JP4646411B2 - 変異体プロパンジオールデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、1,3−プロパンジオールに関して変更されたKmを有する変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関する。本発明は、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの変異形態の核酸配列とアミノ酸配列を提供する。本発明は、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。
発明の背景
1,3−プロパンジオールは、ポリエステルファイバーの生産およびポリウレタンおよび環式化合物の製造において有力な利用性を有するモノマーである。1,3−プロパンジオールの生産は1997年11月11日に発行された米国特許第5,686,276号およびWO98/21341に開示された。グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産のための一つの代表的な経路は以下の一連の工程により達成することができる。グルコースが、解糖経路の酵素による一連の工程において、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)と3−ホスホグリセルアルデヒド(3−PG)に変換される。次に、DHAPのジヒドロキシアセトン(DHA)への加水分解に続く還元によるか、またはDHAPのグリセロール3−リン酸(G3P)への還元に続く加水分解の何れかによりグリセロールが形成される。上記加水分解工程は、それらの基質に関して特異的または非特異的であることが知られている幾多の細胞性ホスファターゼにより触媒され得るか、または上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。上記還元工程は、NAD+(またはNADP+)にリンクした宿主酵素により触媒され得るかまたは上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。注目すべきは、dhaレギュロンが、等式3の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.6)を含むことである。
【0002】
グリセロール (反応) 3-HP + H2O (等式1)
3-HP+NADH+H+ (反応) 1,3-プロパンジオール+NAD+ (等式2)
グリセロール+NAD+ (反応) DHA+NADH+H+ (等式3)
グリセロールは中間体3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3−HP)により1,3−プロパンジオールに変換されることは、上で詳細に記載したとおりである。中間体3−HPは、宿主によりコードされ得るかまたは組換えにより宿主へ導入され得るデヒドロゲナーゼ酵素によりグリセロールから生産される(等式1)。このデヒドロゲナーゼは、グリセロールデヒドロゲナーゼ(E.C.4.2.1.30)、ジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.4.2.1.28)、またはこの形質転換を触媒できるあらゆる他の酵素であり得る。グリセロールデヒドロゲナーゼはdhaレギュロンによりコードされる。1,3−プロパンジオールはNAD+(またはNADP+)リンクした宿主酵素により3−HP(等式2)から生産されるかまたは上記活性が組換えにより宿主に導入され得る。1,3−プロパンジオールの生産におけるこの最後の反応は、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.202)または他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
【0003】
Klebsiella pneumoniaeおよびCitrobacter freundiiにおいては、グリセロールデヒドロゲナーゼ(dhaB)、1,3−プロパンジオールオキシドレダクターゼ(dhaT)、グリセロールデヒドロゲナーゼ(dhaD)、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ(dhaK)の機能上リンクした活性をコードする遺伝子は、dhaレギュロンに包含される。CitrobacterとKlebsiella由来のdhaレギュロンはEscherichia coliにおいて発現されて、グリセロールを1,3−プロパンジオールに変換することが示された。
【0004】
当業界において開示された1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの核酸およびアミノ酸の配列は、Klebsiella pneumoniaeのGenBank受託番号U30903(Williar,1994,”Investigation of the Klebsiella pneumoniae 1,3−propanxdiol pathway:Characterization and expression of glycerol dehydratase and 1,3−propanediol oxidoreductase”化学工学学位論文、ウイスコンシン−マジソン大学);Citrobacter freundiiのGenBank受託番号U09771(Daniel,R.et al.,1995,Purification of 1,3−propanediol dehydrogenase from Citrobacte freundii:cloning,sequencing,and overexpression of the corresponding gene in Escherichia coli.J.Bacteriol.177:2151−2156);およびClostridium pasteurianumのGenBank受託番号AF006034(Luers,F.et al.,1997,Glycerol conversion to 1,3−propanediol by Clostridium pasteurianum:cloning and expression of the gene encoding 1,3−propanediol dehydrogenase.FEMS Microbiol.Lett.154:337−345)を含む。
