KR20140003262A

KR20140003262A - 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물

Info

Publication number: KR20140003262A
Application number: KR1020120071380A
Authority: KR
Inventors: 이주희; 정원석; 최인석
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-01-09

Abstract

본 발명은 (a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 생산방법에 따르면 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온의 생산성을 증가시킬 수 있으며, 배양시 필요한 별도의 냉각 공정 없이 배양시킬 수 있어 미생물의 생장 및 3-하이드록시프로피온산 생산을 동시에 경제적으로 향상시킬 수 있다.

Description

재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물{Producing Method of 3-Hydroxypropionic Acid Using Recombinant Microorganisms and Recombinant Microorganisms used thereby}

본 발명은 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물에 관한 것이다.

최근 원유자원의 고갈에 의한 에너지자원의 불안정성과 탄소배출에 따른 지구온난화에 대한 관심이 집중됨에 따라 석유를 원료로 하여 화학공정을 통해 생산하던 화학물질들을 생물학적 공정을 통하여 대체하려는 연구들이 지속되고 있다.

그 중 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)은 식물 혹은 동물성 지방을 원료로 하는 바이오 디젤의 부산물로 생산되는 글리세롤을 두 단계 효소반응을 거쳐 생물학적으로 생산 가능한 화학물질이다. 3-하이드록시프로피온산은 아크릴산을 비롯하여 1,3-프로판디올, 아크릴아마이드 등 다양한 화학물질로 전환이 가능한 유용한 중간체이지만 화학적으로는 합성이 용이하지 않다. 또한 생물학적으로도 3-HP를 생산하고자 하는 시도가 있으나 아직까지 상업적으로 생산된 예는 없다.

그 중 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는 예가 알려져 있다. 글리세롤은 유기화학에서 가장 다양한 용도로 이용되는 물질 중의 하나로 매일 이용되는 다양한 생활 필수품용 화합물 합성에 일차 재료로 활용되고 있다. 최근 바이오디젤의 대량 생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하였고, 바이오디젤 10억 갤런당 77억 파운드의 글리세롤이 생산되고 있다. 앞으로 바이오디젤의 시장 수요가 증가하면서 부산물인 글리세롤의 생산량도 급격하게 증가할 것으로 예측된다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 생물학적으로 두 종의 효소가 작용하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 3-HP를 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 데하이드로타제(Glycerol dehydratase)는 글리세롤을 탈수반응시켜 3-하이드록시프로피온알데히드(3-hydroxy propionaldehyde; 3-HPA)를 생산하고, 두 번째 효소인 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제(3-HPA dehydrogenase)는 3-HPA를 탈수소화시켜 3-HP를 생산하게 된다.

전환과정 중 첫번째 효소인 데하이드로타제에 의해 중간체로 3-하이드록시프로피온 알데히드가 생성되는데, 이 물질은 세포에 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이것이 생산과정에서 모세포에 미량이라도 축적되게 되면 세포의 성장 및 대사를 저해하여 3-하이드록시프로피온산의 생산성을 감소시키고 세포의 사멸을 초래하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 3-하이드록시프로피온산의 생산성을 높이기 위해서는 중간체로 생성되는 3-하이드록시프로피온 알데히드를 빠른 속도로 산의 형태인 3-하이드록시프로피온산으로 전환시키는 것이 필수이며, 이를 위하여 3-하이드록시프로피온 알데히드를 기질로 하는 고활성의 산화효소를 얻는 것이 요구된다.

생물학적인 방법으로 글리세롤을 3-하이드록시프로피온산으로 전환하기 위해서는 도 1과 같이 데하이드로타제 및 데하이드로게나제가 필요하다. 데하이드라타제는 Klebsiella, Citrobacter 및 Lactobacillus 등으로부터 유래된 DhaB1, Dha2 및 Dha3이 보고되어 있고, 이 데하이드라타제의 활성을 유지시키기 위한 자체 활성인자인 GdrA 및 GdrB이 알려져 있다.

한편, 대장균을 이용한 3-HP 생산의 경우 3-HP 생산 관련 단백질의 고활성을 유지시켜 주기 위하여 33~34℃에서 배양하는데, 이 경우 배양시 발생하는 열을 발산하기 위하여 발효조를 냉각하는 것이 필요하며 이에 따라 공정 비용이 증가하는 문제가 있다. 냉각으로 발생하는 공정 비용을 감소시키고 미생물의 생육을 증진하기 위해서는 좀 더 높은 온도 즉, 35 내지 37℃ 가량의 온도에서 배양하는 것이 바람직하다. 그러나, 3-HPA를 3-HP로 산화하는 반응을 매개하는 공지된 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제 AldH는 37℃에서 활성이 크게 감소하는 문제점이 있다.

