 Ni Superflow Resin andGravity Columns)层析系统进行烯酮还原酶的亲和纯化。取约3.0mL金属镍螯合琼脂糖凝胶填料于层析柱中，静置后超纯水洗10个柱体积后备用；用10 个柱体积的平衡缓冲液(50mM磷酸钠，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4) 进行吸附柱的平衡；将上述操作中获得的粗酶液在4℃下12000rpm，离心10 min；取8.0mL上清液进行上样，上样后的层析柱封好两端，置于冰上缓慢震荡40-60min；重新竖直固定层析柱，排走上样液；用10倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，300mM NaCl，40mM咪唑，pH7.4)洗下非特异吸附的杂蛋白；然后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，300mM NaCl，300mM 咪唑，pH7.4)进行目的蛋白的洗脱，分管收集洗脱液，置于冰上保存。收集液汇集到透析袋内，置于4℃环境中以5mM，pH 7.0磷酸缓冲溶液作为透析液除盐。每隔4h更换透析缓冲液，共更换3次。透析结束后，在透析袋外部加PEG20000对酶液进行浓缩。浓缩完成后，按照Bradford试剂盒的使用手册测定纯化酶溶液的蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白质的纯度。

实施例4多种来源的烯酮还原酶对化合物II的催化活性比较

将上述纯化的烯酮还原酶和醇脱氢酶lbADH用于化合物II的不对称加氢反应。催化反应体系如下：～100μg/mL烯酮还原酶，～20μg/mL lbADH，2g/L 的化合物II，0.2mM的NADP⁺，5％的(v/v)异丙醇，50mM Tris-HCl缓冲液 (pH7.5)。将上述10mL的反应液置于50mL的圆底烧瓶中，磁力搅拌，30℃反应12h。在磁力搅拌的条件下，取样100μL反应液于1.0mL的乙酸乙酯中， 15000×g离心5min，取上清用于气相色谱分析。

气相色谱分析方法：毛细管色谱柱：DB1701 30m×0.53mm×1.5μm；柱温： 80℃，以15℃/min升温至240℃，保温10min；进样口温度：230℃；检测器温度：240℃；载气(N2)：5ml/min；分流比：20:1；进样量：1.0μL；空白溶液：乙酸乙酯。

不同来源的烯酮还原酶对化合物II的不对称加氢反应的活性比较如表1 所示。

表1不同来源的烯酮还原酶对化合物II的催化活性比较

由表1可知，其中OYE1和氧代植二烯酸还原酶OPR3的催化活性较高。 OYE1催化的反应液的GC分析图谱如图3所示，其中底物化合物II的保留时间为4.615min，产物化合物I保留时间为3.648min。

将OYE1和OPR3的催化反应液的样品用于手性柱的GC色谱分析，其 GC色谱分析方法如下：SUPELCO的色谱柱Beta Dex-225(30m×0.25mm，0.25 μm)，载气(H2)：2.5ml/min；进样口温度：220℃；检测器温度：240℃；柱箱平衡时间：2.00min，初始温度：60℃，以30℃/min升温至100℃，保温10min；以1.0℃/min升温至140℃，保温10min；保温10min；以15℃/min升温至180℃，保温10min；分流比30:1。

外消旋化合物I的手性柱分析的GC色谱图如图4所示。

产物对映体特性的GC分析结果表明，OYE1和OPR3的催化化合物II不对称加氢反应生成的产物为化合物I，其ee值大于99％。

实施例5烯酮还原酶OYE1活性口袋部位关键氨基酸的丙氨酸突变筛选

(1)烯酮还原酶OYE1活性口袋部位关键氨基酸的丙氨酸突变子构建

为了提高野生型烯酮还原酶OYE1的催化反应速率和底物转化率，采用计算机辅助设计选择OYE1的定点突变位点。根据已报道烯酮还原酶晶体结构 (PDB ID：3tx9.1)，对烯酮还原酶OYE1进行同源建模，如图2所示。利用蛋白质三维结构分析软件和分子对接软件，进行模拟分析。综合考虑烯酮还原酶与底物对接结果、酶的底物结合口袋特点、酶识辨底物立体选择的结构特点、酶的催化机制，最终对氨基酸序列SEQ ID NO:2的第73位甘氨酸G73，第117 位色氨酸W117，第119位亮氨酸L119，第197位缬氨酸Y197，第252位天冬酰胺N252，第253位丝氨酸S253，第296位脯氨酸P296，第297位苯丙氨酸F297，第377位酪氨酸Y377突变成丙氨酸。

