JP4592418B2 - 高収率での1,3−プロパンジオールの生物生産のための方法 - Google Patents
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Description
グリセロール→3−HPA+H2O(式1)
3−HPA+NADH+H+→1,3プロパンジオール+NAD+(式2)
全体的反応は、補助因子、還元β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の形態である還元当量を消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)に酸化される。
グリセロール+NAD+→DHA+NADH+H+(式3)
DHA+ATP→DHAP+ADP(式4)
1,3−プロパンジオール経路とは対照的に、この経路は炭素およびエネルギーを細胞に提供し、NADHを消費するよりは、むしろ生産するかもしれない。
a)活性PEP−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
b)活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性galP遺伝子、
c)活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性glk遺伝子、および
d)活性グリセロールアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性gapA遺伝子
を含む大腸菌株を提供した。
a1)活性ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ptsH遺伝子、
a2)活性ホスホエノールピルベート−タンパクリン酸基転移酵素の発現を妨げる撹乱された内在性ptsI遺伝子、および
a3)活性グルコース−特異的IIA構成要素の発現を妨げる撹乱された内在性crr遺伝子
の1つまたは複数を含む、上述の大腸菌株も提供した。
e)活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性arcA遺伝子、
f)活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ppc遺伝子、
g)活性cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性btuR遺伝子、および
h)活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたyqhD遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことができる。
i)活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性mgsA遺伝子、
j)活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ackA遺伝子、
k)活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性pta遺伝子、
l)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼAの発現を妨げる撹乱された内在性aldA遺伝子、および
m)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼBの発現を妨げる撹乱された内在性aldB遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことができる。
n)活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性edd遺伝子、
o)活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性glpK遺伝子、および
p)活性NADH−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性gldA遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことができる。
(i)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、
(ii)グリセロール−3−ホスファターゼ、
(iii)デヒドラターゼ、および
(iV)デヒドラターゼ再活性化活性
をさらに含む、ここで述べる大腸菌株を適切な炭素基材と接触させて生物生産できる。
以下の詳細な説明、図1、添付の配列表と説明、および本出願の一部を形成する生物学的寄託から、発明をより詳しく理解できる。
配列番号:1は、loxP511−Cat−loxP511カセットをコードするpLoxCat27の部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号:2〜3は、arcA撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:4〜5は、arcA撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:6は、loxP−Cat−loxPカセットをコードするpLoxCat1の部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号:7〜8は、染色体galPプロモーターのtrcプロモーター置換のためのテンプレートプラスミドである、pR6KgalPを構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:9〜10は、染色体glkプロモーターのtrcプロモーター置換のためのテンプレートプラスミドである、pR6Kglkを構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:11は、loxP−Cat−loxPTrcカセットのヌクレオチド配列である。
配列番号:12〜13は、染色体galPプロモーター置換のための配列番号:11の組み込みを確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:14〜15は、染色体glkプロモーターの置換のための配列番号:11の組み込みを確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:16〜17は、edd撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:18〜19は、eddの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:20は、選択されたtrcプロモーター調節glk発現のためのヌクレオチド配列である。
配列番号:21は、標準trcプロモーターの部分的ヌクレオチド配列である。
配列番号:22〜23は、gapAの増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:24〜25は、gapAからGTGへの開始コドン変更に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:26〜27は、gapAからTTGへの開始コドン変更に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:28は、短1.5GIプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:29〜30は、短1.5GIプロモーターを有する染色体gapAプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:31は、短1.20GIプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:32は、短1.6GIプロモーターのヌクレオチド配列である。
配列番号:33〜34は、短1.20GIプロモーターを有する染色体gapAプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:35は、短1.6GIプロモーターを有する染色体gapAプロモーター置換のために使用される配列番号33を有するオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:36〜37は、mgsA撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:38〜39は、mgsAの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:40〜41は、短1.6GIプロモーターを有する染色体ppcプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:42は、ppcプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:43〜44は、短1.6GIプロモーターを有する染色体yciK−btuRプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:45〜46は、yciK−btuRプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:47〜48は、短1.6GIプロモーターを有する染色体yqhDプロモーター置換のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:49は、yqhDプロモーター置換を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
SEQ ID番号:50〜51は、pta−ackA撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
SEQ ID番号:52〜53は、pta−ackAの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
SEQ ID番号:54〜55は、ptsHIcrr撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:56は、ptsHIcrrの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:57〜58は、aldA撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:59〜60は、aldAの撹乱を確認するのに使用される
オリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:61〜62は、aldB撹乱を構築するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:63〜64は、aldBの撹乱を確認するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号:65は、pSYCO101プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号:66は、pSYCO103プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号:67は、pSYCO106プラスミドのヌクレオチド配列である。
配列番号:68は、pSYCO109プラスミドのヌクレオチド配列である。
発明は、請求の範囲および明細書で使用される以下の用語および定義を参照して、より完全に理解できる。
「NADHデヒドロゲナーゼII」、「NDHII」、および「Ndh」という用語は、ユビキノン−8+NADH+H+からユビキノール−8+NAD+への転換を触媒するタンパクであるII型NADHデヒドロゲナーゼを指す。NADHデヒドロゲナーゼIIの典型は、EC1.6.99.3である。NADHデヒドロゲナーゼIIは、大腸菌ではndhによってコードされる。
