CN112921021B - 一种醛缩酶突变体及其在生产1,3-丙二醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及合成生物学及微生物发酵技术领域，具体的说，本发明涉及半理性设计对脱氧核糖‑5‑磷酸醛缩酶的改造以及在重组大肠杆菌中过表达四种酶:甲醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖‑5‑磷酸醛缩酶、1,3‑丙二醇氧化还原酶或1,3‑丙二醇氧化还原酶同工酶，构建非天然的由甲醇、甲醛一碳化合物和乙醇、乙醛转化为1,3‑丙二醇的生产途径的方法。本发明筛选出的DERA_TMAS233D突变体，相较野生型酶活力提高51％；在利用大肠杆菌实现由甲醛和乙醇到PDO的转化时，PDO的产量提高了21.8％；由甲醛和乙醛到PDO的转化时，PDO的产量提高了9.2％，大大缩短PDO合成途径，提高PDO的产量。

Description

一种醛缩酶突变体及其在生产1,3-丙二醇中的应用

技术领域：

本发明涉及合成生物学及微生物发酵技术领域，具体的说，本发明涉及半理性设计对酶的改造以及在重组大肠杆菌中过表达四种酶:甲醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶、1,3-丙二醇氧化还原酶或1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，构建非天然的由甲醇、甲醛一碳化合物和乙醇、乙醛转化为1,3-丙二醇的生产途径的方法。

背景技术：

甲醛(Formaldehyde)可以来源于甲醇(Methanol)、甲酸(Formate)和甲烷(Methane)，是一种重要的一碳化合物代谢中间体，可用于微生物体的生长以及合成化学品(Bennett et al.,2018；Hwang et al.,2018；Pieja et al.,2017；Zhang et al.,2018)。这些年，对于甲醛的利用，主要有三种不同的天然代谢途径：(1)核酮糖单磷酸途径(RuMP，ribulose monophosphate pathway)、(2)丝氨酸途径(serine pathway)和(3)卡尔文循环(CBB，Calvin-Benson-Bassham pathway)(Zhang et al.,2017)。其中研究最广泛的甲醛利用途径是RuMP途径。该途径通过3-己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps，3-hexulose-6-phosphatesynthase)催化核酮糖-5-磷酸(Ru5P，ribulose-5-phosphate)与甲醛的羟醛缩合反应，生成己酮糖-6-磷酸(Hu6P，hexulose-6-phosphate)，然后通过6-磷酸-3-己糖异构酶(Phi，6-phospho-3-hexuloisomerase)异构化形成果糖-6-磷酸(F6P，fructose-6-phosphate)，随后进入中心代谢途径(如：EMP途径，ED途径)和Ru5P的再生途径(戊糖磷酸途径，PPP)(Müller et al.,2015)(Whitaker et al.,2015；Zhang et al.,2017)。在RuMP途经被广泛应用于甲醛同化的同时，也暴露出了它的很多局限性，其中最关键的一点就是RuMP途径大大受限于Ru5P受体低效率的再生(Hwang et al.,2018)。

1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，具有许多应用(Saxena et al.,2009；Zeng,2019)。例如医药、纺织品、涂料、塑料、化妆品和其他个人护理产品的生产。其中最主要的用途是作为单体用于合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，其被认为比以乙二醇为单体合成的聚酯(PET)具有更优良的特性，可作为一种具有潜在利用价值的塑料，有可能取代传统的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)(Bhatia and Kurian,2008)。其合成方法主要集中于化学法和生物法。

PDO的化学法合成主要包括：丙烯醛水合法，环氧乙烷羰基化法，甲醛乙醛缩合法，乙烯反应法和3-羟基丙醛加氢。由于在工业生产过程中需要高温，高压和昂贵的催化剂，以及排放有毒物质，不符合国内未来的工业要求。随着合成生物学技术的发展，利用微生物进行PDO的生产受到越来越多地研究人员关注。生物法反应条件温和，易于操作，绿色环保，成为PDO制备领域中的研究热点和趋势(Wang et al.,2019；Zhang et al.,2019)(Zeng,2019)。相比化学法，其更为环保的生产方式对于未来工业发展具有重要意义。

PDO的工业级生物法合成主要有两种途径:(1)通过基因工程菌转化甘油合成PDO(Zeng and Sabra,2011)。(2)由DuPont和Genencor公司联合研发的利用重组大肠杆菌将葡萄糖转化为PDO(Nakamura and Whited,2003)。但上述两种途径在生产发酵过程中需要额外加入昂贵的辅因子维生素B₁₂(Vitamin B₁₂)或S-腺苷甲硫氨酸(SAM,S-Adenosyl-L-methionine)。

