CN110964753B - 一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物催化甘油产1，3‑丙二醇的方法。该方法先通过甘油脱水酶将甘油转化为中间体3‑羟基丙醛，中间体在NAD类似物依赖型1，3‑丙二醇脱氢酶与可再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶偶联催化下，还生产1，3‑丙二醇。该体系可用于胞外无细胞体系或在微生物体内催化生物柴油副产物甘油产1，3‑丙二醇，显著降低1，3‑丙二醇生产成本，提高产物得率。

Description

一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)类似物依赖型氧化还原酶催化甘油产1，3-丙二醇的方法，具体地说，是通过甘油脱水酶将甘油转化为3-羟基丙醛，再在NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶与再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶偶联催化下，将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。此催化体系可在体外或在微生物体内催化甘油产1，3-丙二醇。

背景技术

1，3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是重要的化工原料，除了用于粘合剂、防冻剂、增塑剂、洗涤剂、防腐剂等合成，还可用于食品、化妆品和制药等行业，其最广泛的应用是作为聚酯、聚醚和聚亚氨酯合成的单体，其中以其为单体的聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(PTT)具有优良的物理化学性能，进一步加工后的材料可应用于纺织、薄膜材料、包装等工业。1,3-丙二醇的生产主要有化学法和生物法。化学合成法反应条件苛刻，对设备要求高，有害气体排放，增加了环境成本，催化剂以及毒性中间体残留等问题很大程度上限制了1，3-丙二醇在食品和医药等方面的应用；而生物法以其廉价可再生的原料，更环保的工艺过程，受到更加广泛的认可，具有更广阔的发展前景。甘油作为生物柴油生产的副产物，其高值化利用成为生物柴油成本控制的关键问题之一，因此，甘油生物催化转化产1，3-丙二醇具有重要的应用意义。

目前，除Dupont和Genencor公司用葡萄糖为底物外(US 7067300，US 6514733)，德国生物技术研究中心，我国清华大学、大连理工大学、华侨大学、江南大学、北京化工大学、上海理工大学等相继开发了以甘油为底物发酵生产1，3-丙二醇的酶，方法或菌株。仅从优化微生物发酵，多产，联产的思路产1，3-丙二醇菌达到或接近理论得率，仍然存在产物浓度不高、甘油转化率低、生产强度低等问题，如何突破这一瓶颈，提高生物法1，3-丙二醇工业化生产的竞争力，具有重大的现实意义。

以高甘油浓度耐受性的克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)为代表发酵产1，3-丙二醇备受关注，因此菌株与大肠杆菌在生化特性上的相似性，为菌株的基因改良和代谢通路的重建提供了可能。克雷伯氏杆菌厌氧发酵产1，3-丙二醇的途径涉及氧化和还原两条途径。氧化途径中，甘油经甘油脱氢酶(GDH)催化生成二羟丙酮(DHA)，然后进一步转化为丙酮酸，产生ATP和NADH以及乙酸等代谢副产物，伴随菌体生长；而还原途径主要分为两步反应：(1)甘油脱水酶(glycerol dehydratase，GDHt)将甘油脱水为中间体3-羟基丙醛(3-hydoxypropionaldehyde,3-HPA)；(2)1，3-丙二醇脱氢酶(1,3-propanedioldehydrogenase,PDOR,https://www.rcsb.org/structure/3bfj,PDB ID 3BFJ)在辅酶NADH的作用下，催化3-HPA转化为1，3-丙二醇。研究表明，由于反应步骤(2)是限速步骤，因此，在工程菌发酵过程中，当底物浓度较高时，会积累大量的毒性中间体3-HPA(Barbirato,F.etal.,Appl.Environ.Microbiol.1996,62,1448)，与菌体本身产生的酸性物质一起，抑制PDOR的活性，而PDOR活性下降又促使3-HPA的进一步积累，形成恶性循环导致微生物产1，3-丙二醇停止；另一方面，发酵液中的1，3-丙二醇也会反馈抑制PDOR活性。因此，PDOR是生产1，3-丙二醇的关键酶，仅在菌体过表达PDOR也无法得到预期效果(Zheng,P.et al.,Process Biochem.2006,41,2160)，因为此步反应需要消耗化学当量的辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，但由于胞内很多氧化还原酶共享利用NADH或NADPH作为辅酶，可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。然而，任何改变NAD浓度及其NAD(P)/NAD(P)H比例的操作都会对细胞产生胞内全局性影响(Holm,A.K.et al.,J.Biol.Chem.2010,285,17498)，因此，很难从辅酶水平对生物体系中与1，3-丙二醇相关的氧化还原酶进行调控。虽然，改变PDOR辅酶偏好性(由NADH到NADPH)可一定程度提高1，3-丙二醇的产量(CN 200810228269.X)，但NADPH仍是胞内通用辅酶，1，3-丙二醇的产量很难从根本上加以提高。

本发明中以生物兼容小分子为辅因子再生底物，生物正交NADH类似物传递还原力，由于类似物只被突变型氧化还原酶识别(包括PDOR以及再生NAD类似物的氧化还原酶)，即该系统可独立于细胞发挥作用，可在未对系统辅酶水平扰动的情况下，提高1,3-丙二醇的产量，实现生物催化转化甘油产1，3-丙二醇。

发明内容

本发明涉及一种产1，3-丙二醇的方法，具体来说，是通过甘油脱水酶将甘油转化为中间体3-羟基丙醛，在NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶与可再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶耦联催化下，将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。因此，本发明的方法可应用于生物催化转化制备1，3-丙二醇领域，具有重要价值和应用前景。

一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在缓冲体系中，以NAD类似物为介导，甘油脱水酶和维生素B₁₂，以及1，3-丙二醇脱氢酶PDOR催化下，以甘油为原料生产1，3-丙二醇。