発明の概要
本発明は、野生型E.blattaeには通常毒性のレベルである少なくとも105g/lの1,3−プロパンジオールの存在下で生育できるE.blattaeの誘導体から単離された、変異体形態の1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(PDD)の発見に関する。本発明は、よって、上記変異形態のPDDが、通常は毒性のレベルの1,3−プロパンジオールに対してのE.blattaeの耐性に関連するとの発見に一部基づく。本発明は、この変異対PDDが1,3−プロパンジオールとNADに関して変更されたKmを有するとの発見にも一部基づく。
【0005】
従って、本発明は、1,3−プロパンジオールに関して野生型PDDのKmを超えるように増加する1,3−プロパンジオールのKmを有する変異体PDDを提供する。一つの態様において、変異体PDDのKmは1,3−プロパンジオールに関しての野生型PDDのKの約3倍である。別の態様において、変異体PDDはE.blattaeのATCC受託番号PTA−92から得ることができる。
【0006】
本発明のさらに別の態様において、変異体PDDはE.blattaeのPDDにおける残基His105からLeuに対応する変異を含み、図3に示すとおりである。さらなる態様において、変異体PDDは配列番号2に示すアミノ酸を含み、そして配列番号1に示す配列を有する核酸によりコードされる。
【0007】
本発明は、配列番号1に示す配列を有する単離された核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記宿主細胞はCitrobacter,Enterobacter,Clostridium,Klebsiella,Aerobacillus,Lactobacillus,Aspergillus,Saccharomyces,Schizosaccharomyces,Zygosaccharomyces,Pichia,Kluyveromyces,Candida,Hansenula,Debaryomyces,Mucor,Torulopsis,Methylobacter,Escherichia,Salmonella,Bacillus,StreptomycesおよびPseudomonasを含む。
【0008】
さらなる側面において、本発明は、変異体PDDを含む微生物の使用を含む1,3−プロパンジオールの生産法に関する。
ブダペスト条約下で寄託された微生物の記載
出願人は、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に基づくブダペスト条約の権限の下に、以下の生物の寄託を行った。
【0009】
詳細な説明
用語「1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」または「PDD」(当業界では「オキシドレダクターゼ」としても知られる)は、3−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの1,3−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵素に必須のポリペプチドを意味する。1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、例えば、dhaT遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。本発明は、限定ではないが、E.blattae,K.pneumoniae,C.freundii,C.Pasteurianumを含むあらゆる源からの1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを包含する。
【0010】
本明細書にて使用されるとおり、用語「変異体(mutant)」または「変異(mutation)」は、微生物の核酸中に生じるあらゆる遺伝子の変化を意味し、そして該微生物の表現型の変化を反映してもしなくてもよい。変異は、単一の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく;変異は多数の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく;変異はDNAの大きな領域の変化を含んでもよく、例えば重複または倒置を通してである。変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、天然の1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの一つまたは複数のアミノ酸の置換、失または挿入により前駆体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに由来し得る。遺伝子を修飾するための方法(例えば、部位特異的オリゴヌクレオチド変異導入)は、当業界において記載された。
【0011】