「ガラクトース−プロトン同伴輸送体」および「GalP」と言う用語は、周辺質から細胞質への糖およびプロトンの輸送を触媒するタンパクを指す。D−グルコースがGalPのための好ましい基材である。ガラクトース−プロトン同伴輸送体は、大腸菌ではgalPによってコードされる。
「短1.20GIプロモーター」と言う用語は、配列番号:31を指す。「短1.5GIプロモーター」と言う用語は、配列番号:28を指す。「短1.6GIプロモーター」および「短野生型プロモーター」と言う用語は、同義的に使用され配列番号:32を指す。
1.小型脂肪族,非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)、
2.極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln、
3.極性、正に帯電した残基:His、Arg、Lys、
4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys)、および
5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、Trp。
炭素基材の1,3プロパンジオールへの転換のために酵素経路をコードするのに必要な遺伝子を含有する組換え型生物は、技術分野で周知の技術を使用して構築されても良い。グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD1)、グリセロール−3−ホスファターゼ(GPP2)、グリセロールデヒドラターゼ(dhaB1、dhaB2、およびdhaB3)、デヒドラターゼ再活性化因子(orfZおよびorfX)および1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(dhaT)をコードする遺伝子は、クレブシエラ(Klebsiella)またはサッカロミセス(Saccharomyces)などの生来の宿主から単離され、大腸菌DH5α、ECL707、AA200、またはKLP23などの宿主菌株を形質転換するために使用された。
細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学技術分野で一般的かつ周知である。例えば遺伝子配列が既知である場合、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なゲノムライブラリーを作り出しても良く、所望の遺伝子配列に相補的なプローブでスクリーンしても良い。配列が単離されると、適切なベクターを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの標準プライマーに特異的な増幅方法(米国特許公報(特許文献14))を使用してDNAを増幅し、形質転換に適したDNAの総量を得ても良い。
本発明のコンテクストで、コスミドベクターおよびコスミド形質転換法を使用して、グリセロールを1,3−プロパンジオールにプロセスできる遺伝子をプロセスすることが知られている細菌属から、ゲノムDNAの大型セグメントをクローン化した。具体的には技術分野で周知の方法によってK.ニューモニエ(pneumoniae)からゲノムDNAを単離し、コスミドベクターSupercos 1への挿入のために制限酵素Sau3Aで消化して、GigapackIIパッケージング抽出物を使用してパッケージした。ベクターの構築に続いて、大腸菌XL1−Blue MR細胞をコスミドDNAで形質転換した。グリセロール存在下で細胞を培養し、培養液を1,3−プロパンジオール形成について分析して、グリセロールを1,3−プロパンジオールに転換する能力について形質転換体をスクリーンした。
本発明は、宿主細胞内でのG3PDHおよびG3Pホスファターゼ活性の発現に適した遺伝子を提供する。
。
1,3−プロパンジオールの組換え型による生産のための適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物のどちらであっても良く、1,3−プロパンジオール経路のために活性酵素を発現する宿主細胞能力によってのみ制限される。適切な宿主細胞は、シトロバクター(Citrobacter)、エンテロバクター(Enterobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、クレブシエラ(Klebsiella)、アエロバクター(Aerobacter)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)、サッカロミセス(Saccharomyces)、分裂酵母(Schizosaccharomyces)、チゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)、ピチア(Pichia)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ケカビ(Mucor)、トルロプシス(Torulopsis)、メチロバクター(Methylobacter)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、およびシュードモナス(Pseudomonas)などの微生物である。本発明で好ましいのは、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ(Escherichia blattae)、クレブシエラ(Klebsiella)、シトロバクター(Citrobacter)、およびアエロバクター(Aerobacter)である。最も好ましいのは大腸菌(KLP23(特許文献15)、RJ8.n(ATCC PTA−4216),大腸菌:FMP’::Km(ATCC PTA4732)、MG1655(ATCC 700926))である。
本発明は、適切な宿主細胞へのG3PDH、G3Pホスファターゼ、デヒドラターゼ、およびデヒドラターゼ再活性化因子のクローン化、形質転換、および発現に適した多様なベクター、および形質転換および発現カセットを提供する。適切なベクターは、用いられる微生物と適合性のものである。適切なベクターは、例えばバクテリア、ウイルス(バクテリオファージT7またはM−13由来ファージなど)、コスミド、酵母または植物から誘導できる。このようなベクターを得て使用するプロトコルは技術分野で既知である(非特許文献30)。
pSYCO101(配列番号:65):
p−trc(Dar1_GPP2)その他の2つの経路オペロンと比較して反対向き、
p−1.6longGI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6longGI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO103(配列番号:66):
p−trc(Dar1_GPP2)その他の2つの経路オペロンと比較して同じ向き、
p−1.5longGI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.5longGI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO106(配列番号:67):
p−trc(Dar1_GPP2)その他の2つの経路オペロンと比較して同じ向き、
p−1.6longGI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6longGI(orfY_orfX_orfW)。
pSYCO109(配列番号:68):
p−trc(Dar1_GPP2)その他の2つの経路オペロンと比較して同じ向き、
p−1.6longGI(dhaB1_dhaB2_dhaB3_dhaX)、および
p−1.6longGI(orfY_orfX)。
ひとたび適切なカセットが構築されると、それらは適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。G3PDH、G3Pホスファターゼ、デヒドラターゼ、およびデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞内への導入は、形質転換(例えばカルシウム透過化処理細胞、電気穿孔法を使用した)によって、あるいは組換え型ファージウイルスを使用した形質移入などの既知の手順によって達成されても良い(非特許文献30)。
例証される細胞に加えて、本方法が、特に1,3プロパンジオールの生産を亢進するようにデザインされた単一または複数の変異を有する細胞を使用できることが考察された。炭素供給原料を非生成経路に通常迂回させる、あるいは顕著な異化代謝産物抑制を示す細胞は、これらの表現型の欠陥を防ぐように変異できる。例えば多くの野生型細胞は、培養液中のグルコースおよび副産物からの異化代謝産物抑制を受け、グルコース抑制に抵抗性の1,3−プロパンジオール生産をできるこれらの野生型生物の変異株菌株が、本発明において特に有用であることが考察された。
酵素経路に関与する特異的遺伝子をアップレギュレートして、それらがコードする機能の活性を増大させても良い。例えば選択された遺伝子の追加的コピーを宿主細胞内にpBR322などの多コピープラスミド上に導入しても良い。このような遺伝子はまた、適切な制御配列を持つ染色体中に統合されて、それらのコードされる機能の活性増大をもたらしても良い。ターゲット遺伝子は、非天然プロモーターまたは変性天然プロモーターの調節の下にあるように修飾されても良い。内在性プロモーターは、変異、欠失、および/または置換によって、生体内(in vivo)で変性できる。
代案としては特定遺伝子の発現を所定の活性レベルに対して減少させる、または排除することが有用かもしれない。本発明の目的では、減少と排除を区別することが有用である。遺伝子の「ダウンレギュレート」および「ダウンレギュレートする」と言う用語は、減少を指すが、コードされるタンパクの活性の完全排除ではない。遺伝子をダウンレギュレートするおよび撹乱する方法は、当業者に既知である。
遺伝子の撹乱は、例えば1)コード領域および/または制御(プロモーター)領域を欠失させる、2)外来性核酸配列をコード領域および/制御(プロモーター)領域に挿入する、および3)(例えばDNA塩基対変化を作り出すことによって)コード領域および/または制御(プロモーター)領域を変化させることで生じるかもしれない。このような変化は、関心のあるタンパクの発現を妨げ、あるいは非機能的タンパクの発現をもたらす。特定の撹乱は、無作為変異とそれに続くスクリーニングまたは選択によって、あるいは遺伝子配列が既知である場合、特定の撹乱は、当業者に既知の分子生物学的方法による直接介入によって得ても良い。特に有用な方法は、顕著な量のコード領域および/または制御(プロモーター)領域の欠失である。
(代表的酵素経路)
グルコースからの1,3−プロパンジオールの生産は、以下の一連のステップによって達成できる。この一連のステップは、当業者に既知のいくつかの経路の代表的なものである。グルコースは解糖経路の酵素によって、一連のステップでジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)および3−ホスホグリセルアルデヒド(3−PG)に転換される。次にグリセロールは、DHAPのジヒドロキシアセトン(DHA)への加水分解とそれに続く還元、あるいはDHAPのグリセロール3−リン酸(G3P)への還元とそれに続く加水分解のいずれかによって形成される。加水分解ステップは、それらの基材について非特異的であることが分かっているいくつかの細胞ホスファターゼのいずれかによって触媒でき、あるいは活性は、組み換えによって宿主に導入できる。還元ステップはNAD+(またはNADP+)結合宿主酵素によって触媒でき、あるいは活性は、宿主に組み換えによって導入できる。dhaレギュロンが、式3の可逆性反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.6)を含有することは、注目に値する。