近些年也出现了一些新的生物方法用于合成PDO，这些方法也实现了避免额外添加昂贵的辅因子维生素B₁₂(Vitamin B₁₂)或S-腺苷甲硫氨酸(SAM,S-Adenosyl-L-methionine)。例如通过利用重组大肠杆菌，以葡萄糖为底物和2-氧代-4-羟基丁酸(HOBA，2-keto-4-hydroxybutyrate)为中间体合成PDO途径(Chen et al.,2015)。但此合成途径较长，难以调控强化，而且PDO的产量较低。Zhang et al主要通过强化SerC(Phosphoserineaminotransferase from Escherichia coli)催化高丝氨酸生产HOBA的效率对上述途径进行了强化，产量有较大的提高，但距离能够实现工业化仍然有着不小的距离(Zhang etal.,2019)。Wang et al同样以HOBA为中间体，设计了一个醛缩酶依赖的，以甲醛和葡萄糖为底物的新途径。但该途径受限于HOBA的脱羧生成3-HPA的效率问题(Wang et al.,2019)。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明通过理性设计，对来自海栖热袍菌的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶DERA_TMA(Deoxyribose-5-phosphate aldolase from Thermotoga maritima)进行改造，得到其更高活力的突变体DERA_TMAS233D。并在重组大肠杆菌中过表达四种酶：甲醇脱氢酶(MDH2,methanol dehydrogenase 2from B.methanolicus MGA3)、乙醇脱氢酶(HpADH1,alcohol dehydrogenase 1from the thermotolerant methylotrophic yeastHansenula polymorpha)、来自海栖热袍菌的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶S233D突变体(DERA_{TMA S233D},Deoxyribose-5-phosphate aldolase from Thermotoga maritima)和PDO氧化还原酶(DhaT，1,3-propanediol oxidoreductase)中的一种或多种，构建新型的甲醇和甲醛一碳化合物转化为PDO合成途径。这可用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP，ribulose monophosphate pathway)及受限于其低效率的Ru5P受体再生等问题，并且避免了生产途径中外加辅因子维生素B₁₂或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的问题，缩短PDO合成途径，提高PDO的产量。

本发明首先提供一种脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶突变体DERA_TMAS233D，该突变体相比野生型催化活力提高了51％；所述突变体DERA_TMAS233D是在海栖热袍菌来源的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶DERA_TMA(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的基础上发生第233位(位置编号按照SEQ ID NO.1所示序列顺序进行编号)的氨基酸突变获得的，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

本发明还提供DERA_TMAS233D突变体的编码基因；

进一步地，所述DERA_TMAS233D突变体的编码基因如序列表SEQ ID NO.4所示；

本发明还提供包含DERA_TMAS233D突变体编码基因的重组载体，或重组菌株；

所述重组载体采用的质粒可以是petduet-1,pRSFduet-1等可以过表达上述蛋白的任意质粒。

本发明还提供一种生产PDO的基因工程菌，所述基因工程菌是在宿主中过表达DERA_TMAS233D突变体编码基因，以及PDO氧化还原酶编码基因所得；

进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等；

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；

进一步地，所述基因工程菌还在宿主细胞中过表达乙醇脱氢酶编码基因；

进一步地，所述基因工程菌还在宿主细胞中过表达乙醇脱氢酶编码基因和甲醇脱氢酶编码基因；

优选地，所述DERA_TMAS233D突变体编码基因如序列表SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述PDO氧化还原酶编码基因如序列表SEQ ID NO.5所示；

优选地，所述乙醇脱氢酶编码基因如序列表SEQ ID NO.6所示；

优选地，所述甲醇脱氢酶编码基因如序列表SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述DERA_TMAS233D突变体编码基因、PDO氧化还原酶编码基因、乙醇脱氢酶编码基因和甲醇脱氢酶编码基因通过质粒在宿主细胞中进行表达；

更近一步地，所述质粒为pRSFduet-1；

本发明还提供上述基因工程菌在生产1,3-丙二醇中的应用；

进一步地，在宿主中过表达DERA_TMAS233D突变体编码基因，以及PDO氧化还原酶编码基因所得的基因工程菌，可以实现由甲醛和乙醛到PDO的生产；

进一步地，在宿主中过表达DERA_TMAS233D突变体编码基因，以及PDO氧化还原酶编码基因和乙醇脱氢酶编码基因所得的基因工程菌，可以实现由甲醛和乙醇到PDO生产途径，此代谢途径包括三步酶催化反应：(1)HpADH1催化乙醇氧化生成乙醛和NADH；(2)乙醛和甲醛在DERA_TMAS233D催化下，生成3-羟基丙醛(3-HPA,3-hydroxypropionaldehyde)；(3)DhaT催化3-HPA生成PDO和NAD⁺(见附图1)。

