JP6744819B2 - メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、イソプレノイド、およびアセチルＣｏＡ由来産物の生産向上のための組換え微生物 - Google Patents

メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、イソプレノイド、およびアセチルＣｏＡ由来産物の生産向上のための組換え微生物 Download PDF

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Description

本開示は、組換え微生物における、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産を増大させるための組成物および方法、ならびに同物質を生産して使用する方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１４年２月２０日に出願された、米国仮特許出願第６１／９４２，５４６号明細書の優先権を主張する。
メバロン酸は、アセチルＣｏＡをイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸に変換する、メバロン酸依存性生合成経路の中間体である。アセチルＣｏＡのメバロン酸への変換は、上流メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）のチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性によって触媒され得る。
商業的に、メバロン酸は，化粧品中の添加剤として、生分解性ポリマーの製造のために使用されており、その他の化学物質の合成のためのキラル構成要素としての価値を有し得る。
メバロン酸依存性経路の生成物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）である。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、イソプレンならびにイソプレノイドの前駆体である。イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、天然ゴムの単量体であり、また集合的にイソプレノイドと称される非常に多様なその他の天然起源化合物の一般的構造モチーフでもある。それに加えてイソプレンは、多様な合成ポリマー、中でも注目すべきは合成ゴムのための重要な出発原料である。
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに由来する化合物である。２９，０００種を超えるイソプレノイド化合物が同定されており、新しいイソプレノイドが毎年発見されている。イソプレノイドは、イソプレノイドの比較的複雑な構造を形成するための基本的構成単位としてイソプレノイド前駆体分子を使用する、微生物および植物種などの天然物から単離し得る。イソプレノイドは、ほとんどの生きている生物および細胞に不可欠であり、細胞膜流動性および電子伝達を維持する手段を提供する。自然界では、イソプレノイドは、植物中の天然殺虫剤としての多様な役割において機能し、シナモン、クローブ、およびショウガに付随する香りを与える。さらに、製薬業界および化学産業界は、医薬品、栄養補給食品、着香剤、および農業害虫防除剤として、イソプレノイドを利用する。生物学的システムにおけるそれらの重要性と、広範な用途における有用性を考慮して、イソプレノイドは、科学者によって注視され続けてきた。
メバロン酸およびイソプレノイドを得るための従来の手段としては、生物学的材料（例えば、植物、微生物、および動物）からの抽出、および実験室での部分的または完全有機合成が挙げられる。しかしこのような手段は、概して満足のいくものではないことが判明している。特にイソプレノイドでは、それらの分子構造の往々にして複雑な性質を所与として、所望の製品を得るためにいくつかのステップが通常要求されることを考えると、有機合成は非実用的である。さらにこれらの化学合成ステップは、有毒溶媒の使用を伴い得て、生物学的材料からのイソプレノイド抽出もまた同様である。さらに生物学的材料は、典型的に、これらの分子を微量でのみ含有するため、これらの抽出および精製法は、通常、所望のイソプレノイドを比較的低収率でもたらす。不運にも、比較的大量のイソプレノイドを得ることに伴う困難さは、それらの実用的利用を制限してきた。
イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、およびイソプレノイドの生産における最近の進歩は、しっかりした商業的工程の要求を満たすのに十分であり得る、速度、力価、および純度で、イソプレンおよびイソプレノイドを生産する方法を開示する（例えば、国際公開第２００９／０７６６７６Ａ２号パンフレット、および米国特許第７，９１５，０２６号明細書を参照されたい）；しかしイソプレンおよびイソプレノイドの生産を向上させるためならびに同物質の生産量および収率を向上させるための改良が、依然として必要とされる。
メバロン酸依存性生合成経路の中間体としてのメバロン酸の生産を増大させ；イソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドなどのメバロン酸に由来する分子の生産を増大させ；アセチルＣｏＡ由来産物の生産を増大させる組成物および方法の開示によって、このような改善が本明細書で提供される。
本明細書全体を通じて、様々な特許、特許出願およびその他の各種文献（例えば学術誌論文）に言及する。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、および文献の開示は、あらゆる目的のために、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
提供される本明細書は、特に、組換え微生物における１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように、組換え微生物／組換え細胞で１つまたは複数の特定の遺伝子操作を使用する、微生物におけるメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産を増大させるための組成物および方法を開示する。このような調節は、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産増大をもたらし得る。
したがって、一態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレンを産生できる組換え細胞であり、細胞は、（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸のどちらか、またはそれらの活性が調節されるように遺伝子操作されている１つまたは複数のアセチル化タンパク質；（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および（ｉｉｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドを含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾または遺伝子操作されており、適切な培地中の組換え細胞の培養はイソプレンの生産を提供する。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が減衰、欠失または増大するように、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はアセチルトランスフェラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、ＹｆｉＱ、Ｐａｔ、およびＡｃｕＡからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼはＹｆｉＱポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はデアセチラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼは、ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼはＣｏｂＢポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、ポリペプチドクズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）交配種に由来する。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）、およびコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）からなる群から選択される生物に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸（本明細書で同義的にアセチルリン酸、アセチルリン酸、アセチル−Ｐ、Ａｃ−Ｐと言及される）を合成する能力がある。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。
特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、およびリボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）からなる群から選択される。
その他の実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が低下される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活が低下される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、および酢酸輸送体／酢酸ポンプ（ａｃｔＰ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では，１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が増大される。特定の実施形態では、増大される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ａｃｓ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、およびｐｇｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が低下される。特定の実施形態では、低下される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ｐｄｈＲ、ｇｌｔａ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのその他の実施形態では、組換え細胞は、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびパントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからなる群から選択される）。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレン生産は、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して、増大される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレン生産が少なくとも５％増大され、イソプレン生産の増大は、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）イソプレン対二酸化炭素比、（ｖ）比生産性、または（ｖｉ）細胞生産性指数の増大を含んでなる。
その他の態様では、（ａ）本明細書で開示される実施形態のいずれかの組換え細胞をイソプレン生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であり、細胞は、（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸のどちらか、またはそれらの活性が調節されるように遺伝子操作されている１つまたは複数のアセチル化タンパク質；および（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾または遺伝子操作されており、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレノイド前駆体の生産を提供する。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が減衰、欠失または増大するように、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はアセチルトランスフェラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、ＹｆｉＱ、Ｐａｔ、およびＡｃｕＡからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼはＹｆｉＱポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はデアセチラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼは、ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼはＣｏｂＢポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。
特定の実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。
特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、およびリボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）からなる群から選択される。
その他の実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が低下される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活が低下される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、および酢酸輸送体／酢酸ポンプ（ａｃｔＰ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が増大される。特定の実施形態では、増大される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ａｃｓ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、およびｐｇｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が低下される。特定の実施形態では、低下される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ｐｄｈＲ、ｇｌｔａ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、細胞の染色体に組み込まれる。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのその他の実施形態では、組換え細胞は、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびパントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからなる群から選択される）。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイド前駆体は、メバロン酸（ＭＶＡ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレノイド前駆体の生産は、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して、増大される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレノイド前駆体の生産が少なくとも５％増大され、イソプレノイド前駆体の生産の増大は、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる。
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書で開示される実施形態のいずれかの組換え細胞をイソプレノイド前駆体の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレノイド前駆体を回収するステップをさらに含んでなる。
さらに別の態様では、本明細書で提供されるのはイソプレノイドを産生できる組換え細胞であり、細胞は、（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸のどちらか、またはそれらの活性が調節されるように遺伝子操作されている１つまたは複数のアセチル化タンパク質；（ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および（ｉｉｉ）ピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする１つまたは複数の核酸を含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾または遺伝子操作されており、適切な培地中の組換え細胞の培養は、イソプレノイドの生産を提供する。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が減衰、欠失または増大するように、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はアセチルトランスフェラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、ＹｆｉＱ、Ｐａｔ、およびＡｃｕＡからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼはＹｆｉＱポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はデアセチラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼは、ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼはＣｏｂＢポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される。
特定の実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。
特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、およびリボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）からなる群から選択される。
その他の実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が低下される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活が低下される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、および酢酸輸送体／酢酸ポンプ（ａｃｔＰ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が増大される。特定の実施形態では、増大される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ａｃｓ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、およびｐｇｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が低下される。特定の実施形態では、低下される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ｐｄｈＲ、ｇｌｔａ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、細胞の染色体に組み込まれる。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのその他の実施形態では、組換え細胞は、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびパントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）からなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セスタテルペノイド、トリテルペノイド、およびテトラテルペノイドからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピネン、およびバレンセンからなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレノイド生産は、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して、増大される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、イソプレノイド生産が少なくとも５％増大され、イソプレノイド生産の増大は、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる。
さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書で開示される実施形態のいずれかの組換え細胞をイソプレノイドの生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
なおも別の態様では、本明細書で提供されるのは、アセチルＣｏＡ由来産物を産生できる組換え細胞であり、細胞は、（ｉ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸のどちらか、またはそれらの活性が調節されるように遺伝子操作されている１つまたは複数のアセチル化タンパク質；および（ｉｉ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなり、細胞は核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾または遺伝子操作されており、細胞はアセチルＣｏＡ由来産物を産生する。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）を含まないアセチルＣｏＡ由来産物を産生する能力がある細胞と比較して、増大した量のアセチルＣｏＡ由来産物を産生する。
いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡ由来産物は、脂肪酸、フェノール、プロスタグランジン、マクロライド抗生物質、イソプレン、およびイソプレノイドからなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が減衰、欠失または増大するように、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はアセチルトランスフェラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼは、ＹｆｉＱ、Ｐａｔ、およびＡｃｕＡからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼはＹｆｉＱポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はデアセチラーゼである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼは、ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、デアセチラーゼはＣｏｂＢポリペプチドである。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させることで調節される。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、キシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸を合成する能力がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。
特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、およびリボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）からなる群から選択される。
その他の実施形態では、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。特定の実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質の活性が低下される。このような実施形態では、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されている。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が増大される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活性が低下される。いくつかの実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質の活が低下される。このような実施形態では、酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、および酢酸輸送体／酢酸ポンプ（ａｃｔＰ）からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組換え細胞は、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を増大させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が増大される。特定の実施形態では、増大される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ａｃｓ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、およびｐｇｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで、これらのタンパク質の１つまたは複数の活性が低下される。特定の実施形態では、低下される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、ｐｄｈＲ、ｇｌｔａ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる。
本明細書に記載される組換え細胞のいずれか１つの中では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸は、細胞の染色体に組み込まれる。
本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのその他の実施形態では、組換え細胞は、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびパントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａからなる群から選択される）。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、組換え細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、アセチルＣｏＡ由来産物の生産は、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して、増大される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書で開示される実施形態のいずれか１つの組換え細胞をアセチルＣｏＡ由来産物の生産に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）アセチルＣｏＡ由来産物を生産するステップとを含んでなる、アセチルＣｏＡ由来産物を生産する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）アセチルＣｏＡ由来産物を回収するステップをさらに含んでなる。
図１Ａは、４時間にわたる、ＹｆｉＱ遺伝子に欠失を有する細胞と対比した、対照野性型ＹｆｉＱ細胞の増殖（ＯＤ６００）を描写する。図１Ｂは、同細胞の一晩の増殖を描写する。 図１Ａは、４時間にわたる、ＹｆｉＱ遺伝子に欠失を有する細胞と対比した、対照野性型ＹｆｉＱ細胞の増殖（ＯＤ６００）を描写する。図１Ｂは、同細胞の一晩の増殖を描写する。 ４時間にわたる、ＹｆｉＱ遺伝子に欠失を有する細胞と対比した、対照野性型ＹｆｉＱ細胞のイソプレン比生産性を描写する。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で測定された、酢酸のブロス濃度を描写する。ＭＣＭ２７３２（ＹｆｉＱ欠失）（黒菱形）；ＭＣＳ１２２７（ＹｆｉＱ野性型）（白四角形）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で測定された、グルコース比取り込み速度を描写する。ＭＣＭ２７３２（ｙｆｉＱ欠失）（黒色菱形）；ＭＣＳ１２２７（ｙｆｉＱ野性型）（白色四角形）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、容積イソプレン生産性を描写する。ＭＣＭ２７３２（ｙｆｉＱ欠失）（黒色菱形）；ＭＣＳ１２２７（ｙｆｉＱ野性型）（白色四角形）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、グルコース上のイソプレンの累積収率を描写する。ＭＣＭ２７３２（ｙｆｉＱ欠失）（黒色菱形）；ＭＣＳ１２２７（ｙｆｉＱ野性型）（白四角形）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、細胞性能指数（ＣＰＩ）を描写する。ＭＣＭ２７３２（ｙｆｉＱ欠失）（黒色菱形）；ＭＣＳ１２２７（ｙｆｉＱ野性型）（白四角形）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、平滑化イソプレン比生産性を描写する。ＭＣＭ２７３２（ｙｆｉＱ欠失）（黒色菱形）；ＭＣＳ１２２７（ｙｆｉＱ野性型）（白四角形）。 唯一の炭素源としての様々な濃度の酢酸上で培養された、ｙｆｉＱ野性型およびｙｆｉＱ欠失イソプレン産生細胞の増殖速度を描写する。 唯一の炭素源としての様々な濃度の酢酸上で培養された、ｙｆｉＱ野性型およびｙｆｉＱ欠失イソプレン産生細胞のイソプレン比生産性を描写する。 唯一の炭素源としてのグルコース上で培養された、ｙｆｉＱ野性型およびｙｆｉＱ欠失イソプレン産生細胞増殖速度を描写する。 唯一の炭素源としてのグルコース上で培養された、ｙｆｉＱ野性型およびｙｆｉＱ欠失イソプレン産生細胞のイソプレン比生産性を描写する。 プラスミドｐＭＣＳ８２６ＰＫＬ１６（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ））のマップを描写する。 プラスミドｐＥＷＬ１４２１のマップを描写する。 プラスミドｐＭＣＳ１０１９のマップを描写する。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で測定された、酢酸のブロス濃度を描写する。全ての細胞は、ｙｆｉＱ欠失を有する。ＭＣＭ２７３２対照細胞（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種性発現およびｐｔａ過剰発現）（黒色菱形）；ＭＣＭ３１５１（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色四角形）；ＭＤ１２０６（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色三角形）；ＭＤ１２０７（Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（「ｘ」で標識された線）。 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、グルコース上のイソプレンの累積収率を描写する。全ての細胞は、ｙｆｉＱ欠失を有する。ＭＣＭ２７３２対照細胞（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ過剰発現）（黒色菱形）；ＭＣＭ３１５１（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色四角形）；ＭＤ１２０６（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色三角形）；．ＭＤ１２０７（Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（「ｘ」で標識された線） 経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られた、（４０時間にわたる）グルコース上のイソプレン収率を描写する。全ての細胞は、ｙｆｉＱ欠失を有する。ＭＣＭ２７３２対照細胞（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ過剰発現）（黒色菱形）；ＭＣＭ３１５１（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色四角形）；ＭＤ１２０６（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（白色三角形）；．ＭＤ１２０７（Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現およびｐｔａ欠失）（「ｘ」で標識された線） ａｃｔＰ欠失およびａｃｋＡ過剰発現対立遺伝子交換ベクターのマップを描写する。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の増殖速度（図２０Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２０Ｂ）、経時的ブロス酢酸（図２０Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２０Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の増殖速度（図２０Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２０Ｂ）、経時的ブロス酢酸（図２０Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２０Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の増殖速度（図２０Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２０Ｂ）、経時的ブロス酢酸（図２０Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２０Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の増殖速度（図２０Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２０Ｂ）、経時的ブロス酢酸（図２０Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２０Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２１Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２１Ｂ）、経時的に生じたイソプレン収率％（図２１Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２１Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２１Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２１Ｂ）、経時的に生じたイソプレン収率％（図２１Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２１Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２１Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２１Ｂ）、経時的に生じたイソプレン収率％（図２１Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２１Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２４５（ａｃｔＰ欠失）、およびＤＷ１２４５（ａｃｋＡ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２１Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２１Ｂ）、経時的に生じたイソプレン収率％（図２１Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２１Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ペントースリン酸経路上方制御対立遺伝子交換ベクターのマップを描写する。 ｐｆｋＡ下方制御対立遺伝子交換ベクターのマップを描写する。 最後のアミノ酸位置から３つ目に、イソロイシン（Ｉ）、アルギニン（Ｒ）、またはスレオニン（Ｔ）変異がある、ＰｆｋＡ：：ＴｍＲＮＡタンパク質分解タグを発現する細胞の増殖速度を描写する。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の増殖速度（図２５Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２５Ｂ）、ブ経時的ロス酢酸（図２５Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２５Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の増殖速度（図２５Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２５Ｂ）、ブ経時的ロス酢酸（図２５Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２５Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の増殖速度（図２５Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２５Ｂ）、ブ経時的ロス酢酸（図２５Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２５Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の増殖速度（図２５Ａ）、経時的二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）（図２５Ｂ）、ブ経時的ロス酢酸（図２５Ｃ）、および経時的ブロスＭＶＡ（図２５Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２６Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２６Ｂ）、経時的に生じたイソプレン％収率的（図２６Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２６Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２６Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２６Ｂ）、経時的に生じたイソプレン％収率的（図２６Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２６Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２６Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２６Ｂ）、経時的に生じたイソプレン％収率的（図２６Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２６Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）およびＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）の瞬間イソプレン／ＣＯ２生産（図２６Ａ）、経時的に生じたイソプレン力価（図２６Ｂ）、経時的に生じたイソプレン％収率的（図２６Ｃ）、および経時的イソプレン比生産性（図２６Ｄ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）、ＭＤ１２８６（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＩタグ）、ＭＤ１２８５（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＴタグ）、ＭＤ１２８７（（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＲタグ））の増殖速度（図２７Ａ）および経時的に生じたイソプレン力価（図２７Ｂ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 ＭＤ１２０７（対照）、ＭＤ１２８４（ＰＰＰ過剰発現）、ＭＤ１２８６（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＩタグ）、ＭＤ１２８５（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＴタグ）、ＭＤ１２８７（（ＰＰＰ過剰発現およびＰｆｋＡＲタグ））の増殖速度（図２７Ａ）および経時的に生じたイソプレン力価（図２７Ｂ）を描写する。全ての細胞は、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ異種発現があるｙｆｉＱおよびｐｔａ欠失である。 メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物を生成する細胞内の代謝を描写する。