グリセロール→3−HPA+H2O(式1)
3−HPA+NADH+H+→1,3プロパンジオール+NAD+(式2)
グリセロール+NAD+→DHA+NADH+H+(式3)
グリセロールは、上で詳述したように中間体3−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド(3−HPA)を経由して1,3−プロパンジオールに転換される。中間体3−HPAは、宿主によってコードできる、または組み換えによって宿主に導入できるデヒドラターゼ酵素によってグリセロールから生産される(式1)。このデヒドラターゼは、グリセロールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.30)、ジオールデヒドラターゼ(E.C.4.2.1.28)、あるいはこの形質転換を触媒できるあらゆるその他の酵素であることができる。ジオールデヒドラターゼを除くグリセロールデヒドラターゼは、dhaレギュロンによってコードされる。1,3−プロパンジオールは、NAD+−(またはNADP+)結合宿主酵素によって3−HPAから生産され(式2)、あるいは活性は組み換えによって宿主内に導入できる。1,3−プロパンジオール生産におけるこの最後の反応は、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.202)またはその他のアルコールデヒドロゲナーゼによって触媒できる。
1,3−プロパンジオール生産経路の変動を含む多様な変異微生物は、本発明において有用であろう。1,3−プロパンジオール生産経路の中間体の代案の経路を遮断する変異もまた、本発明に有用であろう。例えばグリセロールキナーゼの除外は、G3Pホスファターゼの作用によってG3Pから形成されるグリセロールが、ATPを消費してG3Pに再転換されるのを防止する。またグリセロールデヒドロゲナーゼ(例えばgldA)の除外は、NADH−依存性グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によってDHAPから形成されるグリセロールが、ジヒドロキシアセトンに転換されるのを防止する。変異は、酵素活性を障害するまたは改善するように構造遺伝子に向けることができ、あるいは酵素活性の発現レベルを調節するように、プロモーター領域およびリボゾーム結合部位をはじめとする制御遺伝子に向けることができる。
本発明の発酵培養液は、適切な炭素基材を含有しなくてはならない。適切な基材としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、そしてラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖が挙げられるが、これに限定されるものではない。
典型的に細胞は、35℃において適切な培養液中で培養された。本発明の好ましい生育培養液は、ルリア・ベルターニ(Luria Bertani)(LB)ブロス、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextrose)(SD)ブロス、またはイースト培地(Yeast medium)(YM)ブロスなどの一般的な商業的に調製された培養液である。その他の特定または合成培養液を使用しても良く、特定微生物の生育に適した培養液は、微生物または発酵科学の当業者には既知である。異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている、例えば環状アデノシン2’:3’−モノホスフェートなどの作用薬の使用を反応培養液中に組み込んでも良い。同様に1,3−プロパンジオール生産の亢進をもたらす酵素活性(例えばメチルビオロゲン)を調節することが知られている作用薬を遺伝子操作と併せて、あるいはそれに対する代案として使用しても良い。
本方法は、バッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の最初に設定され、発酵中の人為的変化を受けない。したがって発酵開始時に培養液に所望の微生物または微生物を接種し、発酵を起こさせてシステムには何も添加しない。しかし典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、pHおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、発酵が停止する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。対数期にある細胞が、概して最終生成物または中間体の生産の大部分を担う。
発酵培養液からの1,3−プロパンジオールの精製方法は、技術分野で既知である。例えば反応混合物を有機溶剤、蒸留、およびカラムクロマトグラフィ(米国特許公報(特許文献16))によって抽出することで、細胞培養液からプロパンジオールを得られる。この方法に特に良好な有機溶剤は、シクロヘキサン(米国特許公報(特許文献17))である。
リン酸化、ライゲーション、および形質転換の手順は、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、(非特許文献30)にある。
KLP23 (特許文献15)、
RJ8.n (ATCC PTA−4216)、
MG1655 ATCC 700926(市販される)
pAH48 (特許文献18)
pDT29 (特許文献15)
pKP32 (特許文献15)
pSYCO101 配列番号:65
pSYCO103 配列番号:66
pSYCO106 配列番号:67
pSYCO109 配列番号:68
DNAを染色体の特定領域に統合するためには、挿入するDNAの目的染色体部位に対する相同性および選択マーカーが必要である。組み込み後にマーカーが容易に除去できれば有利である。P1ファージからのloxP/Creリコンビナーゼシステム、および酵母からのFRT/Flpリコンビナーゼシステムが、マーカーを除去する機序を提供する。loxPおよびFRT部位は、CreおよびFlpリコンビナーゼのための認識部位である。CreおよびFlpは部位特異的リコンビナーゼであり、直接的反復認識部位から介在性DNAを切除する。
(グルコキナーゼ(Glk)活性のアッセイ)
グルコースからグルコース−6−ホスフェートへの転換に続いて、グルコキナーゼ反応をグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.49)の反応に共役して、グルコキナーゼ(Glk)活性を340nmにおける分光測定でアッセイした。アッセイは0.5mMのNADP、5mMのATP、5mMのMgCl、および100mMのリン酸緩衝液(pH7.2)中2単位のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。代案のアッセイは、(非特許文献45)にある。
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性のアッセイは、NADHの出現によって、細胞フリー抽出物中で測定した。アッセイに先だってイオン交換カラムを使用して、遠心分離した(50,000×g、1h、4℃)細胞フリーの上清を部分的に精製した。アッセイは0.2mMのグリセルアルデヒド3−リン酸、2.5mMのNAD+、2mMのEDTA、5mMのシステアミン、20mMのリン酸カリウム、および40mMのトリエタノールアミン(pH8.9)を含有した。代案のアッセイは、(非特許文献45)にある。
共役アッセイ(非特許文献46)によって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(Ppc)活性を細胞フリー抽出物中で測定した。この方法は、遠心分離した(50,000×g、1h、4℃)細胞フリー抽出物サンプルを0.22mMのNADH、1.1mMのホスホエノールピルベート(PEP)、0.25mMのアセチル−CoA、および0.1Mのトリス/HCl緩衝液(pH8.5)中の6Uのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH)を含有するキュベット内で、11mMの重炭酸水素ナトリウムおよび11mMの硫酸マグネシウムと共に、総容積1.0mLで室温において培養することを伴う。酵素およびNADHの背景反応速度をPEPの不在下で340nmで最初に判定した。第2の基材であるPEPを引き続いて添加し、経時的な吸光度の変化をさらにモニターした。全体速度から背景速度を差し引いて、Ppc活性を特定した。代案のアッセイは、(非特許文献45)にある。
グリセロールまたは1,2−プロパンジオールのいずれかを基材として使用して、細胞フリー抽出物中のデヒドラターゼ活性を判定した。典型的には、フレンチプレスとそれに続く細胞細片の遠心分離を使用した細胞撹乱によって、細胞フリー抽出物を調製した。アルデヒドのメチルベンゾ−2−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくアッセイは、(非特許文献47)で述べられている。
(非特許文献11)で述べられたように1,3−プロパンジオールおよびNAD+を基材として使用して、1,3−プロパンジオールデヒドロゲナーゼと称されることもある、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素の活性を溶液中で、あるいはスラブゲル中で、細胞フリー抽出物について判定した。代案としては、NADHの消失によって、3−HPAおよびNADHの1,3−プロパンジオールおよびNAD+への転換を判定した。スラブゲルアッセイは、サイズ分離に基づいて、1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(dhaT)の活性を非特異的アルコールデヒドロゲナーゼの活性から区別する潜在的利点を有する。シトロバクター・フレンディ(Citrobacter freundii)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、およびクロストリジウム・パストゥリアヌム(Clostridium pasteurianum)からの1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(dhaT)の天然分子量は、通常大きく、330,000〜440,000ダルトン程度である。ブレビス乳酸菌(Lactobacillus brevis)およびブッフネリ乳酸菌(Lactobacillus buchneri)は、既知の1,3−プロパンジオール酸化還元酵素(dhaT)と同様の特性を有する、デヒドラターゼ連携1,3−プロパンジオール酸化還元酵素を含有する。
(非特許文献49)で発表された方法からの手順を下のように修正して使用した。この方法は、細胞フリー抽出物サンプルを0.2mMのNADH、2.0mMのジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)、および0.1Mmのトリス/HCl(pH7.5)緩衝液中の酵素を含有するキュベット内で、5mMDTTと共に、1.0mLの総量で30℃において培養することを伴う。酵素およびNADHの背景反応速度を340nmで最初に少なくとも3分間判定した。第2の基材であるDHAPを引き続いて添加し、経時的な吸光度の変化を少なくとも3分間さらにモニターした。全体速度から背景速度を差し引いて、G3PDH活性を特定した。