1. 미국등록특허 제6,013,494호 2. 미국등록특허 제6,852,517호

1. Daniel et al., FEMS Microbiol. Rev. 22, 553 (1999) 2. Daniel et al., supra; Toraya and Mori, J. Biol. Chem. 274, 3372 (1999) 3. Tobimatsu et al., J. Bacteriol. 181, 4110 (1999) 4. Wood W. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.82, pp.1585-1588, 1985.

본 발명의 목적은 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 3-HP) 생산능이 우수한 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-HP의 효과적인 생산방법을 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명은 3-하이드록시프로피온산 생산능이 우수하면서 35~37℃의 온도에서 배양하는 경우에도 세포내에서 효소 활성이 우수하여 세포 배양시에 별도의 냉각 과정이 필요 없도록 하는 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid; 3-HP) 재조합 미생물 및 이를 이용한 3-HP의 효과적인 생산방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과, (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제는 (a) 서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물은 상기의 글리세롤 데하이드라타제 및 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에, 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제 또는 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp.), 락토바실러스속(Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속(Salmonella sp .)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 탄소원으로 글리세롤이나 글루코스를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 35 내지 37℃에서 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, (a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 미생물은 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 글리세롤 데하이드라타제 또는 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp.), 락토바실러스속(Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속(Salmonella sp .) 미생물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에서 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용한 3-하이드록시프로피온산 생산방법은 기존에 보고된 대장균 유래의 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제(aldH) 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 이용하는 방법보다 3-하이드록시프로피온 생산이 현저하게 증가한다.

본 발명은, 3-HPA를 3-HP로 전환시키는 알데히드 데하이드로게나제가 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae)로부터 유래한 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 상기 알데히드 데하이드로게나제는 33℃ 보다 35~37℃ 가량의 보다 더 높은 온도에서 배양시 공지의 AldHd에 비하여 더 높은 효소 활성을 유지하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명에 따른 재조합 미생물은 35~37℃의 온도에서 배양시 우수한 활성을 나타내기 때문에 최적 배양 온도를 유지하기 위한 냉각 과정을 부여할 필요없으므로 미생물의 생장 및 3-HP 생산성을 효과적으로 향상시켜 경제적으로 대량 수득할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생성하는 경로와 이를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물들을 보여주는 개략적인 모식도이다.
도 2는 실시예 및 비교예의 재조합 벡터에 대한 개략적인 개열지도이다.
1) dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 유전자는 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026) 유래의 글리세롤 데하이드로타제(glycerol dehydratase) 코딩 유전자이고,
2) gdrA, gdrB는 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026) 유래의 글리세롤 데하이드로타제 재활성인자(glycerol dehydratase reactivator) 코딩 유전자이고,
3) aldH는 대장균 K12 MG1655 유래의 알데히드 데하이드로게나제 코딩 유전자이며,
4) ECL_02229는 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae KCCM 12178) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase) 코딩 유전자이다.
도 3은 배양 온도에 따른 알데히드 데하이드로게나제 효소의 비활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 IPTG 처리 농도에 따른 3-HP 생산량을 비교한 결과이다.
도 5은 재조합 대장균의 배양 온도에 따른 3-HP 생산량을 비교한 결과이다.

본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다.

본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 3-하이드록시프로피온산 생합성 관련하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높은 것이 더욱 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 3-하이드록시프로피온산 합성과 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 더 적은 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 '폴리뉴클레오타이드'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오타이드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 길이가 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는 싱글 스트랜드 폴리뉴클레오타이드가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열번호 1과 혼성화 되는 뉴클레오타이드 서열"은 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하며, 예를 들어, Wood W. I. 등 (비특허문헌 4)에 기술된 방법일 수 있다.

한편 상기 '혼성화'는 발명에 필요한 범위내에서 행해지는 '엄격한 조건하에서 혼성화'되는 것으로 해석될 수 있다. 상기 "엄격"은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 상기 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 혼성화에 사용될 수 있는 시판용 키트로는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 폴리뉴클레오타이드를 검출한다.

한편, 혼성화될 수 있는 기타 뉴클레오타이드는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 3-하이드록시프로피온알데히드(3-Hydroxypropionaldehyde)가 존재하거나 3-하이드록시프로피온알데히드가 생산되는 조건에서, (a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과, (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법 및 그에 사용되는 재조합 미생물을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서는 글리세롤로부터 3-HP를 생산함에 있어, 3-HPA를 3-HP로 전환시키는 3-HPA 데하이드로게나제로서 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제를 이용하는 것을 특징으로 한다.

상기 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제는 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제의 하나이며, 이는 3-하이드록시프로피온알데히드(3-Hydroxy propionaldehyde; 3-HPA)를 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxy propionic acid, 3-HP)으로 전환하는 효소를 의미한다.

본 발명의 상기 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제는 (a) 서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일례로 서열번호 1로 표현된 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다.