本発明は、特に、タンパク質のアセチル化（「アセチル化タンパク質（ａｃｅｔｙｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」または「アセチル化タンパク質（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」）に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節するために遺伝子操作されている組換え微生物中で、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産を増大させる組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、特に、その中で１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が調節されている細胞を含んでなる、組換え微生物、またはそれらの子孫を提供する。これらのアセチル化タンパク質としては、制限なしに、アセチルトランスフェラーゼポリペプチド（アセチルトランスフェラーゼ）および／またはデアセチラーゼポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性は、前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が、低下、減衰、欠失または増大するように調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチド、Ｐａｔポリペプチド、ＡｃｕＡポリペプチド、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）アセチルトランスフェラーゼ（ｇｉ｜１６５０３８１０｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０５８３５．１｜配列番号５１）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＧＣＮ５ファミリーＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｇｉ｜４９９４７３１３５｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０１１１５９７７５．１｜配列番号５２）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）タンパク質アセチルトランスフェラーゼ（ＥＦＤ６６２４７配列番号５３）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）アセチルトランスフェラーゼ（ｇｉ｜１５６０８１３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２１５５１３．１｜配列番号５４）、およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アセチルトランスフェラーゼ（ｇｉ｜１１８４６８１８７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿８８９６９７．１｜配列番号５５）からなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＣｏｂＢポリペプチド、ＳｒｔＮポリペプチド、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＮＡＤ依存性デアセチラーゼ（ｇｉ｜１６７６４５７６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４６０１９１．１｜配列番号５６）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＮＡＤ依存性デアセチラーゼ（ｇｉ｜４９９４７１４３４｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０１１１５８０７４．１｜配列番号５７）、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＮＡＤ依存性タンパク質デアシラーゼ（ｇｉ｜６１４１０３４９４｜ｓｐ｜Ｐ９ＷＧＧ３．１｜ＮＰＤ＿ＭＹＣＴＵ配列番号５８）からなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子／核酸の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増大させることで、ＹｆｉＱポリペプチドの活性が調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増大させることで調節される。
本明細書で詳述されるように、アセチル化は、迅速に変化する条件に応答して、タンパク質の活性を調節しならびに遺伝子発現を制御するために、細胞によって使用される翻訳後修飾である（Ｃｅｒｅｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８２（５）：１１１０−２８）。細胞タンパク質のアセチル化は、細胞内で利用可能なアセチルＣｏＡのアセチル基を標的タンパク質上に転移するアセチルトランスフェラーゼ、およびタンパク質中のアミノ酸からアセチル基を除去するデアセチラーゼとして知られている酵素によって調節される。本明細書で開示されるように、本発明者らは、特に、細胞内アセチル化の制御に関与する遺伝子の調節が、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドをはじめとする、メバロン酸由来分子の生産に、ならびにアセチルＣｏＡ由来分子の生産に、実質的で驚くべき改善をもたらすことを発見した。
一態様では、本明細書で開示される組換え微生物は、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）であり、それは、１つまたは複数のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする核酸を異種発現するように、さらに遺伝子操作または修飾されている。メバロン酸依存性生合成経路は、イソプレノイド前駆体分子ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生産に、特に重要である。上流メバロン酸経路の酵素は、３つの酵素反応を通じて、アセチルＣｏＡをメバロン酸に変換する。理論に束縛されることなく、上流メバロン酸依存性生合成経路への導入のために細胞内で利用可能なアセチルＣｏＡの量の増大は、メバロン酸の細胞内濃度、ひいてはＤＭＡＰＰおよびＩＰＰなどの下流イソプレノイド前駆体分子の濃度を実質的に増大させると考えられる。したがってこれらの株によるメバロン酸生産の収量増大は、商業的応用に有利である。組換え微生物のあらゆる子孫もまた、本発明の範囲内であることが検討される。
さらに、細胞代謝中の炭素利用に関与する追加的な遺伝子の調節、またはアセチルＣｏＡの利用可能な細胞内供給に関与するとされるものもまた調節されて、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドの生産が改善されてもよい。これらとしては、より多くの炭素流がメバロン酸の生産に向かうように、代謝経路中の酵素活性を増大または低下させるように調節され得る、ホスホケトラーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸酵素および／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。その調節が、細胞内でメバロン酸の生産に向かう炭素流を増大させ得るその他の要素としては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、マグネシウム欠乏時ＲｓｓＢ活性インヒビタータンパク質、多剤排出ポンプＡｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのＡｃｒＡ成分、およびフマル酸および硝酸還元ＲＮＡが挙げられる。これは次に、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生産のためのより多くの基質をもたらし得る。したがって本出願の組成物および方法は、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、およびアセチルｃｏＡ由来産物の生産を増大させるために利用可能な微生物株の数、ならびに細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって生産されるこれらの化合物（例えば、メバロン酸）の量の双方において、当該技術分野で以前実施されていたものの改善に相当する。
一般技術
特に断りのない限り、本発明の実施は、当該分野の技術範囲内である、（組換え技術をはじめとする）従来の分子生物学技術、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学を採用する。このような技術は、文献、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，編．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，編，１９９４）．Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）で詳しく説明され、当業者に、本出願で使用される多くの用語について、一般的指針を提供する。
定義
「完全メバロン酸（ＭＶＡ）経路」または「全メバロン酸（ＭＶＡ）経路」という用語は、アセチルＣｏＡをピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換する、細胞代謝経路を指し、それは、酵素アセトアセチル補酵素Ａシンターゼ（例えば、チオラーゼ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａシンターゼ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）によって触媒される。
本明細書の用法では、「上流メバロン酸経路」または「上流ＭＶＡ経路」という用語は、酵素アセトアセチル補酵素Ａシンターゼ（例えば、チオラーゼ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａシンターゼ、および３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素によって触媒される、細胞内の一連の反応を指す。
「下流メバロン酸経路」または「下流ＭＶＡ経路」という用語は、酵素メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）によって触媒される、細胞内の一連の反応を指す。
「イソプレン」という用語は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃７８−７９−５）を指す。それは、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸除去からの、直接的および最終揮発性Ｃ５炭化水素生成物であり得る。これは、ＩＰＰ分子のＤＭＡＰＰ分子への結合または重合を伴わなくてもよい。「イソプレン」という用語は、本明細書で特に断りのない限り、通常、その生産方法に限定されることは意図されない。
本明細書の用法では、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、および融合ポリペプチドを含む。
本明細書の用法では、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、５０以上の異なるポリペプチドライブラリーなどのポリペプチドライブラリーの一部でなく、それが自然界で一緒に存在する少なくとも１つの構成要素から分離される。単離ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得られ得る。
「異種ポリペプチド」とは、宿主細胞とは異なる生物、種、または株に由来する核酸配列によってコードされる、ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、自然界で同一宿主細胞に見られる、野生型ポリペプチドと同じでない。
本明細書の用法では、「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のどちらかで、共有結合的に共に連結した２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。
「組換え核酸」とは、それに関心のある核酸が由来する生物の天然ゲノム中で、関心のある核酸の側面に位置する１つまたは複数の核酸（例えば、遺伝子）を含まない、関心のある核酸を意味する。したがって用語は、例えば、ベクターに、自己複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物ゲノムＤＮＡに、組み込まれた組換えＤＮＡ、またはその他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じる、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。
「異種核酸」は、宿主細胞とは異なる生物、種または株に由来する核酸配列を意味する。いくつかの実施形態では、異種核酸は、天然で同一宿主細胞に見られる野生型核酸と同じでない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に形質転換されまたは組み込まれたｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子によってコードされる核酸は、異種核酸である。
本明細書の用法では、「発現調節配列」は、興味深い核酸の転写を誘導する核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成的または誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現調節配列は、「天然」または異種であり得る。天然発現調節配列は、発現される遺伝子と同じ生物、種、または株に由来する。異種発現調節配列は、発現される遺伝子と異なる生物、種、または株に由来する。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節下において、活性のプロモーターである。
「作動可能に連結する」とは、核酸発現制御配列（プロモーターなど）と第２の核酸配列の間の機能的連結を意味し、発現調節配列は、第２の配列に対応する、核酸の転写を誘導する。
本明細書の用法では、「最少培地（単数）」または「最少培地（複数）」という用語は、細胞増殖で可能な最少栄養素を含有して、通常はアミノ酸が不在である増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、（１）微生物（例えば、細菌、真菌、または藻類細胞）増殖のための炭素源；（２）微生物（例えば、細菌)種および増殖条件間で変動し得る様々な塩；および（３）水を含有する。炭素源は、下でより詳細に考察されるように、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などの他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、著しく変動し得る。塩は、通常、マグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの必須元素を提供して、細胞がタンパク質および核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、特定のプラスミドの維持などについて選択するために、抗生物質などの選択的薬剤によって補足し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性があれば、抵抗性を欠く細胞が増殖するのを防ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択するために、必要に応じて、その他の化合物で補足し得る。
本明細書の用法では、「イソプレノイド」という用語は、各単位が特定パターンに配列された５つの炭素原子からなる、２つ以上の炭化水素単位から構成される天然有機化合物クラスの大規模かつ多様なクラスを指す。本明細書の用法では、「イソプレン」は、「イソプレノイド」の定義から明示的に除外される。
本明細書の用法では、「テルペノイド」という用語は、多様な様式で構築および修飾されて、グループ構成員中で使用されるイソプレノイド単位数に基づいてグループ分けされた、五炭素イソプレノイド単位に由来する有機分子の大規模かつ多様なクラスを指す。ヘミテルペノイドは、１つのイソプレノイド単位を有する。モノテルペノイドは、２つのイソプレノイド単位を有する。セスキテルペノイドは、３つのイソプレノイド単位を有する。ジテルペノイドは、４つのイソプレン単位を有する。セスタテルペノイドは、５つのイソプレノイド単位を有する。トリテルペノイドは、６つのイソプレノイド単位を有する。テトラテルペノイドは、８つのイソプレノイド単位を有する。ポリテルペノイドは、８つを超えるイソプレノイド単位を有する。
本明細書の用法では、「イソプレノイド前駆体」は、テルペノイドまたはイソプレノイドの生合成において、生物によって使用される任意の分子を指す。イソプレノイド前駆体分子の非限定的例としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）が挙げられる。
本明細書の用法では、「質量収率」という用語は、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって消費されたグルコース質量で除して１００を乗じた、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって生産された産物の質量を指す。
「比生産性」とは、生成物生成時間、細胞密度、および培養物容積で除した、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって生成された生成物の質量を意味する。
「力価」は、培養液の容積で除した、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって生成された生成物の質量を意味する。
本明細書の用法では、「細胞生産性指標（ＣＰＩ）」という用語は、培養物中に生じた細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）の質量で除した、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）によって産生された生成物の質量を指す。
本明細書の用法では、「アセチルＣｏＡ由来産物」という用語は、アセチルＣｏＡに由来する二次代謝産物を指す。二次代謝産物の例としては、脂肪酸、フェノール、プロスタグランジン、マクロライド抗生物質、イソプレン、およびイソプレノイドが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書の用法では、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別段の記載がない限り、複数への言及を含む。
本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最大数値限界は、あたかもより低い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより低い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体を通じて示されるあらゆる最小数値限界は、あたかもより高い数値限界が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより高い数値限界を含む。本明細書全体を通じて示されるあらゆる数値範囲は、あたかもより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲に含まれるあらゆるより狭い数値範囲を含む。
細胞アセチル化機構の調節
タンパク質中の残基のアセチル化は、原核および真核細胞全体を通じて見られる翻訳後修飾である。リジン残基のアセチル化は、観察される一般的な翻訳後修飾である。翻訳後修飾として、アセチル化は、迅速に変化する条件に応答してタンパク質の活性を調節し、ならびに遺伝子発現を制御するために、細胞によって使用され得る（Ｃｅｒｅｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８２（５）：１１１０−２８）。細胞タンパク質のアセチル化は、アセチルＣｏＡ分子のアセチル基を標的タンパク質上に転移する、アセチルトランスフェラーゼ（アセチルＣｏＡ依存性アセチルトランスフェラーゼまたはＧｃｎ５様タンパク質Ｎ−アセチルトランスフェラーゼなど、例えばＹｆｉＱ）として知られている酵素によって調節される。本明細書の用法では、「ＹｆｉＱ」という用語は、「タンパク質リジンアセチラーゼ」または「ｐｋａ」という用語と同義的に使用され得るｙｆｉＱによってコードされる、アセチルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。対照的に、細胞内タンパク質の脱アセチル化は、ＮＡＤ＋依存性（Ｓｉｒ２様）タンパク質デアセチラーゼ（サーチュインとしてもまた知られている、例えばＣｏｂＢ）などのデアセチラーゼとして知られている酵素によって調節される。
微生物におけるタンパク質アセチル化の１つの重要な標的は、ＡＭＰ形成アセチル補酵素Ａシンセターゼ（Ａｃｓ）であり、これは酢酸から中央代謝のキーストーン分子である高エネルギー中間体アセチルＣｏＡへの変換に関与する、遍在性酵素である（Ｃｅｒｅｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８２（５）：１１１０−２８）。ＣｏｂＢのデアセチラーゼの活性は、生体外においてＡｃｓ上で実証さている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３７：７３１−４１）。理論に束縛されることなく、Ａｃｓのアセチル化はその酵素的不活性化をもたらすので、Ａｃｓアセチル化の量を低下させるように遺伝子操作された細胞は、より大量のアセチルＣｏＡを産生することが予期され得る。
細胞内タンパク質アセチル化に関与する経路を遺伝子操作することで、組換え微生物は、調節された内在性アセチルトランスフェラーゼおよび／またはデアセチラーゼ遺伝子発現またはタンパク質活性を有しない微生物と比較して、酢酸の産生量が低下し得る。酢酸の産生量の低下は、当業者に公知の日常的アッセイによって測定され得る。酢酸の量低下は、アセチル化タンパク質の１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる細胞と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり、前記細胞は、核酸発現および／またはアセチル化タンパクの活性が調節されるように遺伝子操作されている。
アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱ（ｐｋａ）、Ｐａｔ、またはＡｃｕＡなどであるが、これに限定されるものではない）またはデアセチラーゼ（ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮなどであるが、これに限定されるものではない）の活性はまた、タンパク質活性または遺伝子発現の分子操作によって低下され得る。タンパク質活性または遺伝子発現の低下は、操作が実施されていない場合と比較した、遺伝子発現、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％低下される。
アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱ（ｐｋａ）、Ｐａｔ、またはＡｃｕＡなどであるが、これに限定されるものではない）またはデアセチラーゼ（ＣｏｂＢおよびＳｒｔＮなどであるが、これに限定されるものではない）の活性はまた、タンパク質活性または遺伝子発現の分子操作によって増大され得る。タンパク質活性または遺伝子発現の増大は、操作が実施されていない場合と比較した、遺伝子発現、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性の増大は、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、７５０％、１０００％以上増大される。
いくつかの実施形態では、前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性は、前記１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性が、減衰、欠失または増大するように調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質は、ＹｆｉＱポリペプチドおよびＣｏｂＢポリペプチドからなる群から選択される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＹｆｉＱポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増大させることで、ＹｆｉＱポリペプチドの活性が調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アセチル化タンパク質はＣｏｂＢポリペプチドである。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで調節される。本明細書で開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増大させることで調節される。
場合によっては、アセチルトランスフェラーゼおよび／またはデアセチラーゼ遺伝子の活性（転写時（すなわち、遺伝子発現）および／または翻訳レベル（すなわち、タンパク質活性）のどちらかの調節は、アセチルトランスフェラーゼおよび／またはデアセチラーゼ活性の調節を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路に向かうより多くの炭素流をもたらす。
メバロン酸産生能力がある組換え細胞
メバロン酸依存性生合成経路（ＭＶＡ経路）は、全ての高等真核生物および特定の細菌に存在する、主要代謝経路である。タンパク質プレニル化、細胞膜保守、タンパク質固着、およびＮ−グリコシル化などの多様なプロセスで使用される分子の生成に重要であるのに加えて、メバロン酸経路は、テルペン、テルペノイド、イソプレノイド、およびイソプレン生合成のための基礎原料の役割を果たす、イソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの主要な供給源を提供する。
ＭＶＡ経路の上流部分では、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素活性のいずれかを有するポリペプチドの作用によって、細胞代謝中に生成されたアセチルＣｏＡがメバロン酸に変換される。最初に、アセチルＣｏＡが、チオラーゼの作用によって、アセトアセチルＣｏＡに変換される。次に、アセトアセチルＣｏＡが、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの酵素作用によって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換される。このＣｏＡ誘導体は、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素によってメバロン酸に還元され、これはイソプレノイド生産のメバロン酸経路の律速段階である。メバロン酸は、次にメバロン酸キナーゼ作用によって、メバロン酸５−リン酸に変換され、それは引き続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性によって、メバロン酸５−ピロリン酸に変換される。最後に、メバロン酸５−ピロリン酸デカルボキシラーゼ酵素の活性によって、メバロン酸５−ピロリン酸からＩＰＰが生成される。
いくつかの態様では、本明細書で言及される酵素のいずれかの調節は、発現（例えば、転写または翻訳）、生産、翻訳後修飾または任意のその他の酵素機能に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞内の酵素機能（例えば、触媒能力）は、このような調節のために遺伝子操作されていない細胞と比較して、増大または低下される。一実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作されていない細胞と比較して増大される。別の実施形態では、酵素機能（例えば、活性）は、遺伝子操作されていない細胞と比較して低下される。
上流および下流ＭＶＡ経路からの酵素のいずれでも、本明細書に記載される遺伝子操作宿主細胞との組み合わせで使用されてもよい。ＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ｎｐｈＴ７）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸（ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＭＶＡ経路ポリペプチドの２つ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路核酸としては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
使用され得るＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定的例は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット；国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットに記載される。
ｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする遺伝子
いくつかの微生物（Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、およびＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）などであるが、これに限定されるものではない）において、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。事実上、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真正細菌中で発見された最初のＩＰＰ生合成の二機能性酵素、および天然で別のタンパク質に融合するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の最初の例に相当する（Ｈｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２ Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６−２１２２）。他方、ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。異なる細菌種、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子が、以前、メバロン酸を生産するために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に組み込まれている（その開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６：１４８７−１４９１，２００４）。
したがって、細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞）は、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子（Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）に由来するｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子などであるが、これに限定されるものではない）を発現するように遺伝子操作されて、メバロン酸の生産量、ピーク力価、および細胞生産性が増大され得る。１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子の異種発現で、遺伝子の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする任意の遺伝子が、本発明で使用され得る。特定の実施形態では、ｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子（Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはＥ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）に由来するｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子などであるが、これに限定されるものではない）様々な選択肢が、単独で、または上流ＭＶＡ経路からのタンパク質をコードする１つまたは複数のその他のｍｖａＥおよびｍｖａＳ遺伝子との組み合わせで、本発明の範囲内で検討される。したがって、特定の態様では、表１で検討される遺伝子のいずれかの組み合わせが、上に記載される様式のいずれかで、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内で発現され得る。
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例示的なＭｖａＥポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の双方を持つポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるポリペプチドのチオラーゼ活性が、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ポリペプチドのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する。例示的なＭｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、ＭｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
変異ＭｖａＥポリペプチドとしては、ＭｖａＥポリペプチド活性（すなわちアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力、ならびに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的であり得て、このような置換アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされ得て、またはコードされ得ない。標準的な２０のアミノ酸「アルファベット」が、それらの側鎖類似性に基づいて、化学物質ファミリーに分類されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のあるアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。「非保存的アミノ酸置換」は、その中でアミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち塩基性側鎖を有するアミノ酸が、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸で置換される）。
ＭｖａＥポリペプチド内にアミノ酸置換を導入して、分子の機能性を改善し得る。例えば、基質に対するＭｖａＥポリペプチドの結合親和性を増大させ、またはアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改善するアミノ酸置換をＭｖａＥポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ＭｖａＥポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドを生成するために、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥタンパク質を使用し得る。使用し得る、分解されないまたは分解を起こしにくいｍｖａＥの遺伝子産物の例としては、生物Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびＬ．グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）からのものが挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者は、任意の標準的分子生物学的技術によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中でｍｖａＥタンパク質を発現させて、断片の不在を探し得る。例えば、断片の不在は、Ｈｉｓタグ媒介精製に続いて、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で同定し得て、またはメバロン酸、イソプレン、またはイソプレノイド産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１内で発現される場合は、本明細書に記載される検出方法を使用して同定し得る。
Ｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２年４月；１８４（８）：２１１６−２１２２）に記載されるものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼならびにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性が、分光光度計によって測定され、アセトアセチルＣｏＡの形成またはチオ開裂に伴う３０２ｎｍにおける吸光度の変化が、モニターされる。アセトアセチルＣｏＡの合成を判定するための各反応の標準アッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス、ｐＨ１０．５であり、反応は酵素の添加によって開始される。アッセイは、２００μＬの最終容量を採用し得る。アッセイでは、１酵素単位（ｅｕ）が、１分間の１μｍｏｌアセトアセチルＣｏＡ中の合成またはチオ開裂に相当する。別の例示的なアッセイでは、分光光度計によって、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＰ（Ｈ）の出現または消失によって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性をモニターし得る。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元脱アシル化を示すために測定される各反応の標準アッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ、および１００ｍＭのＫｘＰＯ４、ｐＨ６．５である。アッセイは、２００μＬの最終容量を採用する。反応は、酵素を添加することで開始される。アッセイでは、１ｅｕは、１分間の１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）中の代謝回転に相当する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡまたはメバロン酸の代謝回転に相当する。
代案としては、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号明細書Ａ１を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に、培養物を接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次にプレートをＢｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
例示的なｍｖａＥ核酸としては、ｍｖａＥポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭｖａＥポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なＭｖａＥ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、および／またはエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から単離されたｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号３と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号７と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号１８と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。本明細書の態様のいずれにおいても、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、配列番号１〜８および１８〜１９のいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％配列同一性がある核酸によってコードされてもよい。本明細書の態様のいずれにおいても、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、配列番号１〜８および１８〜１９のいずれか１つがある核酸によってコードされてもよい。
代表的ＭｖａＥポリペプチドとしては、少なくとも１つのＭｖａＥポリペプチド活性を有する、ポリペプチド、ペプチド、または融合ポリペプチドの断片が挙げられる。代表的ｍｖａＥポリペプチドとしては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する天然ポリペプチド、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドが挙げられる。代表的ＭｖａＥポリペプチドとしては、例えば、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離される、ＭｖａＥポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイー（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１１と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１１と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１３と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１３と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号９と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号９と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１５と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。別の態様では、エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ遺伝子によってコードされるＭｖａＥポリペプチドは、配列番号１５と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。本明細書の態様のいずれにおいても、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、配列番号９〜１６および２０〜２１のいずれか１つと、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％配列同一性があるポリペプチドによってコードされてもよい。本明細書の態様のいずれにおいても、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、配列番号９〜１６および２０〜２１のいずれか１つがあるポリペプチドによってコードされてもよい。