本明細書にて使用される句「対応する(corresponding)」は、実施例3に例示された1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ間のアミノ酸の関連性を意味する。本明細書にて論じられる特定の残基は、図3に示すE.blattaeのGEBのPDDに指定された番号を引用するアミノ酸残基数を意味する。HisからLeuへの変異を図3の残基105に示す。図3は、様々な微生物源からの1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを計算法CLUSTALWを用いて並置することができる。本発明は、図1または2に示されるE.blattaeのPDDの変異、またはATCCに寄託されて受託番号PTA−92を有するE.blattaeに限定されないが、E.blattae中の特定の同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むPDDs全てを包含する。E.blattaeのPDD中の残基の特定の残基または部分に相同(即ち、一次構造または三次構造の何れかの位置に対応する)または類似のいずれかであれば、残基は均等である(即ち、化学的にかまたは構造上、結合するか(combine)、反応するか(react)または相互作用する(interact)、同じかまたは類似の機能上の能力を有する)。
【0012】
一次構造に関する相同性を確立するために、PDDのアミノ酸配列を、E.blattaeのPDD一次構造(図2に示す)、そして特に配列が公知の全てのPDDsに対して不変であることが知られている残基のセット(例えば、図3を参照)と、直接比較する。本発明は、変異形態が1,3−プロパンジオールの活性のKmを変更することができる限り、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの全ての源における均等残基の変化を包含する。好ましい態様において、変異形態のKmは1,3−プロパンジオールに関して増加する。配列番号1の核酸配列はPCR技術により得た。そのような技術は、しばしば、偶然にPCRで生じた配列エラーにより特徴付けられる。よって、本発明は、ATCC受託番号PTA−92を有するE.blattaeの1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼおよび1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの他の微生物の源の中の対応する変異を包含する。
【0013】
用語「Km」は酵素の基質に対する親和性を意味する。高いKmは低い親和性を反映し;低いKmは高い親和性を反映する。
用語「炭素基質」および「炭素源」は、本発明の宿主生物により代謝されることができる炭素源、および特にモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、そして炭素が一つの基質またはそれらの混合物からなるグループから選択される炭素源を意味する。
【0014】
用語「宿主細胞」または「宿主生物」は、外来または外因性の遺伝子を受容でき、且つ活性な遺伝子産物を生成するようにそれらの遺伝子を発現させることができる微生物を意味する。
【0015】
本明細書にて使用されるとおり、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片または部分、およびセンスあるいはアンチセンス鎖を表すかに拘わらず二本鎖または一本鎖であってよいゲノミックまたは合成起原のDNAまたはRNAを意味する。用語「天然」および「野生型」は、それ自身の制御配列と共に自然界において見いだされる遺伝子を意味する。本明細書にて使用されるとおり、「アミノ酸」はペプチドまたは蛋白質の配列またはその部分を意味する。
【0016】
用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写および翻訳を意味する。
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中心的な代謝の一部にない遺伝子をしばしば有する染色体外要素を意味し、そして通常は環状二本鎖DNA分子の形態である。そのような要素は、自律複製要素、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAであってよく、多数のヌクレオチド配列を、プロモーター断片および選択された遺伝子産物に関するDNAを適切な3’非翻訳領域と共に細胞に導入することができる唯一の構築物に、接合させるかまたは組換えた、あらゆる源に由来してよい。「形質転換カセット」は、特定の宿主細胞の形質転換を容易にさせる外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来宿主中でその遺伝子の増強された発現を可能にする外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する特定のベクターを意味する。
【0017】
本明細書にて使用される用語「単離された」または「精製された」は、自然界で付随する少なくとも一つの成分から取り出された核酸またはアミノ酸を意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、1,3−プロパンジオールに関して増加したKmを有することにより特徴付けされる変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(PDD)に関する。
【0018】
I.PDD配列
配列番号1に示すポリヌクレオチド配列は、図3に示すとおり、残基105においてHisからLeuへの変異を有する1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(配列番号2)をコードする。当業者には理解されるとおり、遺伝子コードの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号2をコードし得る。本発明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。本発明は、図3に示すとおり、E.blattaeの残基His 105に対応する変異を含むPDDをコードする核酸を包含する。K.pneumoniae由来のPDDに関する核酸およびアミノ酸配列はGenBank受託番号U30903にて提供され;C.freundii由来のPDDはGenBank受託番号U09771にて提供され;そしてC.pasteurianumに関してはGenBank受託番号AF00034にて提供される。本発明は、ATCC受託番号PTA−92を有するE.blattaeから得ることができる変異PDDも包含する。