抽出物をビス−トリスまたはMESおよびマグネシウム緩衝液(pH6.5)中で、有機リン酸基材と共に培養して、酵素活性のアッセイを実施した。使用した基材は、l−α−グリセロールホスフェート、またはd,l−α−グリセロールホスフェートのどちらかであった。アッセイ中の試薬の最終濃度は、緩衝液(20mMのビス−トリスまたは50mMのMES)、MgCl2(10mM)、および基材(20mM)である。サンプル中の総タンパクが低く、酸クエンチで可視的沈殿が生じない場合、サンプルをキュベット内で都合良くアッセイした。この方法は、20mMの基材(50μL、200mM)、50mMのMES、10mMのMgCl2(pH6.5)緩衝液を含有するキュベット内で、酵素サンプルを培養することを伴う。最終ホスファターゼアッセイ容積は、0.5mLであった。酵素含有サンプルを反応混合物に添加し、キュベットの内容を混合し、次にキュベットを温度37℃の循環水浴に5〜120分間入れたが、時間の長さは、酵素サンプル中のホスファターゼ活性が2〜0.02U/mLの範囲にあるかどうかに左右された。酸モリブデン試薬(0.4mL)を添加して、酵素反応をクエンチした。フィスク・スバロウ試薬(0.1mL)および蒸留水(1.5mL)を添加した後、溶液を混合して発色させた。10分間完全に発色させた後、Cary 219 UV/vis分光光度計を使用して、サンプルの吸光度を660nmで読み取った。原液無機ホスフェート溶液(0.65mM)を使用して、最終無機ホスフェート濃度が0.026〜0.130μモル/mLの範囲にある6つの標準を作成して調製された標準曲線と、放出された無機ホスフェートの量とを比較した。
典型的に細胞フリー粗抽出物である適量の酵素を40mMのATP、20mMのMgSO4、21mMの均一13C標識グリセロール(99%、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories))および0.1Mのトリス−HCl(pH9)を含有する反応混合物に25℃で75分間かけて添加した。グリセロールからグリセロール3−リン酸への転換は、次によって検知された。13C−NMR(125MHz):グリセロール(63.11ppm、δ、J=41Hzおよび72.66ppm、t、J=41Hz);グリセロール3−リン酸(62.93ppm、δ、J=41Hz;65.31ppm、brd、J=43Hz;および72.66ppm、dt、J=6,41Hz)。
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク分離後に、大腸菌菌株からの細胞フリー抽出物中のNADH−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ活性(gldA)を判定した。フェナジンメトスルフェート(PMS)を媒介物として使用して、グリセロールおよびNAD+から、ジヒドロキシアセトンおよびNADHへの転換を3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)から濃色のホルマザンへの転換に共役させた(非特許文献50)。
(発酵生成物のHPLC分析)
グルコースから1,3−プロパンジオールへの転換をHPLCによってモニターした。標準クロマトグラフィーを使用して、分析を実施した。適切な一方法は、RI検出を使用したウォーターズ・アライエンス(Waters Alliance)HPLCシステムを用いる。カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラド(Biorad(Hercules、CA))からのカチオンH詰め替えカートリッジプレカラム(4.6mm×30mm)を装着し、50℃に温度調節され、流速0.4mL/minで5mMのH2SO4を移動相として使用した、カリフォルニア州ハーキュリーズのバイオラド(Biorad(Hercules、CA))からのアミネクス(Aminex)HPX87Hカラム(7.8mm×300mm)にサンプルを注入した。システムを毎週、既知濃度の標準に対して較正した。典型的にはグルコース、グリセロール、1,3-プロパンジオール、および酢酸の滞留時間は、それぞれ12.7分、19.0分、25.2分、および21.5分であった。
GC/MSによって1,3−プロパンジオールの生産を確認した。GC/MSの当業者が利用できる標準技術および材料を使用して、分析を実施した。適切な一方法は、ヒューレットパッカード(Hewlett Packard)5971シリーズ質量選択検出器(EI)およびHP−INNOWaxカラム(長さ30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm)に連結された、ヒューレットパッカード(Hewlett Packard)5890シリーズIIガスクロマトグラフを使用した。生成した1,3−プロパンジオールの滞留時間および質量スペクトルを基準1,3−プロパンジオール(m/e:57,58)と比較した。
TM2培養液(TM2)は基本の処方であり、それに炭素源(典型的に20g/Lまたは40g/Lのグルコース)、適切な抗生物質、およびその他の構成要素が添加される。TM2培養液は以下の構成要素を含有する。K2HPO4(13.6g/L)、KH2PO4(13.6g/L)、MgSO4・7H2O(2g/L)、クエン酸一水和物(2g/L)、クエン酸アンモニウム第二鉄(0.3g/L)、(NH4)2SO4(3.2g/L)、酵母抽出物(5g/L)、微量元素溶液(1ml)。pHを6.8に調節する。微量元素の溶液は、クエン酸H2O(4.0g/L)、MnSO4・H2O(3.0g/L)、NaCl(1.0g/L)、FeSO4・7H2O(0.10g/L)、CoCl2・6H2O(0.10g/L)、ZnSO4・7H2O(0.10g/L)、CuSO4・5H2O(0.010g/L)、H3BO3(0.010g/L)、およびNa2MoO4・2H2O(0.010g/L)を含有する。
既述したあらゆる菌株(KLP23、RJ8.n、MB 1655)のフラスコ振盪培養は、実施例で詳細に述べるような適切な抗生物質を含有する2YT培養液またはLBのどちらかで培養して、発酵槽に接種するための前培養を作り出した。培養は、凍結保護物質として15%グリセロールと共に調製した凍結シード・バイアル、あるいは50mg/Lのスペクチノマイシン添加した新鮮なLAプレート上に生育した単一コロニーのどちらかから開始した。凍結バイアルから開始される培養は、2Lフラスコ内の500mLの特定培養液で培養し、単一コロニーを使用して前培養を開始した場合、それを250mLバッフル付きフラスコ内の30mLの特定培養液中に入れた。培養を34℃および300rpmの振盪で、OD550がほぼ1.0 AUになるまで培養して使用し、発酵槽に接種した。場合によってはシード発酵槽を使用して、生産発酵槽に接種するためにより大量の前培養を提供した。シード発酵槽は、ビタミンB12がシードタンクに添加されないこと以外は、生産発酵槽と概して同一である。シード発酵槽を使用する手順の詳細は、該当実施例で述べられている。
(1,3−プロパンジオール生産のためのNADHデヒドロゲナーゼIIマイナス(Δndh)大腸菌株構築)
(KLndh81の構築)
コード領域にloxP511カセットを割り込ませて、ndh変異を得た。上流および下流側面領域を持つndh遺伝子(GenBank目録番号U00096参照)は、大腸菌MG1655からPCR増幅してクローン化した。ndhカセットをStuIで消化し遺伝子のほぼ中央で切断して、ndh遺伝子に対して反対向きのcat遺伝子で、loxP511−Cat−loxP511カセットをこの部位内にクローン化した。Spe IおよびEcoR Vによる消化と、それに続くブラントエンドを生成するためのフィルイン、および1.1kb断片のゲル精製により、プラスミドpLoxCat27[配列番号:1]からloxP511−Cat−loxP511カセットを得た。loxP511部位は、loxP部位の変異体である(非特許文献43)。ndh::CatカセットをPCR増幅し、KLP23適格細胞内に電気穿孔して、菌株KLndh81::Cmを作り出した。Creリコンビナーゼによってクロラムフェニコールマーカーを除去し(非特許文献43)、1個のloxP511部位を含有する96bpの中断配列が残された。この菌株をKLndh81と命名した。代案としてはコード領域をloxP部位のないCatカセットで中断してndh変異を得て、菌株KLNDH413を得た。
Klndh81::Cmからのndh側面配列およびloxP511−Cat−loxP511を含有するカセットをPCR増幅し、pUni/V5−HisTOPO[インビトロジェン(Invitrogen)]内にクローン化して、pAH111を作り出した。pAH111からのndh−loxP511−Cat−loxP511カセットを菌株RJ8/pKD46内に統合した。組換え菌株をクロラムフェニコール耐性について選択した。カセットのndhへの組み込み成功は、PCRで確認した。Creリコンビナーゼ(非特許文献43)を使用して、クロラムフェニコールマーカーを除去し、菌株RJ8.nを作り出した。
(大腸菌株KLP23/pAH48/pDT29およびKLP23/pAH48/pKP32による1,3−プロパンジオールおよびグリセロール生産の比較)
プラスミドpAH48およびpDT29またはpKP32で、菌株KLP23を形質転換した。一般方法で述べたようにして、1,3−プロパンジオール(およびグリセロール)の生産を14L発酵槽内で判定した。解凍した凍結バイアルを200mg/Lのカルベニシリンおよび50mg/Lのスペクチノマイシン添加500mLの2YT中で培養し、それを使用して各発酵の前培養を調製した。フラスコの全内容物を使用して、発酵槽を接種した。発酵槽を35℃およびd6設定値10%で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。各発酵のビタミンB12ストラテジーは、下で詳述する。
本実施例では、接種3時間後に開始して、16mL/時間の速度でビタミンB12(0.075g/L、500mL)を供給した。大腸菌菌株KLP23/pAH48/pDT29を使用した、グルコースから1,3−プロパンジオール(1,3PD)への転換の代表的な発酵の概要を表2.1に示す。1,3−プロパンジオールの収率は、24重量%(1,3プロパンジオールのグラム数/グルコース消費グラム数)であり、力価68g/Lの1,3−プロパンジオールが得られた。
大腸菌菌株KLP23/pAH48/pKP32を使用した、グルコースから1,3−プロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概要を表2.2に示す。接種3時間後に開始して、16mL/時間の速度でビタミンB12(0.150g/L、500mL)を供給した。グルコース供給の連続した添加を可能にするために、36時間後にほぼ2Lの発酵ブロスをパージした。1,3−プロパンジオールの収率は、26重量%(1,3−プロパンジオールのグラム数/グルコース消費グラム数)であり、力価112g/Lの1,3−プロパンジオールが得られた。
(大腸菌株RJ8/pAH48/pDT29およびRJ8/pAH48/pKP32による1,3−プロパンジオールおよびグリセロール生産の比較)
解凍した凍結バイアルを200mg/Lのカルベニシリンおよび50mg/Lのスペクチノマイシン添加500mLの2YT中で培養し、それを使用してRJ8/pAH48pDT29およびRJ8/pAH48/pKP32の前培養を調製した。フラスコの全内容物を使用して、発酵槽を接種した。発酵槽を35℃およびd6設定値10%で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。dhaT欠失があったこと以外は、RJ8/pAH48/pKP32はRJ8/pAH48/pDT29と同一であった。各発酵のビタミンB12ストラテジーは下で詳述する。
大腸菌菌株RJ8/pAH48/pDT29を使用した、グルコースから1,3−プロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概要を表2A.1に示す。ビタミンB12を2、16、および16mgの大量瞬時添加で、それぞれ2、8、および26時間目に提供した。1,3−プロパンジオールの収率は35重量%(1,3−プロパンジオールのグラム数/グルコース消費グラム数)であり、力価50.1g/Lの1,3−プロパンジオールが得られた。
大腸菌菌株RJ8/pAH48/pKP32を使用した、グルコースから1,3−プロパンジオール(1,3−PD)への転換の代表的な発酵の概要を表2A.2に示す。ビタミンB12を48および16mgの大量瞬時添加で、それぞれ26および44時間目に提供した。1,3−プロパンジオールの収率は34重量%(1,3−プロパンジオールのグラム数/グルコース消費グラム数)であり、力価129g/Lの1,3−プロパンジオールが得られた。