所述1，3-丙二醇脱氢酶PDOR基因来源于克雷伯氏菌属，具有SEQ ID NO：1的基因序列，相应的蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR包括但不限于如下多位点突变PDOR-G43K/G186P/L191F(其中，PDOR代表酶名称-第43位甘氨酸突变为赖氨酸，第186位甘氨酸突变为脯氨酸，第191位亮氨酸突变为苯丙氨酸，其他同理)，PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y，PDOR-T142C/G186P，PDOR-T143I/G186P，PDOR-G183M/K187N，PDOR-T142C/G186W，PDOR-L44N/T143Y/G187R/，PDOR-L44N/T142K/L191C，PDOR-L44N/T142K/L191G，或PDOR-L44N/T142K/L191G中的一种或两种以上；

本发明涉及的NAD类似物包括NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD、NUD，它们具有如下的化学结构：

本发明涉及的NAD类似物保留了NAD氧化还原功能结构，上述类似物结构为氧化态称为NAD类似物，而相应的还原态具有1,4-二氢烟酰胺单核苷酸结构，称为NADH类似物。NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε₃₄₀约为6220M^-1·cm^-1(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending onnicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857)，利用该性质分析NAD类似物氧化还原过程。所有化合物参照文献方法(Ji DB,et al.Synthesis ofNAD analogs to develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem,2013,56,296)制备。

体系中用于再生NAD类似物的依赖型氧化还原酶经过基因工程突变，可催化还原NAD类似物为NADH类似物的活性蛋白质包括但不局限于：亚磷酸脱氢酶突变体，苹果酸酶突变体，乳酸脱氢酶突变体，甲酸脱氢酶突变体，甲醛脱氢酶突变体，或甲醇脱氢酶突变体中的一种或两种以上；

所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应底物包括但不限于亚磷酸化合物，苹果酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物，甲醛，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇中的一种或两种以上；

其中，亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐、氘代亚磷酸、氘代亚磷酸盐中的一种或两种以上；

苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐、氘代苹果酸、氘代苹果酸盐中的一种或两种以上；

甲酸化合物为甲酸、甲酸盐、氘代甲酸、氘代甲酸盐中的一种或两种以上；

D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐、氘代D-乳酸、氘代D-乳酸盐中的一种或两种以上；

所述经过基因工程突变可再生NAD类似物的氧化还原酶突变体为：

亚磷酸脱氢酶psPDH突变体包括但不限于psPDH，psPDH-L151V/D213Q，rsPDH，rsPDH-I151R，rsPDH-I151R/E213C，rsPDH-I151R/I218F中的一种或两种以上；

苹果酸酶ME突变体包括但不限于ME-L310R/Q401C，ME-L310R；

乳酸脱氢酶DLDH突变体包括但不限于DLDH-V152R；

甲酸脱氢酶cboFDH突变体包括但不限于cboFDH-G171Y，cboFDH-I170T/A229S，cboFDH-G171R/G234F，cboFDH-H23S/L257R，cboFDH-S380N/C255Q中的一种或两种以上；

甲醛脱氢酶FaDH突变体包括但不限于FaDH-G216R/L236L，FaDH-L218N/R267K，FaDH-G216S/L236W/R267P，FaDH-R267T/L236P中的一种或两种以上；

甲醇脱氢酶MDH突变体包括但不限于MDH-Y172R/G173S，MDH-A238E/N240E，MDH-Y172T/A238E/N240E中的一种或两种以上。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857)。

在pH 6–10(优选pH 7–9.5，再优选pH 7.5–9.5)的缓冲液体系中，反应温度15℃–40℃(优选20℃–35℃，再优选25℃–35℃)，反应时间10min–300min(优选15min–200min，再优选25min–100min)；甘油浓度为0.1mM-1000mM(优选0.1mM-800mM，再优选0.5mM-700mM)，甘油脱水酶浓度为4μg/mL-500μg/mL(优选5μg/mL-400μg/mL，再优选6μg/mL-300μg/mL)，维生素B₁₂浓度为1mM-40mM(优选5mM-30mM，再优选8mM-20mM)，用于NAD类似物再生氧化还原酶的浓度为4μg/mL-500μg/mL(优选5μg/mL-400μg/mL，再优选10μg/mL-300μg/mL)，NAD类似物的浓度为0.01mM-20mM(优选0.05mM-15mM，再优选0.1mM-10mM)，NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR浓度为4μg/mL-500μg/mL(优选5μg/mL-400μg/mL，再优选10μg/mL-300μg/mL)，再生底物浓度为0.1mM-100mM(优选0.2mM-80mM，再优选0.5mM-60mM)，可连续制得产物1，3-丙二醇。

所用甘油脱水酶来源于肺炎克雷伯菌，产气克雷伯氏杆菌，大肠杆菌，弗氏柠檬菌，短乳杆菌，梭菌属巴氏梭菌，布氏乳杆菌中的一种或两种以上组合。

所述反应所涉及的酶表达在微生物细胞内时，NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内，NAD类似物再生所消耗再生底物通过主动运输进入细胞或直接利用胞内代谢产生的再生底物，采用添加直链烷烃的多相体系进行发酵——催化反应中涉及胞外添加底物浓度控制；所述直链烷烃为C_nH_2n+2，10≤n≤16，为缓冲体系体积的0.1-1倍，在发酵体系中富集产物。

将所述反应涉及的酶，转运蛋白，用表达和产生它们的微生物代替，在所述缓冲液中添加甘油和维生素B₁₂生产1，3-丙二醇，微生物包括但不局限于原核微生物中的大肠杆菌，克雷伯氏杆菌Klebsiella peneumoniae，短乳杆菌，巴斯德梭状芽孢杆菌；真核微生物中的酿酒酵母，圆红冬孢酵母，里氏木霉。

本发明的优点和有益效果：以生物柴油副产物——甘油作为底物价格低廉，相关氧化还原酶使用的NAD类似物生物相容性好，可循环再生；相对于化学催化法，酶催化还原条件温和，反应效率高；应用于胞内体系时，使用生物正交辅因子，可在不干扰细胞辅因子代谢的情况下，可将再生底物的还原力选择性传递到1，3-丙二醇生成上，提高产物选择性；且对于细胞没有的还原性底物，只能从培养基中摄取，便于控制反应过程。此外，通过使用氘代的再生底物，如氘代亚磷酸化合物，可获得氘代NADH类似物，用于制备高纯度氘取代的1，3-丙二醇。