根据SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，设计9个突变子的突变引物，见表2所示。以载体pET28a-OYE1为模板，进行PCR扩增整个质粒。经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶消化处理PCR产物1h，消化含甲基化的模板质粒。将消化后的PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经过菌落 PCR验证和测序验证，即获得了目标位点发生突变的烯酮还原酶突变体。

表2 OYE1活性口袋部位关键氨基酸的定点突变引物

(2)烯酮还原酶OYE1活性口袋的丙氨酸突变子的催化活性比较

对SEQ ID NO:2所述的OYE1底物结合口袋的9种定点突变子，采用相同催化条件下，评价各个突变体的催化活性。

按照实施例2的方法，经过诱导表达和镍柱纯化，得到9种突变体纯酶与 lbADH的纯酶。催化化合物II的不对称加氢反应体系如下：～100μg/mL的上述纯化的烯酮还原酶突变体，20μg/mL LbADH纯酶，2g/L的化合物II，终浓度0.2mM的NADP⁺，5％(v/v)异丙醇。将上述10mL的反应液置于50mL 的圆底烧瓶中，磁力搅拌，30℃反应12h。在磁力搅拌的条件下，取样100μL 反应液于1.0mL的乙酸乙酯中，15000×g离心5min，取上层乙酸乙酯溶液，按照实施例3的气相色谱分析方法进行分析产物形成情况。

烯酮还原酶OYE1和9个丙氨酸突变子的底物转化率如表3所示，结果表明OYE1P296A突变体的催化活性最高，而W117A、L119A、Y197A、N252A、 F297A的活性显著下降。

表3野生型OYE1和9个丙氨酸突变子的底物转化率

实施例6烯酮还原酶OYE1在P296位点进行饱和突变的构建与活性筛选

(1)烯酮还原酶OYE1在P296位点的饱和突变库的构建

根据SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，设计19个定点饱和突变引物，见表2所示。以载体pET28a-OYE1为模板，进行PCR扩增整个质粒，经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带。用限制性内切酶DpnI酶消化处理PCR产物1h，消化甲基化的模板质粒。将消化后的PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，经过菌落 PCR验证和测序验证，即获得了目标位点发生突变的烯酮还原酶突变体。

表3 OYE1的P296位点的定点饱和突变引物

(2)烯酮还原酶OYE1在P296位点饱和突变子的催化活性比较

对SEQ ID NO:2所述的OYE1的P296的19种定点饱和突变体，应用相同催化条件下，评价其催化活性。

按照实施例2方法，经过诱导表达和镍柱纯化，得到9种突变体纯酶与 lbADH的纯酶。催化化合物II的不对称加氢反应体系如下：～100μg/mL的上述纯化的烯酮还原酶突变体，20μg/mL LbADH纯酶，2g/L的化合物II，终浓度0.2mM的NADP⁺，5％(v/v)异丙醇。将上述10mL的反应液置于50mL 的圆底烧瓶中，磁力搅拌，30℃反应12h。在磁力搅拌的条件下，取样100μL 反应液于1.0mL的乙酸乙酯中，15000×g离心5min，取上层乙酸乙酯溶液，按照实施例3的气相色谱分析方法进行分析产物形成情况。。

野生型烯酮还原酶OYE1和19个P296饱和突变子的酶活分析如表4所示。结果表明，OYE1 P296A的催化活性最高。

将筛选得到最佳突变体OYE1 P296A简称为OYE296A。通过同源建模和分子对接的比较分析表明，OYE296A与野生型OYE1相比，结合口袋的体积有所增加，如图6所示，可能有助于底物进入酶的催化中心。