进一步地，在宿主中过表达DERA_TMAS233D突变体编码基因，以及PDO氧化还原酶编码基因、乙醇脱氢酶编码基因和甲醇脱氢酶编码基因所得的基因工程菌，可以实现由甲醇和乙醇到PDO生产途径；此代谢途径包括四步酶催化反应：(1)HpADH1催化乙醇脱氢生成乙醛和NADH；(2)MDH2催化甲醇脱氢生成甲醛和NADH；(3)乙醛和甲醛在DERA_TMAS233D催化下，生成3-羟基丙醛；(4)DhaT催化3-HPA生成PDO和NAD⁺(见附图1)。

有益效果：

1、本发明在海栖热袍菌来源的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶DERA_TMA的基础上筛选出一种DERA_TMAS233D突变体，相较野生型酶活力提高51％；在利用大肠杆菌实现由甲醛和乙醇到PDO的转化时，PDO的产量提高了21.8％；由甲醛和乙醛到PDO的转化时，PDO的产量提高了9.2％。

2、本发明通过向宿主菌导入甲醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶S233D突变体和1,3-丙二醇氧化还原酶，构建多种形式的新型PDO生产途径，实现由甲醛/甲醇和乙醇/乙醛到PDO的转化。通过利用乙醇，并提供大量的甲醛受体(乙醛)，可用于解决目前甲醇和甲醛等一碳化合物的利用过于依赖核酮糖单磷酸途径(RuMP)及受限于其低效率的Ru5P受体再生等问题，避免了生产途径中外加辅因子维生素B₁₂或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等问题，大大缩短PDO合成途径，提高PDO的产量。

附图说明：

图1甲醇和乙醇到PDO生物合成途径；

图2将不同来源的DERA用于新型的甲醛和乙醛到PDO生产途径；

图3DERA_TMA不同突变体的酶活力；

图4利用DERA_TMA野生型及其突变体S233D验证甲醛和乙醇到PDO的生产途径；

图5利用DERA_TMA突变体S233D验证甲醇和乙醇到PDO的生产途径；

图6利用DERA_TMA野生型及其突变体S233D验证甲醛和乙醛到PDO的生产途径。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施方式中，选用的甲醇脱氢酶(MDH2)根据其电子受体的不同，可以是吡咯喹啉醌(PQQ，pyrroloquinoline quinone)依赖型的甲醇脱氢酶(MDHs)、NAD依赖型的甲醇脱氢酶(MDHs)及氧(O₂，oxygen)依赖型的醇氧化酶(AOD，alcohol oxidase)。

在本发明的一些实施方式中，选用的乙醇脱氢酶(HpADH1)的来源可以是真核及原核甲基营养菌。

在本发明的一些实施方式中，选用的DhaT可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(NADPH，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)依赖型的醇脱氢酶(yqhD，1,3-propanediol dehydrogenase)、NADH依赖型的1,3-丙二醇氧化还原酶(DhaT，1,3-propanediol oxidoreductase)及其它NADH/NADPH依赖型的醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)，DhaT的来源可以是细菌来源。

本发明采用的一些实验或测定方法如未特别说明，均按如下方法进行：

生物质浓度(OD)测定：取发酵液在600nm处测定吸光度。

甲醛、乙醛和3-HPA：从反应混合物中取出样品并用去离子水稀释，得到1至50mM的浓度范围。将稀释液(40μL)与O-苄基羟胺盐酸盐溶液(80μL，130mM储备溶液的吡啶：甲醇：水＝33：15：2)混合。30℃反应10分钟后，将样品用甲醇(800μL)稀释，离心过膜(0.22μm)，利用配有Shim-pack GIST-C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)的HPLC分析。流动相为：(A)：去离子水(ddH₂O)中加入0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA，trifluoroacetic acid)；(B)：乙腈(CH₃CN)中加入0.095％(v/v)TFA，流速1mL min^-1，在215nm检测，柱温30℃。洗脱条件：梯度洗脱，30min内流动相(B)由8变化80％(Hernandez et al.,2017)。