附图说明：

图1以甘油为原料生产1，3-丙二醇涉及的酶反应式，其中再生底物——通过添加或胞内产物，在NAD类似物氧化还原酶催化下，用于NAD类似物再生的小分子，如亚磷酸化合物，苹果酸，乳酸等，产物——NAD类似物再生后，再生底物生成的产物。

具体实施方式：

实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明，本发明中涉及的通用实验方法如下：

所用NAD类似物(NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD或NUD)均参照文献方法(Ji DB,et al.Sci China Chem,2013,56,296)制备。

NAD类似物再生氧化还原酶突变体通过参考文献(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857)表达纯化，备用。

大肠杆菌等原核生物转化的电转化方法参照《分子克隆指南》第三版，酿酒酵母等真核生物转化的方法参照文献(Gietz,R.D.,et al.Nature Protocols 2007,2,31)中醋酸锂转化方法。

酶的突变与筛选：在晶体结构分析软件Pymol中，选取来源于Klebsiellapneumoniae的1，3-丙二醇脱氢酶PDOR晶体结构(PDB ID:3BFJ)做为模板与含有NAD辅酶的共结晶同工酶(PDB ID:3OX4)进行叠合，选取氨基酸序列SEQ ID NO：2中与NAD辅酶AMP部分相结合的氨基酸残基，将其对应的DNA序列SEQ ID NO：1中相应的碱基用RF克隆(Wang JX,et al.J.Microbiol.Meth.2007,71,225)的方法进行迭代饱和突变，并通过RF克隆的方法，整合到pTc99K载体上，将获得质粒DAN转化至宿主E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆接至LB培养基，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃下200rpm培养48h，4000rpm离心，去上清，并按文献方法(Ji DB,et al.J Am Chem Soc,2011,133,20857)进行显色并筛选，获得具有识别NAD类似物的突变型。

酶的表达纯化：挑取突变型工程菌，用Ni亲和层析柱按文献方法(Wang JX,etal.Protein Express.Purif.2007,53,97)进行蛋白质的过表达纯化，备用。

再生底物以及相应产物的检测：利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，乳酸，丙酮酸或亚磷酸等再生底物和对应产物的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护柱(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。

催化活性的测定：采用初速度法测定甘油脱水酶(GDHt)，1，3-丙二醇脱氢酶(PDOR)NAD类似物依赖性氧化还原酶活性。反应体系为200μL，含有50mM pH 7.5的HEPES缓冲液，30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，2mM NAD或NAD类似物，过量底物，在37℃下，加入适量的酶液启动反应，用紫外分光光度计，在340nm下测定吸光度变化(测定NADH及其类似物浓度变化)；酶活力定义为：在上述条件下，每分钟还原1μmol底物的酶量为1个单位。酶的比活力为每mg蛋白所含酶的单位数(U/mg)。

蛋白含量测定：以牛血清白蛋白ABS为标准蛋白，采用Bradford法测定。

NAD类似物采用液相色谱仪Agilent 1100分析，分析柱为Zorbax 150mm×3.0mmC₁₈(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁铵，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。紫外检测器波长为264nm(类似物及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(类似物还原态在340nm有较强吸收)。

甘油，3-羟基丙醛和1，3-丙二醇采用天美GC-7890F气相色谱分析，分析柱为极性柱FFAP石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.4μm)；柱温190℃，进样器温度250℃，检测器(FID)温度280℃；进样量0.2μL；载气N₂ 40mL/min，H₂ 40.6mL/min，空气130mL/min；分流进样，柱前压0.22Mpa。通过标准品，对照标准样品进行定性，采用面积归一法确定相对含量。

酶偶联催化反应：在37℃下，1mL 50mM pH 7.5HEPES反应液中，含有100mM甘油，再生底物120mM，甘油脱水酶GDHt 5.8U/mg，1，3-丙二醇脱氢酶PDOR 7.9U/mg，加入过量NAD类似物和维生素B₁₂启动反应；按时取样，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，12000g离心5min，一半上清液进行离子色谱IC测定再生底物及产物浓度，另一半用正己烷萃取，GC检测产物中3-羟基丙醛和1，3-丙二醇浓度。

对比例1：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和野生型1，3-丙二醇脱氢酶催化下，制备1，3-丙二醇

在1mL含有50mM pH 7.5的HEPES缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，110mM NADH，来源于肺炎克雷伯菌甘油脱水酶GDHt 15.8μg/mL，来源于肺炎克雷伯菌野生型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR 27.9μg/mL，加入2mM维生素B₁₂启动反应，在37℃反应2h，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，含量为40.1％，说明NADH未被完全氧化，在260nm仅检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为59.9。说明野生型酶存在条件下，可以将甘油转化为1，3-丙二醇，并伴随NADH氧化为NAD。

气相色谱分析：在保留时间8min处未发现甘油峰(气相色谱快速分析1，3-丙二醇发酵液中醇类)，在保留时间12.35min处发现3-羟基丙醛峰，含量为38.7％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为61.3％，说明甘油已经完全转化，但中间体由于热力学平衡问题，产物未能完全转化。

对比例2：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和野生型1，3-丙二醇脱氢酶催化下，NADH循环再生，制备1，3-丙二醇

在1mL含有50mM pH 7.5的HEPES缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，2mM NAD，120mM亚磷酸钠，来源于肺炎克雷伯菌野生型甘油脱水酶GDHt 15.8μg/mL，来源于肺炎克雷伯菌野生型PDOR 27.9μg/mL，源于Ralstonia sp.strain 4506的亚磷酸脱氢酶rsPDH 20.5μg/mL，加入2mM维生素B₁₂启动反应，在37℃反应3h，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，含量为15.2％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为84.8％，说明野生型酶存在条件下，说明NAD被还原为NADH。

气相色谱分析：在保留时间12.35min处发现3-羟基丙醛峰，含量为31.3％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为68.7％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰，说明甘油已经完全转化为3-羟基丙醛，但3-羟基丙醛未能完全转化为1，3-丙二醇。结合HPLC辅因子浓度分析，野生酶条件下，可完全转化甘油，其中一部中间体3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇，伴随部分NAD还原用于3-羟基丙醛的还原。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为23.34min处再生底物亚磷酸峰，含量占2.1％，在保留时间为31.41min处产物磷酸峰，含量占97.9％，表明亚磷酸参与再生NAD。