ｍｖａＥ核酸は、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＥ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＥ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）に変換し得る。例示的なＭｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、ＭｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
変異ＭｖａＳポリペプチドとしては、ＭｖａＳポリペプチド活性（すなわちアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力）を保ちながら、その中で１つまたは複数のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けたものが挙げられる。ＭｖａＳポリペプチドにアミノ酸置換を導入して、分子機能性を改善し得る。例えば、ＭｖａＳポリペプチドの基質に対する結合親和性を増大させ、またはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡに変換する能力を改善するアミノ酸置換を、ＭｖａＳポリペプチドに導入し得る。いくつかの態様では、変異ＭｖａＳポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含有する。
Ｑｕａｎｔ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，１９８９，２６２：１５９−１６４）に記載されるものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を測定することで、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なアッセイでは、３０３ｎｍにおける吸光度の変化をモニターすることで、アセトアセチルＣｏＡのエノール形態の消失を分光光度的に測定することで、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアッセイし得る。３０℃で、５０ｍｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する、標準１ｍＬアッセイシステム；５ｍＭ−アセチルリン酸、１０，ＭアセトアセチルＣｏＡ、および５ｕｌの抽出物サンプルを添加し得て、アセチルＣｏＡ（１００μＭ）および１０単位のＰＴＡの同時添加がそれに続く。次にＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性をアセチルＣｏＡ添加前後の速度差として測定する。使用された条件下（ｐＨ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）におけるアセトアセチルＣｏＡの吸収係数は、１２．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１である。定義上、１単位の酵素活性は、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡの変換を引き起こす。
代案としては、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内のメバロン酸の生成は、制限なしに、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開第２００５／０２８７６５５Ａ１号明細書を参照されたい）またはＨＰＬＣ（米国特許出願第１２／９７８，３２４号明細書を参照されたい）によって測定し得る。例示的なアッセイとして、培養物を、１つまたは複数の抗生物質で補足されたＬＢブロスを含有する振盪管に接種して、３４℃、２５０ｒｐｍで、１４時間培養し得る。次に、１％グルコース、０．１％酵母抽出物、および２００μＭのＩＰＴＧで補足されたＴＭ３培地を含有するウェルプレート内で、培養物を０．２の最終ＯＤに希釈し得る。次に、プレートをＢｒｅａｔｈ Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で密封し、振盪機／インキュベーター内で、３４℃、６００ｒｐｍで２４時間培養する。次に、１ｍＬの各培養物を３，０００×ｇで５分間遠心分離する。次に、上清を２０％硫酸に添加して、氷上で５分間インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分間遠心分離して、ＨＰＬＣ分析のために上清を収集する。サンプル中のメバロン酸濃度は、メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較することで判定される。グルコース濃度は、当該技術分野で公知のいずれかの方法に従って、グルコースオキシダーゼアッセイを実施することでさらに測定し得る。ＨＰＬＣを使用して、各サンプルの屈折率応答と、既知濃度の様々なメバロン酸を含有する溶液を通過させて得られる検量線とを比較することにより、メバロン酸レベルを定量化し得る。
例示的なｍｖａＳ核酸としては、ｍｖａＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なｍｖａＳ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離されたｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号２と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸はまた、配列番号２と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号４と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号６と少なくとも約２％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号８と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。
代表的ＭｖａＳポリペプチドとしては、少なくとも１つのＭｖａＳポリペプチド活性を有する、ポリペプチド、ペプチド、または融合ポリペプチドの断片が挙げられる。代表的ｍｖａＳポリペプチドとしては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する天然ポリペプチドおよびポリペプチド、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドが挙げられる。代表的ＭｖａＳポリペプチドとしては、例えば、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２、および／またはエンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）から単離される、ＭｖａＳポリペプチドが挙げられる。リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１２と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）ＤＳＭ ２０６０１ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドはまた、配列番号１２と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１４と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１４と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１０と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２ ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１０と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１６と、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、または８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ遺伝子によってコードされるＭｖａＳポリペプチドは、配列番号１６と、少なくとも約８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し得る。
ｍｖａＳ核酸は、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内で、マルチコピープラスミド上で発現させ得る。プラスミドは、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド、または中程度コピー数プラスミドであり得る。代案としては、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込み得る。プラスミド上の、または宿主細胞の染色体に組み込まれた部分としての双方の、ｍｖａＳ核酸の異種性発現で、核酸の発現は、誘導性プロモーターまたは構成的発現プロモーターのどちらかによって駆動され得る。プロモーターは、ｍｖａＳ核酸発現の強力な駆動機構であり得て、それは発現の弱い駆動機構であり得て、またはそれは発現の中程度の駆動機構であり得る。
アセトアセチルＣｏＡシンターゼポリペプチドをコードする核酸
一態様では、本明細書に記載される細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）のいずれかは、アセトアセチルＣｏＡシンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の異種核酸を含有し得る。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（別名ｎｐｈＴ７）は、マロニルＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する活性を有して、２つのアセチル−ＣｏＡ分子からアセトアセチル−ＣｏＡを合成する最小の活性（例えば、皆無の活性）を有する酵素をコードする遺伝子である。ｎｐｈＴ７に関する教示については、例えば、その内容を本明細書に明示的に援用する、Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｖｏｌ １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５−１１２７０（２０１０）を参照されたい。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０株の放線菌類に由来するアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、そのそれぞれの開示が参照により本明細書に援用される、特開第２００８−６１５０６Ａ号公報、および米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号明細書に記載される。アセトアセチルＣｏＡシンターゼはまた、アセチル−ＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素とも称され得る。使用され得る代表的なアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（またはアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）は、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ５４０１３１．１である。
一態様では、本発明のアセトアセチルＣｏＡシンタ−ゼは、不可逆反応を通じて、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する。アセチルＣｏＡを生成するためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼの使用は、この反応が不可逆的でありながら、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成するアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の作用は可逆的である、という追加的な利点を提供する。その結果、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成するためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼの使用は、同一最終生成物を生成するためのチオラーゼの使用と比較して、イソプレンの生産性に顕著な改善をもたらし得る。
さらに、イソプレンを生産するためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼの使用は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼがマロニルＣｏＡの脱炭酸を通じて、マロニルＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換し得るという別の利点を提供する。したがって、出発基質の貯蔵は、アセチルＣｏＡの出発量によって制限されない。出発基質がマロニルＣｏＡのみの場合でも、アセトアセチルＣｏＡシンターゼによるアセトアセチルＣｏＡの合成はなおも起こり得る。一態様では、より多くのマロニルＣｏＡを有する宿主株を使用して、出発マロニルＣｏＡのプールが増大される。このような貯留の増大は、自然発生的であり、または分子操作によって操作され得る。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５８３１−５８３９（２００９）を参照されたい。
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれにおいても、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用し得る。このような酵素の非限定的例は、本明細書に記載される。本明細書に記載される特定の実施形態では、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有する、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の放線菌に由来するアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用し得る。
このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子の一例は、る配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。このようなタンパク質は、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼに対応する配列番号１７のアミノ酸配列を有し、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しない。
一実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株の放線菌類から入手されるゲノムＤＮＡをテンプレートとして、および特開第２００８−６１５０６Ａ号公報を参照してデザインし得る１対のプライマーを使用して、核酸増幅法（例えばＰＣＲ）によって得られ得る。
本明細書に記載されるように、本発明で使用するためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株の放線菌類からの配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に限定されない。マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有して、２つのアセチルＣｏＡ分子からアセトアセチルＣｏＡを合成しない、タンパク質をコードする任意の遺伝子を本明細書に記載する方法で使用し得る。特定の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、配列番号１７のアミノ酸配列と高度に類似し、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有して、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であり得る。「高度に類似」または「実質的に同一」という表現は、例えば、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％の同一性を指す。上で使用されるように、同一性は、異なるアミノ酸配列および配列番号１７のアミノ酸配列中のアミノ酸残基間の同一性の百分率に相当し、それは配列類似性を検索するプログラムを使用して、配列番号１７および異なるアミノ酸配列の、アミノ酸配列のアライメントを実施することで計算される。
その他の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、１つ以上アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって、配列番号１７のアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を有し、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有する、タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本明細書では、「より多くのアミノ酸」という表現は、例えば、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは２〜５個のアミノ酸を指す。
なおも別の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの部分または全体とハイブリダイズでき、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するタンパク質をコードできる、ポリヌクレオチドからなってもよい。本明細書では、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下における結合維持に相当する。ハイブリダイゼーションは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に記載される方法などの従来の既知の方法によって実施し得る。
本明細書に記載されるように、配列番号１７のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種ＣＬ１９０株から得られたのではない放線菌類などの、潜在的にあらゆる生物から単離し得る。さらに、本明細書の用途のためのアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子は、当該技術分野で知られている方法によって、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを改変することで得られ得る。ヌクレオチド配列の変異誘発は、クンケル法またはギャップド二本鎖法、またはそれらのどちらかに類似した方法などの既知の方法によって実施し得る。例えば、変異誘発は、変異誘発キット（例えば製品名；Ｍｕｔａｎｔ−ＫおよびＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ））、部位特異的変異誘発のための製品名；ＬＡ ＰＣＲ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ）などを使用して、実施してもよい。
配列番号１７のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡシンターゼの活性は、下述するように評価し得る。具体的には、評価されるタンパク質をコードする遺伝子を、その中で遺伝子が発現し得るように、最初に宿主細胞に導入し、クロマトグラフィーなどの技術によるタンパク質の精製がそれに続く。評価される得られたタンパク質含有する緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡを添加し、例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）での培養がそれに続く。反応完了後、失われた基質量および／または生成された生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を判定する。したがって試験されるタンパク質が、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するかどうかを評価し、合成程度を評価することが可能である。このような場合、評価される得られたタンパク質を含有する緩衝液に、基質としてアセチルＣｏＡのみを入れて、失われた基質量および／または生成された生成物量を同様に判定することで、タンパク質が２つのアセチルＣｏＡ分子から、アセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有するかどうかを調べることが可能である。
メバロン酸の生産増大能力がある組換え微生物
本明細書に記載される組換え微生物（例えば、組換え細菌、真菌、または藻類細胞）は、本明細書に記載される様々な遺伝子または酵素経路に対するいかなる操作もない同一細胞を上回る量および／または濃度で、メバロン酸を産生する能力を有する。メバロン酸に向かう炭素流を増大させるために、本明細書に記載される様々な経路の調節のために遺伝子操作されている組換え微生物（例えば、細菌細胞）が、メバロン酸を生産するために使用され得る。いくつかの態様では、細胞は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含有し、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。アセチル化タンパク質は、アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱなどであるが、これに限定されるものではない）および／またはデアセチラーゼ（ＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）であり得る。いくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで（内在性ｙｆｉＱ遺伝子の欠失などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢタンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることで（内在性ｃｏｂＢ遺伝子の発現の増大、またはｃｏｂＢをコードする核酸の異種発現などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の態様では、本明細書に記載される組換え細胞を適切な培地中で培養することは、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含まない、メバロン酸を産生する能力がある細胞と比較して、改善されたメバロン酸の生産をもたらし、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。その他の実施形態では、改善されたメバロン酸の生産は、メバロン酸比生産性の増大、メバロン酸力価の増大、メバロン酸収率の増大、細胞生存率の増大、および／または酢酸生成量の低下の１つまたは複数によって特徴付けられる。
一態様では、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている本明細書に記載される組換え細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されていない同一細胞を上回る濃度で、メバロン酸を産生する能力を有する。細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、包括的に、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、または２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤを超えて、ならびにこれら数字の間の任意の数値メバロン酸を産生し得る。例示的一実施形態では、細胞は、約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤを超えるメバロン酸を産生し得る。
核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている宿本明細書に記載される主細胞（細菌、真菌、または藻類細胞などの）は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されていない同一細胞と比較して、より高いピーク力価のメバロン酸を生産する能力を有する。別の態様では、細本明細書に記載される胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含有するように修飾されていない同一細胞よりも高いピーク力価でメバロン酸を産生し、前記タンパク質は、適切な培地中で培養されると、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、４８時間の発酵後に、包括的に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２０ｇ／Ｌ、２３０ｇ／Ｌ、２４０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２６０ｇ／Ｌ、２７０ｇ／Ｌ、２８０ｇ／Ｌ、２９０ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌを超えるピーク力価、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。例示的な一実施形態では、細胞は、４８時間の発酵後に、約１０５ｇ／Ｌのピーク力価を超えるメバロン酸を産生する。
核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている宿本明細書に記載される主細胞（細菌、真菌、または藻類細胞などの）は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されていない同一細胞と比較して、より高い細胞生産性指数（ＣＰＩ）を生じる能力を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含有するように修飾されていない同一細胞よりも高いＣＰＩを有し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。一態様では、細胞は、最少培地中で培養され得る。細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、メバロン酸について、包括的に、少なくとも約１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）、または３０（ｇ／ｇ）、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。例示的一実施形態では、細胞は、メバロン酸について少なくとも約４．５（ｇ／ｇ）のＣＰＩを有する。
核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている宿本明細書に記載される主細胞（細菌、真菌、または藻類細胞などの）は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されていない同一細胞と比較して、より高い質量収率のメバロン酸を生産する能力を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質前記タンパク質を含有するように修飾されていない同一細胞よりも、グルコースからのメバロン酸のより高い質量収率を有し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。一態様では、細胞は、最少培地中で培養され得る。細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、グルコースから、包括的に、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、または５５％、ならびにこれらの数字の間の任意の数値の質量収率のメバロン酸を産生し得る。例示的一実施形態では、細胞は、グルコースから、少なくとも約３８％質量収率のメバロン酸を産生する。
組換え細胞を使用して多量のメバロン酸を生産する方法。
本明細書でまた提供されるのは、メバロン酸を生産する方法である。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、（ａ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなるように修飾されている組換え細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）を含んでなる組成物を培養するステップと、（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり、前記タンパク質は、本明細書に記載されるように、（上に記載される細菌細胞などの細胞のいずれかをはじめとする）またはメバロン酸を産生する能力があるそれらの子孫の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸の生産に適した条件下で、本明細書に記載される組換え細胞のいずれかを培養して、組換え細胞にメバロン酸を産生させるステップとを含んでなる。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
メバロン酸を生産する方法はまた、（ａ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質を異種性に発現する細胞を培養するステップと、（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。さらに、細胞は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質が欠損している同一細胞を上回る濃度でメバロン酸を産生し得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。
メバロン酸は、包括的に、約３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１１０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１２０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１３０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１４０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１５０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１６０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１７０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１８０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、１９０ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ、または２００ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤを超えるメバロン酸、ならびにこれらの数字の間の任意の数値の量で生産され得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。例示的一実施形態では、本メバロン酸生産方法は、約８５ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤを超えるメバロン酸を生産し得る。
メバロン酸を生産する方法は同様に、（ａ）本明細書に記載されるように、メバロン酸に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されている細胞を培養するステップと、（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、細胞は１つまたは複数のアセチル化タンパク質を異種発現し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作された細胞は数時間の発酵後に、１つまたは複数のアセチル化タンパク質が欠損している同一細胞よりも高いピーク力価でメバロン酸を産生し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。
本明細書で提供される細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、包括的に、４８時間の発酵後に、約５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、または２００ｇ／Ｌを超えるピーク力価、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のメバロン酸を産生し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。例示的一実施形態では、本メバロン酸生産方法は、４８時間の発酵後に、約１０５ｇ／Ｌを超えるピーク力価のメバロン酸を生産し得る。
メバロン酸を生産する方法は同様に、（ａ）本明細書に記載されるように、メバロン酸に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されている細胞を培養するステップと、（ｂ）メバロン酸を生産するステップとを含んでなり得て、細胞は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなり、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。細胞は、１つまたは複数の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする上流ＭＶＡ経路遺伝子の１つまたは複数のコピーが欠損しメバロン酸生産に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されていない同一細胞よりも高い、メバロン酸ＣＰＩを有する。例示的一実施形態では、本メバロン酸生産方法は、メバロン酸について少なくとも４．５（ｇ／ｇ）のＣＰＩがある細胞を使用して、メバロン酸を生産し得る。代案としては、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞などの）は、包括的に、少なくとも１（ｇ／ｇ）、２（ｇ／ｇ）、３（ｇ／ｇ）、４（ｇ／ｇ）、５（ｇ／ｇ）、６（ｇ／ｇ）、７（ｇ／ｇ）、８（ｇ／ｇ）、９（ｇ／ｇ）、１０（ｇ／ｇ）、１１（ｇ／ｇ）、１２（ｇ／ｇ）、１３（ｇ／ｇ）、１４（ｇ／ｇ）、１５（ｇ／ｇ）、２０（ｇ／ｇ）、２５（ｇ／ｇ）、または３０（ｇ／ｇ）、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のＣＰＩを有し得る。いくつかの態様では、メバロン酸を生産する方法は、メバロン酸を回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書で提供されるのは、上述の細胞のいずれかを使用して、メバロン酸の生産を向上させる方法である。細胞によるメバロン酸の生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現によって向上され得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。メバロン酸の生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現がない細胞によるメバロン酸の生産と比較して、約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上され得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。
イソプレンの産生が可能な組換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、幅広い用途で利用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造をはじめとする、多数の化学薬品組成物およびポリマーの合成において、中間体または出発原料として用いられる。イソプレンはまた、多数の植物および動物によって天然に合成される重要な生物学的材料である。
イソプレンは、イソプレンシンターゼの酵素作用によって、ＤＭＡＰＰから生成される。そのため、理論に束縛されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）内のメバロン酸の細胞産生を増大させることは、より大量のイソプレン生産も同様にもたらすと考えられる。グルコースからのメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼの、およびイソプレンおよびイソプレノイド生産のためのその他の適切な酵素の、適切な酵素活性レベルと組み合わせると、グルコースから生成されるイソプレノイド前駆体およびイソプレンを含むイソプレノイドのより高いモル収率につながる。
イソプレンの生産は、酵素活性が調節されてイソプレン生産に向かう炭素流が増大するように酵素経路の１つまたは複数が操作されている、明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを使用して実施され得る。メバロン酸生成への炭素流動増大のために操作された様々な酵素経路を有する、本明細書に記載される組換え微生物を使用して、イソプレンが生産され得る。上に記載されるメバロン酸の生産増大能力がある、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を発現する（前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている）組換え宿主細胞のいずれも、イソプレンの生産増大能力があり得る。いくつかの態様では、これらの細胞は、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸とをさらに含んでなる。その他の態様では、これらの細胞は、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチドをさらに含んでなる。
下流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される細胞または方法のいずれかに記載される細胞は、下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
下流メバロン酸生合成経路は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）をさらに含んでなり得る。本明細書で提供される細胞は、イソプレンシンターゼ、１つまたは複数の上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／または１つまたは複数の下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸を含んでなり得る。下流ＭＶＡ経路のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する；（ｂ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する；および（ｃ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、Ｍ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群に由来し得る。別の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼである。
いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、強力プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路をコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、異種下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）からのポリペプチドである。
下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれ得て、または細胞内で安定して発現され得る。下流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター上にさらに存在し得る。
例示的な下流ＭＶＡ経路ポリペプチドを以下にさらに提供する：（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；および（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）。具体的には、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）に由来し得て、より具体的には、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）に由来し得る。他の態様では、下流ＭＶＫポリペプチドは、Ｍ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）に由来し得る。下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの追加的な例は、下流ＭＶＫ経路ポリペプチドおよび下流ＭＶＫ経路ポリペプチド変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書にある。
本明細書に記載される細胞のいずれでも、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードする内在性または異種核酸）を含んでなり得る。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル二リン酸ΔイソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換し、および／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞内抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを相互転換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＩＤＩ核酸としては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
下流ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路核酸としては、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的な下流ＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する、天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、より良いイソプレン生産の結果をもたらす、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド変異体もまた使用し得る。