PDO分析方法：采用气质连用(GC-MS)方法：将样品(400μL)与苯硼酸(400μL，300mM母液)在室温(25℃)下进行10min反应，离心后，使用色谱/质谱仪(GC/MS QP2020；Shimadzu，Japan)系统配备有Sh-Rxi-5Sil-Ms柱(Shimadzu，Japan)，氦气作为载气。最初柱温箱温度保持在100℃，2min，然后以15℃min^-1的速率升至270℃，并保持12min(Wang etal.,2019；Zhang et al.,2019)。

3-HPA的定量：由于3-HPA不能买到，因此以合成已知浓度溶液的形式，作为一种“标准品”进行分析，方法如下：将1mg/mL DERA与20mM甲醛和20mM乙醛混合，并将该混合物在30℃下保持5h以形成3-HPA。反应完成后，使用10kDa超滤管除去DERA，得到含有3-HPA的溶液(定义为溶液A)。将一部分溶液A与20mM NADH和DhaT混合，经过30分钟的反应时间后，使用10kDa超滤管除去酶DhaT，得到的溶液含有PDO和少量3-HPA(定义为溶液B)。为了进行比较，取相同量的溶液A，并将其与等于上一步中使用的NADH和DhaT溶液的体积的缓冲溶液混合(定义为溶液C)。可通过GC-MS准确测量PDO，其测得的PDO来自3-HPA一比一的转换。因此，溶液B和C的3-HPA峰面积之间的差异对应于测得的PDO的浓度。

DERA比活力(U/mg)定义：1mg的DERA蛋白在1min的时间能够催化1μmol 3-HPA的生成定义为1U/mg。

培养基：

固体培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，琼脂15，pH 7.0；

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，pH 7.0。

培养条件：

种子培养：将单克隆接种4mL LB培养基，根据转入质粒的抗性添加卡那霉素(50μg/mL)，37℃，220rpm培养8-10h。

发酵：向500mL摇瓶中加入100mL LB培养基，根据转入质粒的抗性基因添加卡那霉素(50μg/mL)，接种使菌体初始OD₆₀₀值达到0.05，37℃，220rpm培养。待菌体OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃下继续培养8～10h。然后测定菌体在600nm处的吸光值，收集一定量菌体离心去上清后，用一定量的50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)重悬并转移到10mL离心管中，加入终浓度为0.3～6.0g/L甲醛或3.2～19.2g/L甲醇、0.44～8.8g/L乙醛或4.6～27.6g/L乙醇，使菌体浓度达到OD₆₀₀＝50,25-35℃，200-250rpm下培养2-50h。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。

实施例1：筛选高效的DERA用于新型的甲醛和乙醛到PDO生产途径

将不同来源的DERA构建到已构建有编码DhaT基因的表达载体pRSFduet-1-DhaT上，分别为：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶pRSFduet-DERA_ECO-DhaT；来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶pRSFduet-DERA_TMA-DhaT(DERA_TMA氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)；来源于嗜热芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶pRSFduet-DERA_GTH-DhaT；来源于表皮耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶pRSFduet-DERA_PAE-DhaT；来源于表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶pRSFduet-DERA_SEP-DhaT。将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中(Control未表达任何DERA，仅表达pRSFduet-1-DhaT)，挑取单克隆后于LB培养基中37℃培养8h，后转接于含有50μg/mL卡那霉素的100mLLB培养基至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后，测定菌体在600nm处的吸光值，收集一定量菌体离心去上清后，用一定量的50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)重悬并转移到10mL离心管中，加入终浓度为3.0g/L甲醛和4.4g/L乙醛，使最终体积在5mL左右，使菌体浓度达到OD₆₀₀＝50。然后在30℃，230rpm下培养。

然后选取几个时间点取样，离心取上清并进行PDO含量和副产物的测定，并对这五种来源的醛缩酶进行比较。如图2所示，结果是使用来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的菌株产量最高，2h时达到689.33±5.6mg/L。

实施例2：对DERA_TMA进行半理性设计突变的酶活测定结果

从实施例1中，我们可以筛选到在该生物转化系统中性能最好的来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶。然后，我们对该酶进行了半理性的突变设计，并对获得的突变体进行酶活测定，结果如图3，其S233D突变体获得了相比野生型高51％的催化活力，其比活力为1.89±0.04U/mg，S233D突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3：验证新型的甲醛和乙醇到PDO生产途径

将来源于多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的HpADH1基因(SEQ ID NO.6所示)、来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的突变体DERA_TMAS233D基因(SEQ ID NO.4所示)、来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的DhaT基因(SEQ ID NO.5所示)构建到表达载体pRSFduet-1上。将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆后于LB培养基中37℃培养8h，后转接于含有50μg/mL卡那霉素的400mL LB培养基至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后，测定菌体在600nm处的吸光值，收集一定量菌体离心去上清后，用一定量的50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)重悬并转移到50mL离心管中，加入终浓度为1.5g/L甲醛和13.8g/L乙醇，并使最终体积在20mL，且使菌体浓度达到OD₆₀₀＝50。然后在30℃，230rpm下培养，培养过程中补加甲醛，在加入初始底物的2～14h内分十次共补加3.0g/L。