实施例1：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和PDOR-T143I/G186P催化下，制备1，3-丙二醇。

按文献方法(Fuller,C.W.et al.Eur.J.Biochem.1980,103,421)，还原NCD为NCDH，用作3-羟基丙醛的还原剂。

在1mL含有50mM pH7.5的HEPES缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，110mM NCDH，来源于肺炎克雷伯菌甘油脱水酶GDHt15.8μg/mL，NCD依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR-T143I/G186P 18.9μg/mL，加入2mM维生素B₁₂启动反应，在37℃反应2h，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水体积比＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有NCDH特征峰，含量为40.5％，说明NADH未被完全氧化，在260nm仅检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为59.5。说明野生型酶存在条件下，可以将甘油转化为1，3-丙二醇，并伴随NCDH氧化为NCD。

气相色谱分析：在保留时间8min处未发现甘油峰，在保留时间12.35min处发现3-羟基丙醛峰，含量为37.1％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为62.9％，说明甘油已经完全转化，但中间体由于热力学平衡问题，产物未能完全转化。

实施例1的结果表明，来源于肺炎克雷伯菌甘油脱水酶GDHt可以有效与NCD依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR-T143I/G186P联合催化转化甘油为1，3-丙二醇，NCDH被氧化为NCD。综合实施例1、对比例1和对比例2的结果说明，以突变型1，3-丙二醇脱氢酶，NADH类似物为催化剂，完全可以催化3-羟基丙醛到1，3-丙二醇这一步反应，替代天然的1，3-丙二醇脱氢酶行使功能。

实施例2：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和PDOR-G43K/G186P/L191F体催化下，亚磷酸钠为NCD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇

在1mL含有50mM pH7.5的HEPES缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，2mM NCD，120mM亚磷酸钠，来源于肺炎克雷伯菌野生型甘油脱水酶GDHt15.8μg/mL，PDOR-G43K/G186P/L191F 17.9μg/mL，亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C 10U/mg，加入2mM维生素B₁₂启动反应，在37℃反应180min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NCDH含量为12.9％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为87.1％，说明突变酶存在条件下，说明NCD被还原为NCDH。

气相色谱分析：在保留时间12.35min处发现3-羟基丙醛峰，含量为30.2％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为69.8％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰，说明甘油已经完全转化为3-羟基丙醛，但3-羟基丙醛未能完全转化为1，3-丙二醇。结合HPLC辅因子浓度分析，野生甘油脱水酶和突变1，3-丙二醇脱氢酶和NCD再生酶的催化下，可完全转化甘油，其中一部中间体3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇，伴随部分NCD再生用于3-羟基丙醛的还原。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为23.42min处再生底物亚磷酸峰，含量占2.5％，在保留时间为31.40min处产物磷酸峰，含量占97.5％，表明亚磷酸被氧化为磷酸并参与再生NCD。

所有反应的样品在340nm均出现了特征吸收峰，但不同催化组合得到的吸收峰强度有明显差别，说明亚磷酸脱氢酶突变体参与NAD类似物的还原再生。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε₃₄₀为6220M^-1·cm^-1，绘制标准曲线，得到定量结果(表1)。由于NAD类似物化合物结略有不同，可依据不同的NAD类似物，选择合适的亚磷酸脱氢酶突变体进行1，3-丙二醇制备。

表1.亚磷酸脱氢酶催化亚磷酸还原NAD类似物的实验结果

实施例3：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y催化下，氘代亚磷酸钾为NUD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇

根据文献方法(Woodyer R,et al.FEBS J,2005,272,3816)，将亚磷酸钾溶解在D₂O中，冷冻干燥，重复4次获得氘代亚磷钾，备用。

在5mL含有100mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，2mM NUD，120mM氘代亚磷酸钾，来源于产气克雷伯氏杆菌野生型甘油脱水酶GDHt 15.8μg/mL，PDOR-G43K/G186P/L191F 18.9μg/mL，亚磷酸脱氢酶psPDH-L151V/D213Q20μg/mL，加入5mM维生素B₁₂启动反应，在37℃反应30min，加入45mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NUDH含量为14.1％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为85.9％，说明突变酶催化条件下，说明NUD被还原为NUDH。收集上述260nm处样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)⁺为644.1026，与NUD²H的理论分子量(C₂₀H₂₉ ²H N₄O₁₆P₂ ⁺，643.1054)一致，表明得到了NUD²H。

气相色谱分析：在保留时间12.4min处发现3-羟基丙醛峰，含量为31.9％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为68.1％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰，说明甘油已经完全转化为3-羟基丙醛，但3-羟基丙醛未能完全转化为1，3-丙二醇。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为23.42min处再生底物亚磷酸峰，含量占3.9％，在保留时间为31.40min处产物磷酸峰，含量占96.1％，表明亚磷酸被氧化为磷酸并参与再生NUD。

实施例4：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶和PDOR-T143I/G186P催化下，苹果酸为NFCD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇

在1mL含有50mM pH 9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，2mM NFCD，120mM苹果酸钠，来源于大肠杆菌野生型甘油脱水酶GDHt 15.8μg/mL，PDOR-T143I/G186P 18.9μg/mL，苹果酸酶ME-L310R/Q401C 29μg/mL，加入30mM维生素B₁₂启动反应，在15℃反应240min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NFCDH含量为12.2％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为87.8％，说明突变酶催化条件下，说明NFCD被还原为NFCDH。

气相色谱分析：在保留时间12.4min处发现3-羟基丙醛峰，含量为30.1％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为69.9％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为7.74min处乳酸酸，含量占98.1％，在保留时间为10.41min处苹果酸，含量占1.9％，表明苹果酸被氧化为丙酮酸并参与再生NFCD。根据反应的化学计量关系可知，NCD再生循环利用35次。

实施例5：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-G183M/K187N催化下，氘代苹果酸钠为NBrCD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇。