いくつかの態様では、下流ＭＶＡ経路ポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）からのポリペプチドである。いくつかの態様では、ＭＶＫポリペプチドは、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチド、Ｍ．ブルトニイ（Ｍ．ｂｕｒｔｏｎｉｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチド、およびメタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本明細書に記載されるいずれかのプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるプロモーター）を使用して、本明細書に記載されるＭＶＡポリペプチドのいずれかの発現を駆動し得る。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、（本明細書に記載されるような、炭素流を増大するように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組成物または方法のいずれかに記載される細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、またはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性イソプレンシンターゼ経路ポリペプチドを過剰発現するように操作される。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはイソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）などの雑種からのポリペプチドである。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなる。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。イソプレシンターゼンをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドとしては、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０−１３０１６，１９９５に記載されるようにして、測定し得る。１つの例示的なアッセイでは、窒素流下で、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を蒸発するまで乾燥させて、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．２中で１００ｍＭの濃度に再水和して、−２０℃で保存し得る。アッセイを実施するために、金属ねじ蓋およびテフロン（商標）被覆ケイ素隔壁付き２０ｍＬのＨｅａｄｓｐａｃｅバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内の２５μＬの細胞抽出物に、５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭの（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５％グリセロール、および２ｍＭのＤＴＴ）の溶液を添加して、振盪しながら３７℃で１５分間培養し得る。反応は、２００μＬの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することでクエンチし、ＧＣ／ＭＳによって定量化し得る。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、ポプライソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズイソプレンシンターゼポリペプチドまたはその変異体である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）または雑種ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）からのポリペプチドまたはそれらの変異体である。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドまたは対応する核酸は、マメ亜科（Ｆａｂｏｉｄｅａｅ）などのマメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドまたは対応する核酸は、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ）（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３７：７００−７１２，２００５）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）、コットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）とヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）交雑種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ×ｔｒｅｍｕｌａ）（ＣＡＣ３５６９６）など（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ ２１３：４８３−４８７，２００１）、アスペン（ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）など）（Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０（２２）：１３０１０−１３１６，１９９５）、ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｒｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９８／０２５５０号パンフレット）、またはそれらの変種に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチド、または対応する核酸は、プエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ）、プエラリア・ロバタ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）、セイヨウハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｎｉｇｒａ）、またはコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）またはそれらの変種に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチド、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチド、または対応する核酸は、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）またはそれらの変種に由来する。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼまたはその変異体）をコードする核酸は、コドン最適化される。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは核酸（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの天然ポリペプチドまたは核酸）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸でない。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変異体（例えば、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）からの野生型または天然ポリペプチドまたは核酸の変種）である。
いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、変種である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変種である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された触媒活性などの改善された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、変種は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された溶解度を有する。溶解度の増大は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のいずれかであり得る。溶解度の増大は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍のいずれかであり得る。いくつかの態様では、溶解度の増大は、約１０％〜約１００倍（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、または約５倍〜約２０倍）である。いくつかの態様では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、天然起源イソプレンシンターゼの変異体であり、天然起源イソプレンシンターゼと比較して、改善された安定性（熱安定性など）を有する。
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、または少なくとも約２００％の活性を有する。変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、配列類似性を共有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％のいずれかのアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼと、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、または約９０％〜約９５％のアミノ酸配列同一性のいずれかを有する。
いくつかの態様では、変異体は、野生型または天然起源イソプレンシンターゼ中に、変異を含んでなる。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、変異体と、野生型または天然起源イソプレンシンターゼの間で異なるアミノ酸残基の数は、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基など、１つまたは複数であり得る。天然起源イソプレンシンターゼとしては、例えば、葛イソプレンシンターゼ、ポプライソプレンシンターゼ、ヨーロッパナライソプレンシンターゼ、および柳イソプレンシンターゼなど、植物からの任意のイソプレンシンターゼが挙げられる。いくつかの態様では、変異体は、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体である。いくつかの態様では、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体は、少なくとも１種のアミノ酸置換、少なくとも１種のアミノ酸挿入、および／または少なくとも１種のアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）イソプレンシンターゼである。いくつかの態様では、変異体（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）からのイソプレンシンターゼの変異体をコードする核酸は、コドン最適化される（例えば、その中で異種イソプレンシンターゼが発現される宿主細胞に基づいてコドン最適化される）。その他の態様では、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）に由来するイソプレンシンターゼの変異体は、表２に示されるアミノ酸残基に、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、および／または少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。別の態様では、イソプレンシンターゼの変異体は、表２に示されるアミノ酸残基のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸欠失、または少なくとも１つのアミノ酸挿入を含んでなり、アミノ酸残基番号は、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼ（配列番号２４）のアミノ酸残番号に対応する。一態様では、ウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼは、例えば、完全長イソプレンシンターゼよりアミノ酸１６個分短いＭＥＡイソプレンシンターゼなどのトランケート型イソプレンシンターゼである。
Figure 0006744819
一実施形態では、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼはトランケート型であり、完全長ウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼよりもアミノ酸１６個分短い。
本明細書で提供されるイソプレンシンターゼポリペプチドは、イソプレンシンターゼおよびイソプレンシンターゼ変異体に関して、その内容全体を明示的に参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２４１４６号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号明細書に記載される、イソプレンシンターゼまたはイソプレンシンターゼ変異体のいずれかであり得る。
本明細書に記載されるプロモーター（例えば、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターをはじめとする、本明細書に記載されて、本開示の実施例で同定されるいずれかのプロモーター）を使用して、本明細書に記載されるイソプレンシンターゼのいずれかの発現を駆動し得る。
適切なイソプレンシンターゼとしては、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、およびＡＹ１８２２４１によって同定されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される組成物、またはイソプレンシンターゼをコードする微生物を作成する方法をはじめとする方法のいずれかで、使用し得るイソプレンシンターゼのタイプは、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２４１４６号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレット、および国際公開第２０１３／１６６３２０号パンフレットにもまた記載される。
ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、（本明細書に記載されるように炭素流を増大させるように操作されている宿主細胞をはじめとする）本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする内在性核酸の染色体のコピーをさらに含んでなる。いくつかの態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、ＩＤＩポリペプチドおよびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。いくつかの態様では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、１つのプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、複数のプラスミドが、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、およびＤＸＳポリペプチドまたはその他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願第１２／３３５，０７１号明細書（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書）、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に、より詳細に記載される。
例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの１つまたは２つ以上の活性を有する、ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、およびポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のいずれかが挙げられるが、これに限定されるものではない。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路核酸としては、ＤＸＰ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。例示的なＤＸＰ経路ポリペプチド、および核酸、およびＤＸＰ経路ポリペプチド活性を測定する方法は、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレットにより詳細に記載される。
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。（本明細書に記載されるものなどの）標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。例示的なＤＸＳポリペプチド、および核酸、およびＤＸＳ活性を測定する方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願第１２／３３５，０７１号明細書（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書）、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書により詳細に記載される。
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸（ＭＥ−ＣＰＰまたはｃＭＥＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２、４−シクロ二リン酸を（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸（ＨＭＢＰＰまたはＨＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブテ−２−エン−１−イル二リン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する。標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内、細胞抽出物中、または生体内で、ＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。
下流ＭＶＡ経路、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＰ経路ポリペプチドの起源生物
イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／またはＭＶＡ経路核酸（およびそれらがコードするポリペプチド）は、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／またはＭＶＡ経路核酸を天然に含有する、任意の生物から得られ得る。イソプレンは、細菌、酵母、植物、および動物などの多様な生物によって、天然に形成される。いくつかの生物が、イソプレンを生成するためのＭＶＡ経路を含有する。イソプレンシンターゼ核酸は、例えば、イソプレンシンターゼを含有する任意の生物から得られ得る。ＭＶＡ経路核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得られ得る。ＩＤＩおよびＤＸＰ経路核酸は、例えば、ＩＤＩおよびＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得られ得る。
イソプレンシンターゼ、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、またはラン藻から単離され得る。例示的な起源生物としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種などの酵母、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種などの細菌、またはメタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）の種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、葛またはポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）ＣＡＣ３５６９６）またはアスペン（例えば、ポプルス・トレムロイデス（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））などの植物が挙げられる。使用し得る例示的なイソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチド起源は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６２号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０６８号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７６号パンフレット、国際公開第２０１０／０１３０７７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３１０７９号パンフレット、国際公開第２０１０／１４８１５０号パンフレット、国際公開第２０１０／０７８４５７号パンフレット、および国際公開第２０１０／１４８２５６号パンフレットにもまた記載される。
イソプレンの生産増大能力がある組換え細胞
イソプレンに向かう素流が増大するように遺伝子操作されている、本明細書に記載される組換え細胞は、イソプレンに向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されていない同一細胞を上回る濃度で、イソプレンを産生する能力を有する。一態様では、本明細書に記載される組換え細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなり、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されて、１つまたは複数のアセチル化タンパク質が欠損している同一細胞上回る濃度で、イソプレンを産生する能力を有し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。アセチル化タンパク質は、アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱなどであるが、これに限定されるものではない）および／またはデアセチラーゼ（ＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）であり得る。いくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで（内在性ｙｆｉＱ遺伝子の欠失などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢタンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることで（内在性ｃｏｂＢ遺伝子の発現の増大、またはｃｏｂＢをコードする核酸の異種発現などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の実施形態では、適切な培地中でこれらの細胞培養することは、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含まないイソプレンを産生する細胞と比較して、改善されたイソプレンの生産を提供し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。いくつかの態様では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなる。特定の態様では、これらの細胞は、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする異種核酸、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、および／またはイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の１つまたは複数のコピーをさらに含んでなり得る。本明細書で開示される細胞の態様のいずれにおいても、１つまたは複数の異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。その他の態様では、改善されたイソプレンの生産は、イソプレン比生産性の増大、イソプレン力価の増大、イソプレン収率の増大、細胞生存率の増大、および／または酢酸生成量の低下の１つまたは複数によって特徴付けられる。
例示的一実施形態では、本明細書で開示される細胞は、イソプレンに向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されていないイソプレン産生細胞と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレンを産生し得る。その他の態様では、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含まないイソプレン産生細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）と比較して、少なくとも５％高い量のイソプレンを産生し得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。代案としては、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％を超える、ならびにこれらの数字の間の任意の数値のイソプレンを産生し得る。
本発明の一態様では、イソプレンに向かう炭素流が増大するように遺伝子操作された細胞が提供され、細胞は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなり、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。全ＭＶＡ経路をコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、およびイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸。いくつかの態様では、細胞は、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。１つまたは複数の異種核酸が、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。異種核酸の１つまたは複数は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得て、または細胞内で安定して発現され得る。１つまたは複数の異種核酸が、ベクター上にさらに存在し得る。
本明細書に記載される組成物または方法いずれかに従って、イソプレンに向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されている細胞によるイソプレンの生産は、向上され得る（例えば、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現が向上され、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される）。その他の態様では、本明細書に記載される方法または組成物のいずれかに従った、細胞によるイソプレンの生産は、向上／増大／改善され得る（例えば、１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現によって向上され、前記タンパク質は、イソプレンシンターゼポリペプチド、全ＭＶＡ経路のポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される）。本明細書の用法では、「向上された」／「改善された」／「増大された」イソプレン生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を発現せず、イソプレン生産に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されていない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、増大されたイソプレンの細胞生産性指数（ＣＰＩ）、増大されたイソプレンの力価、増大されたイソプレンの質量収率、累積イソプレン収率の増大、後期発酵イソプレン生産の増大、細胞生存率の増大、酢酸生成量の低下、および／または増大されたイソプレンの比生産性を指し、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。イソプレンの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上され得る。イソプレンの生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を発現しない細胞によるイソプレンの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上され得て、前記タンパク質は、それらの発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作される。
イソプレンの生産はまた、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍数、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれか向上され得る。
組換え細胞を使用してイソプレンを生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載されるような、イソプレンに向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されている組換え微生物のいずれかを培養するステップを含んでなるイソプレンを生産する方法である。一態様では、イソプレンは、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、およびイソプレンシンターゼポリペプチドを含んでなる組換え細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）を培養することで生産され得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。特定の実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり得る。イソプレンは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかによって、生産され得る。細胞のいずれでも、グルコースなどであるが、これに限定されるものではない炭水化物、または酢酸などであるが、これに限定されるものではないその他の炭素源から、イソプレンを生産する目的で使用され得る。
したがって、本明細書でまた提供されるのは、（ａ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなる細胞を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなるイソプレンを生産する方法であり、細胞は、アセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている。その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）イソプレンを生産するための適切な培地中で、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含んでなる細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）を培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップとを含んでなるイソプレンを生産する方法であり、前記タンパク質は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作される。細胞は、上述されるような全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子、および上に記載されるイソプレンシンターゼポリペプチドのいずれかを含んでなり得る。いくつかの態様では、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。本明細書に記載されるイソプレンシンターゼまたはその変異体のいずれか、本明細書に記載される微生物（例えば、細菌）または植物系統のいずれか、本明細書に記載されるプロモーターのいずれか、および／または本明細書に記載されるベクターのいずれかはまた、本明細書に記載される方法で使用され得る、本明細書に記載されるエネルギー源（例えば、グルコースまたは任意のその他の六炭糖）のいずれかを使用して、イソプレンを生産するのにも使用され得る。いくつかの態様では、イソプレンを生産する方法は、イソプレンを回収するステップをさらに含んでなる。
いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク絶対生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク絶対生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの量が、ピーク比生産性時点で測定される。いくつかの態様では、細胞ピーク比生産性は、本明細書で開示される細胞あたりのイソプレン量のいずれかに関する。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの累積総量が測定される。いくつかの態様では、細胞累積総生産性は、本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかに関する。
いくつかの態様では、アセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている本明細書に記載される細胞（例えば、培養中の細胞）のいずれもが、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ以上のイソプレンイソプレン／湿潤細胞重量グラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）を産生する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒなど、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
いくつかの態様では、アセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇイソプレン／ｇ湿潤細胞重量／ｈｒ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）以上のイソプレンを生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈなどの約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
いくつかの態様では、アセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇイソプレン／Ｌブロス（ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、式中、ブロス容積は、細胞および細胞培地の容積を含む）以上のいずれかをほぼ超える、またはそのいずれかである、イソプレンの累積力価（総量）を生成する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈなどの約２〜約１００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈ、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌｂｒｏｔｈである。
いくつかの態様では、アセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている細胞は、容量基準で発酵発生気体の少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、または２５％を構成する。いくつかの態様では、イソプレンは、発生気体の容量基準で約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％、または約１〜約１０％などの約１〜約２５％を構成する。
これらの細胞内のアセチル化タンパク質の発現および／または活性が調節されるように遺伝子操作されている本明細書に記載される組換え細胞によるイソプレンの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上され得る。イソプレンの生産は、野性型レベルの１つまたは複数のアセチル化タンパク質、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはＩＤＩポリペプチドを発現して、イソプレン生産に向かう炭素流を増大させるように操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約５０％〜約１，０００，０００倍、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上され得る。
イソプレンの生産はまた、天然細胞による、または１つまたは複数のアセチル化タンパク質、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ＤＸＰ経路ポリペプチド、および／またはＩＤＩポリペプチドを発現せず、イソプレン生産に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されていない細胞によるイソプレンの生産と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれか向上され得て、前記タンパク質は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作される。
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生できる組換え細胞
イソプレノイドは、多数の生物中で、ＭＶＡ経路の最終生成物であるイソプレノイド前駆体分子の合成から生成され得る。上述のように、イソプレノイドは、重要なクラスの化合物に相当し、例えば、食品および飼料補給剤、フレーバーおよび臭気化合物、および抗がん、抗マラリア、抗真菌、および抗菌化合物を含む。
分子クラスとして、イソプレノイドは、化合物に含まれるイソプレン単位数に基づいて分類される。モノテルペンは、１０個の炭素または２個のイソプレン単位を含んでなり、セスキテルペンは、１５個の炭素または３個のイソプレン単位を含んでなり、ジテルペンは、２０炭素または４個のイソプレン単位を含んでなり、セステルテルペンは、２５個の炭素または５個のイソプレン単位を含んでなり、以下同じように続く。ステロイド（一般的に約２７個の炭素を含んでなる）は、イソプレノイドの切断または再構成生成物である。
イソプレノイドは、イソプレノイド前駆体分子ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから生成され得る。これらの多様な化合物は、これらの比較的単純な汎用前駆体から誘導され、保存的ポリプレニルピロリン酸シンターゼのグループによって合成される（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。それらの特有の生理学的機能を反映する、これらの直鎖プレニルピロリン酸の様々な鎖長は、一般に、アリル性基質（ジメチルアリル二リン酸（Ｃ５−ＤＭＡＰＰ）、ピロリン酸ゲラニル（Ｃ１０−ＧＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（Ｃ１５−ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（Ｃ２０−ＧＧＰＰ））と、対応する数のイソペンテニルピロリン酸（Ｃ５−ＩＰＰ）との縮合反応を通じて、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの非常に発達した活性部位によって判定される（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０）。ピロリン酸ポリプレニルシンターゼの例としては、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたファルネセンシンターゼ（配列番号２６）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたアモルファジエンシンターゼ（配列番号２５））；ピロリン酸ゲラニルシンターゼ；またはゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、酵素活性が調節されてイソプレノイド生産に向かう炭素流が増大するように、酵素経路の１つまたは複数が操作されている、本明細書に記載される組換え宿主細胞のいずれかを使用して実施され得る。さらに、これらの細胞は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、および／またはホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、および／またはイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を発現し得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。いくつかの態様では、これらの細胞は、上述のＩＤＩおよび／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含んでなる。理論により拘束されることなく、上述の組成物および方法のいずれかによって、細胞内で、アセチルＣｏＡまたはメバロン酸の細胞産生を増大させることは、同様により大量のイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド生成をもたらすと考えられる。グルコースからのアセチルＣｏＡおよび／またはメバロン酸生成のモル収率を増大させることは、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ、およびイソプレンおよびイソプレノイド生成のためのその他の適切な酵素の適切な酵素活性レベルとグルコースを組み合わせると生成される、イソプレンをはじめとするイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドのより高いモル収率につながる。