【0019】
微生物のゲノムから所望の遺伝子を得るための方法は共通であり、そして分子生物学の当業界においてよく知られている。例えば、上記遺伝子の配列が公知ならば、適切なゲノミックライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ消化により創製してよく、そして所望の遺伝子配列に相補なプローブを用いて選抜してよい。上記配列が単離されたなら、標準のプライマー指向性増幅方法、例えばポリメラーゼ鎖停止反応(PCR)(U.S.4,683,202)を用いて増幅することにより、適切なベクターを用いた形質転換のために適した量のDNAを得てよい。
【0020】
別法として、適切な細菌の宿主の形質転換のためのコスミッドベクターを用いる方法は、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Seconnd Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)にうまくきさいされている。
【0021】
PDD遺伝子内で変異を作成する方法は当業者に知られており、例えば、部位特異的変異導入を含み、手法は1988年7月26日発行の米国特許US4760025に記載されている。
【0022】
ベクターおよび発現カセット
本発明は、変異体PDD並びに1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関連する他の蛋白質を適切な宿主細胞中にクローン化、形質転換および発現させるるのに適した、様々なベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する。適切なベクターは、用いられる細菌に適合性のものであることになる。適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス(例えばバクテリオファージT7またはM13由来のファージ)、コスミッド、酵母または植物に由来し得る。そのようなベクターを得て、そして使用するためのプロトコルは当業界において知られている(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual−volumes1,2,3(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,(1989))。
【0023】
典型的には、上記ベクターまたはカセットは、問題の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を収容する遺伝子の5’領域と、転写停止を制御するDNA断片の3’領域を含む。両制御領域は、形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することがもっとも好ましいが、そのような制御領域は生産宿主として選択された特定の種にとって本来の遺伝子に由来する必要がないことは認識されるはずである。
【0024】
開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細胞におけるPDDの発現を操縦するのに有用であり、多数存在して、当業者により熟知されている。理想的には、これらの遺伝子を操縦することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、限定ではないが、CYC1,HIS3,GAL1,GAL10,ADH1,PGK,PHO5,GAPDH,ADC1,TRP1,URA3,LEU2,ENO,TPI(Saccharomycesにおける発現に有用);AOX1(Pichiaにおける発現に有用);およびlac,trp,IPL,IPR,T7,tacおよびtrc(E.coliにける発現に有用)を含む。
【0025】
停止制御領域は、好ましい宿主にとって本来の様々な遺伝子に由来してもよい。任意には、停止部位は必要なく、しかしながら、もしも含まれていれば最も好ましい。
【0026】
本酵素の効果的な発現のためには、該酵素をコードするDNAを、発現が適切なメッセンジャーRNAの形成をもたらすように、開始コドンを通して作動可能なように、選択された発現制御領域に連結する。
適切な宿主の形質転換およびPDDの発現
適切なカセットが構築されたなら、それらを使用することにより、適切な宿主細胞を形質転換する。1,3−プロパンジオールの生産に必要な他の蛋白質とは別々かまたは一緒に、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含むカセットを宿主細胞に導入することは、公知の手法、例えば形質転換(例えば、カルシウム透過化細胞、エレクトロポレーションを用いて)または組換えファージウイルスを用いるトランスフェクション(Sambrook et al.,前記)により達成してよい。
【0027】
宿主細胞
1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの組換え生産のための適切な宿主細胞は、原核または真核の何れであってもよく、そして活性な酵素を発現する宿主細胞の能力によってのみ制限されることになる。好ましい宿主は、グリセロールまたは1,3−プロパンジオールの生産に有用な典型的な宿主であり、例えば、Citrobacter,Enterobacter,Clostridium,Klebsiella,Aerobacter,Lactobacillus,Aspergillus,Saccharomyces,Schizosaccharomyces,Zygosaccharomyces,Pichia,Kluyveromyces,Candida,Hansenula,Debaryomyces,Mucor,Torulopsis,Methylobacter,Escherichia,Salmonella,Bacillus,StreptomycesおよびPseudomonasである。本発明において最も好ましいのは、E.coli,Klebsiella種およびSaccharomyces種である。