表4野生型烯酮还原酶OYE1与P296位点的定点饱和突变体的活性比较

实施例7突变株OYE296A在催化不对称加氢还原化合物II制备布瓦西坦中间体化合物I的应用

(1)烯酮还原酶突变株OYE296A与辅酶lbADH的发酵制备

将菌株E.coli IEF-OYE296A与E.coli IEF-lbADH从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃， 200rpm培养至对数生长中期，获得新鲜培养的种子液。

使用10L发酵罐制备E.coli IEF-OYE1-P296A发酵液，而在2.5L发酵罐中发酵制备E.coli IEF-LbADH发酵液。

发酵条件控制如下：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到含卡那霉素50mg/L的大肠杆菌发酵培养基中；30℃培养4h，加入终浓度为 10g/Lα-乳糖，控制发酵温度23℃，溶解氧DO控制大于20％，用25％的氨水控制发酵pH6.8，继续发酵12h，获得湿菌体含量为30g/L的发酵液，分别记为OYEP296A发酵液和lbADH发酵液。

辅酶lbADH粗酶液的制备：4000×g，4℃下，离心lbADH发酵液收集细胞；用50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)重新悬浮细胞，控制湿菌体密度为 20g/L；采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到lbADH粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

(2)底物添加量为0.2％时布瓦西坦中间体化合物I的制备

OYEP296A粗酶液的制备：4000×g，4℃下，离心OYEP296A发酵液收集细胞；用50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)重新悬浮，控制湿菌体密度在20g/L；采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

OYEP296A催化0.2％的化合物II的不对称加氢反应：取100mL的 OYEP296A粗酶液到500mL的圆底烧瓶中，再加入20mL的lbADH粗酶液加入10mL的异丙醇，加入0.4g的化合物II，加入终浓度为0.05mM的NADP⁺，最后补加50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)至总体积为200mL。在30℃，500rpm 磁力搅拌下进行催化反应。催化36h后结束反应。取0.2mL的反应液到0.8mL 的乙酸乙酯中，15000×g离心2min，取上清用于气相色谱分析。

底物和产物的浓度的GC分析方法：毛细管色谱柱：DB1701

30m×0.53mm×1.5μm；柱温：80℃，以15℃/min升温至240℃，保温10min；进样口温度：230℃；检测器温度：240℃；载气(N2)：5ml/min；分流比：20:1；进样量：1.0μL；空白溶液：乙酸乙酯。

产物的对映体过量值的GC分析方法：SUPELCO的色谱柱Beta Dex-225 (30m×0.25mm，0.25μm)，载气(H2)：2.5ml/min；进样口温度：220℃；检测器温度：240℃；柱箱平衡时间：2.00min，初始温度：60℃，以30℃/min 升温至100℃，保温10min；以1.0℃/min升温至140℃，保温10min；保温10min；以15℃/min升温至180℃，保温10min；分流比30:1。

反应终点的催化样品中，底物和产物浓度的GC分析图谱如图5所示。结果表明，底物化合物II的转化率>99％。通过手性柱的GC分析，产物化合物 I的ee值>99％。

(3)底物添加量为0.5％时的布瓦西坦中间体制备

OYEP296A粗酶液的制备：4000×g，4℃下，离心OYEP296A发酵液收集细胞；用50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)重新悬浮，控制湿菌体密度在60g/L；采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

OYEP296A催化0.5％的化合物II的不对称加氢反应：取100mL的 OYEP296A粗酶液到500mL的圆底烧瓶中，再加入20mL的lbADH粗酶液加入10mL的异丙醇，加入1.0g的化合物II，加入终浓度为0.1mM的NADP⁺，最后补加50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)至总体积为200mL。在30℃，500rpm 磁力搅拌下进行催化反应。60h后结束催化反应。取0.2mL的反应液到0.8mL 的乙酸乙酯中，15000×g离心2min，取上清用于气相色谱分析。