3-HP의 생산성을 높이기 위해서는 중간체로 생성되는 3-HPA를 빠른 속도로 3-HP로 전환시키는 것이 필수이며, 이를 위하여 3-HPA에 대한 높은 활성을 나타내는 데하이드로게나제가 요구되는데, 본 발명의 엔테로박터 클로아세 유래의 데하이드로게나제는 3-HPA에 대한 활성이 높은 특징이 있다.

한편, 3-HPA를 3-HP로 전환하는데 이용되는 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 알데히드 데하이드로게나제 등을 포함한 공지의 알데히드 데하이드로게나제는 미생물의 배양온도가 33~34℃인 경우에는 활성이 높지만, 이 보다 높은 35~37℃인 경우에는 활성이 감소된다. 대장균 등과 같은 미생물은 37℃에서 생장이 더 빠르므로 더 높은 온도에서 배양하여 균체 수 증가에 따른 3-HP 생산 증가를 시도할 수 있으나, 높은 온도에서는 효소 활성이 감소된다. 이를 위하여 33~34℃의 저온에서 배양하려면 배양으로 발생하는 열을 발산시키기 위하여 냉각 공정을 통해 배양 온도를 낮추어야 하므로 공정 비용이 증가한다. 또한 최적 성장온도 이하에서의 배양에 따른 생장속도 저하의 문제가 있다.

그러나, 본 발명의 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제는 35 내지 37℃의 배양온도에서도 효소 활성의 감소가 최소화되는 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 알데히드 데하이드로게나제를 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 생합성하는 경우 별도의 발효조 냉각 공정을 채용하지 않아도 되므로 고온에서 배양하여 미생물의 생장 및 3-HP 생산을 동시에 경제적으로 향상시킬 수 있다.

본 발명의 3-HP의 전구체가 되는 3-HPA를 글리세롤로부터 생산하기 위하여 본 발명의 재조합 미생물은 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase) 또는 디올 데하이드라타제(diol dehydratase) (이하, 간단히 '글리세롤 데하이드라타제'라 칭함)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.

상기 글리세롤 데하이드라타제는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)로 전환시키는 효소를 의미한다. 상기 효소에는 미생물 배양시 탄소원(carbon source)으로 사용된 글리세롤을 3-HPA로 전환할 수 있는 임의의 글리세롤 데하이드라타제가 이용될 수 있다.

상기 글리세롤 데하이드로타제는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp .), 락토바실러스속( Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속( Salmonella sp .)으로 구성되는 군으로 선택된 미생물에서 유래될 수 있고, 보다 구체적으로는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디( Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum ), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium) 또는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 유래일 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 3에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 dhaB1에 대응하고, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 DhaB1에 대응한다. 서열번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 dhaB2에 대응하고, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 DhaB2에 대응한다. 서열번호 7에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 dhaB3에 대응하고, 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 DhaB3에 대응한다.

본 발명의 상기 글리세롤 데하이드로타제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (a) 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일례로, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 표현된 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 미생물은 상기 상술한 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제 및 글리세롤 데하이드로타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에, 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데하이드로타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp.), 시트로박터속(Citrobacter sp .), 락토바실러스속( Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속( Salmonella sp .)으로 구성되는 군으로 선택된 미생물에서 유래될 수 있고, 보다 구체적으로는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디( Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum ), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium) 또는 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 유래일 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 9에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 gdrA에 대응하고, 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 GdrA에 대응한다. 서열번호 11에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 gdrB에 대응하고, 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 유래의 GdrB에 대응한다.

상기 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드는 (a) 서열번호 10 또는 서열번호 12의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레타이드 서열 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 일례로, 서열번호 9 및 서열번호 11로 표현된 뉴클레오타이드 서열이 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 재조합 미생물은 상기 상술한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환카세트나 재조합 벡터 등을 만들고 이를 적정한 숙주세포에 도입하여 발현시켜서 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 상술한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자군(핵산분자)을 박테리움, 바이러스(박테리오파지 T17, M-13 파생파지 등), 코스미드, 효모, 식물 등의 적절한 벡터에 클로닝할 수 있으며, 상기 벡터는 적당한 숙주세포에 도입될 수 있다.

상기에 사용되는 벡터에는 3-하이드록시프로피온알데히드 데하이드로게나제의 발현을 촉진하기 위하여, 개시 조절 부위, 프로모터 등의 다양한 핵산분자를 더 포함할 수 있다. 예컨데 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 세포의 발현을 촉진하는 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 피키아(Pichia) 속 세포의 발현을 촉진하는 AOX1, 및 대장균(E. coli) 발현을 촉진하는 lac, trp, XP_L, XP_R, T7, tac, trc 등이 있다. 또한 상기 벡터는 각 바람직한 숙주에 따라 다양한 종결 조절 부위도 포함될 수 있고, 경우에 따라서는 별도의 종결 부위를 포함하지 않을 수도 있다.