根据文献方法(Woodyer R,et al.FEBS J,2005,272,3816)，将苹果酸钠溶解在D₂O中，冷冻干燥，重复4次获得氘代苹果酸钠，备用。

在1mL含有50mM pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，0.1mM NBrCD，120mM氘代苹果酸钠，来源于弗氏柠檬菌野生型甘油脱水酶GDHt 17.8μg/mL，PDOR-T143I/G186P 23.9μg/mL，苹果酸酶ME-L310R33μg/mL，加入40mM维生素B₁₂启动反应，在25℃反应200min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NBrCDH含量为14.1％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为85.9％，说明突变酶催化条件下，说明NBrCD被还原为NBrCDH。收集上述260nm处样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)⁺为720.2991，与NBrD²H的理论分子量(C₂₀H₂₆ ²HBrN₅O₁₅P₂，719.2995)一致，表明得到了NBrD²H。

气相色谱分析：在保留时间12.4min处发现3-羟基丙醛峰，含量为33.7％，14.61min处发现1，3-丙二醇峰，含量为66.3％，在保留时间16.45min处未发现甘油峰。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为7.72min处乳酸，含量占94.2％，在保留时间为10.24min处氘代苹果酸，含量占5.8％，表明苹果酸被氧化为丙酮酸并参与再生NBrCD。根据反应的化学计量关系可知，NBrCD再生循环利用660次。

实施例6：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-T142C/G186W催化下，D-乳酸盐钠为NTD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇。

在1mL含有100mM pH 9.5的磷酸缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，15mM NTD，120mM D-乳酸盐钠，来源于短乳杆菌野生型甘油脱水酶GDHt 19.1μg/mL，PDOR-T143I/G186P 28.9μg/mL，乳酸脱氢酶DLDH-V152R 49μg/mL，加入50mM维生素B₁₂启动反应，在35℃反应90min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NTDH含量为11.9％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为88.1％，说明突变酶催化条件下，说明NTD被还原为NTDH。

气相色谱分析：在保留时间12.4min处发现3-羟基丙醛峰，含量为35.2％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为64.8％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为5.21min处丙酮酸，含量占95.2％，在保留时间为7.74min处D-乳酸，含量占4.8％，表明苹果酸被氧化为丙酮酸并参与再生NTD。根据反应的化学计量关系可知，NTD再生循环利用4次。

实施例7：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-L44N/T143Y/G187R催化下，甲酸铵为NGD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇。

在1mL含有100mM pH 9.5的磷酸缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，25mM NGD，120mM甲酸铵，来源于梭菌属巴氏梭菌野生型甘油脱水酶GDHt 23.1μg/mL，PDOR-T143I/G186P 32.4μg/mL，甲酸脱氢酶cboFDH-S380N/C255Q 49μg/mL，加入80mM维生素B₁₂启动反应，在40℃反应30min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NGDH含量为9.9％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，含量为90.1％，说明突变酶催化条件下，说明NGD被还原为NGDH。

气相色谱分析：在保留时间12.4min处发现3-羟基丙醛峰，含量为38.1％，14.68min处发现1，3-丙二醇峰，含量为61.9％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰。

离子色谱检测再生底物以及相应产物：在保留时间为3.64min处甲酸，含量占5.8％，表明甲酸被氧化为二氧化碳并参与再生NGD。根据反应的化学计量关系可知，NGD再生循环利用2.5次。

实施例8：以甘油为原料，野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-L44N/T142K/L191C催化下，甲醇为NClCD类似物循环再生试剂，制备1，3-丙二醇。

在1mL含有100mM pH 10的磷酸缓冲液反应体系中，含有30mM(NH₄)₂SO₄，100mM甘油，25mM NClCD，120mM甲醇，来源于布氏乳杆菌野生型甘油脱水酶GDHt 29.1μg/mL，PDOR-T143I/G186P 39.7μg/mL，甲醇脱氢酶MDH-Y172T/A238E/N240E 46.2μg/mL，加入40mM维生素B₁₂启动反应，在20℃反应200min，加入9mL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应，取出500μL进行，进行辅酶以及产物分析。

HPLC分析：样品在340nm下有特征峰，NClCDH含量为10.6％，在260nm检测到与NAD保留时间相同的特征峰，NClCD含量为90.1％，说明突变酶催化条件下，说明NClCD被还原为NClCDH。

气相色谱分析：在保留时间2.18min处发现甲醛峰，含量为38.1％，在保留时间3.8min处发现甲醇峰，含量为5.3％，在保留时间12.21min处发现3-羟基丙醛峰，含量为7.3％，14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量为36.6％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰。

实施例9：以甘油为原料，在大肠杆菌胞内，NCD介导下，由野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-L44N/T142K/L191C催化下，苹果酸为NCD类似物循环再生试剂，苹果酸酶ME-L310R/Q401C为辅酶再生催化剂，制备1，3-丙二醇。

将NCD依赖型苹果酸酶、甘油脱水酶、NCD依赖型1，3-丙二醇脱氢酶和NCD转运蛋白同时在宿主细胞中表达，构成NCD依赖的生物正交催化体系。当培养基中的甘油，苹果酸和NCD进入宿主细胞后，启动该生物催化体系，甘油向1，3-丙二醇的转化完成。以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.Appl Environ Microbiol,2011,77,427)，构建生产1，3-丙二醇的工程菌株为例予以说明。

将表达转运NCD的蛋白AtNDT2(Accession No.NC_003070)(Palmieri FB,et al.JBiol Chem,2009,284,31249)的基因由gapA P1启动子(Charpentier B,et al.JBacteriol,1994,176,830)控制表达。将编码野生型甘油脱水酶GDHt的基因，编码PDOR-L44N/T142K/L191C的基因和编码ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。

将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WJ001。在5mL LB培养基中诱导工程菌E.coli WJ001表达上述三种功能蛋白，培养基中添加50μg/mL氨苄青霉素、2mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD₆₀₀为4.5，2000×g离心6min收集菌体。