【0028】
培地および炭素源
本発明における発酵培地は適切な炭素源を含まなければならない。適切な基質は、限定ではないが、モノサッカライド、例えばグルコースおよびフルクトース、オリゴサッカライド、例えばラクトースまたはシュークロース、ポリサッカライド、例えば澱粉またはセルロース、またはそれらの混合物、および継続可能な供給原料からの未精製の混合物、例えばチーズの乳清透過物(permeate)、コーンスティープ(cornsteep)リカー、サトウキビ糖蜜、および大麦麦芽を含んでよい。さらに、炭素源は一炭素の基質、例えば二酸化炭素、またはカギとなる生化学中間体への代謝変換が証明されたメタノールであってもよい。
【0029】
好ましい炭素基質はモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、および一炭素基質である。より好ましいのは、糖、例えばグルコース、フルクトース、シュークロースおよび一炭素基質、例えばメタノールおよび二酸化炭素である。もっとも好ましいのはグルコースである。
【0030】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者に知られており、培養物の生育およびグリセロール生産に必要な酵素経路の促進に適した、適切なミネラル、塩、共因子、バッファーおよび他の成分を含まねばならない。Co(II)塩および/またはビタミンB12またはその前駆体には、特定の注意を払う。
【0031】
培養条件:
典型的には、細胞を30℃において適切な培地中で生育させる。本発明において好ましい生育培地は、一般に市販されている調製培地、例えばLuria Bertani(LB)ブロス、Sabouraud Dextrose(SD)ブロスまたは酵母麦芽抽出物(YM)ブロスである。他に定義されたかまたは合成の生育培地も使用してよく、そして特定の微生物の生育のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。直接または間接に異化産物抑制を変調することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン2’:3’−1リン酸または環状アデノシン2’:5’−1リン酸の使用は、上記反応培地に取り込んでもよい。同様に、グリセロール生産の増強を導く酵素活性を変調することが知られている薬剤(例えば、スルファイト、ビスルファイトおよびアルカリ)の使用は、遺伝子操作と共にかあるいは別に使用してよい。
【0032】
発酵のための適切なpH範囲はpH5.0からpH9.0であるが、pH6.0が初期条件の範囲としては好ましい。
本発明を実施する様式および方法は以下の実施例に体する引用により当業者によりさらに完全に理解されるかもしれず、それらの実施例はいかなる様式においても本発明または特許請求の範囲に制限することを意図されない。
実施例
実施例1は配列番号2に示す変異体PDDに付随する動力学上の変化を記載する。
材料と方法
株−野生型ATCC33429、変異体PDDのATCC受託番号PTA−92を含むE.blattae。
生育−細胞は、複合培地中で、30C 500mlにおいて2800ml発酵バッチ中で225rpmにて撹拌しながら20時間生育させた。培地は、KH2PO4,5.4g/L;(NH4)2SO4,1.2g/L;MgSO47H2O,0.4g/L;酵母抽出物、2.0g/L;トリプトン、2.0g/L;およびグリセロール、9.2g/Lを水道水中に含む。
抽出物の調製−嫌気条件を避けるために注意しながら細胞を遠心分離により回収した。沈殿物は、50mM KClおよび1mM DTTを含む100mlのTricine pH8.2に懸濁した。細胞はフレンチ細胞プレッシャーを通して破壊した。粗抽出物を、20K X gで20分間遠心分離してから、100K X gで1時間遠心分離することにより透明にして、高速上清(HSS)画分を生じさせた。
アッセイ−PDDに関するアッセイはJohnson,E.A.et al.,1987,J.Bacteriol.169:2050−2054に記載されたとおりに実施した。
PDDの部分精製−HSSを16 X 100 Poros 20HQカラム上で分離させた。バッファーは、Aは50mM HEPES,pH7.4であり、100uM MnClを含み、そしてBは500mM KClを含むATCCバッファーである。カラムを10ml/分にて負荷および展開した。勾配は10CV洗浄、10CVにて70%Bまで直線勾配、そして100%まで1CVであった。活性は勾配の極めて初期の画分において検出された。1mMまで追加のDTTを添加した後に、33429株のプールされたカラム画分をアッセイのために回収されたとおりに使用した。株GEB031からの活性画分をプールして、PM30上で濃縮して、追加の1mM DTTの添加後に濃縮されたとおりに使用した。
株 GD(U/mg) PDD(U/mg) GD/PDD比
33429 0.64 0.22 2.9
GEB031 0.79 0.08 9.9
PDD動力学−結果を以下に示す。
株 Km(mMプロパンジオール) Km(uM NAD)
33429 28 57
実施例2:E.blattaeからの1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子(dhaT)のクローン化と配列決定
dhaT遺伝子を、PCRにより、E.blattaeのゲノミックDNAから、鋳型DNAとしてK.pneumoniaeのdhaT配列に基づく合成プライマー(プライマー1と2)を用いて5’末端にXbaI部位および3’末端にBamHI部位を取り込んだ。生成物をpCR−Blunt II−TOPO(Invitrogen)中にサブクローン化した。クローン化されたdhaTを次に標準技術により配列決定した。