プラスミドpAH48およびpKP32で、菌株RJ8.nを形質転換した。一般方法で述べたようにして、1,3−プロパンジオール(およびグリセロール)の生産を14L発酵槽内で判定した。解凍したRJ8.n/pAH48/pKP32の凍結バイアルを200mg/Lのカルベニシリンおよび50mg/Lのスペクチノマイシン添加500mLのLBに移して、前培養を調製した。培養をシード発酵槽に移し、1Lの培養を生産発酵槽に移す前に16時間培養した。その時点で、OD550は50 AU超に達し、30g/Lのグリセロールがブロス中に蓄積した。シードおよび生産発酵槽のどちらも35℃およびd6設定値10%で操作した。その他の全調節パラメータは一般方法で述べたとおりである。
(arcAグローバル制御因子に欠失がある大腸菌株の構築およびフラスコ振盪成績)
0.6kbコード領域をpKD3のFRT−CmR−FRTカセットで置換することで、arcA欠失[GenBank目録番号U00096参照]を作り出した。pKD3をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:2および配列番号:3で、置換カセットを増幅した。プライマー配列番号:2は、arcAの5’末端に対して41bpの相同性、pKD3に対して20bpの相同性を含む。プライマー配列番号:3は、arcAの3’末端に対して42bpの相同性、pKD3に対して20bpの相同性を含む。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株をLBプレート上で12.5mg/Lのクロラムフェニコールにより選択した。プライマーペア配列番号:4および配列番号:5を使用して、arcA遺伝子の欠失をPCRで確認した。野生型菌株は0.7kbのPCR生成物を与え、一方、組換え菌株は特徴的な1.1kbのPCR生成物を与える。菌株をMG1655 ΔarcA::Cmと命名した。P1溶菌液を調製し使用して、変異を菌株KLndh81内に移し、KLndh81 ΔarcA::Cmを形成した。
(ガラクトース−プロトン同伴輸送体(galP)およびグルコキナーゼ(glk)の発現レベルを調節するTRCプロモーターを有するリン酸転移酵素システムマイナス(PTS−)大腸菌株の構築)
(loxP−CAT−loxP−Trcカセット(pTrCm42)の構築)
HindIIIおよびNcoIで消化したプラスミドpTrc99a(ファーマシア(Pharmacia))から直鎖DNAを得て、T4 DNAポリメラーゼで充填し、環状化して、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン(Invitrogen(Carlsbad、CA))からの大腸菌TOP−10に形質転換した。50mg/Lのカルベニシリンを含有するルリア寒天プレート上での選択に続いて、結果として生じるプラスミド(pTrc1)を精製し、制限酵素分析にかけてして元来HindIIIとNcoIの間に存在していたDNA領域が不在であることを確認した。
プライマーペア配列番号:7および配列番号:8を使用して、pTrCm42から、trcプロモーターおよびlacオペレーターを上流loxP−CAT−loxPカセットと共に含有するDNAカセットをPCR増幅した。プライマーペアは、galP上流領域に対する40bpの相同性をPCR生成物の両端に組み込む。PCRパラメータは95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間、Taqポリメラーゼ(ロシュ(Roche))を使用して30サイクルであった。生成物をEcho pUni/His5 R6K(インビトロジェン(Invitrogen))中にサブクローニングして、プラスミドpR6KgalPを生成した。
プライマーペア配列番号:9および配列番号:10を使用して、PCRによるpTrCm42から、trcプロモーターおよびlacオペレーターを上流loxP−CAT−loxPカセットと共に含有するDNAカセットを増幅した。プライマーペア配列番号:9および配列番号:10は、glk上流領域に対するそれぞれ39(1塩基欠失)および40bpの相同性をPCR生成物の両端に組み込む。PCRパラメータは95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間、Taqポリメラーゼ(ロシュ(Roche))を使用して30サイクルであった。生成物をEcho pUni/His5 R6K(インビトロジェン(Invitrogen))中にサブクローニングして、プラスミドpR6Kglkを生成した。
大腸菌株NF9の誘導体を供与体としてを使用して、P1vir形質導入により、大腸菌株KLndh81のPTSマイナス誘導体(ΔptsHIcrr)を得た(非特許文献51)。形質導入は、ptsH、ptsI、およびcrrを含むオペロンをカナマイシン抗生物質耐性マーカーで置換して(非特許文献52)、菌株KLpts7を与える。マッコンキー(MacConkey)(ラクトース−)寒天+1%グルコース上に平板培養すると、KLpts7は白色コロニー表現型を示す。
rTthRNAポリメラーゼ(パーキンエルマー(Perkin Elmer))、pR6KgalPをテンプレートとして、およびプライマーペア配列番号:7および配列番号:8を使用して、loxP−Cat−loxP−Trcカセットを含みgalP上流領域に対する40bpの相同性を両端に組み込んだ、PCR増幅生成物[GenBank目録番号U00096参照]を生成した。(非特許文献42)で述べられたようなλレッドシステムを使用して、組み込みのためのpKD46を含有するエレクトロ−コンピテントKLpts7細胞に、PCR増幅された組み込みカセットを形質転換した。10mg/Lのクロラムフェニコール添加LBプレート上で選択を実施した。このカセットの成功した組み込みは、galP ATG開始コドン上流の38〜181bp領域(GenBank目録番号U00096参照)をloxP−Cat−loxP−Trcカセット(配列番号:11)で置き換えて、菌株KLpts::galP−trcを提供する。プライマーペア配列番号:7および配列番号:8(組み込み部位を増幅して1.4kbの生成物を与える)と、プライマーペア配列番号:12および配列番号:13(上流および下流領域含めた組み込み部位を増幅して2.1kbの生成物を与える。)を使用して、PCR分析によって組み込みを確認した。PCRパラメータは95℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間、TaqポリメラーゼまたはrTthポリメラーゼを使用して30サイクルであった。マッコンキー(MacConkey)(ラクトース−)寒天+1%グルコース上に平板培養すると、KLpts::galP−trcは淡紅色コロニー表現型を示す。(非特許文献43)で述べられたようにして、クロラムフェニコールマーカーを除去した。プライマーペア配列番号:12および配列番号:13(1.1kbの生成物を与える)を使用してPCR分析によって除去を確認し、結果として得られる菌株をKLgalP−trcと命名した。
rTth RNAポリメラーゼ(パーキンエルマー(Perkin Elmer))、pR6Kglkをテンプレートとして、およびプライマーペア配列番号:9および配列番号:10を使用して、loxP−Cat−loxP−Trcカセットを含み、glk上流領域に対するほぼ40bpの相同性を両端に組み込んだPCR増幅生成物[GenBank目録番号U00096参照]を生成した。上述のλレッドシステムを使用して、組み込みのためのpKD46を含有するエレクトロ−コンピテントKLgalP−trc細胞に、PCR増幅された組み込みカセットを形質転換した。10mg/Lのクロラムフェニコールを含有するLBプレート上で選択を実施した。このカセットの成功した組み込みは、glk ATG開始コドン上流の40〜137bp領域(GenBank目録番号U00096参照)をloxP−Cat−loxP−Trcカセット(配列番号:11)で置き換える。プライマーペア配列番号:14および配列番号:15(上流および下流領域を含めた組み込み部位を増幅して2.4kbの生成物を与える)を使用して、PCR分析によって組み込みを確認した。マッコンキー(MacConkey)(ラクトース−)寒天+1%グルコース上に平板培養すると、コロニーは深紅色を示し、親株(KLgalP−trc)と比較して、グルコースから酸への転換の増大が示された。上述のようにしてクロラムフェニコールマーカーを除去し、引き続くPCR分析(プライマーペア配列番号:14および配列番号:15を使用して1.3kbの生成物を与える)から菌株KLGGが得られた。
MG1655 ΔarcA::Cm菌株のP1溶菌液を調製して使用し、変異を菌株KLGGに移した。結果として生じるクロラムフェニコール抵抗性クローンKLGG ΔarcA::CmをゲノムPCRによって調べ、変異が存在することを確実にした。FLPリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し(非特許文献42)、この菌株をKLGG ΔarcAと命名した。
1.7kbのコード領域をpLoxCat2からのloxP−cat−loxPカセットで置換してedd欠失[GenBank目録番号U00096参照]を得た。プライマーペア配列番号:16および配列番号:17で置換カセットを増幅した。プライマー配列番号:16は、eddの5’末端に対する80bpの相同性、およびテンプレートpLoxCat2に対する18bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:17は、eddの3’末端に対する78bpの相同性、およびpLoxCat2に対する19bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、KLGG ΔarcA/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株をLBプレート上で12.5mg/Lクロラムフェニコールによって選択した。プライマーペア配列番号:18および配列番号:19を使用して、edd遺伝子の欠失をPCRで確認した。野生型菌株は2.2kbのPCR生成物を与え、一方組換え型は特徴的な1.6kbのPCR生成物を与える。菌株をKLGG ΔarcA Δedd::catと命名した。Creリコンビナーゼ(非特許文献43)を使用して、クロラムフェニコールマーカーを除去し、この菌株をKLGG ΔarcA Δedd、あるいは代案としてはFMPと命名した。
ΔptsHIcrr、天然galPプロモーターのtrcプロモーター置換、および天然glkプロモーターのtrcプロモーター置換(これらの3つ全ての変更については実施例4で述べられる)を含む細胞は、最初に緩慢な増殖を示した。また引き続く選択(下で述べるような)は、常に生育がより早い誘導体をもたらした。細胞フリー抽出物からアッセイされたグルコキナーゼ活性は、生育のより早い誘導体で、生育がより緩慢な親株と比較して典型的に3倍高かった。
(菌株FMP/pSYCO103およびFMP’::Km/pSYCO103を使用したグルコースから1,3−プロパンジオールへの発酵の比較例)
菌株FMPおよびFMP’::KmをプラスミドpSYCO103で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、1,3−プロパンジオールの生産を14L発酵槽内で判定した。解凍したFMP/pSYCO103の凍結バイアルを50mg/Lスペクチノマイシン添加500mLの2YTに移して前培養を調製した。dO設定値は15%であった。ビタミンB12を16mgの大量瞬時添加で発酵槽に30、43、および51時間目に添加した。
(グルコースからの1,3プロパンジオール生産のための大腸菌株におけるグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)変性発現の遺伝子操作)
(開始コドンを変化させることによるGapA発現の低下)