따라서 본 발명에 사용되는 재조합 미생물은 해당 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

예컨데 시트로박터(Citrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 클렙시엘라(Klebsiella), 에어로박터(Aerobacter), 락토바실러스(Lactobacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 피키아(Pichia), 클루이베르마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세뉼라(Hansenula), 데바리오마이세스(Debaryomyces), 뮤코(Mucor), 토롤롭시스(Torulopsis), 메틸로박터(Methylobacter), 에스체리아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas) 등이 사용될 수 있으며, 특히 에스체리아 콜라이(Escherichia coli), 에스체리아 블라태(Escherichia blattae), 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 사트로박터(Citrobacter) 속, 에어로박터(Aerobacter) 속이 더욱 바람직하다.

상기 재조합 벡터의 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계는 상기 상술한 3-HP 생산하는 재조합 미생물을 탄소원(carbon source)으로 단당류, 올리고당류, 다당류, 또는 글리세롤로부터 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원의 존재하에 환경에서 수행된다. 세포 배양 및 3-HP의 생산 효율면에서 바람직한 탄소원은 글리세롤 및/또는 글루코스이다. 글루코스를 글리세롤로 전환하지 못하는 미생물의 경우에는 공지의 방법으로 상기 전환에 필요한 외래 유전자를 도입시켜 글루코스로부터 3-HP가 생산되도록 할 수 있다. 상기 배지에는 비타민 B₁₂가 첨가될 수 있다.

본 발명의 3-하이드록시프로피온산 생산방법에서 사용되는 숙주세포를 배양하는 단계는 35 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 본 발명에 사용되는 재조합 미생물의 배양조건은 사용된 숙주세포에 따라 적절히 조절할 수 있는데, 예를 들어 대장균의 경우 호기성(aerobic) 조건하에서 pH 6 ~ 7.6 내지 상기의 온도에서 1 ~ 4 일간 수행될 수 있다. 상기 범위 내에서 배양하는 경우가 세포 성장이 활발하면서 효율적으로 3-HP를 생산할 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 생합성하는 경우 35 내지 37℃에서 배양시에도 세포내에서 우수한 활성을 유지하므로 최적 활성 온도인 33℃를 유지하기 위하여 필요한 별도의 냉각 공정 없이 형질전환체를 배양시킬 수 있어 미생물의 생장 및 3-HP 생산을 동시에 경제적으로 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, (a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제는 (a) 서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물일 수 있다.

또한 상기 재조합 미생물은 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.

또한 상기 재조합 미생물의 글리세롤 데하이드라타제 또는 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp .), 락토바실러스속( Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속( Salmonella sp .)으로 이루어진 군에서 하나 이상 유래된 것일 수 있다.

또한 상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.

상기에 대한 구체적인 설명은 상기의 3-하이드록시프로피온산의 생산방법에서 사용된 재조합 미생물과 동일하다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

[ 실시예 ]

3-HP를 생산하기 위하여 재조합 발현벡터를 도 2과 같이 제조하였다. 먼저 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumonia DSM 2026)의 게놈DNA을 추출하여 하기의 프라이머로 PCR로 증폭한 후 얻어진 dhaB1 , dhaB2 , dhaB3 . gdrA 및 gdrB을 각각 pET-Duet 벡터(Novagen)의 BspHI-EcoRI 및 EcoRI-SalI 위치에 삽입하여 pET-BAB 벡터를 제작하였다.

1) K. pneumonia 유래 dhaB123 - gdrA 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머

정방향 (서열번호 13: 5'-ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT-3' (BspHI))

역방향 (서열번호 14: 5'-AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC-3' (EcoRI))

2) K. pneumonia 유래 gdrB 유전자 증폭을 위해 사용된 프라이머

정방향 (서열번호 15: 5'-TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC-3' (EcoRI))

역방향 (서열번호 16: 5'-TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC-3' (SalI))

PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 5분(dhaB123 - gdrA) 혹은 30초(gdrB)), Cycle Ⅲ (72 ℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae KCCM 12178)로부터 게놈 DNA를 추출하여 하기의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행 하여 유전자 ECL_02229를 증폭하였고 NdeＢⅠ 과 BglⅡ로 절단하여 pET-BAB 벡터에 클로닝하여 pET-BAB-Ec 벡터를 완성하였다(도 2).

정방향 (서열번호 17): 5'-TTTCATATGCATTTTCAGCACCTGAC-3'(NdeI)

역방향 (서열번호 18): 5'-AAAAGATCTTCATGATTGAGACTCCAGGG-3'(BglⅡ)

이때, PCR은 Cycle Ⅰ (95℃, 5분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 95℃, 30초 / 55℃, 30초 / 72℃, 1분 45초), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 수행되었다.

[ 비교예 ]: 재조합 대장균의 제조

상기 실시예와 동일한 방법으로 pET-BAB벡터를 제작하였다.