イソプレノイドのタイプ
メバロン酸への炭素流動増大のために操作された本発明の細胞は、イソプレノイドおよびイソプレノイド前駆体分子ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰの産生を増大できる。イソプレノイドの例としては、制限なしに、ヘミテルペン、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルテルペノイド、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、より高級なポリテルペノイドが挙げられる。いくつかの態様では、ヘミテルペノイドは、プレノール（すなわち３−メチル−２−ブテン−１−オール）、イソプレノール（すなわち３−メチル−３−ブテン−１−オール）、２−メチル−３−ブテン−２−オール、またはイソ吉草酸である。いくつかの態様では、モノテルペノイドは、制限なしに、ピロリン酸ゲラニル、ユーカリプトール、リモネン、またはピネンであり得る。いくつかの態様では、セスキテルペノイドは、ピロリン酸ファルネシル、アルテミシニン、またはビサボロールである。いくつかの態様では、ジテルペノイドは、制限なしに、ゲラニルゲラニルピロリン酸、レチノール、レチナール、フィトール、タキソール、フォルスコリン、またはアフィジコリンであり得る。いくつかの態様では、トリテルペノイドは、制限なしに、スクアレンまたはラノステロールであり得る。イソプレノイドはまた、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピネン、およびバレンセンからなる群から選択し得る。
いくつかの態様では、テトラテルペノイドは、リコペンまたはカロテン（カロテノイド）である。本明細書の用法では、「カロテノイド」という用語は、植物の葉緑体および有色体中、藻類などのいくつかのその他の光合成生物の葉緑体および有色体中、ある種の真菌およびいくつかの細菌中に生じる、一群の天然有機色素を指す。カロテノイドとしては、酸素含有キサントフィルおよび酸素非含有カロテンが挙げられる。いくつかの態様では、カロテノイドは、キサントフィルおよびカロテンからなる群から選択される。いくつかの態様では、キサントフィルは、ルテインまたはゼアキサンチンである。いくつかの態様では、カロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチンまたはリコペンである。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載されるイソプレノイドへの炭素流動増大のために操作された細胞は、上述の下流メバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、ならびにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、内在性ポリペプチドであり得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。代案としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。
ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、イソプレノイド前駆体分子をより複雑なイソプレノイド化合物に変換する。例示的なシンターゼポリペプチドとしては、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。さらに、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された酵素活性などの改善された活性を有し得る。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼ変異体は、改善された安定性（例えば、熱安定性）、および／または改善された溶解度などのその他の改善された特性を有する。例示的なポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸としては、制限なしに、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）シンターゼ、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ、または任意のその他の既知のポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドなどのポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
本発明のいくつかの態様では、本明細書の組成物または方法のいずれかに記載されるイソプレノイドへの炭素流動増大のために操作された細胞は、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、内在性遺伝子によってコードされる内在性ポリペプチドであり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、内在性ｉｓｐＡ遺伝子によってコードされる（例えば、配列番号２３）。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、または同様に誘導性プロモーターと作動可能に連結し得る。ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、強力なプロモーターとさらに作動可能に連結し得る。特に、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＦＰＰシンターゼポリペプチドを過剰発現するように改変し得る。
いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドは異種ポリペプチドである。本発明の細胞は、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸の２つ以上のコピーを含んでなり得る。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。
ＦＰＰシンターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込み得て、または細胞内で安定して発現させ得る。ＦＰＰシンターゼをコードする核酸は、さらにベクター上に存在し得る。
標準法を使用して、ポリペプチドが、試験管内で、細胞抽出物中で、または生体内で、ＩＰＰを高級イソプレノイドに変換する能力を測定することで、ポリペプチドがポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第７，９１５，０２６号明細書、Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１年３月；１５５（３）：１０７９−９０；Ｄａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１年４月１２日［印刷前のデジタル出版］；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１年３月２４日［印刷前のデジタル出版］］；Ｋｅｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２０１１年３月７日；１１：４３； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２０１０年１１月２１日；１０：２２６；Ｋｕｍｅｔａ＆Ｉｔｏ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０年１２月；１５４（４）：１９９８−２００７；およびＫｏｌｌｎｅｒ＆Ｂｏｌａｎｄ，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２０１０年８月２０日；７５（１６）：５５９０−６００に記載される。
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産増大能力がある組換え細胞
本明細書に記載される組換え微生物（例えば、組換え細菌、真菌、または藻類細胞）は、本明細書に記載される様々な酵素経路に対する任意の操作のない同一細胞を上回る量および／または濃度で、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する能力を有する。さらに、本明細書に記載される細胞は、イソプレノイドに向かう炭素流を増大させるために遺伝子操作されておらず１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が欠失している同一細胞を上回る量および／または濃度で、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する能力を有し、細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸が調節されるように、遺伝子操作されている。アセチル化タンパク質は、アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱなどであるが、これに限定されるものではない）および／またはデアセチラーゼ（ＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）であり得る。いくつかの実施形態では、ＹｆｉＱポリペプチドの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで（内在性ｙｆｉＱ遺伝子の欠失などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の実施形態では、ＣｏｂＢポリペプチドの活性は、ＣｏｂＢタンパク質の活性を増大させることで（内在性ｃｏｂＢ遺伝子の発現の増大、またはｃｏｂＢをコードする核酸の異種発現などであるが、これに限定されるものではない）調節される。その他の実施形態では、これらの細胞は適切な培地中で培養することは、１つまたは複数のアセチル化タンパク質を含まないイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生する細胞と比較して、改善されたイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産を提供し、前記タンパク質は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作される。特定の態様では、これらの細胞は、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする異種核酸の１つまたは複数のコピー、および／またはホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチドをさらに含んでなり得る。本明細書で開示される細胞の態様のいずれにおいても、１つまたは複数の異種核酸が宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。その他の態様では、改善されたイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド比生産性の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド力価の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド収率の増大、細胞生存率の増大、および／または酢酸生成量の低下の１つまたは複数によって特徴付けられる。
本発明の一態様では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、および／またはホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、および／またはＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、および／またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体に向かう炭素流を増大させるために遺伝子操作されている細胞が提供され、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸をさらに含んでなり得る。さらにポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドは、ＦＰＰシンターゼポリペプチドであり得る。１つまたは複数の異種核酸が、構成的プロモーターと作動可能に連結し得て、誘導性プロモーターと作動可能に連結し得て、または誘導性および構成的プロモーターの組み合わせと作動可能に連結し得る。１つまたは複数の異種核酸は、さらに、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または中程度のプロモーターと、作動可能に連結し得る。１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする異種核酸の１つまたは複数、全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、ホスホケトラーゼをコードする１つまたは複数の異種核酸ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸、および／またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする１つまたは複数の異種核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得て、または細胞内で安定して発現され得て、前記タンパク質は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作される。１つまたは複数の異種核酸が、ベクター上にさらに存在し得る。
本明細書で提供されるのは、向上、改善、または増大されたイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産のために、上に記載されるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体に向かう炭素流増大のために遺伝子操作されている細胞のいずれかを使用する方法である。本明細書の用法では、「向上された」／「改善された」／「増大された」イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体の細胞生産性指数（ＣＰＩ）および／またはイソプレノイド生産の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド力価の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド質量収率の増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド比生産性の増大、細胞生存率の増大、および／または酢酸塩生成量の低下を指し、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍向上され得る。イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作されている１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現がない細胞によるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上され得る。
イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産はまた、天然細胞による、または１つまたは複数のアセチル化タンパク質の発現がなく、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産に向かう炭素流が増大するように、遺伝子操作されていない細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍数、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれか向上され得て、前記タンパク質は、それらの活性が調節されるように遺伝子操作される。
組換え細胞を使用してイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆物質分子を生産する方法
本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載される様々な酵素経路が遺伝子操作されている、および／または１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、全ＭＶＡ経路のポリペプチド、およびピロリン酸ポリプレニルシンターゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでなる組換え微生物（例えば、組換え体細菌、真菌、または藻類細胞）を培養するステップを含んでなる、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法であり、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。特定の実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする、１つまたは複数の核酸をさらに含んでなる。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドは、本明細書に記載される細胞のいずれかから、本明細書に記載される方法のいずれかに従って、生産され得る。細胞のいずれでも、グルコースなどであるが、これに限定されるものではない炭水化物から、または酢酸などであるが、これに限定されるものではないその他の炭素源から、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する目的で使用され得る。
したがって、本明細書で提供されるのは、（ａ）イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体に向かう炭素流増大のために遺伝子操作されている細胞を培養するステップと；（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法である。その他の態様では、本明細書で提供されるのは、（ａ）１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）をイソプレンを生産するのに適切な培地中で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法である。前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。細胞は、上述されるような全ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子、および／またはホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸分子をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、本明細書に記載される細胞のいずれかであり得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
例示的一実施形態では、当該イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド製造方法は、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されておらず、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞と比較して、少なくとも５％より高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産し得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。その他の態様では、本明細書で提供されるのは、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイド製造方法であり、それは、例示的一実施形態では、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体産生細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）と比較して、少なくとも５％より高い量のイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを生産し得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体の生産に向かう炭素流が増大するように、遺伝子操作されておらず。代案としては、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、包括的に、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％を超えるイソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドを産生し得る。いくつかの態様では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを生産する方法は、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドを回収するステップをさらに含んでなる。
本明細書で提供されるのは、イソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体分子の生産向上のために、上に記載されるイソプレノイドおよび／またはイソプレノイド前駆体に向かう炭素流が増大するように遺伝子操作されている細胞のいずれかを使用する方法である。本明細書の用法では，「向上された」イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない細胞と比較した、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかによって記載される細胞による、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド生産の細胞生産性指数（ＣＰＩ）増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの力価増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの質量収率増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの比生産性増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイド累積収率増大、イソプレノイド前駆体および／またはイソプレノイドの後期発酵の増大、および細胞生存率の増大、および／または酢酸生成量の低下を指し、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産は、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産と比較して、約１０％〜約１，０００，０００倍（例えば、約１〜約５００，０００倍、約１〜約５０，０００倍、約１〜約５，０００倍、約１〜約１，０００倍、約１〜約５００倍、約１〜約１００倍、約１〜約５０倍、約５〜約１００，０００倍、約５〜約１０，０００倍、約５〜約１，０００倍、約５〜約５００倍、約５〜約１００倍、約１０〜約５０，０００倍、約５０〜約１０，０００倍、約１００〜約５，０００倍、約２００〜約１，０００倍、約５０〜約５００倍、または約５０〜約２００倍）向上され得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。例示的一実施形態では、イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産は、約５％〜約１，０００，０００倍増大され得る。
イソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産はまた、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない細胞によるイソプレノイド前駆体分子および／またはイソプレノイドの生産と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍数、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍、５０，０００倍、１００，０００倍、２００，０００倍、５００，０００倍、または１，０００，０００倍のいずれか向上され得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。
メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体、およびアセチルＣｏＡ由来産物の生産改善のための追加的な酵素経路調節
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法または組成物のいずれかに記載される組換え細胞は、１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり、細胞は、核酸の活性および／またはタンパク質の発現が調節されるように修飾されている。細胞代謝中の炭素利用に関与する追加的な遺伝子の調節、またはアセチルＣｏＡの利用可能な細胞内供給に関与するとされるものもまた調節されて、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、および／またはイソプレノイドの生産が改善されてもよい。これらのとしては、ホスホフルクトキナーゼが関与する経路の調節、ホスホケトラーゼに関与する経路の調節、ペントースリン酸経路酵の調節素、酢酸生産と酢酸循環とアセチルＣｏＡ生産に関与する酵素の調節、エントナー・ドウドロフ経路が関与する経路の調節、ペントースリン酸経路の酸化分岐が関与する経路の調節などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載される方法または組成物のいずれかに記載される組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドまたはホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸をさらに含んでなり得る。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸は、構成的プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導性プロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸は、強力なプロモーターと作動可能に連結する。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする２つ以上の異種核酸（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸の２、３、４つ以上のコピー）が使用される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種核酸は、弱いプロモーターと作動可能に連結する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ホスホケトラーゼポリペプチドを過剰発現するように遺伝子操作される。
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換、および／またはフルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース−５−リン酸からグリセルアルデヒド−３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。その他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース−６−リン酸からエリスロース−４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒できる。したがって、理論により拘束されることなく、本明細書に記載されるホスホケトラーゼの発現は、炭水化物源から生成されるアセチルリン酸量の増大をもたらし得る。このアセチルリン酸はアセチルＣｏＡに変換され得て、それは次に、ＭＶＡ経路の酵素機能によって使用されて、メバロン酸、イソプレノイド前駆体分子、イソプレンおよび／またはイソプレノイドが生産され得る。したがって炭水化物基質から生成されるこれらの化合物の量が、増大されてもよい。代案としては、増大をより高い細胞内濃度に反映させることなく、アセチル−ＰおよびＡｃＣｏＡの生成が増大され得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ反応が起こっているにもかかわらず、細胞内アセチル−ＰまたはアセチルＣｏＡ濃度は不変であり、または低下することさえある。
例示的なホスホケトラーゼ核酸としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なホスホケトラーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載される起源生物のいずれかからの天然ポリペプチドおよび核酸、ならびに本明細書に記載される起源生物のいずれかに由来する変異ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
標準法を使用して、ペプチドが、Ｄ−フルクトース−６−リン酸またはＤ−キシルロース−５−リン酸をアセチル−Ｐに変換する能力を測定することで、ポリペプチドが、ホスホケトラーゼペプチド活性を有するかどうかを判定し得る。次にアセチル−Ｐは、分光光度法で検出し得るフェリルアセチルヒドロキサム酸に変換され得る（Ｍｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９−２９３６，２００１）。本明細書に記載されるようなホスホケトラーゼペプチド活性を有すると同定された任意のポリペプチドは、本発明で使用するのに適する。
その他の態様では、代表的ホスホケトラーゼ核酸としては、例えば、ラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、フェリモナス・バレアリカ（Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ）、ペドバクター・サルタンス（Ｐｅｄｏｂａｃｔｏｒ ｓａｌｔａｎｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、および／またはノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）から単離された、ホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書で使用され得るホスホケトラーゼ酵素の追加的な例は、参照により本明細書に援用される、米国特許第７，７８５，８５８号明細書に記載される。
エントナー・ドウドロフ経路が関与する経路
エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路は、エンデン・メイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路の代替物である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のようないくつかの生物がＥＤおよびＥＭＰ経路の双方を持つ一方で、その他の生物はそのどちらか一方のみを有する。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ ａｎｄ Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５−３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９−８８０；Ｄａｗｅｓ ｅｔ ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５−８０３）。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）が、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸塩から１分子のＨ２Ｏを除去して、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸塩６−リン酸を形成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）は、アルドール切断を触媒する（Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８−４６４６）。２つの遺伝子は、オペロン中にある。
ホスホケトラーゼ経路に向けられ得る代謝産物はまた、ＥＤ経路にも転用され得る。代謝産物が、ＥＤ経路に失われるのを回避するために、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性が弱力化される。弱力化を達成する一方法は、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることである。これはクロラムフェニコールまたはカナマイシンカセットによって片方または双方の遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成し得る。これらの酵素機能がなければ、ホスホケトラーゼ酵素を通じてより多くの炭素が流動し、ひいてはメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の収率が増大する。
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）および／または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下させ得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。
場合によっては、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性の弱力化は、弱力化された内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ−２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ遺伝子発現を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
ペントースリン酸経路の酸化分岐が関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソースとペントースを分解し、細胞様々な同化経路のための中間体を提供する。それはまた、ＮＡＤＰＨの主な産生者でもある。ペントースリン酸経路は、酸化分岐（グルコース６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）または６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）のような酵素がある）、および非酸化分岐（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡまたはｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素がある）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４−３３０）。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ペントースリン酸経路の非酸化分岐（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼのタンパク質の発現および／または活性を調節し（例えば、酵素活性を増大させ）、フルクトース６−リン酸およびキシルロース５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによって、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の最終生成量を増大させる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％増大する。いくつかの態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、および（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増大させることで、調節される。これは合成構成的高発現性プロモーターによって、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子プロモーターを置換することで達成し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードする遺伝子はまた、適切なプロモーターの後のプラスミド上にクローン化し得る。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性の増大は、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼおよび（または）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現増大を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
ホスホフルクトキナーゼが関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、フルクトース−６−リン酸のリン酸化を触媒する、解糖の重要な酵素である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢによってコードされる２つのイソ酵素を有する。細胞内のホスホフルクトキナーゼ活性の大部分は、ｐｆｋＡに起因する（Ｋｏｔｌａｒｚ ｅｔ ａｌ．１９７５ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３８１：２５７−２６８）。
ホスホケトラーゼ酵素に向けて炭素を誘導するために、ホスホフルクトキナーゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させて）、フルクトース−６−リン酸およびキシルロース−５−リン酸に向けてより多くの炭素が流動するようにし得て、それによってメバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、およびイソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の最終生産量を増大させる。ホスホフルクトキナーゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％低下される。いくつかの態様では、ホスホフルクトキナーゼの活性は、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで調節される。これは合成構成的低発現性プロモーターによって、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモーターを置換することで、達成し得る。ホスホフルクトキナーゼの活性の低下は、ホスホフルクトキナーゼの発現低下を有しない細胞と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。
酢酸生産、酢酸循環させる、およびアセチルＣｏＡ生産に関与する遺伝子の調節
有用な工業的発酵産物を生産するために、微生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母など）が、高細胞密度発酵のための宿主株として広範に使用されている。グルコースは、相対的に安価で容易に利用可能な炭素およびエネルギー源であることから、宿主細胞の高密度増殖のためならびに異種発現される組換え遺伝子の発現ための増殖培地に、かなりの量のグルコースが添加される。高細胞密度発酵中に起こり得る大きな１つの問題は、酢酸が最も優勢である発酵性酸性副産物の生産であり、それは細胞増殖および生産における限界の主要因になり得る（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３９，６６３（１９９２）；Ｌｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５６，１００４（１９９０））。
本明細書で提供される実施形態では、酢酸循環タンパク質、酢酸生産タンパク質、またはアセチルＣｏＡ生産関連タンパク質としてはホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）、ＡＭＰ形成アセチル補酵素Ａシンセターゼ（Ａｃｓ）、および酢酸輸送体／酢酸ポンプ／（ａｃｔＰ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される実施形態のいずれか１つの中では、これらのタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子に対する変異は、発現を増大または低下／減衰／欠失させ、またはこれらのタンパク質の活性に対する変化は、単独で、または組み合わせのどちらかで起こり得て、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産をさらに促進する。これらの酢酸循環タンパク質の発現および／または活性に対する変化は、単独で、または（上述されるようなＹｆｉＱおよび／またはＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）１つまたは複数のアセチル化タンパク質活性の調節との組み合わせで起こりえる。いくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼの活性は、１つまたは複数の酢酸循環遺伝子／タンパク質の調節と並んで、アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の欠失または減衰によって調節される。例示的な実施形態では、ＹｆｉＱの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドまたはｙｆｉＱ遺伝子の発現の欠失または減衰によって調節される。その他の実施形態では、デアセチラーゼの活性は、１つまたは複数の酢酸循環遺伝子／タンパク質の調節と並んで、デアセチラーゼポリペプチドまたはデアセチラーゼ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。例示的な実施形態では、ＣｏｂＢの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドまたはｃｏｂＢ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。
好気条件下の微生物におけるグルコース代謝では、クレブス回路（ＴＣＡ回路）を超える炭素流動は、酢酸／酢酸塩に変換されて、それは究極的に細胞外に排出される（Ｍａｊｅｗｓｋｉ ＆ Ｄｏｍａｃｈ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，３５，７３２（１９９０））。排出された酢酸／酢酸塩は、宿主株の増殖と所望の発酵産物の生産を阻害し得る。
ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １９１：５５０−５５８）は、アセチルＣｏＡとアセチルリン酸の間の可逆的変換を触媒する（本明細書で、同義的にアセチルリン酸、アセチルリン酸、アセチル−Ｐ、またはＡｃ−Ｐと称される）一方で、酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６−９２２）は、アセチルリン酸を利用して酢酸を形成する。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でオペロンとして転写され得る。これらは一緒に、ＡＴＰの放出と共に、酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）および／または酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を調節することで、利用可能なアセチルＣｏＡの量を増大させ得る。例えば、このような調節は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の発現を増大させることで達成され得る。このような調節はまた、酢酸キナーゼ遺伝子の発現を増大させることで達成され得る。特定の実施形態では、調節は、ホスホトランスアセチラーゼおよび酢酸キナーゼ遺伝子の双方の発現を改変することで達成され得る。調節はまた、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子および／または酢酸キナーゼ遺伝子の発現を低下、減衰、または欠失させることで得られ得る。減衰を達成する一方法は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）および／または酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）遺伝子を欠失させることである。これはクロラムフェニコールカセットによって片方または双方の遺伝子を置換し、それに続いてカセットをループアウトすることで達成され得る。理論により拘束されることなく、これらの遺伝子を欠失させることは、より多くの炭素をメバロン酸経路に転用し、酢酸の生産から離すことで、メバロン酸、イソプレンまたはイソプレノイドの収率を増大させ得る。
代案としては、理論により拘束されることなく、ａｃｋＡの発現または活性を増大させることは、アセチルＣｏＡを合成するのに使用される酢酸の生産を増大させ得る。
代案としては、理論により拘束されることなく、ｐｔａの発現または活性増大させることは、アセチルＣｏＡの生産を増大させ得る。
さらに、ｐｔａおよび／またはａｃｋＡ遺伝子の発現の調節は、（上述されるようなＹｆｉＱおよび／またはＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性の調節との組み合わせで実施され得る。いくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼの活性は、アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を欠失または減衰させることで、調節される。例示的な実施形態では、ＹｆｉＱの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドまたはｙｆｉＱ遺伝子の発現の欠失または減衰によって調節される。その他の実施形態では、デアセチラーゼの活性は、デアセチラーゼポリペプチドまたはデアセチラーゼ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。例示的な実施形態では、ＣｏｂＢの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドまたはｃｏｂＢ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。
微生物における酢酸生産および酢酸循環に関与する別のタンパク質は、ＡＭＰ形成アセチル補酵素Ａシンセターゼ（Ａｃｓ）であり、これは、酢酸から、中央代謝のキーストーン分子である高エネルギー中間体アセチルＣｏＡへの変換に関与する遍在性酵素である（Ｃｅｒｅｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．，８２（５）：１１１０−２８）。理論に束縛されることなく、Ａｃｓの発現を増大させるように遺伝子操作される細胞は、より大量のアセチルＣｏＡを産生することが予期され得る。追加的な、Ａｃｓは、アセチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼの基質である。単なる例として、ＣｏｂＢのデアセチラーゼの活性は、生体外においてＡｃｓ上で実証されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３７：７３１−４１）。理論に束縛されることなく、Ａｃｓのアセチル化はその酵素的不活性化をもたらし得るので、Ａｃｓアセチル化の量を低下させるように遺伝子操作された細胞は、より大量のアセチルＣｏＡを産生することが予期され得る。さらに、Ａｃｓ遺伝子の発現の調節は、（上述されるようなＹｆｉＱおよび／またはＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性の調節との組み合わせで実施し得る。いくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼの活性は、アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を欠失または減衰させることで、調節される。例示的な実施形態では、ＹｆｉＱの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドまたはｙｆｉＱ遺伝子の発現の欠失または減衰によって調節される。その他の実施形態では、デアセチラーゼの活性は、デアセチラーゼポリペプチドまたはデアセチラーゼ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。例示的な実施形態では、ＣｏｂＢの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドまたはｃｏｂＢ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。
微生物における酢酸生産および酢酸取り扱いに関与する別のタンパク質は、酢酸輸送体／酢酸ポンプ（ａｃｔＰ）である。ａｃｔＰ活性は、低下または減衰させて、膜を越える酢酸輸送を最小化させ得る。理論に束縛されることなく、酢酸生産が膜を越える輸送に連動すれば、これは、プロトン勾配の脱共役のために、エネルギー損失をもたらし得ると考えられる。いくつかの態様では、ａｃｔＰの活性低下またはａｃｔＰの欠如を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生産が改善され得る。染色体への組み込みまたはプラスミドなどの染色体外ビヒクルを使用して、修飾ａｃｔＰ遺伝子が導入されてもよい。なおも別の態様では、ａｃｔＰを発現する細胞（例えば、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株などの微生物）のゲノムからａｃｔＰが欠失して、メバロン酸および／またはイソプレンの生産が改善されてもよい。別の態様では、ａｃｔＰポリペプチドをコードする異種核酸は、内在性にａｃｔＰを発現しない細胞内で発現され得る。さらに、ａｃｔＰ遺伝子の発現の調節は、（上述されるようなＹｆｉＱおよび／またはＣｏｂＢなどであるが、これに限定されるものではない）１つまたは複数のアセチル化タンパク質の活性の調節との組み合わせで実施し得る。いくつかの実施形態では、アセチルトランスフェラーゼの活性は、アセチルトランスフェラーゼポリペプチドまたはアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を欠失または減衰させることで、調節される。例示的な実施形態では、ＹｆｉＱの活性は、ＹｆｉＱポリペプチドまたはｙｆｉＱ遺伝子の発現の欠失または減衰によって調節される。その他の実施形態では、デアセチラーゼの活性は、デアセチラーゼポリペプチドまたはデアセチラーゼ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。例示的な実施形態では、ＣｏｂＢの活性は、ＣｏｂＢポリペプチドまたはｃｏｂＢ遺伝子の発現または活性を増大させることで調節される。
いくつかの態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの欠失または減衰は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の価などのより高いイソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、またはｐｔａの欠失は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の価を含めて、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高い瞬間イソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの欠失は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の価を含めて、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。その他の態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの欠失は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の価を含めて、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの容積生産性をもたらす。その他の態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの欠失は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の価を含めて、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの欠失は、ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａを発現する微生物と比較して、より長時間維持されるピーク比生産性をもたらす。
いくつかの態様では、組換え微生物は、減衰した内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を有しない微生物と比較して、低下した量の酢酸を産生する。酢酸の産生量の低下は、当業者に公知の日常的アッセイによって測定され得る。酢酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
ａｃｔＰ、ａｃｋＡ、および／またはｐｔａの活性はまた、酵素のその他の分子操作によって低下され得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。
場合によっては、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性の減衰は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子および／または内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現の減衰を有しない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路に向かうより多くの炭素流をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＡＭＰ形成アセチル補酵素Ａシンセターゼ（Ａｃｓ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）および／または酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性が増大され得る。これらの酵素活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％増大する。
クエン酸シンターゼ経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡの縮合を触媒して、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の代謝産物である、クエン酸を形成する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２：５２４３−５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：２９００−２９０５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、ｇｌｔＡによってコードされるこの酵素は、二量体サブユニットの三量体のように挙動する。六量体形態は、酵素が、ＮＡＤＨによってアロステリックに調節され得るようにする。この酵素は、幅広く試験されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７−１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｓｙｍｐ．５４：８３−９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５−４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５−５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリックな阻害を回避するために、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼによる置換またはその添加が考察された（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９−２３９）。
どちらも基質としてアセチルＣｏＡを有するために、クエン酸シンターゼによって触媒される反応は、メバロン酸経路の最初のステップを触媒するチオラーゼと直接競合する（Ｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６−２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸シンターゼ発現を調節して（例えば、酵素活性を低下させる）、より多くの炭素をメバロン酸経路に流動させて、それによってメバロン酸、イソプレン、およびイソプレノイドの最終生成量を増大させる。クエン酸シンターゼ活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。いくつかの態様では、クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の活性を低下させることで調節される。これは、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子による、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体置換によって、またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸シンターゼをコードする導入遺伝子を使用することで、達成され得る。クエン酸シンターゼの活性はまた、合成構成的低発現性プロモーターによって内在性クエン酸シンターゼ遺伝子プロモーターを置換することで、調節され得る（例えば、低下させる）。クエン酸シンターゼの活性の低下は、クエン酸シンターゼの発現低下を有しない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多量の炭素流をもたらし得る。
乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では、Ｄ乳酸は、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を通じて、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７−１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化を伴い、したがって酸素が制限されており、全ての還元当量に対応し得ない場合に、乳酸が生成する。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因になり得る。したがって、メバロン酸生成（および所望ならば、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイド生成）への炭素流動を改善するために、当業者は、酵素の活性を低下させることなどによって、乳酸デヒドロゲナーゼの活性を調節し得る。
したがって、一態様では、乳酸デヒドロゲナーゼの活性は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の減衰によって調節され得る。このような減衰は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失によって達成され得る。当業者に知られている乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減衰させるその他の方法もまた、使用してもよい。
乳酸デヒドロゲナーゼが関与する経路を操作することで、組換え微生物は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現の減衰を有しない微生物と比較して、低下した量の乳酸を産生する。乳酸の産生量の低下は、当業者に公知の日常的アッセイによって測定され得る。乳酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下する。
乳酸デヒドロゲナーゼの活性はまた、酵素のその他の分子遺伝子操作によって低下され得る。酵素活性の低下は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の低下であり得る。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下される。
したがって、場合によっては、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性の減衰は、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現の減衰を有しない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらす。
リンゴ酸酵素が関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内、ｓｆｃＡおよびｍａｅＢ遺伝子によってコードされる）は、以下の式によって（ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を使用して）、リンゴ酸塩からピルビン酸への変換を触媒するアナプレロティック酵素である。
（Ｓ）−リンゴ酸＋ＮＡＤ（Ｐ）＋ピルビン酸＋ＣＯ２＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
したがって、この酵素の２つの基質は、（Ｓ）−リンゴ酸およびＮＡＤ（Ｐ）＋である一方で、その３つの生成物は、ピルビン酸、ＣＯ２、およびＮＡＤＰＨである。
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ＭａｅＢ）の発現（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５−１３６５）は、１）炭素をＴＣＡ回路から、アセチルＣｏＡの直接前駆体であるピルビン酸（それ自体がメバロン酸経路の直接前駆体である）に戻すこと、そして２）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素反応で使用され得る追加的なＮＡＤＰＨを生成することによって、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体およびイソプレノイド収率の増大を助け得る（Ｏｈ，ＭＫ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５−１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７−５９４６）。
したがって、リンゴ酸酵素の活性および／または発現の増大などの調節によって、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの下流生産のためのより多くの出発基質（ピルビン酸またはアセチルＣｏＡ）が獲得され得る。ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であり得る。これを達成するための非限定的な一方法は、内在性ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子プロモーターを合成構成的発現プロモーターで置換することである。酵素活性を増大させる別の非限定的方法は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を使用する。当業者は、容易に利用可能な分子生物学的技術を使用して、発酵または培養中にｍａｅＢＲＮＡの発現をモニターし得る。
したがって、いくつかの実施形態では、組換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子発現の増大を有しない微生物と比較して、増大した量のピルビン酸を産生する。いくつかの態様では、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子の活性増大は、ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素遺伝子発現の増大を有しない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路に向かうより多くの炭素流をもたらす。
ピルビン酸の産生量の増大は、当業者に公知の日常的アッセイによって測定され得る。ピルビン酸の量は、分子操作が実施されない場合と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。
リンゴ酸酵素の活性はまた、酵素のその他の分子操作によって増大され得る。酵素活性の増大は、いかなる操作も実施しなかった場合と比較した、比活性または全活性の任意の量の増大であり得る。場合によっては、酵素活性は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が関与する経路
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの脱炭酸を触媒し、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、およびｌｐｄＡによってコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、いくつかの調節因子によって調節される。したがって、当業者は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節することで、アセチルＣｏＡを増大させ得る。変化は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性および／または発現の増大（例えば、持続的発現）であり得る。これは、例えば、ＰＬ．６（ａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇ（配列番号１３）、λプロモーター、Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００１４１６）のような強力な構成的プロモーターを、オペロンの前に配置させる、または１つまたは複数の合成構成的発現プロモーターを使用するなどの異なる方法によって、達成され得る。
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つまたは複数の遺伝子の活性を増大させることで、調節される。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性増大のために、これらの遺伝子の任意の１、２または３つを操作し得るものと理解される。別の態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサーの活性の弱力化によって調節し得て、詳細は下述される。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子の欠失によって弱力化し得る。
場合によっては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の１つまたは複数の遺伝子は、内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増大させる別の方法は、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、および（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群からの１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸を導入することである。
これらの方法のいずれかを使用することで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性が調節されていない微生物と比較して、組換え微生物は、増大した量のアセチルＣｏＡを生じ得る。ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節することは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの発現調節を有しない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路へのより多くの炭素流をもたらし得る。
代表的変異の組み合わせ
本明細書に記載される酵素および／または酵素経路のいずれについても、本明細書に記載される酵素および／または酵素経路の任意の組み合わせ（２、３、４、５、６個以上）を調節する分子操作が、明示的に検討される．ものと理解される。
一実施形態では、単なる例示として、組み合わせの列挙を容易にするために、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡと称され、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと称され、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと称され、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）はＤと称され、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡまたはｍａｅＢ）はＥと称され、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ）はＦと称され、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｙｂｈＥ）はＧと称され、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｌ）はＨと称され、アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱなど）はＩと称され、デアセチラーゼ（などのＣｏｂＢ）はＪと称される。上で考察されるように、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を増大させるために、ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、および／またはｌｐｄＡ酵素を単独で、３酵素の内２つを、または３酵素の内３つを使用し得る。したがって、この例示的実施形態では、酵素Ａ〜Ｊの任意の２つの組み合わせのために使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＪ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧ、ＢＨ、ＢＩ、ＢＪ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨ、ＣＩ、ＣＪ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＩ、ＤＪ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＨ、ＥＩ、ＥＪ、ＧＨ、ＧＩ、ＧＪ、ＨＩ、ＨＪ、およびＩＪである。任意の３つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＢＧ、ＡＢＨ、ＡＢＩ、ＡＢＪ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＣＧ、ＢＣＨ、ＢＣＩ、ＢＣＪ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＤＧ、ＣＤＨ、ＣＤＩ、ＣＤＪ、ＤＥＦ、ＤＥＧ、ＤＥＨ、ＤＥＩ、ＤＥＪ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＣＧ、ＡＣＨ、ＡＣＩ、ＡＣＪ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＤＧ、ＡＤＨ、ＡＤＩ、ＡＤＪ、ＡＥＦ、ＡＥＧ、ＡＥＨ、ＡＥＩ、ＡＥＪ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＤＧ、ＢＤＨ、ＢＤＩ、ＢＤＪ、ＢＥＦ、ＢＥＧ、ＢＥＨ、ＢＥＩ、ＢＥＪ、ＣＥＦ、ＣＥＧ、ＣＥＨ、ＣＥＩ、ＣＥＪ、ＣＦＧ、ＣＦＨ、ＣＦＩ、ＣＦＪ、ＣＧＨ、ＣＧＩ、およびＣＧＪである。任意の４つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＣＧ、ＡＢＣＨ、ＡＢＣＩ、ＡＢＣＪ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＤＧ、ＡＢＤＨ、ＡＢＤＩ、ＡＢＤＪ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＧ、ＡＢＥＨ、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＪ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＤＧ、ＢＣＤＨ、ＢＣＤＩ、ＢＣＤＪ、ＣＤＥＦ、ＣＤＥＧ、ＣＤＥＨ、ＣＤＥＩ、ＣＤＥＪ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＤＧ、ＡＣＤＨ、ＡＣＤＩ、ＡＣＤＪ、ＡＣＥＦ、ＡＣＥＧ、ＡＣＥＨ、ＡＣＥＩ、ＡＣＥＪ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、ＢＧＥＦ、ＢＨＥＦ、ＢＩＥＦ、ＢＪＥＦ、およびＡＤＥＦである。任意の５つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＣＤＧ、ＡＢＣＤＨ、ＡＢＣＤＩ、ＡＢＣＤＪ、ＡＢＤＥＦ、ＡＢＤＥＧ、ＡＢＤＥＨ、ＡＢＤＥＩ、ＡＢＤＥＪ、ＢＣＤＥＦ、ＢＣＤＥＧ、ＢＣＤＥＨ、ＢＣＤＥＩ、ＢＣＤＥＪ、ＡＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＧ、ＡＣＥＤＨ、ＡＣＥＤＩ、ＡＣＥＤＪ、ＡＢＣＥＦ、ＡＢＣＥＧ、ＡＢＣＥＨ、ＡＢＣＥＩ、およびＡＢＣＥＪである。任意の６つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥＧ、ＡＢＣＤＥＨ、ＡＢＣＤＥＩ、ＡＢＣＤＥＪ、ＢＣＤＥＦＧ、ＢＣＤＥＦＨ、ＢＣＤＥＦＩ、ＢＣＤＥＦＪ、ＣＤＥＦＧＨ、ＣＤＥＦＧＩ、およびＣＤＥＦＧＪである。任意の７つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤＥＦＧ、ＡＢＣＤＥＦＨ、ＡＢＣＤＥＦＩ、ＡＢＣＤＥＦＪ、ＢＣＤＥＦＧＨ、ＢＣＤＥＦＧＩ、およびＢＣＤＥＦＧＪである。任意の８つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤＥＦＧＨ、ＡＢＣＤＥＦＧＩ、およびＡＢＣＤＥＦＧＪである。任意の９つの酵素Ａ〜Ｊの組み合わせでは、使用され得る非限定的組み合わせは、ＡＢＣＤＥＦＧＨＩおよびＡＢＣＤＥＦＧＨＪである。別の態様では、全ての１０個の酵素の組み合わせＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪが使用される。
その他の実施形態では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド、イソプレノイド前駆体、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産の改善／向上／増大をもたらすのに使用するために、本明細書に記載される変異体のいずれもが組み合わされて組換え細胞内で発現され得る。
したがって、本明細書に記載されるような組換え微生物は、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼおよび／または酢酸キナーゼ、（ｃ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ）リンゴ酸酵素、（ｅ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ複合体、（ｆ）アセチルトランスフェラーゼ（ＹｆｉＱなど）、および（ｇ）デアセチラーゼ（ＣｏｂＢなど）からなる群からの１つまたは複数の酵素の活性を調節することで、組換え微生物中の代謝炭素流がメバロン酸生産に向けられるトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路活性条件下で培養されない微生物と比較して増大された、メバロン酸生産の増大を達成し得る。
生成増大のためのその他の制御因子および要素
その他の分子操作を使用して、メバロン酸生成に向かう炭素流を増大させ得る。一方法は、メバロン酸経路に供給する経路に対する負の制御因子の効果を削減し、低下させまたは排除することである。例えば、場合によっては、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロン中にあり、４番目の遺伝子はｐｄｈＲ上流にある。ＰｄｈＲは、そのオペロンの転写の負の制御因子である。ピルビン酸不在下では、それはその標的プロモーターに結合して、転写を抑制する。それはまた、ｎｄｈおよびｃｙｏＡＢＣＤを同様に調節する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４−５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子の欠失は、ピルビン酸の供給を改善し得て、したがって、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生成を改善する。
その他の態様では、ＰＧＬ低下またはＰＧＬ欠損がある微生物（様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株など）への６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）の導入を使用して、アセチルＣｏＡ由来産物、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、およびイソプレノイドの生産が改善され得る。ＰＧＬは、染色体への組み込みまたはプラスミドなどの染色体外ビヒクルを使用して、導入されてもよい。なおも別の態様では、ＰＧＬを発現する細胞（例えば、様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株などの微生物）のゲノムからＰＧＬが欠失して、メバロン酸および／またはイソプレンの生産が改善されてもよい。別の態様では、ＰＧＬポリペプチドをコードする異種核酸は、内在性にＰＧＬを発現しない細胞内で発現され得る。いくつかの態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の値などのより高いイソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高い瞬間イソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。その他の態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの容積生産性をもたらす。その他の態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ＰＧＬの欠失は、ＰＧＬを発現する微生物と比較して、より長時間にわたるピーク比生産性の維持をもたらす。
別の態様では、本明細書で開示される細胞のいずれかで、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｐｐｃ）遺伝子発現の調節を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産が改善され得る。一態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子発現は、野性型細胞と比較してｐｐｃ遺伝子発現低下をもたらす別のプロモーターで、ｐｐｃ遺伝子のプロモーター配列を置換することで低下され得る。いくつかの態様では、ｐｐｃ遺伝子発現は、野性型細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで低下され得る。いくつかの態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の値などのより高いイソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高い瞬間イソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。その他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの容積生産性をもたらす。その他の態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現低下は、野性型レベルでホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現する微生物と比較して、より長時間維持されるピーク比生産性をもたらす。
別の態様では、本明細書で開示される細胞のいずれかで、マグネシウム欠乏時ＲｓｓＢ活性インヒビター（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｉｒａＭ）遺伝子発現の調節を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産が改善され得る。一態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現は、野性型細胞と比較してｉｒａＭ遺伝子発現増大をもたらす別のプロモーターで、ｉｒａＭ遺伝子のプロモーター配列を置換することで増大され得る。いくつかの態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現は、野性型細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで増大され得る。いくつかの態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の値などのより高いイソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高い瞬間イソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。その他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンの容積生産性をもたらす。その他の態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ｉｒａＭ遺伝子発現の増大は、野性型レベルでｉｒａＭ遺伝子を発現する微生物と比較して、より長時間維持されるピーク比生産性をもたらす。
別の態様では、本明細書で開示される細胞のいずれかで、多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのＡｃｒＡ成分（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のａｃｒＡ遺伝子）遺伝子発現の調節を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産が改善され得る。一態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現は、野性型細胞と比較してａｃｒＡ遺伝子発現低下をもたらす別のプロモーターで、ａｃｒＡ遺伝子のプロモーター配列を置換することで低下され得る。いくつかの態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現は、野性型細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで低下され得る。別の態様では、ａｃｒＡの発現は、それがもはや機能性ａｃｒＡタンパク質を産生しないようにする、細胞ゲノム内のａｃｒＡ遺伝子の欠失などによって、完全に消滅させ得る。いくつかの態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現の欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の値などのより高いイソプレン収率をもたらす。別の態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現の欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高い瞬間イソプレン収率をもたらす。別の態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現の欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。別の態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現の欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンの容積生産性をもたらす。別の態様では、ａｃｒＡ遺伝子発現の欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、より高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ａｃｒＡ遺伝子の発現欠失または低下は、野性型レベルでａｃｒＡ遺伝子を発現する微生物と比較して、より長時間維持されるピーク比生産性をもたらす。