用50mL p 7.5的MOPS培养基(Hirota R.,et al.J.Biosci.Bioeng.2012,113,445)洗涤重悬菌体，将菌体密度OD₆₀₀调整到8。上述工程菌悬液中加入100mM甘油，10mM苹果酸，1mM维生素B₁₂，0.1mM的NCD，10mL正十二烷，分别在18℃、30℃、40℃的200rpm摇床中厌氧反应4h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应，取500μL的上清液进行产物分析。

参照实施例8的方法利用离子色谱分析有机酸产物，结果表明16℃反应液含0.8mM苹果酸、17.3mM丙酮酸；30℃反应液含0.2mM苹果酸，19.4mM丙酮酸；42℃反应液含0.5mM苹果酸、13.8mM丙酮酸。

参照实施例8的方法利用气相色谱分析：在保留时间12.21min处未发现3-羟基丙醛峰，在保留时间14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量分别为60.1％，66.6％和64.3％，在保留时间16.35min处发现甘油峰，含量占39.9％，33.4％和35.7％。

在不添加苹果酸，添加NCD的对照实验中，苹果酸浓度分别为1.2mM，0.2mM和0.3mM；对应1，3-丙二醇含量分别为50.2％，55.2％和54.1％，甘油峰含量占49.8％，44.8％和45.9％；只添加苹果酸，未添加NCD，未检测到1，3-丙二醇仅为10.1％，15.7％和13.1％。

实验结果表明在全细胞催化过程中苹果酸酶ME-L310R/Q401C通过氧化苹果酸为PDOR-L44N/T142K/L191C提供NCDH，催化3-羟基丙醛还原生成1，3-丙二醇，使1，3-丙二醇产量比只添加NCD时最大提高11.4％，比只添加苹果酸时最大提高50.9％。

实施例9说明，在全细胞催化过程中胞内苹果酸酶ME-L310R/Q401C可以通过氧化胞内和外加苹果酸提供NCDH，被PDOR-L44N/T142K/L191C用做辅酶应用于还原反应，大大提高了1，3-丙二醇的产量。

实施例10：以甘油为原料，在克雷伯氏杆菌内，NFCD介导下，由野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-L44N/T142K/L191G催化下，亚磷酸为NFCD类似物循环再生试剂，亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F为辅酶再生催化剂，制备1，3-丙二醇。

可以将识别NFCD的亚磷酸脱氢酶、甘油脱水酶、NFCD依赖型PDOR-L44N/T142K/L191G和NFCD转运蛋白同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NFCD的生物催化体系。下面以改造克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)TUAC01(朱建国等，食品与发酵工业，2008，34，6)，构建生产1，3-丙二醇的工程菌株。

NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I,et al.Nature 2004,432,622)，可以转运NFCD。将表达转运蛋白NTT4的基因，编码野生型甘油脱水酶GDHt的基因，编码PDOR-L44N/T142K/L191G的基因和编码rsPDH-I151R/I218F的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。

将上述工程质粒电转化导入Klebsiella pneumoniae ME308获得工程菌株K.pneumonia WJ006。在LB培养基中诱导工程菌K.pneumonia WJ006表达上述四种功能蛋白，5mL培养基中添加80μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD₆₀₀为4.5，2000×g离心5min收集菌体。

用pH 8.0的M9培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD₆₀₀调整到6。上述工程菌悬液50mL中加入100mM甘油，110mM亚磷酸、0.4mM的NFCD，10mL正十四烷，，在37℃的200rpm摇床中厌氧反应5h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应。

参照实施例8的方法利用离子色谱分析有机酸产物，发酵液含10.1mM亚磷酸酸，100.4mM磷酸。

参照实施例8的方法利用气相色谱分析：在保留时间12.21min处未发现3-羟基丙醛峰，在保留时间14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量为68.7％，在保留时间16.35min处发现甘油峰，含量占31.3％。

在只添加NFCD的对照实验中，3-羟基丙醛含量为6.1％，甘油峰含量占87.9％，1，3-丙二醇含量为6.0％；只添加亚磷酸，未检测到1，3-丙二醇。

实验结果表明在全细胞催化过程中亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F通过氧化亚磷酸为PDOR-L44N/T142K/L191G提供NFCDH，催化生成1，3-丙二醇，单独添加亚磷酸或NFCD都无法生成1，3-丙二醇。

实施例11：以甘油为原料，在巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteurianum)内，NUD介导下，由野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-T142C/G186W催化下，甲醛为NUD类似物循环再生试剂，甲醛脱氢酶FaDH-G216R/L236L为辅酶再生催化剂，制备1，3-丙二醇。

将识别NUD的甲醛脱氢酶、甘油脱水酶、偏好NUD的PDOR-T142C/G186W和NUD转运蛋白同时在宿主细胞中表达，同时在宿主细胞中表达。当培养基中的甲醛和NUD进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。下面以改造巴氏梭状芽孢杆菌(Clostridium pasteurianum)ATCC 6013(Pyne et al.Biotechnology for Biofuels 2013,6,50)，构建生产1，3-丙二醇的工程菌株。

将上述编码基因整合的工程质粒pHT3导入C.pasteurianum ATCC 6013获得工程菌株C.pasteurianum WL007。在5mL LB培养基中诱导工程菌C.pasteurianum WL007表达上述功能蛋白，5mL培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在30℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD₆₀₀为4.5，2000×g离心5min收集菌体，用50mL浓度100mM，pH 7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD₆₀₀调整到9。上述工程菌悬液中加入100mM甘油，100mM甲醛、0.8mM的NUD，10mL正十六烷，，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应5h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应。

参照实施例8的方法利用离子色谱分析有机酸产物，发酵液含91.1mM甲酸。

参照实施例8的方法利用气相色谱分析：在保留时间3.15min处未发现甲醛峰，含量为8.1％；在保留时间14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量为64.7％，在保留时间16.35min处发现甘油峰，含量占28.2％。

在只添加NUD的对照实验中，3-羟基丙醛含量为4.1％，甘油峰含量占91.2％，1，3-丙二醇含量为4.7％；只添加甲醛，未检测到1，3-丙二醇。

实验结果表明在全细胞催化过程中甲醛脱氢酶酶FaDH-G216R/L236L通过氧化甲醛为PDOR-T142C/G186W提供NUDH，催化产生1，3-丙二醇。

实施例12：以甘油为原料，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741内，NGD介导下，由野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y催化下，甲酸为NGD类似物循环再生试剂，甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S为辅酶再生催化剂，制备1，3-丙二醇。