结果表明，底物化合物II的转化率>99％，产物化合物I的ee值>99％。

(4)1.0％的底物添加量时的布瓦西坦中间体制备

OYEP296A粗酶液的制备：4000×g，4℃下，离心OYEP296A发酵液收集细胞；用50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)重新悬浮，控制湿菌体密度在80g/L；采用高压细胞匀浆仪破碎细胞后，得到粗酶液，需尽快用于催化反应，避免长时间保存。

OYEP296A催化1.0％的化合物II的不对称加氢反应：取125mL的 OYEP296A粗酶液到500mL的圆底烧瓶中，再加入20mL的lbADH粗酶液加入10mL的异丙醇，加入2.0g的化合物II，加入终浓度为0.2mM的NADP⁺，最后补加50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)至总体积为200mL。在30℃，500rpm 磁力搅拌下进行催化反应。在催化反应过程中，催化60h后，补加0.1mM的 NADP⁺，再继续反应48h。取0.2mL的反应液到0.8mL的乙酸乙酯中，15000×g 离心2min，取上清用于气相色谱分析。

序列表

<110> 奥锐特药业股份有限公司

浙江工业大学

<120> 烯酮还原酶突变体及其应用

<141> 2021-05-17

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> Saccharomyces pastorianus

<400> 1

atgagcttcg tgaaagactt taaaccgcag gcgctgggtg ataccaacct gtttaagccg 60

attaagatcg gcaacaacga actgttacat cgcgcggtta ttcctcctct gacccgtatg 120

cgtgcgttac atcctggcaa cattccgaat cgcgattggg cggtggaata ttatacccag 180

cgcgcgcaac gtcctggcac catgattatt accgaaggcg cgtttatttc acctcaggcg 240

ggcggttatg ataatgcacc gggcgtgtgg tcagaagaac agatggtgga atggaccaaa 300

attttcaacg cgatccacga gaaaaaatcg tttgtgtggg tgcagctgtg ggttttaggt 360

tgggcggcgt ttcctgataa tctggcgcgt gatggcttac gctatgatag cgcgagcgat 420

aacgtgttta tggatgcgga acaggaagcg aaagcgaaaa aagcgaacaa cccgcagcat 480

agcctgacca aagatgagat taagcagtac atcaaggaat atgtgcaggc ggcgaaaaat 540

agcattgcgg cgggtgcgga tggtgttgaa attcatagcg cgaacggcta tctgctgaac 600

cagtttctgg acccgcatag caacacccgc accgatgaat atggcggcag cattgaaaat 660

cgcgcgcgct ttaccttaga agtggtggat gcgctggttg aagcgattgg ccatgaaaaa 720

gtgggcctgc gcttatcacc gtatggcgtg tttaacagca tgagcggcgg tgcggaaacc 780

ggtattgtgg cgcagtatgc gtatgttgcg ggcgaactgg aaaaacgtgc gaaagcgggt 840

aaacgcctgg cgtttgtgca tctggttgaa ccgcgcgtga ccaatccgtt tctgaccgaa 900

ggcgaaggcg aatatgaagg cggcagcaac gattttgtgt acagcatttg gaaaggcccg 960

gttattcgcg cgggtaactt tgcattacat ccggaagttg tgcgcgaaga agtgaaagat 1020

aaacgcaccc tgattggcta tggccgcttt tttattagca acccggatct ggtggatcgc 1080

ctggaaaaag gcctgccgct gaacaaatat gatcgcgaca ccttttatca gatgagcgcg 1140

catggctata ttgattaccc gacctatgaa gaagcgctga aactgggctg ggataagaaa 1200

tga 1203

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> Saccharomyces pastorianus

<400> 2

Met Ser Phe Val Lys Asp Phe Lys Pro Gln Ala Leu Gly Asp Thr Asn

1 5 10 15

Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Leu His Arg Ala

20 25 30

Val Ile Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Leu His Pro Gly Asn Ile

35 40 45

Pro Asn Arg Asp Trp Ala Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Arg Ala Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Thr Met Ile Ile Thr Glu Gly Ala Phe Ile Ser Pro Gln Ala

65 70 75 80

Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Val Trp Ser Glu Glu Gln Met Val