然后选取一些时间点取样，离心取上清并进行PDO含量和副产物的测定，结果如图4，在16h时得到了最大产量为1.25±0.01g/L，相比使用野生型DERA_TMA(其余构建均相同)的对照菌株产量提高了21.8％。

实施例4：验证新型的甲醇和乙醇到PDO生产途径

将来源于甲醇芽孢杆菌(B.methanolicus MGA3)的MDH2基因(SEQ ID NO.7所示)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的HpADH1基因(SEQ ID NO.6所示)、来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶突变体DERA_TMAS233D基因(SEQ IDNO.4所示)、来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的DhaT基因(SEQ ID NO.5所示)构建到表达载体pRSFduet-1上。将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coliBL21(DE3)中，挑取单克隆后于LB培养基中37℃培养8h，后转接于含有50μg/mL卡那霉素的100mL LB培养基至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后，测定菌体在600nm处的吸光值，收集一定量菌体离心去上清后，用一定量的50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)重悬并转移到10mL离心管中，加入终浓度为10mM MgSO₄、1mM TPP、9.6g/L甲醇和13.8g/L乙醇，使最终体积在5mL左右，使菌体浓度达到OD₆₀₀＝50。然后在30℃，230rpm下培养。

然后选取几个时间点取样，离心取上清并进行PDO的测定。结果如图5所示，在42h时得到产量为77.1mg/L。

实施例5验证新型的甲醛和乙醛到PDO生产途径

将来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶突变体DERA_TMAS233D基因(SEQ ID NO.4所示)、来源于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的DhaT基因(SEQ ID NO.5所示)构建到表达载体pRSFduet-1上。将上述表达载体分别转化在大肠肝菌表达宿主E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆后于LB培养基中37℃培养8h，后转接于含有50μg/mL卡那霉素的100mL LB培养基至OD₆₀₀达到0.6-0.8，然后添加0.2mM IPTG诱导基因表达，30℃继续培养10h后，测定菌体在600nm处的吸光值，收集一定量菌体离心去上清后，用一定量的50mM磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)重悬并转移到10mL离心管中，加入终浓度为3.0g/L甲醛和4.4g/L乙醛，并使最终体积在5mL，且使菌体浓度达到OD₆₀₀＝50。然后在30℃，230rpm下培养。

然后选取2h和12h取样，离心取上清并进行PDO含量的测定，结果如图6，在2h时得到了最大产量为0.75±0.01g/L，相比使用野生型DERA_TMA(其余构建均相同)的对照菌株产量提高了9.2％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京化工大学

<120> 一种醛缩酶突变体及其在生产1,3-丙二醇中的应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 海栖热袍菌（Thermotogamaritima）

<400> 1

Met Ile Glu Tyr Arg Ile Glu Glu Ala Val Ala Lys Tyr Arg Glu Phe

1 5 10 15

Tyr Glu Phe Lys Pro Val Arg Glu Ser Ala Gly Ile Glu Asp Val Lys

20 25 30

Ser Ala Ile Glu His Thr Asn Leu Lys Pro Phe Ala Thr Pro Asp Asp

35 40 45

Ile Lys Lys Leu Cys Leu Glu Ala Arg Glu Asn Arg Phe His Gly Val

50 55 60

Cys Val Asn Pro Cys Tyr Val Lys Leu Ala Arg Glu Glu Leu Glu Gly

65 70 75 80

Thr Asp Val Lys Val Val Thr Val Val Gly Phe Pro Leu Gly Ala Asn

85 90 95

Glu Thr Arg Thr Lys Ala His Glu Ala Ile Phe Ala Val Glu Ser Gly

100 105 110

Ala Asp Glu Ile Asp Met Val Ile Asn Val Gly Met Leu Lys Ala Lys

115 120 125

Glu Trp Glu Tyr Val Tyr Glu Asp Ile Arg Ser Val Val Glu Ser Val

130 135 140

Lys Gly Lys Val Val Lys Val Ile Ile Glu Thr Cys Tyr Leu Asp Thr

145 150 155 160

Glu Glu Lys Ile Ala Ala Cys Val Ile Ser Lys Leu Ala Gly Ala His

165 170 175

Phe Val Lys Thr Ser Thr Gly Phe Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Glu