将识别NGD的甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S，甘油脱水酶，偏好NGD的PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y，转运蛋白NTT4，同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖NGD的生物催化体系。当培养基中的甲酸钠和NGD进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y的基因，由TEF组成型启动子,CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。

将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae WJ008。用5mL pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiae WL008表达上述两种功能蛋白，在30℃的200rpm摇床中培养38h至菌体密度OD₆₀₀为5.3，2000×g离心5min收集菌体，用50mL浓度50mM,pH 7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD₆₀₀调整到9。上述工程菌悬液中加入100mM甘油，110mM甲酸、0.5mM的NGD，10mL正十四烷，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应5h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应。

参照实施例8的方法利用离子色谱分析有机酸产物，发酵液含9.1mM甲酸。

参照实施例8的方法利用气相色谱分析：在保留时间14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量为65.3％，在保留时间16.35min处发现甘油峰，含量占34.7％。

在只添加NGD的对照实验中，3-羟基丙醛含量为4.7％，甘油峰含量占95.3％，未检测到1，3-丙二醇；只添加甲酸，未检测到1，3-丙二醇。

实施例13：以甘油为原料，在里氏木霉(Trichoderma reesei)内，NTD介导下，由野生型甘油脱水酶GDHt和PDOR-G183M/K187N催化下，异丙醇为NTD类似物循环再生试剂，甲醇脱氢酶MDH-Y172T/A238E/N240E为NTD类似物循环再生催化剂，制备1，3-丙二醇。

将识别NTD的甲醇脱氢酶甲醇脱氢酶MDH-Y172T/A238E/N240E，甘油脱水酶，偏好NGD的PDOR-G183M/K187N，转运蛋白NTT4，同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NTD的生物催化体系。当pH 7.5的M9培养基中的异丙醇和NTD进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码MDH-Y172T/A238E/N240E的基因和编码PDOR-G183M/K187N的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。将工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei WJ009，用5mL pH 5的含有15g/L乳糖，10g/L酵母提取物，1g/L的(NH₄)₂SO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄，0.6g/L CaC1₂，0.005g/LFeSO₄·7H₂O，0.0016g/L MnSO₄·H₂O，0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O，0.0037g/L CoCl₂·6H₂O的培养基诱导工程菌T.reesei WJ009表达上述功能蛋白，在25℃的200rpm摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用50mL浓度100mM,pH 7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。

上述工程菌，重悬在pH 9的Tris-HCl缓冲液中，加入100mM甘油，100mM异丙醇、1mM的NTD，10mL正十二烷，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应5h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)淬灭反应。

气相色谱分析：在保留时间2.18min处发现丙酮峰，含量为30.2％，在保留时间3.8min处发现异丙醇峰，含量为8.8％，在保留时间12.21min处发现3-羟基丙醛峰，含量为8.3％，14.74min处发现1，3-丙二醇峰，含量为52.7％，在保留时间16.35min处未发现甘油峰。

在只添加NTD的对照实验中，3-羟基丙醛含量为1.7％，甘油峰含量占98.3％，未检测到1，3-丙二醇；只添加异丙醇，未检测到1，3-丙二醇。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60

atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctggggggga aaaaagccct gctggtcacc 120

gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggtggaca aaaccctgca ttatctgcgg 180

gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240

gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300

ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360

ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420

aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480

accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540

ccgctgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600

acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660

atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720

ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgcc tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780

gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840

cacggcgtgg ccaacgctgt cctgctgccg catgtggcgc gctacaacct gatcgccaac 900

ccggagaaat tcgccgatat cgctgaactg atgggcgaaa atatcaccgg actgtccact 960

ctcgacgcgg cggaaaaagc catcgccgct atcacgcgtc tgtcgatgga tatcggtatt 1020

ccgcagcatc tgcgcgatct gggggtaaaa gaggccgact tcctctacat ggcggagatg 1080

gctctgaaag acggcaatgc gttctcgaac ccgcgtaaag gcaacgagca ggagattgcc 1140

gcgattttcc gccaggcatt c 1161

<210> 2

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Tyr Arg Met Phe Asp Tyr Leu Val Pro Asn Val Asn Phe Phe

1 5 10 15

Gly Pro Asn Ala Ile Ser Val Val Gly Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly

20 25 30

Gly Lys Lys Ala Leu Leu Val Thr Asp Lys Gly Leu Arg Ala Ile Lys

35 40 45

Asp Gly Ala Val Asp Lys Thr Leu His Tyr Leu Arg Glu Ala Gly Ile

50 55 60

Glu Val Ala Ile Phe Asp Gly Val Glu Pro Asn Pro Lys Asp Thr Asn

65 70 75 80

Val Arg Asp Gly Leu Ala Val Phe Arg Arg Glu Gln Cys Asp Ile Ile

85 90 95

Val Thr Val Gly Gly Gly Ser Pro His Asp Cys Gly Lys Gly Ile Gly

100 105 110

Ile Ala Ala Thr His Glu Gly Asp Leu Tyr Gln Tyr Ala Gly Ile Glu

115 120 125

Thr Leu Thr Asn Pro Leu Pro Pro Ile Val Ala Val Asn Thr Thr Ala

130 135 140

Gly Thr Ala Ser Glu Val Thr Arg His Cys Val Leu Thr Asn Thr Glu

145 150 155 160

Thr Lys Val Lys Phe Val Ile Val Ser Trp Arg Asn Leu Pro Ser Val

165 170 175

Ser Ile Asn Asp Pro Leu Leu Met Ile Gly Lys Pro Ala Ala Leu Thr

180 185 190

Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Val Glu Ala Tyr Ile

195 200 205

Ser Lys Asp Ala Asn Pro Val Thr Asp Ala Ala Ala Met Gln Ala Ile

210 215 220

Arg Leu Ile Ala Arg Asn Leu Arg Gln Ala Val Ala Leu Gly Ser Asn

225 230 235 240

Leu Gln Ala Arg Glu Asn Met Ala Tyr Ala Ser Leu Leu Ala Gly Met

245 250 255

Ala Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln

260 265 270

Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Met Pro His Gly Val Ala Asn Ala Val Leu