85 90 95

Glu Trp Thr Lys Ile Phe Asn Ala Ile His Glu Lys Lys Ser Phe Val

100 105 110

Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Asn Leu

115 120 125

Ala Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Ser Asp Asn Val Phe Met

130 135 140

Asp Ala Glu Gln Glu Ala Lys Ala Lys Lys Ala Asn Asn Pro Gln His

145 150 155 160

Ser Leu Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Ile Lys Glu Tyr Val Gln

165 170 175

Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His

180 185 190

Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser Asn

195 200 205

Thr Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe

210 215 220

Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Leu Val Glu Ala Ile Gly His Glu Lys

225 230 235 240

Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser Gly

245 250 255

Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Ala Gly Glu

260 265 270

Leu Glu Lys Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu

275 280 285

Val Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly Glu

290 295 300

Tyr Glu Gly Gly Ser Asn Asp Phe Val Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro

305 310 315 320

Val Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg Glu

325 330 335

Glu Val Lys Asp Lys Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe Ile

340 345 350

Ser Asn Pro Asp Leu Val Asp Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn

355 360 365

Lys Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Tyr Gln Met Ser Ala His Gly Tyr Ile

370 375 380

Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Trp Asp Lys Lys

385 390 395 400

<210> 3

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<213> Saccharomyces pastorianus

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Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Leu His Arg Ala

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Val Ile Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Leu His Pro Gly Asn Ile

35 40 45

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Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Asn Leu

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<210> 4

<211> 1203

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<400> 4

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attaagatcg gcaacaacga actgttacat cgcgcggtta ttcctcctct gacccgtatg 120

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ggcggttatg ataatgcacc gggcgtgtgg tcagaagaac agatggtgga atggaccaaa 300

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tga 1203

Claims

1.一种烯酮还原酶突变体，其特征在于，其由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型烯酮还原酶在选自第73、117、119、197、252、253、296、297、376之中的一个或多个位点进行突变而获得。

2.如权利要求1所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为将所述位点的氨基酸突变为A、G、V、L、I、P、F、Y、W、S、T、C、M、N、Q、D、E、K、R、H中的一种。

3.如权利要求2所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为丙氨酸A突变。

4.如权利要求1或2所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为在第296位点进行突变。

5.如权利要求4所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述第296位点的突变选自P296A、P296C、P296D、P296E、P296F、P296G、P296H，P296L，P296I，P296M，P296N，P296Q，P296R，P296S，P296T，P296V，P296W，P296K，P296Y中的一个。

6.如权利要求5所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变为P296A突变。

7.如权利要求6所述的烯酮还原酶突变体，其特征在于，所述烯酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或者与SEQ ID NO:3保持70％以上同一性。

8.编码如权利要求1-7中任一项所述的烯酮还原酶突变体的基因。

9.如权利要求6所述的编码烯酮还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或者与SEQ ID NO:4保持70％以上同一性。

10.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求8-9任一项所述的编码烯酮还原酶突变体的基因。

11.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求8-9任一项所述的编码烯酮还原酶突变体的基因。

12.权利要求1-7任一项所述的烯酮还原酶突变体或权利要求8-9任一项所述的基因在酶催化不对称还原4-丙基-2(5H)-呋喃酮(化合物II)制备布瓦西坦中间体(R)-4-正丙基二氢呋喃-2(5H)-酮(化合物I)中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用包括：构建含有所述编码烯酮还原酶突变体的基因的重组菌，以所述重组菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶制剂为催化剂，对化合物II进行不对称加氢反应，获得化合物I。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述不对称加氢反应是在NAD(P)⁺/NAD(P)H辅酶循环系统协同作用下进行。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述辅酶循环系统选自醇脱氢酶/异丙醇、甲酸脱氢酶/甲酸盐、葡萄糖脱氢酶/葡萄糖。

16.如权利要求13所述的应用，其特征在于，在所述不对称加氢反应的体系中，含烯酮还原酶突变体的细胞用量为5～50g/L的湿细胞，辅酶细胞的用量为2～5g/L的湿细胞，化合物II用量为0.1％～1.0％，NAD(P)⁺用量为0.05～0.2mM，异丙醇用量为1％～10％，水解过程控制pH7.0～9.0、温度20℃～40℃。