대장균 K12 MG1655(Escherichia coli)로부터 게놈 DNA를 추출하여 하기의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 aldH 유전자를 증폭하여 NdeI 과 BglⅡ로 절단한 후 상기의 pET-BAB 벡터에 클로닝하여 pET-BAB-H 벡터를 완성하였다.

정방향 (서열번호 19): 5'-TTTCATATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC-3' (NdeI)

역방향 (서열번호 20): 5'-TTTAGATCTTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA-3' (BglⅡ)

PCR은 Cycle I (97℃, 5 min), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 3 min), Cycle Ⅲ(72℃, 10 min)과정으로 수행되었다.

[ 실험예 1]: 감마- 글루타밀 -감마- 아미노부틸알데히드 디하이드로게나제의 효소활성 측정

상기에서 제작한 재조합 벡터 pET-BAB-H(비교예)와 pET-BAB-Ec(실시예)를 대장균 K(DE3)에 도입하여 형질전환하였다.

두 재조합 균주는 생산 배지(40 g/L Glycerol, 1.4 g/L MgSO₄.7H₂O, 34.8 g/L K₂HPO₄, 6 g/L KH₂PO₄, 4 g/L (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/L Citric Acid, 0.014 g/L ZnCl₂, 0.041 g/L FeCl₂.4H₂O, 0.015 g/L MnCl₂, 0.0015 g/L CuCl₂, 0.003 g/L H₃BO₃, 0.0025 g/L Na₂MoO₄, pH 7.6)에 각각 접종하고 33℃ 및 37℃에서 100 mL 플라스크를 이용하여 배양하였다. 접종 후 OD₆₀₀=0.6~0.8일 때 IPTG 0.03mM로 발현을 유도하였다.

발현유도 후 18시간에 세포를 수확하여 원심분리로 분리한 후 PBS buffer (pH 8)로 두 번 세척하고 PBS buffer를 첨가한 후 초음파로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 원심분리 한 후 효소활성을 측정하였다.

효소 활성 측정은 2mM 3-HP 및 4mM NAD⁺ 를 혼합하여 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 디하이드로게나제에 의한 산화시키고, 340 nm에서 생성된 NADH의 양을 측정함으로써 효소활성을 간접적으로 측정하였다. 이때 1 유닛(unit)은 1분 동안 1 mmole의 NAD⁺(혹은 NADP⁺)를 NADH(혹은 NADPH)로 전환시키는 효소의 양으로 정의하였다.

33℃에서 배양한 경우 데하이드로게나제의 활성(specific activity)을 측정 결과, 비교예의 경우에는 19.0 U/mg protein이고 실시예는 18.9 U/mg protein으로, 두 효소 모두 유사한 활성을 나타내었다. 반면 37℃에서 배양하는 경우 비교예의 비활성은 11.67 U/mg protein으로 급격히 감소하였으나, 실시예는 21.43 U/mg protein으로 측정되었다(도 3). 이는 실시예가 비교예에 비하여 활성이 83% 향상된 것이다.

따라서 본 발명의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 디하이드로게나제를 포함하는 재조합 미생물은 배양온도를 35 내지 37℃로 하더라도 세포 내 효소 활성이 높게 유지되며 이를 이용하여 3-HP의 생산을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

[ 실험예 2]: 3- 하이드록시프로피온산(3-HP)의 합성

상기에서 제조한 실시예 및 비교예의 재조합 균주를 생산 배지(40 g/L Glycerol, 1.4 g/L MgSO₄.7H₂O, 34.8 g/L K₂HPO₄, 6 g/L KH₂PO₄, 4 g/L (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/L Citric Acid, 0.014 g/L ZnCl₂, 0.041 g/L FeCl₂.4H₂O, 0.015 g/L MnCl₂, 0.0015 g/L CuCl₂, 0.003 g/L H₃BO₃, 0.0025 g/L Na₂MoO₄, pH 7.6)에 각각 접종하고 33℃ 및 37℃에서 100 mL 플라스크를 이용하여 각각 배양하였다. 접종 후 OD₆₀₀=0.6~0.8일 때 IPTG로 발현을 유도하였고, IPTG 유도 후 18시간, 24시간이 되었을 때 배양액 일부를 추출하여 OD(optical density) 및 3-HP 생산을 확인하였다. IPTG 농도는 0.1, 0.03, 0.01, 및 0.001mM으로 첨가하였다.

실시예 및 비교예에 대하여 HPLC 분석시 Aminex HPX-87H (300mm*7.8mm) 컬럼을 사용하였고, 이동상은 0.5mM 황산용액에 9% 아세토니트릴(Acetionitrile)이 함유된 용액을 사용하여 유속 0.4 ml/min으로 흘려주었고, 컬럼의 온도는 35℃이었다. 검출기는 RI 및 UV/VIS (210nm) 듀얼모드를 사용하여 3-HP는 총 35분의 분석 시간 중 18.3분에 검출되었다.