275 280 285

Leu Pro His Val Ala Arg Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Pro Glu Lys Phe

290 295 300

Ala Asp Ile Ala Glu Leu Met Gly Glu Asn Ile Thr Gly Leu Ser Thr

305 310 315 320

Leu Asp Ala Ala Glu Lys Ala Ile Ala Ala Ile Thr Arg Leu Ser Met

325 330 335

Asp Ile Gly Ile Pro Gln His Leu Arg Asp Leu Gly Val Lys Glu Ala

340 345 350

Asp Phe Leu Tyr Met Ala Glu Met Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe

355 360 365

Ser Asn Pro Arg Lys Gly Asn Glu Gln Glu Ile Ala Ala Ile Phe Arg

370 375 380

Gln Ala Phe

385

Claims (8)

1.一种生物催化甘油产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：在缓冲体系中，以NAD类似物为介导，甘油脱水酶、维生素B₁₂、NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR、再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶、再生底物存在下，以甘油为原料生产1，3-丙二醇；所述1，3-丙二醇脱氢酶PDOR基因来源于克雷伯氏菌属，其为序列2所示的氨基酸序列突变体，所述NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢PDOR的突变体为

PDOR多位点突变PDOR-G43K/G186P/L191F，PDOR-G43D/L44F/G186P/L191Y，PDOR-T143I/G186P，PDOR-G183M/K187N，PDOR-T142C/G186W，PDOR-L44N/T143Y/G187R/，PDOR-L44N/T142K/L191C，或PDOR-L44N/T142K/L191G中的一种或两种以上；所述NAD类似物为NCD，NFCD，NClCD，NBrCD，NMeCD，NGD，NTD和NUD中的一种或两种以上，具体结构式如下：

。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述用于再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶，为可催化还原NAD类似物为NADH类似物的突变活性蛋白质，选自：亚磷酸脱氢酶，苹果酸酶，乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶，甲醛脱氢酶，或甲醇脱氢酶中的一种或两种以上；

所述再生NAD类似物的氧化还原酶对应再生底物选自亚磷酸化合物，苹果酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物，甲醛，甲醇，乙醇，丙醇或丁醇中的一种或两种以上；

其中，亚磷酸化合物为亚磷酸，亚磷酸盐，氘代亚磷酸或氘代亚磷酸盐中的一种或两种以上；

苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐、氘代苹果酸、氘代苹果酸盐中的一种或两种以上；

甲酸化合物为甲酸，甲酸盐，氘代甲酸或氘代甲酸盐中的一种或两种以上；

D-乳酸化合物为D-乳酸，D-乳酸盐，氘代D-乳酸或氘代D-乳酸盐中的一种或两种以上。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征还在于：所述经过突变可再生NAD类似物的氧化还原酶突变体为：

亚磷酸脱氢酶突变体选自psPDH-L151V/D213Q，rsPDH-I151R，rsPDH-I151R/E213C或rsPDH-I151R/I218F中的一种或两种以上；

苹果酸酶突变体选自ME-L310R/Q401C，ME-L310R中的一种或两种；

乳酸脱氢酶突变体选自DLDH-V152R；

甲酸脱氢酶突变体选自cboFDH-G171Y，cboFDH-I170T/A229S，cboFDH-G171R/G234F，cboFDH-H23S/L257R或cboFDH-S380N/C255Q中的一种或两种以上；

甲醛脱氢酶突变体选自FaDH-G216R/L236L，FaDH-L218N/R267K，FaDH-G216S/L236W/R267P或FaDH-R267T/L236P中的一种或两种以上；

甲醇脱氢酶突变体选自MDH-Y172R/G173S，MDH-A238E/N240E或MDH- Y172T/A238E/N240E中的一种或两种以上。

4.按照权利要求1所述产1，3-丙二醇的方法，其特征还在于：所述缓冲体系为pH 6–10的缓冲液体系，反应温度15 °C–40 °C，反应时间10 min–300 min；甘油浓度为0.1 mM−1000mM，甘油脱水酶浓度为4 μg/mL−500 μg/mL，维生素B₁₂浓度为1 mM−40 mM，再生NAD类似物的NAD类似物依赖型氧化还原酶的浓度为4 μg/mL−500 μg/mL，NAD类似物的浓度为0.01 mM−20 mM，NAD类似物依赖型1，3-丙二醇脱氢酶PDOR浓度为4 μg/mL−500 μg/mL，再生底物浓度为0.1 mM−100 mM，可得产物1，3-丙二醇。

5.按照权利要求1所述产1，3-丙二醇的方法，其特征还在于：甘油脱水酶来源于肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，弗氏柠檬菌，短乳杆菌，梭菌属巴氏梭菌，布氏乳杆菌中的一种或两种以上组合。

6.按照权利要求1所述产1，3-丙二醇的方法，其特征还在于：将所述反应所涉及的酶表达在微生物细胞内，NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内，NAD类似物再生所消耗再生底物通过主动运输进入细胞或直接利用胞内代谢产生的再生底物，采用添加直链烷烃的多相体系进行发酵；所述直链烷烃为C_nH_2n+2，10 ≤ n≤16，为缓冲体系体积的0.1-1倍。

7.按照权利要求6所述产1，3-丙二醇的方法，其特征还在于：将所述反应涉及的酶，转运蛋白，用表达相应蛋白的微生物代替，在所述缓冲液中添加甘油和维生素B₁₂生产1，3-丙二醇，微生物选自下述中的一种或二种以上：原核微生物中的大肠杆菌，克雷伯氏杆菌Klebsiella peneumoniae，短乳杆菌，巴斯德梭状芽孢杆菌；真核微生物中的酿酒酵母，圆红冬孢酵母，里氏木霉。

8.按照权利要求1或5所述产1，3-丙二醇的方法，其特征还在于：所述的缓冲体系选自磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液中的一种或两种以上。

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