180 185 190

Asp Val His Leu Met Lys Trp Ile Val Gly Asp Glu Met Gly Val Lys

195 200 205

Ala Ser Gly Gly Ile Arg Thr Phe Glu Asp Ala Val Lys Met Ile Met

210 215 220

Tyr Gly Ala Asp Arg Ile Gly Thr Ser Ser Gly Val Lys Ile Val Gln

225 230 235 240

Gly Gly Glu Glu Arg Tyr Gly Gly

245

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ile Glu Tyr Arg Ile Glu Glu Ala Val Ala Lys Tyr Arg Glu Phe

1 5 10 15

Tyr Glu Phe Lys Pro Val Arg Glu Ser Ala Gly Ile Glu Asp Val Lys

20 25 30

Ser Ala Ile Glu His Thr Asn Leu Lys Pro Phe Ala Thr Pro Asp Asp

35 40 45

Ile Lys Lys Leu Cys Leu Glu Ala Arg Glu Asn Arg Phe His Gly Val

50 55 60

Cys Val Asn Pro Cys Tyr Val Lys Leu Ala Arg Glu Glu Leu Glu Gly

65 70 75 80

Thr Asp Val Lys Val Val Thr Val Val Gly Phe Pro Leu Gly Ala Asn

85 90 95

Glu Thr Arg Thr Lys Ala His Glu Ala Ile Phe Ala Val Glu Ser Gly

100 105 110

Ala Asp Glu Ile Asp Met Val Ile Asn Val Gly Met Leu Lys Ala Lys

115 120 125

Glu Trp Glu Tyr Val Tyr Glu Asp Ile Arg Ser Val Val Glu Ser Val

130 135 140

Lys Gly Lys Val Val Lys Val Ile Ile Glu Thr Cys Tyr Leu Asp Thr

145 150 155 160

Glu Glu Lys Ile Ala Ala Cys Val Ile Ser Lys Leu Ala Gly Ala His

165 170 175

Phe Val Lys Thr Ser Thr Gly Phe Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Glu

180 185 190

Asp Val His Leu Met Lys Trp Ile Val Gly Asp Glu Met Gly Val Lys

195 200 205

Ala Ser Gly Gly Ile Arg Thr Phe Glu Asp Ala Val Lys Met Ile Met

210 215 220

Tyr Gly Ala Asp Arg Ile Gly Thr Asp Ser Gly Val Lys Ile Val Gln

225 230 235 240

Gly Gly Glu Glu Arg Tyr Gly Gly

245

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 海栖热袍菌（Thermotogamaritima）

<400> 3

atgatcgaat accgtatcga agaagctgtt gctaaatacc gtgaattcta cgaattcaaa 60

ccggttcgtg aatctgctgg tatcgaagac gttaaatctg ctatcgaaca caccaacctg 120

aaaccgttcg ctaccccgga cgacatcaaa aaactgtgcc tggaagctcg tgaaaaccgt 180

ttccacggtg tttgcgttaa cccgtgctac gttaaactgg ctcgtgaaga actggaaggt 240

accgacgtta aagttgttac cgttgttggt ttcccgctgg gtgctaacga aacccgtacc 300

aaagctcacg aagctatctt cgctgttgaa tctggtgctg acgaaatcga catggttatc 360

aacgttggta tgctgaaagc taaagaatgg gaatacgttt acgaagacat ccgttctgtt 420

gttgaatctg ttaaaggtaa agttgttaaa gttatcatcg aaacctgcta cctggacacc 480

gaagaaaaaa tcgctgcttg cgttatctct aaactggctg gtgctcactt cgttaaaacc 540

tctaccggtt tcggtaccgg tggtgctacc gctgaagacg ttcacctgat gaaatggatc 600

gttggtgacg aaatgggtgt taaagcttct ggtggtatcc gtaccttcga agacgctgtt 660

aaaatgatca tgtacggtgc tgaccgtatc ggtacctctt ctggtgttaa aatcgttcag 720

ggtggtgaag aacgttacgg tggttaa 747

<210> 4

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgatcgaat accgtatcga agaagctgtt gctaaatacc gtgaattcta cgaattcaaa 60