실시예의 경우, 3-HP 생산을 위한 최적 IPTG 처리 농도는 0.03 mM 이며(도 4), 생산된 3-HP의 농도는 33℃에서 7.8 g/L이고 37℃에서는 7.71 g/L이었다. 반면, 비교예의 경우 3-HP의 생산 농도는 33℃ 및 37℃ 온도에서 각각 8.0g/L, 7.29g/L이었다. 따라서, 33℃에서는 실시예와 비교예의 3-HP 생성량이 유사하였으나, 37℃에서는 비교예의 경우에서 3-HP 생산량의 감소폭이 실시예에 비하여 현저하게 크다는 것을 알 수 있다(도 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Samsung Petrochemical Co., LTD. <120> Producing Method of 3-Hydroxypropionic Acid Using Recombinant Microorganisms and Recombinant Microorganisms used thereby <130> DP120225 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Enterobacter cloacae <400> 1 atgcattttc agcacctgac ttactggcag gataaagcaa aaaacagcgc cattgagacc 60 cggttattta ttaacggtgc ctattgtgac gccgccgata atgccacgtt tgaaaccgtc 120 aatcccgcga cacaacagac gctggcgaac gtggcccggg gcaagcaggc ggacgtggac 180 cgtgcagttc aggcggcgcg tgaggtattt gagcgcggtg actggtcgca ggcgtctccg 240 gcgcagcgca aggccgtgct caataagctt gccgatttaa tggaacgcca cggcgaagag 300 ctggccttac tggaaacact ggacaccggt aaacccatcc gccacagcct gcgcgacgat 360 attcccggcg cggctcgtgc cattcgctgg tacgccgaag cggcggataa agtctacggc 420 gaagtggcgc ctacggggcc gggcgaactg gcgatgatcg tgcgcgagcc gatcggggtg 480 gttgcggcca tcgttccctg gaacttcccg ctgctgctgg cctgctggaa gctgggcccg 540 gcactggtcg cgggcaacag cgtggtattg aaaccgtcgg agaaatcgcc actcaccgcc 600 ctgcggctgg ccgggctggc 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attgccctgg agtctcaatc atga 1494 <210> 2 <211> 497 <212> PRT <213> Enterobacter cloacae <400> 2 Met His Phe Gln His Leu Thr Tyr Trp Gln Asp Lys Ala Lys Asn Ser 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Arg Leu Phe Ile Asn Gly Ala Tyr Cys Asp Ala Ala 20 25 30 Asp Asn Ala Thr Phe Glu Thr Val Asn Pro Ala Thr Gln Gln Thr Leu 35 40 45 Ala Asn Val Ala Arg Gly Lys Gln Ala Asp Val Asp Arg Ala Val Gln 50 55 60 Ala Ala Arg Glu Val Phe Glu Arg Gly Asp Trp Ser Gln Ala Ser Pro 65 70 75 80 Ala Gln Arg Lys Ala Val Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Met Glu Arg 85 90 95 His Gly Glu Glu Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Asp Thr Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Arg His Ser Leu Arg Asp Asp Ile Pro Gly Ala Ala Arg Ala Ile 115 120 125 Arg Trp Tyr Ala Glu Ala Ala Asp Lys Val Tyr Gly Glu Val Ala Pro 130 135 140 Thr Gly Pro Gly Glu Leu Ala Met Ile Val Arg Glu Pro Ile Gly Val 145 150 155 160 Val Ala Ala Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Leu Ala Cys Trp 165 170 175 Lys Leu Gly Pro Ala Leu Val Ala Gly Asn Ser Val Val Leu Lys Pro 180 185 190 Ser 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Val Leu Val Val Thr Arg Phe Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Thr 405 410 415 Leu Ala Asn Asp Ser Glu Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Val Trp Thr Arg 420 425 430 Asp Leu Ser Arg Ala His Arg Met Ser Arg Arg Leu Lys Ala Gly Ser 435 440 445 Val Phe Val Asn Asn Tyr Asn Asp Gly Asp Met Thr Val Pro Phe Gly 450 455 460 Gly Tyr Lys Gln Ser Gly Asn Gly Arg Asp Lys Ser Leu His Ala Leu 465 470 475 480 Glu Lys Phe Thr Glu Leu Lys Thr Ile Trp Ile Ala Leu Glu Ser Gln 485 490 495 Ser <210> 3 <211> 1668 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 3 atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca ggacgggctg 60 attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120 tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gagctggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180 gacatgatcg accgatttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240 atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt cagtcgggag 300 gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360 atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420 aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgctgc tgacgccgcc 480 gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctatgcg 540 ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgccccgg cgttttgacg 600 cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660 gccgagacgg tgtcggtcta cggcaccgaa gcggtattta ccgacggcga tgatactccg 720 tggtcgaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780 tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840 gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca aaacggcgcg 900 gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt gctggcggaa 960 aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020 cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccgacttt 1080 attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140 gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200 ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260 caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt ggaggccgcc 1320 acctacgcgc acggtagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga tctgagtgcg 1380 gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gttgagccgc 1440 agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg ggtcaccggc 1500 gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag tgcggtcaac 1560 gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga acgctgggcg 1620 gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ctgaataa 1668 <210> 4 <211> 555 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 4 Met Lys Arg Ser Lys Arg Phe Ala Val Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn 1 5 10 15 Gln Asp Gly Leu Ile Gly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met 20 25 30 Asp Ser Pro Phe Asp Pro Val Ser Ser Val Lys Val Asp Asn Gly Leu 35 40 45 Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Arg Arg Asp Gln Phe Asp Met Ile Asp 50 55 60 Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Glu Arg Thr Glu Gln Ala 65 70 75 80 Met Arg Leu Glu Ala Val Glu Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile His 85 90 95 Val Ser 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<400> 6 Val Gln Gln Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser Phe Thr Leu Lys Thr Arg 1 5 10 15 Glu Gly Gly Val Ala Ser Ala Asp Glu Arg Ala Asp Glu Val Val Ile 20 25 30 Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys His Gln His His Thr Leu Ile Asp 35 40 45 Met Pro His Gly Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ile Ala Gly Val Glu Glu 50 55 60 Glu Gly Leu His Ala Arg Val Val Arg Ile Leu Arg Thr Ser Asp Val 65 70 75 80 Ser Phe Met Ala Trp Asp Ala Ala Asn Leu Ser Gly Ser Gly Ile Gly 85 90 95 Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Arg Asp Leu 100 105 110 Leu Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Ser Gln Ala Pro Leu Leu Thr 115 120 125 Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Arg 130 135 140 Lys Glu Ser Pro Ser Pro Val Pro Val Val Asn Asp Gln Met Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys 165 170 175 His Val Val Gln Asp Ala Glu Pro Val Thr Leu His Val Asp Leu Val 180 185 190 Arg Glu <210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 7 atgagcgaga 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Arg Ser Ser Gln Ala Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu 100 105 110 His Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Val Arg Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Tyr Gln Gln Arg His Lys Leu Arg Lys Gly Ser 130 135 140 <210> 9 <211> 1824 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 9 atgccgttaa tagccgggat tgatatcggc aacgccacca ccgaggtggc gctggcgtcc 60 gacgacccgc aggcgagggc gtttgttgcc agcgggatcg tcgcgacgac gggcatgaaa 120 gggacgcggg acaatatcgc cgggaccctc gccgcgctgg agcaggccct ggcgaaaaca 180 ccgtggtcgg tgagcgatgt ctctcgcatc tatcttaacg aagccgcgcc ggtgattggc 240 gatgtggcga tggagaccat caccgagacc attatcaccg aatcgaccat gatcggtcat 300 aacccgcaga cgccgggcgg ggtgggcgtt ggcgtgggga cgactatcgc cctcgggcgg 360 ctggcgacgc tgccggcggc gcagtatgcc gaggggtgga tcgtactgat tgacgacgcc 420 gtcgatttcc ttgacgccgt gtggtggctc aatgaggcgc tcgaccgggg gatcaacgtg 480 gtggcggcga tcctcaaaaa ggacgacggc gtgctggtga acaaccgcct gcgtaaaacc 540 ctgccggtgg tagatgaagt gacgctgctg gagcaggtcc ccgagggggt aatggcggcg 600 gtggaagtgg ccgcgccggg ccaggtggtg cggatcctgt cgaatcccta cgggatcgcc 660 accttcttcg ggctaagccc ggaagagacc caggccatcg tccccatcgc ccgcgccctg 720 attggcaacc gttcagcggt ggtgctcaag accccgcagg gggatgtgca gtcgcgggtg 780 atcccggcgg gcaacctcta cattagcggc gaaaagcgcc gcggagaggc cgatgtcgcc 840 gagggcgcgg aagccatcat gcaggcgatg agcgcctgcg ctccggtacg cgacatccgc 900 ggcgaaccgg gcactcacgc cggcggcatg cttgagcggg tgcgcaaggt aatggcgtcc 960 ctgaccgacc atgagatgag cgcgatatac atccaggatc tgctggcggt ggatacgttt 1020 attccgcgca aggtgcaggg cgggatggcc ggcgagtgcg ccatggaaaa tgccgtcggg 1080 atggcggcga tggtgaaagc ggatcgtctg caaatgcagg ttatcgcccg cgaactgagc 1140 gcccgactgc agaccgaggt ggtggtgggc ggcgtggagg ccaacatggc catcgccggg 1200 gcgttaacca ctcccggctg tgcggcgccg ctggcgatcc tcgacctcgg cgccggctcg 1260 acggatgcgg cgatcgtcaa cgcggagggg cagataacgg cggtccatct cgccggggcg 1320 gggaatatgg tcagcctgtt gattaaaacc gagctgggcc tcgaggatct ttcgctggcg 1380 gaagcgataa aaaaataccc gctggccaaa gtggaaagcc tgttcagtat tcgtcacgag 1440 aatggcgcgg tggagttctt tcgggaagcc ctcagcccgg cggtgttcgc caaagtggtg 1500 tacatcaagg agggcgaact ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560 ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620 caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680 tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740 gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca acgcggtcgc caccgggctg 1800 ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824 <210> 10 <211> 607 