gapA遺伝子のATG開始コドンをGTGまたはTTG開始コドンで置き換えて、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼGapAのレベルを低下させた。
225bpの上流gapA配列(GenBank目録番号U00096参照)をFRT−CmR−FRTおよび遺伝子操作プロモーターで置き換え、合成の短1.5GIプロモーター(配列番号:28)による天然gapAプロモーターの置換を行った。pKD3をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:29および配列番号:30によって置換カセットをPCRで増幅した。プライマー配列番号:29は、ATGstartを含むgapAに対する39bpの相同性を含有し、短1.5GIプロモーターを含有し、テンプレートpKD3に対する20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:30は、上流gapA配列に対する59bpの相同性、およびpKD3に対する21bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔して、MG1655 1.5gapA::Cmを得た。12.5mg/Lのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で、組換え菌株を選択した。カセットの成功した組み込みは、gapA ATG開始コドンの34〜258bp上流領域をFRT−CmR−FRT−短1.5GIプロモーターカセットで置き換える。P1ファージ溶菌液を調製し使用して、変異をFMP’::Kmに移した。この菌株をFMP’::Km 1.5gapA::Cmと称する。
(FMP’::Km 1.5gapA::Cmからのマーカーの除去)
菌株FMP’::Km 1.5gapA::Cmから(一般方法の節で述べたように)クロラムフェニコールマーカーを除去して、菌株FMP’::Km 1.5gapAを得た。
(大腸菌株FMP’1.5gapA/pSYCO106を使用したグルコースからの1,3−プロパンジオールの高収率の実証)
菌株FMP’1.5gapAをプラスミドpSYCO106で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、1,3−プロパンジオールおよびグリセロールの生産を14L発酵槽内で判定した。解凍したFMP’1.5gap/pSYCO106の凍結バイアルを50mg/Lスペクチノマイシン添加500mLのSBG1%に移して、前培養を調製した。ビタミンB12を16mgの大量瞬時添加で発酵槽に接種前および接種28時間目に添加した。最終1,3−プロパンジオール濃度は129g/Lであり、質量収率は40.2%であった。
(大腸菌におけるメチルグリオキサール合成酵素(mgsA)変異株の遺伝子操作)
0.4kbのコード領域をpKD4のFRT−Kan−FRTカセットで置き換えてmgsA欠失[GenBank目録番号U00096参照]を作り出した。pKD4をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:36および配列番号:37で、置換カセットをPCR増幅した。プライマー配列番号:36は、mgsAの5’末端に対する40bpの相同性、テンプレートDNAであるpKD4に対する20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:37は、mgsAの3’末端に対する40bpの相同性、pKD4に対する20bpの相同性の相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を12.5mg/Lのカナマイシンを含むLBプレート上で選択した。プライマーペア配列番号:38およびQID番号:39を用して、PCRによってmgsA遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は1.3kbのPCR生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な2.4kbのPCR生成物を与える。この菌株をMG1655 ΔmgsA::kanと命名した。mgsA変異株がMG1655中に得られたら、P1ファージ溶菌液を調製して使用し、変異をFMP’1.5gapA内に移した(実施例8)。FLPリコンビナーゼを使用してカナマイシン耐性マーカーを除去し(非特許文献42)、この菌株をFMP’1.5gapA ΔmgsAと命名した。
(大腸菌株FMP’1.5gapA ΔmgsA/pSYCO106を使用したグルコースから1,3−プロパンジオールへの発酵)
菌株FMP’1.5gapA ΔmgsAをプラスミドpSYCO106で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、1,3−プロパンジオール(およびグリセロール)の生産を14L発酵槽内で判定した。FMP’1.5gapA ΔmgsA/pSYCO106の新鮮なプレート(50mg/Lのスペクチノマイシン添加LA)からの単一コロニーを250mLフラスコ内の100mg/Lスペクチノマイシン添加30mLのLB中に移して、前培養を調製した。34℃および300rpmでOD550が1 AUになるまで培養後、10.8mLの培養を発酵槽に移した。操作のほぼ全体に渡り、発酵槽をグルコース限界で操作した。ビタミンB12を16mgの大量瞬時添加で、接種前、接種28時間目および38時間目に発酵槽に添加した。最終1,3−プロパンジオール濃度は130g/Lであり、質量収率は47.5%であった。グルコース過剰(0〜20g/L)を維持した操作で、141g/Lの1,3−プロパンジオールおよび43.6%の質量収率を得た。
(直鎖DNA形質転換によるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)のための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築)
FRT−CmR−FRTおよび遺伝子操作されたプロモーターを含有する59bpの上流ppc配列カセットを置き換えて、合成の短1.6 GIプロモーターによる天然ppcプロモーターの置換を作り出した。pKD3をテンプレートとして使用して、PCR生成物をプライマーペア配列番号:40および配列番号:41で増幅した。プライマー配列番号:40は、上流ppc配列に対して80bpの相同性、テンプレートpKD3に対して20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:41は、上流ppc配列に対して39bpの相同性を含有し、短1.6 GIプロモーター配列を含有し、pKD3に対して20bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を12.5mg/Lのクロラムフェニコール添加LBプレート上で選択し、MG1655 1.6ppc::Cmを得た。成功したカセットの組み込みは、ppcATGstartの上流90〜148bp領域[GenBank目録番号U00096参照]をFRT−CmR−FRT−短1.6 GIプロモーターカセットで置き換える。プライマーペア配列番号:40および配列番号:41によって、上流ppc領域への組み込みを確認した。野生型菌株は0.2kbのPCR生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な1.2kbのPCR生成物を与えた。プライマー配列番号:42を使用してこのPCR生成物が配列決定され、プロモーター置換効率的に起きたことが示された。P1ファージ溶菌液を調製して使用し、変異を菌株FMP’1.5gap ΔmgsAに移した。この菌株をFMP’1.5gap Δmgs 1.6ppc::Cmと命名した。FLPリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し(非特許文献42)、結果として得られる菌株をプラスミドpSYCO106でエレクトロ形質転換し、FMP’1.5gap Δmgs 1.6ppc/pSYCO106を得た。
(大腸菌株FMP’1.5gapA ΔmgsA/pSYCO106を使用したグルコースから1,3−プロパンジオールへの発酵)
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、FMP’1.5gapA ΔmgsA 1.6ppc/pSYCO106による1,3−プロパンジオールの生産を14L発酵槽内で判定した。FMP’1.5gapA ΔmgsA 1.6ppc/pSYCO106の新鮮なプレート(50mg/Lのスペクチノマイシン添加LA)からの単一コロニーを250mLフラスコ内の100mg/Lのスペクチノマイシン添加30mLのLB中に移して、前培養を調製した。34℃および300rpmでOD550が1 AUになるまで培養後、10.8mLの培養を発酵槽に移した。ビタミンB12を16mgの大量瞬時添加で、接種前、接種28時間目および38時間目に発酵槽に添加した。最終1,3−プロパンジオール濃度は135.3g/Lであり、質量収率は46.1%であった。
(直鎖DNA形質転換によるyciK/btuRのための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築)
遺伝子yciKおよびbtuRは、大腸菌の単一オペロン内に存在する。yciK−btuRの上流に1.3kbのカセットを挿入して、天然yciK−btuRプロモーターの合成短1.6 GIプロモーターによる置換を作り出した。pKD13をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:43および配列番号:44によって、FRT−CmR−FRTおよび遺伝操作されたプロモーターを含有する置換カセットをPCR増幅した。プライマー配列番号:43は、上流yciK−btuR配列に対する70bpの相同性を含有し、テンプレートpKD13に対する20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:44は、上流yciK−btuR配列に対する30bpの相同性を含有し、短1.6 GIプロモーター配列を含有し、pKD13に対する20bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を25.0mg/Lのカナマイシン添加LBプレート上で選択し、MG1655 1.6yciK−btuR::Kmを得た。カセットの成功した組み込みは、yciK ATG開始コドン上流のbp27およびbp28間[GenBank目録番号U00096参照]へのFRT−CmR−FRT−短1.6GIプロモーターカセットの挿入をもたらす。上流yciK/btuR領域への組み込みは、プライマーペア配列番号:45および配列番号:46によって確認された。野生型菌株は1.4kbのPCR生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な2.8kbのPCR生成物を与える。P1ファージ溶菌液を調製して使用し、変異をTripleと称される菌株FMP’1.5gap Δmgs 1.6ppc誘導体に移した。抗生物質を除去した後、菌株Triple 1.6btuRを得た。
(Triple 1.6btuR/pSYCO109を有する大腸菌株を使用したグルコースから1,3−プロパンジオールへの発酵)
菌株Triple 1.6btuRをpSYCO109で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、Triple 1.6btuR/pSYCO109による1,3−プロパンジオールの生産を14L発酵槽内で判定した。Triple 1.6btuR/pSYCO109の新鮮なプレート(50mg/Lのスペクチノマイシン添加LA)からの単一コロニーを250mLフラスコ内の100mg/Lのスペクチノマイシン添加30mLのLB中に移して、前培養を調製した。34℃および300rpmでOD550が1 AUになるまで培養後、10.8mLの培養を発酵槽に移した。ビタミンB12を8mgの大量瞬時添加で、接種前、接種28時間目および38時間目に発酵槽に添加した。最終1,3−プロパンジオール濃度は123g/Lであり、質量収率は45.7%であった。