【0033】
DNA配列決定の結果を配列番号1および配列番号2として与える。
プライマー1
5’TCTGATACGGGATCCTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT3’
プライマー2
5’GCGCCGTCTAGAATTATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTG3’
当業者には容易に理解されるとおり、PCR方法を通して生成された核酸配列は不注意によるエラーを含んでいるかもしれない。本発明は、ATCC受託番号PTA−92を有するE.blattaeから得ることができるPDDをコードする核酸も包含する。
【0034】
特許、特許出願、配列および刊行物を含む、本明細書中の全ての文献は、引用により完全に本明細書に編入される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(PDD)の核酸配列(配列番号1)を提供する。
【図2】 図2は、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(PDD)のアミノ酸配列(配列番号1)を提供する。
【図3】 図3は、様々な微生物のPDDのアミノ酸アラインメントを提供する。Eb GEBTはATCCに寄託されたE.blattae変異体PDDを表し、Eb 429TおよびEb 907Tは野生型E.blattae(ATCC加盟番号33429)を表し;KpnはKlebsiella pneumoniae(GenBank加盟番号U30903)であり;CfuはCitrobacter freundii(GenBank加盟番号U09771)であり、そしてCpastはClostridium pasteurianum(GenBank加盟番号AF006034)である。
Claims (9)
- 対応する野生型1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの1,3−プロパンジオールに関するKmを超える、1,3−プロパンジオールに関しての増加したKmを有する変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、ATCC受託番号PTA−92を有するE.blattaeから得ることができ、E.blattae中の残基His105からLeuに対応する変異を含み、そして配列番号2に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号2に示す配列を有する変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸。
- 配列番号1に示す配列を有する、請求項2記載の単離された核酸。
- 請求項2記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
- 請求項4記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- Citrobacter,Enterobacter,Clostridium,Klebsiella,Aerobacillus,Lactobacillus,Aspergillus,Saccharomyces,Schizosaccharomyces,Zygosaccharomyces,Pichia,Kluyveromyces,Candida,Hansenula,Debaryomyces,Mucor,Torulopsis,Methylobacter,Escherichia,Salmonella,Bacillus,StreptomycesおよびPseudomonasを含む、請求項5記載の宿主細胞。
- 工程:i.対応する野生型1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの1,3−プロパンジオールに関するKmを超える、1,3−プロパンジオールに関しての増加したKmを有する変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む微生物を得る工程であって、該変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、ATCC受託番号PTA−92を有するE.blattaeから得ることができ、E.blattae中の残基His105からLeuに対応する変異を含み、そして配列番号2に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、該微生物は活性のある1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を発現することができる少なくとも一つの遺伝子を含む工程、および
ii.上記微生物を炭素基質に接触させる工程
を含む、微生物において1,3−プロパンジオールを生産する方法。 - 微生物が、Citrobacter,Enterobacter,Clostridium,Klebsiella,Aerobacillus,Lactobacillus,Aspergillus,Saccharomyces,Schizosaccharomyces,Zygosaccharomyces,Pichia,Kluyveromyces,Candida,Hansenula,Debaryomyces,Mucor,Torulopsis,Methylobacter,Escherichia,Salmonella,Bacillus,StreptomycesおよびPseudomonasを含む、請求項7記載の方法。
- ATCC受託番号PTA−92を有する単離された微生物。
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