別の態様では、本明細書で開示される細胞のいずれかで、ＦＮＲＤＮＡ結合転写調節因子（ＦＮＲ）遺伝子発現の調節を使用して、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産が改善され得る。一態様では、ＦＮＲ遺伝子発現は、野性型細胞と比較してＦＮＲ発現増大をもたらす別のプロモーターで、ＦＮＲをコードする遺伝子のプロモーター配列を置換することで増大され得る。その他の態様では、ＦＮＲをコードする異種核酸が、ＦＮＲを内在性に発現しない細胞で発現され得る。いくつかの態様では、ＦＮＲ発現は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで増大され得る。いくつかの態様では、ＦＮＲ発現増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか、これらの百分率の間の任意の値などのより高いイソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ＦＮＲ発現の増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較してと比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高い瞬間イソプレン収率をもたらす。その他の態様では、ＦＮＲ発現の増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの細胞生産性指数をもたらす。その他の態様では、ＦＮＲ発現の増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンの容積生産性をもたらす。その他の態様では、ＦＮＲ発現の増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、これらの百分率の間の任意の値を含めて、包括的に、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかのより高いイソプレンのピーク比生産性をもたらす。いくつかの態様では、ＦＮＲ発現の増大は、野性型細胞または内在性にＦＮＲを発現しない細胞と比較して、より長時間維持されるピーク比生産性をもたらす。
例示的な宿主細胞
１つまたは複数の遺伝子の異種発現のために使用され得て、生産される核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作され得る、任意の微生物またはそれらの子孫（例えば、組換え宿主細胞）が、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物の生産増大のために、本明細書に記載されるように使用され得る。
グラム陽性またはグラム陰性細菌をはじめとする細菌細胞を使用して、上述の核酸のいずれかを発現させ得る。具体的には、核酸は、Ｐ．シトレア（Ｐ．ｃｉｔｒｅａ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタスＢ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）細胞のいずれか１つで発現され得る。いくつかの態様では、宿主細胞は、ラクトバチルス・デルブレッキイ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）またはラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）などのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種であり得る。
本発明の組成物および方法で宿主細胞として使用し得る、多数のタイプの嫌気性細胞がある。本発明の一態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかに記載される細胞は、偏性嫌気性細胞およびその子孫である。偏性嫌気性菌は、典型的に、酸素が存在する条件では、たとえ増殖したとしても、十分に増殖しない。小量の酸素は存在してもよいものと理解され、すなわち、低レベルの酸素に対して偏性嫌気性菌が有する、いくらかの耐性レベルがある。一態様では、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物を産生するように遺伝子操作された偏性嫌気性菌が、本明細書に記載される方法および／または組成物のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、実質的酸素非含有条件下で培養され、その中では存在する酸素量は、嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない。
本発明の別の態様では、本明細書に記載される組成物また方法のいずれかで記載されおよび／または使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞およびその子孫である。通性嫌気性菌は、酸素が存在すれば、好気性呼吸（例えば、ＴＣＡ回路の利用）によって細胞ＡＴＰを産生し得る。しかし通性嫌気性菌は、酸素不在下でもまた増殖し得る。これは、より多量の酸素の存在下で死滅し、または不十分に増殖する、偏性嫌気性菌とは対照的である。したがって一態様では、通性嫌気性菌が、本明細書で提供される組成物および／または方法のいずれかのための宿主細胞の役割を果たし得て、メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体分子、イソプレノイド、および／またはアセチルＣｏＡ由来産物を産生するように遺伝子操作され得る。通性嫌気性宿主細胞は、存在する酸素量が嫌気性菌の増殖、維持、および／または発酵に有害でない、実質的に酸素非含有の条件下で増殖し得て、または代案としてはより多量の酸素の存在下で増殖し得る。
宿主細胞はさらに、糸状菌細胞およびその子孫であり得る。（例えば、Ｂｅｒｋａ ＆ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７−１５４を参照されたい）。いくつかの態様では、糸状菌細胞は、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｔ．コニンギイ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、Ｔ．ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノース（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、Ｃ．ルクノウェンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）種、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ショウユコウジカビ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、またはＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、Ｆ．ロゼウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．グラミヌム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、Ｆ．セレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）などのフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）などのニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）種、Ｍ．ミーヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）などのケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）種、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種またはエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）種のいずれかであり得る。いくつかの態様では、真菌は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アクレアトウス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、またはＦ．ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）である。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
宿主細胞はまた、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、またはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種などの酵母であり得る。いくつかの態様では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３−４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許第７，６５９，０９７号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。
宿主細胞は、さらに、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ユーグレナ藻類、クロミスタ、または渦鞭毛藻類などの藻類種であり得る。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ ＆ Ｗａｒｍｂｒｏｄｔ，”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｌｇａｅ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｙｅａｓｔ，”（１９９３），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書において利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号明細書に記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、宿主細胞は、形態学に基づいて、以下の群のいずれかに分類されるラン藻などのラン藻である：クロロコックム目（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、プレウロカプサ目（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ）、ネンジュモ目（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）、またはスティゴネマ目（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０−７９を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で利用するためのプラスミドまたはプラスミド構成要素としては、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２８２５４５号明細書、および国際公開第２０１１／０３４８６３号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を使用して、本明細書に記載される上流ＭＶＡ経路ポリペプチドのいずれかなどの１つまたは複数の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドが発現され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物および方法において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を使用して、１つまたは複数のｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドが発現され得る。一態様では、宿主細胞は、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を発現する、メバロン酸を産生する能力がある大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の組換え細胞、またはそれらの子孫である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞（本明細書に記載されるように遺伝子操作されている細胞など）は、上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸が欠損して、１つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含まない同一細胞を上回る量、ピーク力価、および細胞生産性で、メバロン酸を産生し得て、前記細胞は、核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように遺伝子操作されている。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で上流ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸は、染色体コピーであり得る（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組み込まれる）。別の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でｍｖａＥおよびｍｖａＳポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種性に発現した核酸は、染色体のコピーであり得る（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に組み込まれる）。その他の態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は培養中にある。
代表的ベクター
当業者は、発現ベクターが、特定の宿主株について遺伝子発現を最適化する特定構成要素を含有するように、デザインされることを認識するであろう。このような最適化構成要素としては、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書で言及されるベクターおよび構成要素は、例示的な目的のために記載され、本発明の範囲を狭めることは意図されない。
本明細書に記載される組成物および方法のいずれかにおいて、適切なベクターを使用し得る。例えば、適切なベクターを使用して、嫌気性菌内で、ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、および／またはピロリン酸ポリプレニルシンターゼをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーの発現を最適化し得る。いくつかの態様では、ベクターは選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に対する栄養上の利点などの代謝上の利点をもたらす核酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの態様では、上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、ピロリン酸ポリプレニルシンターゼ、および／または１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチド核酸の１つまたは複数のコピーが、選択マーカーなしに宿主細胞ゲノム内に組み込まれる。
本明細書で特徴付けられるまたは本開示の実施例で使用されるベクターのいずれか１つが、使用され得る。
代表的形質転換方法
上流ＭＶＡ経路ポリペプチド、イソプレンシンターゼ、下流ＭＶＡ経路ポリペプチド、および／またはホスホケトラーゼ１つまたは複数のコピーをコードする核酸が、適切な技術を使用して微生物に挿入され得る。さらに、形質転換、電気穿孔、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介またはＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質移入または組換えファージウイルスを使用した形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿によるインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルでの高速衝撃、およびプロトプラスト融合などの、宿主細胞にＤＮＡコンストラクトまたはベクターを導入するための標準的な技術を使用して、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路、および／またはポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸またはそれらを含有するベクターを、宿主細胞（例えば、本明細書に記載される植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または細菌細胞）中に挿入し得る。一般的形質転換技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれ、または染色体外自己複製配列として維持され得る。形質転換体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって選択し得る。形質転換体を選択する適切な方法は、その開示が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第１２／３３５，０７１号明細書（米国特許公開第２００９／０２０３１０２号明細書）、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、および米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。
例示的な細胞培養液
本明細書の用法では、「最少培地」または「最少培地」という用語は、常時ではないが、通常、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸）の存在がない、細胞増殖に可能な最少栄養素を含有する増殖培地を指す。最少培地は、典型的に、（１）微生物（例えば、細菌、藻類、真菌細胞）増殖のための炭素源；（２）微生物（例えば、細菌、藻類、真菌細胞）種および培養条件の間で変動し得る、様々な塩類；および（３）水を含有する。下でより詳細に考察されるように、炭素源は、グルコースのような単糖類から、酵母抽出物などのその他のバイオマスのより複雑な加水分解物まで、顕著に変動し得る。塩類は、概してマグネシウム、窒素、リン、およびイオウなどの不可欠な構成要素を提供し、細胞がタンパク質と核酸を合成できるようにする。最少培地はまた、抗生物質などの選択的作用因子で補足して、特定のプラスミドの維持などについて選択し得る。例えば、微生物が、アンピシリンまたはテトラサイクリンなどの特定の抗生物質に耐性を示す場合、耐性を欠く細胞が増殖するのを妨ぐために、その抗生物質を培地に添加し得る。培地は、必要に応じてその他の化合物で補足して、特定のアミノ酸などの所望の生理学的または生化学的特性について選択し得る。
任意の最少培地調合物を使用して、宿主細胞を培養し得る。例示的な最少培地調合物としては、例えば、Ｍ９最少培地およびＴＭ３最少培地が挙げられる。１リットルのＭ９最少培地あたり、以下を含有する：（１）２００ｍＬの無菌Ｍ９塩（１リットルあたり、６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ、および５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ４（無菌）；（３）２０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（またはその他の炭素源）；および（４）１００μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２（無菌）。１リットルのＴＭ３最少培地あたり、以下を含有する：（１）１３．６ｇのＫ２ＨＰＯ４；（２）１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４；（３）２ｇのＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ；（４）２ｇのクエン酸一水和物；（５）０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム；（６）３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４；（７）０．２ｇの酵母抽出物；および（８）１ｍＬの１０００×微量成分溶液；ｐＨは約６．８に調節され、溶液は濾過滅菌される。１リットルの１０００×微量成分あたり、以下を含有する：（１）４０ｇのクエン酸一水和物；（２）３０ｇのＭｎＳＯ４ ＊Ｈ２Ｏ；（３）１０ｇのＮａＣｌ；（４）１ｇのＦｅＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ；（４）１ｇのＣｏＣｌ２ ＊６Ｈ２Ｏ；（５）１ｇのＺｎＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ；（６）１００ｍｇのＣｕＳＯ４ ＊５Ｈ２Ｏ；（７）１００ｍｇのＨ３ＢＯ３；および（８）１００ｍｇのＮａＭｏＯ４ ＊２Ｈ２Ｏ；ｐＨは約３．０に調節される。
追加的な例示的最少培地は、以下を含む：（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４ ＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７ ＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸第二鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母抽出物（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒからの）、（６）１０００×修正微量金属溶液、（７）硫酸５０％ｗ／ｖ、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、および（９）マクロ塩類溶液３．３６ｍＬ。全ての構成要素を脱イオンＨ２Ｏに共に添加して溶解し、次に加熱滅菌する。室温への冷却に続いて、ｐＨを水酸化アンモニウム（２８％）で７．０に調節して、所定容積にする。滅菌およびｐＨ調節後、ビタミン溶液およびスペクチノマイシンを添加する。
宿主細胞は、任意の炭素源を使用して培養し得る。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる、１つまたは複数の炭素含有する化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するのに使用される細胞培地としては、宿主細胞の生存率維持または増殖に適した任意の炭素源が挙げられる。いくつかの態様では、炭素源は、炭水化物（単糖、二糖類、オリゴ糖、または多糖類など）、または転化糖（例えば、酵素処理スクロースシロップ）である。
いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物、または酵母抽出物の１つまたは複数の構成要素を含む。いくつかの態様では、酵母抽出物の濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物である。いくつかの態様では、炭素源は、酵母抽出物（またはその１つまたは複数の構成要素）と、グルコースなどの別の炭素源との双方を含む。
例示的な単糖類としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ；例示的なオリゴ糖としては、乳糖およびスクロースが挙げられ；および例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース）およびＣ５糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）が挙げられる。
例示的な細胞培養条件
本発明の組換え細胞の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、実施例セクションで後述される。細胞（例えば、細菌、真菌、藻類）培養の維持および増殖に適したその他の材料および方法もまた、技術分野で周知である。例示的な技術は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，編），米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）、またはＢｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．にある。
標準的細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号パンフレットと、その中で引用される参考文献を参照されたい）。いくつかの態様では、細胞は、適切な温度、ガス混合物、およびｐＨ（約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％ＣＯ２、およびｐＨ約５〜約９など）で、増殖され維持される。いくつかの態様では、細胞は、適切な細胞培地中で３５℃で増殖される。いくつかの態様では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０（約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０または約６．５〜約７．０など）である。細胞は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で増殖し得る。さらに、より特異的な細胞培養条件を使用して、細胞を培養し得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などの細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞）は、低コピー数から中程度コピー数プラスミド中で、強力なプロモーターの制御下にある、１つまたは複数の異種核酸を発現し、３４℃で培養される。
使用し得る標準的培養条件と、バッチ、流加、または連続発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号パンフレット、米国特許出願第１２／３３５，０７１号明細書（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号明細書）、国際公開第２０１０／００３００７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号明細書、国際公開第２００９／１３２２２０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号明細書に記載される。バッチおよび流加発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．にある。
いくつかの態様では、細胞は、グルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコース量の約１０５％以下（約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％など）であることを意味する。特定の態様では、培地に添加されるグルコースの量は、特定期間中に細胞によって消費されるグルコースの量と、ほぼ同じである。いくつかの態様では、細胞増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量が支持し得る速度で、細胞が増殖するように、グルコースの添加量を制限することで制御される。いくつかの態様では、グルコースは、細胞の培養時間中に蓄積されない。様々な態様において、細胞は、グルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、または７０時間以上培養される。様々な態様において、細胞は、細胞が培養される総時間の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％以上にわたって、グルコース制限条件下で培養される。いかなる特定の理論による拘束も意図されないが、グルコース制限条件は、細胞のより良好な制御を可能にすると考えられる。
いくつかの態様では、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、バッチ培養中で増殖される。細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）はまた、流加培養または連続培養中で増殖させ得る。さらに、細胞（細菌、真菌、または藻類細胞など）は、上述の最少培地のいずれかをはじめとするが、これに限定されるものではない最少培地中で培養し得る。最少培地は、１．０％（ｗ／ｖ）以下のグルコースまたは任意のその他の六炭糖で、さらに補足し得る。具体的には、最少培地は、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。さらに、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）以下の酵母抽出物で補足し得る。具体的には、最少培地は、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコースで補足し得る。代案としては、最少培地に、１％（ｗ／ｖ）、０．９％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）、０．７％（ｗ／ｖ）、０．６％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．４％（ｗ／ｖ）、０．３％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、または０．１％（ｗ／ｖ）グルコースおよびｗｉｔｈ０．１％（ｗ／ｖ）、０．０９％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０７％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０１％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物を添加し得る。
例示的な精製法
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、生産された化合物を回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレンを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、イソプレンは、吸収ストリッピングによって回収される（例えばその開示が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１Ａ１号明細書を参照されたい）。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、イソプレノイドを回収するステップをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のいずれかは、テルペノイドまたはカロテノイドを回収するステップをさらに含む。
適切な精製法は、その開示が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７Ａ１号明細書に、より詳細に記載される。
代表的生体外タンパク質アセチル化および脱アセチル化アッセイ
代表的アセチル化アッセイは、緩衝液およびアセチルＣｏＡの存在下で実施される。例えばアッセイは、２００μＭのｃＡＭＰ存在下および不在下で、２０ｍＭ緩衝液、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭアセチルＣｏＡ、２０μＭのＵＳＰ中で実施され得る。反応は、２０μＭのＭｔ−ＰａｔＡを添加することで開始され得て、２２℃で１０分間インキュベートして、ＳＤＳローディング色素中で沸騰させることでクエンチされる。代表的緩衝液は、次のように提供される：酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０〜５．０）、ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５〜８．０）、ＢｉｓＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ（ｐＨ９．０）、およびグリシン（ｐＨ１０．０）。反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−ＡｃＬｙｓ抗体ウエスタンブロット法（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と並行して分析され得て、化学発光（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量的に検出される。
脱アセチル化アッセイは、２００μＭのｃＡＭＰ存在下および不在下で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、２０μＭ自己アセチル化Ｍｔ−ＰａｔＡ Ｈ１７３Ｋ変異体中で、２２℃で実施され得る。反応物は、５μＭＲｖ１１５１ｃを添加することで開始され、ＳＤＳローディング色素中で沸騰させることで様々な時点で停止され得る。サンプルは、抗Ａｃ−Ｌｙｓ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法を使用して、並行して分析され得る。
本明細書に記載される方法は、細菌、真菌細胞、および藻類細胞内の全てのタンパク質のアセチル化および脱アセチル化をモニタリングするために使用される。
本発明は、例証として提供され制限を意図するものではない、以下の実施例を参照してさらに理解される得る。
実施例１：標準およびアセチル化調節性株の構築
本実施例は、標準株、ならびに細胞内タンパク質アセチル化調節に関与する遺伝子に変異を含有する株の構築を記載する。
Ｉ．標準株の構築
マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）（株ＡＴＣＣ２３１１４）からのホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）酵素のＤＮＡ配列（配列番号２８）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内における発現のためにコドン最適化され（配列番号２９）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。ＧＥＮＥＡＲＴシームレスクローニングおよび構築キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼがプラスミドｐＥＷＬ１４２１（ｐＴｒｃウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）ｉｓｐＳ（ＭＥＡ変異体）−Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ）にサブクローニングされ、プラスミドｐＭＣＳ８２６（図１３）が得られた。使用されたプライマーは、ホスホケトラーゼではＭＣＳ５３４（ｃｇｃｔａａｃｔｇｃａｔａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃ）（配列番号３２）およびＭＣＳ５３５（ｇｃｔｇｇａｇａｃｃｇｔｔｔａａａｃｔｔｔａａｃｔａｇａｃｔｔｔａ）（配列番号３３）、プラスミドｐＥＷＬ１４２１ではＭＣＳ５３６（ｔａａａｇｔｃｔａｇｔｔａａａｇｔｔｔａａａｃｇｇｔｃｔｃｃａｇｃ）（配列番号３４）およびＭＣＳ５３７（ｇｔｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｃｃｔｔｔａｔｇｃａｇｔｔａｇｃｇ）（配列番号３５）（図１４）であった。プラスミドｐＭＣＳ８２６上のＩｓｐＳおよびホスホケトラーゼ読み取り枠間のＤＮＡの配列は、プライマーＭＣＳ４８８（ｔｔａｇｃｇｔｔｃａａａｃｇｇｃａｇａａｔｃｇｇ）（配列番号３６）およびＭＣＳ５６２（ｃｃｇｔｔｔｇａａｃｇｃｔａａＡＧＡＴＡＣＧＣＧＴＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＧＧＴＡＡＡａｔｇａｔｔａｇｃａａａａｔｃｔａｔｇａｔｇａｔａａａａａｇｔａｔｃｔｇｇ）（配列番号３７）を使用して、ＰＣＲによって改変された。標準技術を使用して、得られたＰＣＲ産物を精製し自己ライゲートさせて、プラスミドｐＭＣＳ１０１９を形成した（図１５）。
ＤＮＡカセットは、ＰＣＲによって二段階処理で作成された。ＦＲＴ−ｇｂ２−ＣＭ−ＦＲＴテンプレート（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）からのプライマーＭＣＳ５０４およびＭＣＳ５１６を使用して、約１．８ｋｂの生成物がＰＣＲによって増幅された。次にこのＰＣＲ産物は、プライマーＭＣＳ５１６およびＭＣＳ５４５を使用した、ＰＣＲによる増幅の第２のラウンドのためのテンプレートとして使用された。このＰＣＲ産物は、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ Ｒｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｑｕｉｃｋ ａｎｄ Ｅａｓｙ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子欠失キットを使用して、製造業者の指示に従って、ＭＤ８９１株（ＢＬ２１ ｗｔ， ｐｇｌ＋ ｔ ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ：：ＦＲＴ， Ｇｉ１．２ｇｌｔＡ ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ ｐｇｌ ＭＬ， ＦＲＴ−ＰＬ．２−２ｃｉｓ−ＲＢＳ１００００−ＭＶＫ（ｂｕｒｔｏｎｉｉ） ｃｌｏｎｅ Ａ ＋ ｔ ａｃｋＡ：：ＦＲＴ）染色体に組み込まれた。以下、Ｇｉ１．２ｇｌｔＡ ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡおよびＣＴＯは同義的に使用され、ｐｇｌＭＬおよびｐｇｌ−は同義的に使用される。得られた株は、ＭＣＳ１０１５（ＭＤ８９１＋ａｃｋＡ：：Ｃｍ＿ｐＬ．２＿ｐｔａ）と称される。ＭＣＳ１０１５株の配列解析は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子上流のクロラムフェニコール抗生物質マーカーおよびｐＬ．２プロモーターの挿入を明らかにした。製造業者の指示に従って、クロラムフェニコール抗生物質マーカーがＦＬＰ発現によってＭＣＳ１０１５株から除去され、ＭＣＳ１０１６（ＭＤ８９１＋ＦＲＴ：：ａｃｋＡ：：ＦＲＴ＿ｐＬ．２＿ｐｔａ）株が作成された。ＭＣＳ１０１６株は、プラスミドｐＭＣＳ１０１９（配列番号３０）およびｐＭＣＭ１２２５（配列番号２７）で形質転換されて、同質遺伝子型株ＭＣＳ１２２７（ｐＭＣＳ１０１９（ｐＴｒｃ＿ＩｓｐＳ＿ＲＢＳ３＿ＰＫＬ１６［Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）］）、ｐＭＣＭ１２２５）およびＭＣＳ１３１６（ｐＭＣＳ１０１９（ｐＴｒｃ＿ＩｓｐＳ＿ＲＢＳ３＿ＰＫＬ１６［Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）］）、ｐＭＣＭ１２２５）が作成された。使用されたプライマーの配列は、表１−１に示される。
Figure 0006744819
ＩＩ．アセチル化染色体変異株の構築
ｙｆｉＱおよびｃｏｂＢの欠失のためのコンストラクトは、ＫｅｉｏライブラリーからのクローンコロニーＰＣＲによって増幅された（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２００６．０００８ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ４１０００５０）。ｙｆｉＱ欠失コンストラクトは、プライマーＭＣＭ１０３８およびＭＣＭ１０３９を使用してＪＷ２５６８（プレート２１、Ｇ１２）から増幅された。ｃｏｂＢ欠失コンストラクトは、プライマーＭＣＭ１０３３およびＭＣＭ１０３５を使用してＪＷ１１０６（プレート２１、Ａ２）から増幅された。製造業者のプロトコルに従って、以下の条件で、５０μＬ反応（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩキット；カタログ６００６７９）を実施した：ｙｆｉＱでは、９５℃、２０分間；（９５℃、２０秒間；５５℃、２０秒間；７２℃、１．５分間）×３０；７２℃、３分間；４℃保持およびｃｏｂＢでは、９５℃、２０分間；（９５℃、２０秒間；５５℃、２０秒間；７２℃、１．２５分間）×３０；７２℃、３分間；４℃保持。ＰＣＲ産物は、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、カタログ２８１０４）に従って精製され、３０μＬ ＥＢ中に溶出された。プライマー配列は、表１−２に示される。
Figure 0006744819
ｙｆｉＱおよびｃｏｂＢにおける構成的プロモーター挿入のためのコンストラクトは、二段階ＰＣＲ処理によって作成された。ＫａｎＲ＿ｇｉ１．６と称されるコンストラクトは、ＦＲＴ−ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴテンプレート（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ）からのプライマーＭＣＳ５８０およびＭＣＳ５８４を使用して、ＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製され、さらなるＰＣＲにおいてテンプレートとして使用された（反応あたり１０ｎｇ）。ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−ｇｉ１．６−ＹｆｉＱコンストラクトは、プライマーＭＣＭ１０４２およびＭＣＭ１０４３を使用して増幅された。ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−ｇｉ１．６−ＣｏｂＢコンストラクトは、プライマーＭＣＭ１０４６およびＭＣＭ１０４８を使用して増幅された。製造業者のプロトコルに従って、以下の条件で、５０μＬ反応（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩキット；カタログ６００６７９）を実施した：９５℃、２０分間；（９５℃、２０秒間；５５℃、２０秒間；７２℃、１．２５分間）×３０；７２℃、３分間；４℃保持ＰＣＲ産物は、製造業者のプロトコル（ＱｉａｇｅｎＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、カタログ２８１０４）に従って精製され、３０μＬ ＥＢ中に溶出された。プライマー配列は、表１−３に示される。
Figure 0006744819
コンストラクトはＤＷ８５３株内に導入され、それはｐＲｅｄＥＴ−ｃａｒｂを保有するＭＤ８９１株である。標準分子生物学手順を使用して、ｐＲＥＤ／ＥＴプラスミド（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）をＭＤ８９１に電気穿孔し、引き続いて５０μｇ／ｍＬの濃度でカルベニシリンを含有する固体ＬＢ培地プレート上で形質転換体を３０℃で増殖させることで、ＤＷ８５３が生成された。ｐＲｅｄＥＴ−ｃａｒｂを含有する細胞は、ＬＢ＋ｃａｒｂ５０中で３０℃で一晩培養され、次に新鮮ＬＢ＋ｃａｒｂ５０中で１：１００に希釈され、３０℃で２時間で培養された。１３０μＬの１０％アラビノースが添加されて、細胞は３７℃でおよそ２時間培養された。細胞は、培養物の半分の容積の冷ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄して、培養物の１０分の１の容積に再懸濁することで、電気穿孔のために調製された。１００μＬの細胞懸濁液が、２ｍｍ電気穿孔キュベット内で３μＬのＤＮＡと組み合わされて、２５ｕＦＤ、２００Ω、２．５ｋＶで電気穿孔され、５００μＬのＬＢで即座にクエンチされた。細胞は回収されて３７℃で３時間振盪され、次に形質転換体が、ＬＢ／ｋａｎ１０プレート上で３７℃で一晩選択された。形質転換体は、再度画線塗抹されて、次に液体ＬＢ／ｋａｎ１０中で培養され、３０％グリセロール中で冷凍された。株の説明は、表１−４に示される。