(直鎖DNA形質転換によるyqhDのための遺伝子操作されたプロモーターを有する大腸菌株の構築)
yqhC遺伝子を含む967bpの上流yqhD配列をFRT−CmR−FRTおよび遺伝子操作されたプロモーターを含有するカセットで置き換えて、合成短1.6 GIプロモーターによる天然yqhD(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター置換を作り出した。pKD3をテンプレートとして使用して、PCR生成物をプライマーペア配列番号:47および配列番号:48で増幅した。プライマー配列番号:47は上流yqhD配列に対して78bpの相同性、テンプレートpKD3に対して20bpの相同性を含有した。プライマー配列番号:48は上流yqhD配列に41bpの相同性(1bpの欠失あり)、短1.6 GIプロモーター配列に40bpの相同性、そしてpKD3に19bpの相同性を組み込んだ。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を12.5mg/Lクロラムフェニコール添加LBプレート上で選択し、MG1655 1.6yqhD::Cmを得た。成功したカセット組み込みは、yqhD ATG startの上流50〜1016bp領域[GenBank目録番号U00096参照]をFRT−CmR−FRT−短1.6 GIプロモーターカセットで置き換える。プライマー配列番号:49による配列決定で上流yqhD領域への組み込みが確認され、プロモーター置換が効率的に起きたことが示された。P1ファージ溶菌液を調製し使用して、変異をに菌株Triple 1.6btuRに移した。抗生物質を(上述のように)除去した後、菌株Triple 1.6btuR 1.6yqhDが得られた。
(大腸菌株Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109を使用したグルコースから1,3−プロパンジオールへの発酵)
菌株Triple 1.6btuR 1.6yqhDをpSYCO109で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109による1,3−プロパンジオールの生産を14L発酵槽内で判定した。Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109の新鮮なプレート(50mg/Lスペクチノマイシン添加LA)からの単一コロニーを250mLフラスコ内の100mg/Lスペクチノマイシン添加30mLのLB中に移して、前培養を調製した。34℃および300rpmでOD550が1 AUになるまで培養後、10.8mLの培養を発酵槽に移した。ビタミンB12を16mgの大量瞬時添加で、発酵経過20.6時間目に発酵槽に添加した。最終1,3−プロパンジオール濃度は113.3g/Lであり、質量収率は48.8%であった。
(直鎖DNA形質転換による酢酸キナーゼ(ack)およびリン酸トランスアセチラーゼ(pta)に欠失変異を有する大腸菌株の構築)
3.3kbのコード領域をpKD3のFRT−CmR−FRTカセットで置き換えて、pta−ackA欠失[GenBank目録番号U00096参照]を作り出した。pKD3をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:50および配列番号:51で置換カセットを増幅した。プライマー配列番号:50は、ptaの5’末端に対する80bpの相同性、およびテンプレートDNA、pKD3に対する20bpの相同性を含有する。プライマー配列番号:51は、ackAの3’末端に対する80bpの相同性、pKD3に対する20bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製して、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を12.5mg/Lのクロラムフェニコールを含むLBプレート上で選択し、菌株MG1655 ΔackA−pta::Cmを得た。プライマーペア配列番号:52および配列番号:53を使用して、PCRによりpta−ackA遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は3.8kbのPCR生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な1.6kbのPCR生成物を与えた。P1ファージ溶菌液を調製して使用し、変異を菌株Triple 1.6btuR 1.6yqhDに移し、菌株Triple 1.6btuR 1.6yqhD ΔackA−pta::Cmを形成した。FLPリコンビナーゼを使用して、クロラムフェニコール耐性マーカーを除去し(非特許文献42)、Triple 1.6btuR 1.6yqhD ΔackA−pta(Triple Triple(TT)と改名される)を得た。Triple 1.6btuR 1.6yqhDおよびTT菌株をプラスミドpSYCO109でエレクトロ形質転換した。
(菌株TRIPLE 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109と比較した菌株TRIPLE TRIPLE/pSYCO109におけるリン酸トランスアセチラーゼ(Pta)酵素活性の測定)
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、14L発酵内でTT/pSYCO109およびTriple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109による発酵を実施した。Triple 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO106による典型発酵については、実施例13Aで述べた。
(TRIPLE 1.6btuR 1.6yqhD/pSYCO109と比較した菌株TT/pSYCO109におけるモル収率の改善された安定性)
二連のフラスコ振盪培養を菌株Triple btuR 1.6yqhD、pSYCO109、およびTT pSYCO109で培養した。LB+50mg/Lスペクチノマイシン中で1個のコロニーを10時間培養した後、100mLの培養を50ppmのスペクチノマイシン有りまたは無しで、2%のグルコース添加30mLのTM2培養液に移した(1日目)。収率の安定性を研究するために、50ppmのスペクチノマイシン有りまたは無しで、2%のグルコースを含有する30mL容積の新鮮なTM2培養液に、1日目の培養の100mL容量を24時間後に移した。これを4回繰り返した。各24時間の期間終了後に、モル収率を実施例2のように計算して、結果を下の表9に示す。ackA−pta欠失がモル収率を安定化させることで、1,3−プロパンジオール生産が改善する。
(直鎖DNA形質転換によるアルデヒドデヒドロゲナーゼ中に欠失変異を有する大腸菌株の構築)
1.3kbのコード領域をpKD3のFRT−CmR−FRTカセットで置き換えて、aldA欠失[GenBank目録番号U00096参照]を作り出した。pKD3をテンプレートとして使用して、プライマーペア配列番号:57および配列番号:58で、カセットを増幅した。プライマー配列番号:57は、aldAの5’末端に対する80bpの相同性、テンプレートDNA、pKD3に対する20bpの相同性を有する。プライマー配列番号:58は、aldAの3’末端に対する80bpの相同性、pKD3に対する20bpの相同性を含有する。PCR生成物をゲル精製し、MG1655/pKD46適格細胞内に電気穿孔した。組換え菌株を12.5mg/Lのクロラムフェニコール添加LBプレート上で選択した。プライマーペア配列番号:59および配列番号:60を使用して、PCRによってaldA遺伝子の欠失を確認した。野生型菌株は2.0kbのPCR生成物を与え、一方組換え菌株は特徴的な1.8kbのPCR生成物を与える。その菌株のP1溶菌液を調製して使用し、変異を菌株TTに移して、TT ΔaldA::Cm菌株を形成した。FLPリコンビナーゼ使用してクロラムフェニコール耐性マーカーを除去し(非特許文献42)、TT aldAを作り出した。
(菌株FMP’1.5gap/pSYCO106によるグリセロールの生産)
菌株FMP’1.5gapAをプラスミドpSYCO106で形質転換した。一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、14L発酵槽内でグリセロールの生産を判定した。解凍したFMP’1.5gap/pSYCO106の凍結バイアルを50mg/Lのスペクチノマイシン添加500mLのSBG1%に移して、前培養を調製した。ビタミンB12を発酵槽に添加した。典型的発酵からはモル収率115%で、202g/Lのグリセロールの生産がもたらされた。
(菌株TT/pSYCO109によるグリセロール生産)
一般方法で述べたようにして、以下の異なる発酵槽の調節パラメータで、14L発酵槽中でグリセロール生産を判定した。50mg/Lのスペクチノマイシン添加LBプレート上のTT/pSYCO109の単一コロニーを250mLフラスコ内の100mg/Lスペクチノマイシン添加30mLのLBに移した。OD550がほぼ1 AUになったとき、10.8mLの培養を使用して上述のように調製した発酵槽を接種した。発酵槽にビタミンB12は添加しなかった。典型的発酵からは、モル収率137%で302g/Lのグリセロールの生産がもたらされた。
本発明は、特許請求の範囲に記載の発明を含め、以下の発明を包含する。
(1) a)活性PEP−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
b)活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性galP遺伝子、
c)活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性glk遺伝子、および
d)活性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性gapA遺伝子
を含むことを特徴とする大腸菌(E.coli)株。
(2) 前記撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系が、
i)活性ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ptsH遺伝子、
ii)活性ホスホエノールピルベート−タンパクリン酸転移酵素の発現を妨げる撹乱された内在性ptsI遺伝子、および
iii)活性グルコース−特異的IIA構成要素の発現を妨げる撹乱された内在性crr遺伝子
の1つまたは複数を含むことを特徴とする(1)に記載の大腸菌株。
(3) e)活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性arcA遺伝子、
f)活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ppc遺伝子、
g)活性cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性btuR遺伝子、および
h)活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたyqhD遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことを特徴とする(1)または(2)に記載の大腸菌株。
(4) i)活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性mgsA遺伝子、
j)活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ackA遺伝子、
k)活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性pta遺伝子、