ccggttcgtg aatctgctgg tatcgaagac gttaaatctg ctatcgaaca caccaacctg 120

aaaccgttcg ctaccccgga cgacatcaaa aaactgtgcc tggaagctcg tgaaaaccgt 180

ttccacggtg tttgcgttaa cccgtgctac gttaaactgg ctcgtgaaga actggaaggt 240

accgacgtta aagttgttac cgttgttggt ttcccgctgg gtgctaacga aacccgtacc 300

aaagctcacg aagctatctt cgctgttgaa tctggtgctg acgaaatcga catggttatc 360

aacgttggta tgctgaaagc taaagaatgg gaatacgttt acgaagacat ccgttctgtt 420

gttgaatctg ttaaaggtaa agttgttaaa gttatcatcg aaacctgcta cctggacacc 480

gaagaaaaaa tcgctgcttg cgttatctct aaactggctg gtgctcactt cgttaaaacc 540

tctaccggtt tcggtaccgg tggtgctacc gctgaagacg ttcacctgat gaaatggatc 600

gttggtgacg aaatgggtgt taaagcttct ggtggtatcc gtaccttcga agacgctgtt 660

aaaatgatca tgtacggtgc tgaccgtatc ggtaccgatt ctggtgttaa aatcgttcag 720

ggtggtgaag aacgttacgg tggttaa 747

<210> 5

<211> 1161

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）

<400> 5

atgtcttacc gtatgttcga ctacctggtt ccgaacgtta acttcttcgg tccgaacgct 60

atctctgttg ttggtgaacg ttgccagctg ctgggtggta aaaaagctct gctggttacc 120

gacaaaggtc tgcgtgctat caaagacggt gctgttgaca aaaccctgca ctacctgcgt 180

gaagctggta tcgaagttgc tatcttcgac ggtgttgaac cgaacccgaa agacaccaac 240

gttcgtgacg gtctggctgt tttccgtcgt gaacagtgcg acatcatcgt taccgttggt 300

ggtggttctc cgcacgactg cggtaaaggt atcggtatcg ctgctaccca cgaaggtgac 360

ctgtaccagt acgctggtat cgaaaccctg accaacccgc tgccgccgat cgttgctgtt 420

aacaccaccg ctggtaccgc ttctgaagtt acccgtcact gcgttctgac caacaccgaa 480

accaaagtta aattcgttat cgtttcttgg cgtaacctgc cgtctgtttc tatcaacgac 540

ccgctgctga tgatcggtaa accggctgct ctgaccgctg ctaccggtat ggacgctctg 600

acccacgctg ttgaagctta catctctaaa gacgctaacc cggttaccga cgctgctgct 660

atgcaggcta tccgtctgat cgctcgtaac ctgcgtcagg ctgttgctct gggttctaac 720

ctgcaggctc gtgaatacat ggcttacgct tctctgctgg ctggtatggc tttcaacaac 780

gctaacctgg gttacgttca cgctatggct caccagctgg gtggtctgta cgacatgccg 840

cacggtgttg ctaacgctgt tctgctgccg cacgttgctc gttacaacct gatcgctaac 900

ccggaaaaat tcgctgacat cgctgaactg atgggtgaaa acatcaccgg tctgtctacc 960

ctggacgctg ctgaaaaagc tatcgctgct atcacccgtc tgtctatgga catcggtatc 1020

ccgcagcacc tgcgtgacct gggtgttaaa gaaaccgact tcccgtacat ggctgaaatg 1080

gctctgaaag acggtaacgc tttctctaac ccgcgtaaag gtaacgaaca ggaaatcgct 1140

gctatcttcc gtcaggcttt c 1161

<210> 6

<211> 1050

<212> DNA

<213> 多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）

<400> 6

atgacctcta tcccgaaaac ccagaaagct gttgttttcg aaaccaacgg tggtccgctg 60

ctgtacaaag acatcccggt tccgcagccg aaaccgaacg aaatcctggt taacgttaaa 120

tactctggtg tttgccacac cgacctgcac gcttggaaag gtgactggcc gctggacacc 180

aaactgccgc tggttggtgg tcacgaaggt gctggtgttg ttgttgctaa aggtgctaac 240

gttaccaact tcgaaatcgg tgactacgct ggtatcaaat ggctgaacgg ttcttgcatg 300

ggttgcgaat tctgccagca gggtgctgaa ccgaactgcc cggaagctga cctgtctggt 360

tacacccacg acggttcttt ccagcagtac gctaccgctg acgctgttca ggctgctaaa 420

atcccgaaag gtaccaacct ggctgacgtt gctccgatcc tgtgcgctgg tgttaccgtt 480

tacaaagctc tgaaaaccgc tgaactgtct ccgggtcagt gggttgctat ctctggtgct 540

ggtggtggtc tgggttctct ggctgttcag tacgctgttg ctatgggtct gcgtgttctg 600

ggtatcgacg gtggtgacga aaaagctaaa ctgttcgaat ctctgggtgg tgaagttttc 660