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 10 Met Pro Leu Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ala Thr Thr Glu Val 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Asp Asp Pro Gln Ala Arg Ala Phe Val Ala Ser Gly 20 25 30 Ile Val Ala Thr Thr Gly Met Lys Gly Thr Arg Asp Asn Ile Ala Gly 35 40 45 Thr Leu Ala Ala Leu Glu Gln Ala Leu Ala Lys Thr Pro Trp Ser Val 50 55 60 Ser Asp Val Ser Arg Ile Tyr Leu Asn Glu Ala Ala Pro Val Ile Gly 65 70 75 80 Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Thr 85 90 95 Met Ile Gly His Asn Pro Gln Thr Pro Gly Gly Val Gly Val Gly Val 100 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525 Lys Val Phe Val Thr Asn Cys Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro 530 535 540 Gly Gly Ser Ile Arg Asp Ile Ala Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser 545 550 555 560 Ser Leu Asp Phe Glu Ile Pro Gln Leu Ile Thr Glu Ala Leu Ser His 565 570 575 Tyr Gly Val Val Ala Gly Gln Gly Asn Ile Arg Gly Thr Glu Gly Pro 580 585 590 Arg Asn Ala Val Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Asn 595 600 605 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 11 atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60 gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120 tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180 cgggtgggta ttgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240 gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcatct gcgtacgctc 300 ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctga 354 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 12 Met Ser Leu Ser Pro Pro Gly Val Arg Leu Phe Tyr Asp Pro Arg Gly 1 5 10 15 His His Ala Gly Ala Ile Asn Glu Leu Cys Trp Gly Leu Glu Glu Gln 20 25 30 Gly Val Pro Cys Gln Thr Ile Thr Tyr Asp Gly Gly Gly Asp Ala Ala 35 40 45 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Arg Val Gly Ile 50 55 60 Gly Leu Ser Ala Ser Gly Glu Ile Ala Leu Thr His Ala Gln Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Ala Pro Leu Ala Thr Gly His Val Thr Asp Ser Asp Asp His 85 90 95 Leu Arg Thr Leu Gly Ala Asn Ala Gly Gln Leu Val Lys Val Leu Pro 100 105 110 Leu Ser Glu Arg Asn 115 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for dhaB123-gdrA amplication, forward <400> 13 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for dhaB123-gdrA amplication, backward <400> 14 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for gdrB amplication, forward <400> 15 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for gdrB amplication, backward <400> 16 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ECL_02229 amplication, forward <400> 17 tttcatatgc attttcagca cctgac 26 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ECL_02229 amplication, backrward <400> 18 aaaagatctt catgattgag actccaggg 29 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aldH amplication, forward <400> 19 tttcatatga attttcatca tctggcttac 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aldH amplication, backward <400> 20 tttagatctt tcggtcattt caggcctcca 30

Claims

(a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과;
(b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (a) 서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제3항에 있어서,
상기 글리세롤 데하이드라타제 또는 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp .), 락토바실러스속( Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속( Salmonella sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 유래된 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 탄소원으로 글리세롤이나 글루코스를 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 미생물을 배양하는 단계는 35 내지 37℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산의 생산방법.
(a) 글리세롤 데하이드라타제(glycerol dehydratase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 (b) 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제(gamma-glutamyl-gamma-aminobutyraldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 글리세롤로부터 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물.
제8항에 있어서,
상기 엔테로박터 클로아세 유래의 감마-글루타밀-감마-아미노부틸알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 (a) 서열번호 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 (a)의 상보적 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물.
제8항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 추가적으로 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물.
제10항에 있어서,
상기 글리세롤 데하이드라타제 또는 글리세롤 데하이드라타제 재활성화 인자는 클렙시엘라속(Klebsiella sp .), 시트로박터속(Citrobacter sp .), 락토바실러스속( Lactobacillus sp .) 클로스트리디움속(Clostridium) 및 살로넬라 속( Salmonella sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상 유래된 것을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물.
제8항에 있어서,
상기 재조합 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 3-하이드록시프로피온산을 생산하는 재조합 미생물.