l)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼAの発現を妨げる撹乱された内在性aldA遺伝子、および
m)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼBの発現を妨げる撹乱された内在性aldB遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことを特徴とする(1)、(2)、または(3)に記載の大腸菌株。
(5) n)活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性edd遺伝子、
o)活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性glpK遺伝子、および
p)活性NADH−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性gldA遺伝子
の1つまたは複数をさらに含むことを特徴とする(1)、(2)、(3)、または(4)に記載の大腸菌株。
(6) 適切な条件下で、(1)、(2)、(3)、(4)または(5)に記載の大腸菌株を適切な炭素基材と接触させるステップを含むことを特徴とする1,3−プロパンジオールの生物生産方法。
(7) 前記大腸菌株が
(i)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、
(ii)グリセロール−3−ホスファターゼ、
(iii)デヒドラターゼ、および
(iv)デヒドラターゼ再活性化因子
をさらに含むことを特徴とする(6)に記載の方法。
(8) a)活性PEP−グルコースリン酸転移酵素系タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系、
b)活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードするアップレギュレートされた内在性galP遺伝子、
c)活性グルコキナーゼをコードするアップレギュレートされた内在性glk遺伝子、
d)活性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするダウンレギュレートされた内在性gapA遺伝子、
e)活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる撹乱された内在性arcA遺伝子、
f)活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性ppc遺伝子、
g)活性cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードするアップレギュレートされた内在性btuR遺伝子、
h)活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードするアップレギュレートされたyqhD遺伝子、
i)活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる撹乱された内在性mgsA遺伝子、
j)活性酢酸キナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性ackA遺伝子、
k)活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる撹乱された内在性pta遺伝子、
l)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼAの発現を妨げる撹乱された内在性aldA遺伝子、
m)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼBの発現を妨げる撹乱された内在性aldB遺伝子、
n)活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる撹乱された内在性edd遺伝子、
o)活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性glpK遺伝子、
p)活性NADH−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる撹乱された内在性gldA遺伝子、および
q)pSYCOコンストラクト配列番号:65、66、67、または68のヌクレオチド配列のいずれか1つ
を含むことを特徴とする大腸菌株。
Claims (3)
- a)攪乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系であって、
i) ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ptsH遺伝子、
ii) 活性ホスホエノールピルベート−タンパク質リン酸転移酵素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ptsI遺伝子、および
iii) 活性グルコース−特異的IIA構成要素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性crr遺伝子、の1または複数を含むもの、
b)活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性galP遺伝子であって、前記アップレギュレートがガラクトース−プロトン同伴輸送体活性の増加をもたらすもの、
c)活性グルコキナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性glk遺伝子であって、前記アップレギュレートがグルコキナーゼ活性の増加をもたらすもの、
d)活性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にダウンレギュレートされた内在性gapAであって、前記ダウンレギュレートがグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらすもの、
e)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、
f)グリセロールデヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、および
g)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、を含み、これにより、大腸菌(E.coli)株が適切な炭素源をグリセロール、1,3−プロパンジオール、または、グリセロールおよび1,3−プロパンジオールへ生物変換することができることを特徴とする大腸菌(E.coli)株。 - a)攪乱された内在性ホスホエノールピルベート−グルコースリン酸転移酵素系であって、
i) ホスホキャリアタンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ptsH遺伝子、
ii) ホスホエノールピルベート−タンパクリンクリン酸転移酵素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ptsI遺伝子、および
iii) グルコース−特異的IIA構成要素の発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性crr遺伝子、の1または複数を含むもの、
b)活性ガラクトース−プロトン同伴輸送体をコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性galP遺伝子であって、前記アップレギュレートがガラクトース−プロトン同伴輸送体活性の増加をもたらすもの、
c)活性グルコキナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性glk遺伝子であって、前記アップレギュレートがグルコキナーゼ活性の増加をもたらすもの、
d)活性グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にダウンレギュレートされた内在性gapA遺伝子であって、前記ダウンレギュレートがグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少をもたらすもの、
e)活性有気呼吸制御タンパクの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性arcA遺伝子、
f)活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性ppc遺伝子であって、前記アップレギュレートがホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増加をもたらすもの、
g)活性cob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされた内在性btuR遺伝子であって、前記アップレギュレートがcob(I)アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性の増加をもたらすもの、
h)活性アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝的にアップレギュレートされたyqhD遺伝子であって、前記アップレギュレートがアルコールデヒドロゲナーゼ活性の増加をもたらすもの、
i)活性メチルグリオキサールシンターゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性mgsA遺伝子、
j)活性酢酸キナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性ackA遺伝子、
k)活性ホスホトランスアセチラーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性pta遺伝子、
l)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼAの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性aldA遺伝子、
m)活性アルデヒドデヒドロゲナーゼBの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性aldB遺伝子、
n)活性ホスホグルコン酸デヒドラターゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性edd遺伝子、
o)活性グリセロールキナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性glpK遺伝子、
p)活性NADH−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼの発現を妨げる遺伝的に攪乱された内在性gldA遺伝子、
q)pSYCOプラスミド配列番号:65、66、67、または68のヌクレオチド配列のいずれか1つ、
r)グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、
s)グリセロールデヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、および
t)グリセロール−3−ホスファターゼ活性を有する蛋白質をコードする外来性遺伝子、を含みこれにより、大腸菌(E.coli)株が適切な炭素源をグリセロール、1,3−プロパンジオール、またはグリセロールおよび1,3−プロパンジオールへ生物変換することができることを特徴とする大腸菌(E.coli)株。 - 適切な条件下で、請求項1または2に記載の大腸菌株を適切な炭素基材と接触させるステップを含むことを特徴とする1,3−プロパンジオールの生物生産方法。
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