atcgacttca ccaaagaaaa agacatcgtt ggtgctgttc agaaagctac caacggtggt 720

ccgcacggtg ttatcaacgt ttctgtttct ccggctgcta tctctcagtc ttgccagtac 780

gttcgtaccc tgggtaaagt tgttctggtt ggtctgccgg ctggtgctgt ttgcgaatct 840

ccggttttcg aacacgttat caaatctatc cagatccgtg gttcttacgt tggtaaccgt 900

caggacaccg ctgaatctat cgacttcttc gttcgtggta aagttaaagc tccgatcaaa 960

gttgttggtc tgtctgaact gccgaaagtt ttcgaactga tggaacaggg taaaatcgct 1020

ggtcgttacg ttctggacac ctctaaataa 1050

<210> 7

<211> 1158

<212> DNA

<213> 甲醇芽孢杆菌（B. methanolicus）MGA3

<400> 7

atgaaaaaca cccagtctgc tttctacatg ccgtctgtta acctgttcgg tgctggttct 60

gttaacgaag ttggtacccg tctggctggt ctgggtgtta aaaaagctct gctggttacc 120

gacgctggtc tgcactctct gggtctgtct gaaaaaatcg ctggtatcat ccgtgaagct 180

ggtgttgaag ttgctatctt cccgaaagct gaaccgaacc cgaccgacaa aaacgttgct 240

gaaggtctgg aagcttacaa cgctgaaaac tgcgactcta tcgttaccct gggtggtggt 300

tcttctcacg acgctggtaa agctatcgct ctggttgctg ctaacggtgg taccatccac 360

gactacgaag gtgttgacgt ttctaaaaaa ccgatggttc cgctgatcgc tatcaacacc 420

accgctggta ccggttctga actgaccaaa ttcaccatca tcaccgacac cgaacgtaaa 480

gttaaaatgg ctatcgttga caaacacgtt accccgaccc tgtctatcaa cgacccggaa 540

ctgatggttg gtatgccgcc gtctctgacc gctgctaccg gtctggacgc tctgacccac 600

gctatcgaag cttacgtttc taccggtgct accccgatca ccgacgctct ggctatccag 660

gctatcaaaa tcatctctaa atacctgccg cgtgctgttg ctaacggtaa agacatcgaa 720

gctcgtgaac agatggcttt cgctcagtct ctggctggta tggctttcaa caacgctggt 780

ctgggttacg ttcacgctat cgctcaccag ctgggtggtt tctacaactt cccgcacggt 840

gtttgcaacg ctatcctgct gccgcacgtt tgccgtttca acctgatctc taaagttgaa 900

cgttacgctg aaatcgctgc tttcctgggt gaaaacgttg acggtctgtc tacctacgaa 960

gctgctgaaa aagctatcaa agctatcgaa cgtatggctc gtgacctgaa catcccgaaa 1020

ggtttcaaag aactgggtgc taaagaagaa gacatcgaaa ccctggctaa aaacgctatg 1080

aacgacgctt gcgctctgac caacccgcgt aaaccgaaac tggaagaagt tatccagatc 1140

atcaaaaacg ctatgtaa 1158

Claims (10)

1.一种脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶突变体的应用，其特征在于，所述醛缩酶突变体为DERA_TMAS233D突变体，是在SEQ ID NO.1所示的野生型脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的基础上发生S233D突变获得的，为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述应用是在以甲醛和乙醛为底物生产1,3-丙二醇中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述醛缩酶突变体的编码基因为SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体或重组菌株在以甲醛和乙醛为底物生产1,3-丙二醇中的应用，其特征在于，所述重组载体或重组菌株包含权利要求2中所述突变体的编码基因。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组载体采用的表达质粒为petduet-1或 pRSFduet-1。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组菌株是在宿主中过表达DERA_TMAS233D突变体编码基因，以及PDO氧化还原酶编码基因所得。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组菌株还在宿主细胞中过表达乙醇脱氢酶编码基因。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组菌株还在宿主细胞中过表达甲醇脱氢酶编码基因。

8.如权利要求5-7中任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，所述重组菌株采用的宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia coli）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。

10.如权利要求5-7中任意一项权利要求所述的应用，其特征在于，DERA_TMAS233D突变体编码基因如序列表SEQ ID NO.4所示， PDO氧化还原酶编码基因如序列表SEQ ID NO.5所示；乙醇脱氢酶编码基因如序列表SEQ ID NO.6所示；甲醇脱氢酶编码基因如序列表SEQ IDNO.7所示。

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