Figure 0006744819
ＩＩＩ．ＰＬ．２−ｐｔａの形質導入
ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ−ＰＬ．２−ｐｔａ遺伝子座は、形質導入によってＭＣＳ１０１５株からＭＣＭ２７２１株内に移動され、ａｃｋＡの欠失が維持された。ＭＧ１６５５のＰ１溶解産物を使用して、ＭＣＳ１０１５の溶解産物が作成された。この溶解産物の１００μＬが、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＣａＣｌ２の培養物の半分の容積に再懸濁された１００μＬのＭＣＭ２７２１の一晩培養物と混合された。反応物は、３０℃でなおも３０分間培養されて、次に１００μＬの１Ｍクエン酸ナトリウムでクエンチされた。５００μＬのＬＢが添加されて、ＬＢ／ｃｍｐ５プレート上で３７℃で一晩選択する前に、培養物は３７℃１時間で振盪された。単一コロニーは、ＬＢ／ｋａｎ１０ｃｍｐ１０上に再度画線塗抹された。コロニーは培養されて、ＭＣＭ２７２５（ＭＤ８９１ ＋ ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ：：ｙｆｉＱ ＦＲＴ−ｃｍｐ−ＦＲＴ：：ＰＬ．２−ｐｔａ）として冷凍された。
ＩＶ．ループアウト
上記株からの抗生物質マーカーは、ＦＬＰリコンビナーゼの一過性発現によって除去された。プラスミドｐＣＰ２０（ｗｗｗ．ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／Ｓｉｔｅ．ｐｈｐ？ＩＤ＝６４６２１を参照されたい）が電気穿孔されて、ＬＢ／ｃａｒｂ５０上で３０℃で形質転換体が選択された。形質転換体コロニーは、ＬＢ／ｃａｒｂ５０ブロス中で３０℃で濁るまで培養され、次に３７℃で数時間培養された。次に培養物はＬＢプレート上に画線塗抹されて、３７℃で一晩培養された。単一コロニーは、ＬＢ、ＬＢ／ｃａｒｂ５０、ＬＢ／ｋａｎ１０、およびＬＢ／ｃｍｐ５（ＭＣＭ２７２５ループアウト用）上にパッチに植えられた。各抗生物質に対して感受性のコロニーについてＬＢからの画線塗抹が培養されて、３０％グリセロール中で冷凍された。ループアウト株は、表１−５に示される。
Figure 0006744819
Ｖ．イソプレン産生細胞
プラスミドｐＭＣＳ１０１９およびｐＭＣＭ１２２５は、上記宿主に同時電気穿孔されて、イソプレン産生細胞が作成された。形質転換体はＬＢ／ｃａｒｂ５０ｓｐｅｃ５０上で選択されて、単一コロニーは液体ＬＢ／ｃａｒｂ５０ｓｐｅｃ５０中で培養され、３０％グリセロール中で冷凍された。イソプレン産生細胞は、表１−６に示される。
Figure 0006744819
実施例２：増殖速度およびイソプレン比生産性のための小規模アッセイにおけるｙｆｉＱ欠失の評価
本実施例は、ｙｆｉＱ遺伝子の欠失を保有する株において、イソプレン生産および増殖速度を測定した。
Ｉ．材料と方法
ＬＢ培地、酵母抽出物およびＭｇＳＯ４非含有ＴＭ３培地、１０％酵母抽出物、１ＭのＭｇＳＯ４、５０％グルコース、２００ｍＭのＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｍＬカルベニシリン、アルミホイルシール、４８ウェル滅菌５ｍＬブロック、Ｂｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシールメンブレン、アルミホイルシール、９６ウェルマイクロタイタープレート、９６ウェルガラスブロックは、Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃから購入された。Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣには５９７３Ｎ質量分光計が装着された。
ＴＭ培地（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物非含有）、１％グルコース、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足ＴＭ３培地を調製した。一晩培養物を補足ＴＭ３培地中に０．２光学濃度（ＯＤ）で接種することで、４８ウェル滅菌ブロック内で２ｍＬの１日培養を開始した。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、２時間培養した。２時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤが６００ｎｍで測定され、細胞は２００μＭのＩＰＴＧによって誘導された。ＯＤ読み取りはＩＰＴＧ誘導後に４時間にわたり毎時実施されて、増殖速度が判定された。ＯＤ測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＴＭ３培地中で適切に希釈して、６００ｎｍでマイクロタイタープレート内で実施された。
ＩＰＴＧ誘導の２、３、および４時間後に、１００μＬのイソプレンサンプルが９６ウェルガラスブロック内に収集された。ガラスブロックはアルミホイルで密封されて、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養された。３０分間後、ブロックを水浴中で２分間７０℃に維持し、ＧＣ／ＭＳ内でイソプレンヘッドスペース測定を実施して、比生産性を判定した。
ＩＩ．結果
図１Ａは、ｙｆｉＱ欠失細胞と対比して、４時間にわたる対照野性型ｙｆｉＱ細胞の増殖（ＯＤ６００）を示す一方で、図１Ｂは、一晩増殖（ＯＤ６００）を示す。図２は、ｙｆｉＱ欠失細胞と対比して、４時間にわたる対照野性型ｙｆｉＱ細胞のイソプレン比生産性を示す。
実施例３：メバロン酸経路およびイソプレンシンターゼ発現株内のイソプレン生産に対するｙｆｉＱ遺伝子欠失の影響
本実施例は、メバロン酸経路およびイソプレンシンターゼからの導入遺伝子を発現する、１５Ｌ規模の流加培養中で培養された改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（ＢＬ２１由来産生宿主ＭＤ８９１）を使用して、イソプレン生産評価するために実施された。この実験の宿主株はどちらも、酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）ポリペプチドをコードする遺伝子に欠失を保有して、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼを発現する。さらに、どちらもホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）を過剰発現する。
これらのイソプレン産生細胞には、同一処理が実施された。ここでは対照細胞ＭＣＳ１２２７の能力計量が、ｙｆｉＱリジンアセチルトランスフェラーゼが欠失した実験的細胞（細胞の詳細は表３−１に提供される）のものと比較される。関連能力計量は、グルコース上の累積イソプレン収率、イソプレンの容積生産性、およびＣＰＩである。
Figure 0006744819
Ｉ．材料と方法
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍＬの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にした。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質を添加した。
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：
４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
ビタミン溶液（１リットルあたり）：１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
供給液（１キログラムあたり）：０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉＨ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍＬのマクロ塩溶液、６．５５ｍＬのビタミン溶液、０．８２ｍＬの１０００×修正微量金属溶液である。１００μＭのＩＰＴＧ標的：供給物１キログラムあたり１．８７ｍｌの無菌１０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加する。
この実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）および温度（３４℃）における、グルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施した。各実験を開始するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生株の適切な冷凍バイアルを解凍して、トリプトン酵母抽出物（ＬＢ）培地と適切な抗生物質とを含有するフラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）における測定で、種菌がほぼ１．０の光学濃度に増殖した後に、５００ｍＬを使用して１５Ｌバイオリアクターに接種し、初期タンク容積を５Ｌにした。
バイオリアクター背圧を０．７バールゲージに維持し、生産生物に酸素を提供するのに使用される入口ガスは、入口ガスを既知の濃度（７．３〜８．３容積％の酸素）に希釈する、工場内設備によって提供される。
バッチ添加される培地には、グルコースが９．７ｇ／Ｌでバッチ添加された。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで達成される。細胞のＯＤ５５０が６になったら、ＩＰＴＧの無菌溶液を含有するシリンジを添加して、ＩＰＴＧ濃度を１００μＭにした。ｐＨ上昇によってシグナルされるように、ひとたびグルコースが培養物によって消費されたら、グルコース供給液を１０ｇ／分以下の速度で供給して代謝要求を満たした。溶存酸素制限が確立された後、固定時点において、温度を３４℃から３７℃に１時間かけて上昇させた。グルコース上の最大累積イソプレン質量収率を判定するのに十分長い時間、典型的に、合計６４時間の経過発酵時間（ＥＦＴ）にわたり、発酵を実行した。表３−２は、処理条件を示す。
Figure 0006744819
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、Ｈｉｄｅｎ ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計によって独立して判定された。
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。
発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定された。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定された。
ＨＰＬＣ情報は、次のとおり：装置：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５；カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ Ｉｏｎ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ ３００ｍｍ×７．８ｍｍ カタログ番号１２５−０１４０カラム温度：５０℃；ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈ ｒｅｆｉｌｌ ３０ｍｍ×４．６ｍｍカタログ番号１２５−０１２９ランニング緩衝液：０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４；ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分；近似ランニング圧力：約１１００〜１２００ｐｓｉ；注入容積：２０マイクロリットル；検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ Ｋ−２３０１；）実行時間：２６分間。
ＩＩ．結果
イソプレン生産性計量（および値が取得された場合はＥＦＴ）は、表３−３に示される。
Figure 0006744819
経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で測定された酢酸のブロス濃度は、図３に示される。ｙｆｉＱ（ＭＣＭ２７３２）が欠失した実験的細胞は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも低い酢酸のブロス濃度で終了した。酢酸のブロス濃度は、ＨＰＬＣによって評価された。
それぞれ１５Ｌの発酵中で経時的に測定されたグルコース比取り込み速度は、図４に示される。ｙｆｉＱ欠失を保有する実験的細胞（ＭＣＭ２７３２）は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも高いグルコース比取り込み速度を一貫して示す。より低い酢酸のブロス濃度は、おそらくより高いグルコース比取り込み速度の駆動機構であり、それは次により高い容積生産性を駆動する（図５に示される）。平滑化グルコース比取り込み速度は、次式を使用して計算された：
グルコース比取り込み速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝毎時グラムグルコース摂取勾配（８時間にわたる平均化）／ブロス容積＊ＯＤ
それぞれ１５Ｌの発酵中で経時的に得られた容積生産性は、図５に示される。ｙｆｉＱ欠失（ＭＣＭ２７３２）を保有する実験的細胞は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも高いグルコース上のイソプレン容積生産性で終了する。６４時間の時点が使用されて、上記表３−３に値が代入された。容積生産性は、次式を使用して計算された：
容積生産性（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝［Σ（ＩｓｐＥＲ（ｔ）／１０００＊６８．１１７）］／［ｔ−ｔ０］、式中、総和は、ｔ０〜ｔに由来し、ＩｓｐＥＲはイソプレン放出速度である。タンク所要時間は、計算に含まれない。
それぞれ１５Ｌの発酵中で経時的に得られたグルコース上のイソプレン累積収率は、図６に示される。ｙｆｉＱ欠失（ＭＣＭ２７３２）を保有する実験的細胞は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも高いグルコース上のイソプレン累積収率で終了する。ＭＣＭ２７３２でより低いブロス酢酸は、より低い炭素の損失を表すが、効率向上は、酢酸炭素損失の再捕捉によって説明される得るものを上回る。６４時間の時点が使用されて、上記表３−３に値が代入された。全収率は、次式を使用して計算された：
グルコース上の％重量収率＝イソプレン合計（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］、
式中、０．５９はグルコース供給液中のグルコースの重量％であり、８３．５はｔ＝０で発酵槽内にバッチ添加された供給物のグラム数である。各供給物は、その重量％が独立して測定された。
各１５Ｌの発酵中で経時的に得られた細胞性能指数（ＣＰＩ）は、図７に示される。ｙｆｉＱ欠失を保有する実験的細胞（ＭＣＭ２７３２）は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも高い細胞性能指数で終了する。６４時間の時点が使用されて、上記表３−３に値が代入された。ＣＰＩは、次式を使用して計算された：
ＣＰＩ＝総グラムイソプレン／総グラム乾燥細胞重量
各１５Ｌの発酵中で経時的に得られた平滑化イソプレン比生産性は、図８に示される。ｙｆｉＱ欠失を保有する実験的細胞（ＭＣＭ２７３２）は、ｙｆｉＱについて野性型である対照細胞よりも高いピーク比生産性を示す。これは、おそらくより高いグルコース比取り込み速度によって駆動される。６４時間の時点が使用されて、上記表３−３に値が代入された。平滑化イソプレン比生産性は、次式を使用して計算された：
比生産性（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝ＩｓｐＥＲ＊６８．１１７ｇ／ｍｏｌ／ＯＤ。ＩｓｐＥＲは、（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）単位のイソプレン放出速度である。ＯＤ＝光学濃度＝５５０ｎｍにおける吸光度＊水中希釈係数。
平滑化比生産性（ｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ）＝イソプレン毎時生成ミリグラム（８時間間隔で平均化した）の勾配／ブロス容積＊ＯＤ。
これらのアッセイの結果は、ｙｆｉＱ欠失が、イソプレン産生過程においてブロス中に酢酸を蓄積しない株（ＭＣＭ２７３２）をもたらすことを示唆する（図３）。ＭＣＭ２７３２は、発酵稼働全体を通じて、一貫して低い酢酸ブロス濃度を保つ。おそらく、そして理論に束縛されることなく、これはｙｆｉＱをコードする遺伝子が欠失しており、アセチルＣｏＡシンセターゼのアセチル化に低下がもたらされるためである。低下したアセチルＣｏＡシンセターゼのアセチル化は活性を保ち、酢酸をブロスから自由に取り込むことができる。対照的に、対照細胞ＭＣＳ１２２７は約６ｇ／Ｌの酢酸を蓄積し、これはａｃｋＡ欠失を保有するイソプレン産生細胞に起こることの典型例である。おそらく、そして理論に束縛されることなく、これは、酢酸がひとたび細胞から出ると、このポリペプチドをコードする遺伝子が欠失しているために、それが酢酸キナーゼに再度取り込まれ得ないという事実のためである。結論として、ｙｆｉＱ欠失（ＭＣＭ２７３２染色（ｓｔａｉｎ））は、より高いグルコース比取り込み速度をもたらし（図４）、それは次にイソプレン能力に対していくつかの有益な効果を有する（図５）。
実施例４：酢酸と共に培養された細胞内の増殖速度およびイソプレン生産に対するｙｆｉＱ欠失の効果
実施例は、細胞が酢酸存在下で培養された際における、細胞増殖速度およびイソプレン生産に対するｙｆｉＱの欠失効果を探索する。
Ｉ．材料と方法
ＬＢ培地、酵母抽出物およびＭｇＳＯ４非含有ＴＭ３培地、１０％酵母抽出物、１ＭのＭｇＳＯ４、５０％グルコース、２００ｍＭのＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｍＬカルベニシリン、１０％硫酸、および１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液は、社内で製された。アルミホイルシール、４８ウェル滅菌５ｍＬブロック、Ｂｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシールメンブレン、９６ウェルマイクロタイタープレートは、ＶＷＲから購入された。９６ウェルガラスブロックは、Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌから購入された。酢酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａから購入された。Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣには５９７３Ｎ質量分光計が装着された。実施例で使用されたイソプレン産生細胞の概要は、表４−１にある。
Figure 0006744819
一晩培養物は、１０ｍＬプラスチック試験管内で、適切な抗生物質を添加して、３ｍＬのＬＢ培地中のグリセロール培養原液から直接調製された。一晩培養物は、３０℃、２２０ｒｐｍで培養された。
補足ＴＭ３培地は、ＴＭ培地、（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物非含有）１％グルコースまたは様々な濃度の酢酸ナトリウム、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物および妥当な抗生物質を組み合わせることで調製された。一晩培養物を補足ＴＭ３培地中に０．２光学濃度（ＯＤ）で接種することで、４８ウェル滅菌ブロック内で２ｍＬの１日培養物を調整した。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、２時間培養した。２時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤが６００ｎｍで測定され、細胞は２００μＭのＩＰＴＧによって誘導された。ＯＤ読み取りおよびイソプレン比生産性サンプルは、誘導の２〜６時間後から採取された。ＯＤ測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＴＭ３培地中で適切に希釈して、６００ｎｍでマイクロタイタープレート内で実施された。
ＩＰＴＧ誘導の４時間後、１時間毎に、１００μｌのイソプレンサンプルが９６ウェルガラスブロック内に収集された。ガラスブロックはアルミホイルで密封されて、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養された。３０分後、ブロックを７０℃水浴上に２分間保ち、ＧＣ／ＭＳ内でイソプレンヘッドスペース測定を実施した。
ＩＩ．結果
唯一の炭素源として様々な濃度の酢酸上で培養された野性型およびΔｙｆｉＱイソプレン産生細胞増殖速度が、図９に示される一方で、イソプレン比生産性は、図１０に示される。対照的に、この条件セットで、唯一の炭素源としてグルコースを使用して培養された野性型およびΔｙｆｉＱイソプレン産生細胞増殖速度は、図１１に示される一方で、イソプレン比生産性は、図１２に示される。
実施例５：細胞内のイソプレノイド生産に対するｙｆｉＱ遺伝子欠失の影響
本実施例は、メバロン酸経路およびピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたファルネセンシンターゼ（配列番号２６）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたアモルファジエンシンターゼ（配列番号２５））；ピロリン酸ゲラニルシンターゼ；またはゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼからの導入遺伝子を発現する、１５Ｌ規模の流加培養中で培養された改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用して、イソプレノイド生産を評価するために実施される。この実験中の細胞株は、酢酸キナーゼ（ＡｃｋＡ）ポリペプチドをコードする遺伝子に欠失を保有して、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼを発現する。さらに、どちらもホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）を過剰発現する。
これらのイソプレノイド産生細胞には、同一処理が実施された。対照細胞の能力計量は、ｙｆｉＱリジンアセチルトランスフェラーゼが欠失しているまたはｃｏｂＢデアセチラーゼの発現が増大している実験的細胞と比較される。関連能力計量は、上グルコースの累積イソプレノイド収率、イソプレノイド容積生産性、および細胞性能指数である。
Ｉ．イソプレノイド産生細胞の構築
標準技術を使用して、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）シンターゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたファルネセンシンターゼ（配列番号２６）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたアモルファジエンシンターゼ（配列番号２５））；ピロリン酸ゲラニルシンターゼ；またはゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子が、ｐＭＣＳ１０１９またはｐＥＷＬ１４２１のどちらかに、ｉｓｐＳの代わりにクローン化される。得られたプラスミドは、ｐＭＣＭ１２２５と共に宿主株に同時形質転換される。宿主株の部分的一覧は、表５に記載される。
Figure 0006744819
ＩＩ．材料と方法
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍＬの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ Ｈ２Ｏに溶解する。この溶液を加熱滅菌する（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にする。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質を添加する。
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
ビタミン溶液（１リットルあたり）：１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌する。
供給液（１キログラムあたり）：０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉＨ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を共に混合し、高圧蒸気滅菌する。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍＬのマクロ塩溶液、６．５５ｍＬのビタミン溶液、０．８２ｍＬの１０００×修正微量金属溶液である。１００μＭのＩＰＴＧ標的：供給物１キログラムあたり１．８７ｍｌの無菌１０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加する。
この実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）および温度（３４℃）における、グルコースからのイソプレノイド生産をモニターするために実施される。各実験を開始するために、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレノイド産生細胞の冷凍バイアルを解凍し、トリプトン酵母抽出物（ＬＢ）培地および適切な抗生物質と共に、フラスコに接種する。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）における測定で、ほぼ１．０の光学濃度に増殖した後に、５００ｍＬを使用して１５Ｌバイオリアクターに接種し、初期タンク容積を５Ｌにする。
バイオリアクター背圧を０．７バールゲージに維持し、細部に酸素を提供するのに使用される入口ガスは、入口ガスを既知の濃度（７．３〜８．３容積％の酸素）に希釈する、工場内設備によって提供される。
バッチ添加される培地には、グルコースが９．７ｇ／Ｌでバッチ添加される。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで達成される。細胞のＯＤ５５０が６になったら、ＩＰＴＧの無菌溶液を含有するシリンジを添加して、ＩＰＴＧ濃度を１００μＭにする。ｐＨ上昇によってシグナルされるように、ひとたびグルコースが培養物によって消費されたら、グルコース供給液を１０ｇ／分以下の速度で供給して代謝要求を満たす。溶存酸素制限が確立された後、固定時点において、温度を３４℃から３７℃に１時間かけて上昇させる。グルコース上の最大累積イソプレノイド質量収率を判定するのに十分長い時間、典型的に、合計６４時間の経過発酵時間（ＥＦＴ）にわたり、発酵を実行する。
発生気体中のイソプレノイド、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、Ｈｉｄｅｎ ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計によって独立して判定される。発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定される。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定される。
ＨＰＬＣ情報は、次のとおり：装置：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５；カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ Ｉｏｎ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ ３００ｍｍ×７．８ｍｍ カタログ番号１２５−０１４０カラム温度：５０℃；ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈ ｒｅｆｉｌｌ ３０ｍｍ×４．６ｍｍカタログ番号１２５−０１２９ランニング緩衝液：０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４；ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分；近似ランニング圧力：約１１００〜１２００ｐｓｉ；注入容積：２０マイクロリットル；検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ Ｋ−２３０１；）実行時間：２６分間。
実施例６：酢酸循環株の構築
本実施例は、酢酸循環、酢酸生産、およびアセチルＣｏＡ生産の調節に関与する遺伝子に追加的な変異を含有する株の構築を記載する。この実施例は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）の欠失およびｙｆｉＱ遺伝子の欠失を保有する、株の構築を記載する。
Ｉ．ＣＭＰ４００の構築
ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓプロトコルを使用して、クロラムフェニコール耐性標識された構成的ｇｉ１．６プロモーターが、ａｃｓ遺伝子の前に挿入された。ＦＲＴ−ｇｂ２−ｃｍ−ＦＲＴカセットは、プライマーａｃｓＡＵｐｐＫＤ３およびａｃｓＡＤｎＧＩ１．６ｐＫＤ３Ｒを使用して、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓによって提供されるプラスミドからＰＣＲ増幅された。得られたＰＣＲ産物ＦＲＴ−ｃｍｐ−ＦＲＴ：：ｇｉ．６−ａｃｓは、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓプロトコルに従ってｐＲｅｄＥＴプラスミドを保有するＨＭＢ株に変換され、組換え体はＬＢｃｍｐ５プレート上で３７℃で選択された。ＨＭＢ遺伝子型：ＢＬ２１重量、ｐｇｌ＋ｔＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ：：ＦＲＴ。コロニーはｃｍｐＲおよびｃａｒｂＳであることが確認され、次にＣＭＰ４００として冷凍された。
Figure 0006744819
ＩＩ．ＭＤ８０３の構築
４．４２９ｋｂのＰＣＲフラグメントＰｔａ：：Ｋａｎは、プライマーＣＭＰ５３４およびＣＭＰ５３５を使用して、Ｋｅｉｏコレクションから増幅された。このＰＣＲ産物のおよそ３００ｎｇが使用されて、宿主株ＣＭＰ１１４１（ＨＭＢ Ｇｉ１．２ｇｌｔＡ ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ ｐｇｌ ＭＬ （ｐｇｌ（−）） ＋ ｐＲｅｄＥＴＡｍｐ）に組み込まれた。形質転換体は、ＬＡ＋Ｋａｎ１０プレート上で３７℃で選択された。変異体は、その後、同一のセットプライマーによって確認された。得られた株は、ＭＤ８０３（ＣＭＰ１１４１＋ｉｐｔａ：：Ｋａｎ）と命名された。
Figure 0006744819
ＩＩＩ．ＭＣＭ３１５１の構築
ＭＣＭ２０６５株（ＢＬ２１、ΔｐｇｌＰＬ．２ｍＫＫＤｙｌ、ＧＩ１．２ｇｌｔＡ、ｙｈｆＳＦＲＴＰｙｄｄＶＩｓｐＡｙｈｆＳ、ｔｈｉＦＲＴｔｒｕｎｃＩｓｐＡ、ｂＭＶＫ）は、標準法を使用して、ＭＣＭ２７２２（実施例１）のＰ１溶解産物で形質導入されたｙｆｉＱ：：ｋａｎＲ被形質導入体が、ＬＢ ｋａｎ１０プレート上で３７℃で一晩選択された。被形質導入体は再度画線塗抹され、ＰＣＲによって確認された。この株は、ＬＢ ｋａｎ１０中で培養されて、ＭＣＭ２８０１として冷凍された。ｋａｎＲマーカーは、プラスミドｐＣＰ２０の形質転換によってループアウトされ（ｗｗｗ．ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／Ｓｉｔｅ．ｐｈｐ？ＩＤ＝６４６２１を参照されたい）、ＬＢ ｃａｒｂ５０上で３０℃で一晩選択され、液体ＬＢ ｃａｒｂ５０中における３７℃で見かけ上濁るまでの単一コロニーの継代培養がそれに続いた。培養物は抗生物質非含有ＬＢ上に画線塗抹されて、３７℃で一晩培養された。単一コロニーは、抗生物質含有および非含有プレートにパッチに植えられて、ｃａｒｂＳ、ｋａｎＳコロニーが同定された。ＰＣＲを使用して、野生型ａｃｋＡ遺伝子座と未標識のΔｙｆｉＱ遺伝子座の存在が確認された。このコロニーは、ＬＢ中で３７℃で培養されて、ＭＣＭ２８０４として冷凍された。ＭＤ８０３からのＰ１溶解産物を使用して、ＭＣＭ２８０４がｐｔａ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴで形質導入され、被形質導入体は、ＬＢ ｋａｎ１０プレート上で３７℃で一晩選択された。コロニーは、ＬＢ ｋａｎ１０上に再度画線塗抹され、液体ブロス中で培養されて、ＭＣＭ３８０３と同様に冷凍された。Ｐ１溶解産物はＭＣＳ１３８８上で培養され、ＣＭＰ４００のサブクローンを使用して、ＭＣＭ３８０３がＦＲＴ−ｃｍｐ−ＦＲＴ：：ｇｉ．６−ａｃｓで形質導入された。被形質導入体は、ＬＢ ｃｍｐ５プレート上で３７℃で一晩選択された。コロニーはＬＢ ｃｍｐ５上に画線塗抹されて一晩培養され、次に得られた単一コロニーを使用して、液体培養が接種された。この培養物は、ＭＣＭ３１３９として冷凍された。プラスミドｐＭＣＭ１２２５およびｐＭＣＳ１０１９は、ＭＣＭ３１３９に同時電気穿孔されて、形質転換体は、３７℃で一晩培養されたＬＢｃａｒｂ５０ ｓｐｅｃ５０プレート上で選択された。単一コロニーは、液体ＬＢ ｃａｒｂ５０ ｓｐｅｃ５０中で３７℃で培養され、ＭＣＭ３１５１として冷凍された。
Figure 0006744819
ＩＶ．イソプレン産生細胞ＭＤ１２０６（Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼ）およびＭＤ１２０７（Ｅ．ｇａｌホスホケトラーゼ）の構築
ＭＣＭ３１３９は、接種されて一晩培養された。培養物は希釈されて、ＯＤ０．８〜１．０に培養され、次に洗浄されて、プラスミドｐＣＰ２０で電気穿孔された（ｗｗｗ．ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／Ｓｉｔｅ．ｐｈｐ？ＩＤ＝６４６２１を参照されたい）。培養物は、３０℃で１時間回復された。形質転換体はＬＡ＋Ｃａｒｂ５０プレート上で選択されて、３０℃で一晩培養された。得られたＣｍＲマーカー非含有株は、ＭＤ１２０５（ＣＴＯ ｐｇｌ−ＦＲＴ−ＰＬ．２−２ｃｉｓ−ＲＢＳ１００００−ＭＶＫ（ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ｙｆｉＱ：：ＦＲＴ ｐｔａ：：ＦＲＴ ｃｌｏｎｅ Ａ， ＦＲＴ：：ｇｉ１．６−ａｃｓ）と命名された。ＭＤ１２０５は、ｐＭＣＭ１２２５およびｐＭＣＳ１０１９で同時形質転換されてＭＤ１２０６が生成し、またはｐＭＣＭ１２２５およびｐＥＷＬ１４２１で同時形質転換されて、ＭＤ１２０７が生成された。形質転換体は、ＬＡ＋Ｓｐｅｃ５０＋Ｃａｒｂ５０プレート上で選択された。
Figure 0006744819
実施例７：実施例６株のイソプレン収率に対する効果
本実施例は、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）の欠失およびｙｆｉＱ遺伝子の欠失を保有する細胞内で、イソプレン生産測定する。細胞の詳細は、表７−１に提供される。
ｙｆｉＱの欠失およびａｃｓ構成的活性型があるＭＣＭ２７３２株は、酢酸再取り込みおよびイソプレン生産の改善を示した。改善された酢酸再取り込みは、ａｃｋＡ除去株に関連する酢酸蓄積を顕著に低下させ、ならびにイソプレン比生産性を増大させて、生存度を改善させ、稼働の生産的部分を延長し、それはイソプレン力価を増大させた。本実施例は、ｐｔａを欠失させ、それによってホスホケトラーゼ流動（ＡｃＰからイソプレンへ）を増大させることで、酢酸再取り込み向上させる、ＭＣＭ３１５１、ＭＤ１２０６、およびＭＤ１２０７を使用する（図２８）。
Figure 0006744819
Ｉ．材料と方法
培地レシピ（発酵培地１リットルあたり）：７．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、２ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、０．５ｇの酵母抽出物、１．６ｍＬの５０％硫酸、１ｍＬの１０００×修正微量金属溶液。全ての成分を合わせてＤｉ Ｈ２Ｏに溶解した。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分間）。水酸化アンモニウム（２８％）によってｐＨを７．０に調節し、所定容積にした。滅菌およびｐＨ調節後に、１０ｇのグルコース、８ｍＬのビタミン溶液、および抗生物質を添加した。
１０００×修正微量金属溶液（１リットルあたり）：４０ｇのクエン酸＊Ｈ２Ｏ、３０ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、１０ｇのＮａＣｌ、１ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１ｇのＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＨ３ＢＯ３、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
ビタミン溶液（１リットルあたり）：１．０ｇの塩酸チアミン、１．０ｇのＤ−（＋）−ビオチン、１．０ｇのニコチン酸、４．０ｇの塩酸ピリドキシン。各成分をＤｉ Ｈ２Ｏに１つずつ溶解して、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に溶液を所定容積にして、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
マクロ塩溶液（１リットルあたり）：２９６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２９６ｇのクエン酸一水和物、４９．６ｇのクエン酸第二鉄アンモニウム。全ての成分を水に溶解して所定容積にし、０．２２ミクロンフィルターによって濾過滅菌した。
供給液（１キログラムあたり）：０．５９０ｋｇのグルコース、０．３９３ｋｇのＤｉＨ２Ｏ、７．４ｇのＫ２ＨＰＯ４、および８．９ｇの１００％Ｆｏａｍｂｌａｓｔ８８２。全ての成分を混ぜ合わせて、高圧蒸気滅菌した。供給液の高圧蒸気滅菌後、クリーンベンチ内で栄養素補給剤を供給ボトルに入れる。供給物への滅菌後添加物は（供給液１キログラムあたり）、５．５４ｍｌのマクロ塩溶液、６．５５ｍｌのビタミン溶液、０．８２ｍｌの１０００×修正微量金属溶液である。１００μＭのＩＰＴＧ標的：供給物１キログラムあたり１．８７ｍｌの無菌１０ｍｇ／ｍｌ溶液を添加する。
この実験は、所望の発酵ｐＨ（７．０）および温度（３４℃）における、グルコースからのイソプレン生産をモニターするために実施された。各実験を開始するために、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレン産生細胞の冷凍バイアルを解凍し、トリプトン酵母抽出物（ＬＢ）培地および適切な抗生物質と共に、フラスコに接種した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）における測定で、種菌がほぼ１．０の光学濃度に増殖した後に、５００ｍＬを使用して１５Ｌバイオリアクターに接種し、初期タンク容積を５Ｌにした。
バイオリアクター背圧を０．７バールゲージに維持し、細部に酸素を提供するのに使用される入口ガスは、入口ガスを既知の濃度（７．３〜８．３容積％の酸素）に希釈する、工場内設備によって提供された。
バッチ添加される培地には、グルコースが９．７ｇ／Ｌでバッチ添加された。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することで達成される。細胞のＯＤ５５０が６になったら、ＩＰＴＧの無菌溶液を含有するシリンジを添加して、ＩＰＴＧ濃度を１００μＭにした。ｐＨ上昇によってシグナルされるように、ひとたびグルコースが培養物によって消費されたら、グルコース供給液を１０ｇ／分以下の速度で供給して代謝要求を満たした。溶存酸素制限が確立された後、固定時点において、温度を３４℃から３７℃に１時間かけて上昇させた。グルコース上の最大累積イソプレン質量収率を判定するのに十分長い時間、典型的に、合計６４時間の経過発酵時間（ＥＦＴ）にわたり、発酵を実行した。表７−２は、処理条件を示す。
Figure 0006744819
発生気体中のイソプレン、酸素、窒素、および二酸化炭素レベルは、Ｈｉｄｅｎ ＨＰＲ２０（Ｈｉｄｅｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）質量分光計によって独立して判定された。
発酵ブロス中の溶存酸素は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙによって提供される光学センサー付きの清潔な滅菌適性プローブによって測定される。
発酵槽ブロス中のクエン酸、グルコース、酢酸、およびメバロン酸濃度は、４時間間隔で収集されるブロスサンプル中で、ＨＰＬＣ分析によって判定された。ブロスサンプル中の濃度は、既知濃度の標準物質を使用してあらかじめ作成された検量線に対する、屈折率応答の比較によって判定された。
ＨＰＬＣ情報は、次のとおり：装置：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５；カラム：ＢｉｏＲａｄ−Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ Ｉｏｎ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ ３００ｍｍ×７．８ｍｍ カタログ番号１２５−０１４０カラム温度：５０℃；ガードカラム：ＢｉｏＲａｄ−Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈ ｒｅｆｉｌｌ ３０ｍｍ×４．６ｍｍカタログ番号１２５−０１２９ランニング緩衝液：０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４；ランニング緩衝液流速：０．６ｍＬ／分；近似ランニング圧力：約１１００〜１２００ｐｓｉ；注入容積：２０マイクロリットル；検出器：屈折率（Ｋｎａｕｅｒ Ｋ−２３０１；）実行時間：２６分間
ＩＩ．結果
イソプレン生産性計量（および値が取得された場合はＥＦＴ）は、表７−３に示される。
実験株のｐｔａが欠失しなくても酢酸濃度は低く保たれたので、ａｃｓ過剰発現は、ｙｆｉＱ欠失と相まって、（ホスホケトラーゼ経路からの）アセチルリン酸をアセチルＣｏＡ（およびイソプレンを生産するメバロン酸経路に）に送るのに十分であったと思われる。
ＭＤ１２０７株は、他の新規株と同程度には機能しなかった。この株は、典型的にＭ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）ホスホケトラーゼと比較して、より高い発現レベルを示すＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼを発現するので、これは興味深い。誘導後の遅滞の増大は、より緩慢な増殖速度、およびより長いＤＯ％限界到達時間をもたらし、それによって稼働のピーク生産性および高収率相が短縮された。
Figure 0006744819
経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で測定された酢酸のブロス濃度は、図１６に示される。対照および実験的全例で、酢酸のブロス濃度は非常に低かった。実験株は、発酵終了時に、わずかにより低い酢酸濃度を有した。
それぞれ１５Ｌの発酵中で経時的に得られたグルコース上のイソプレン累積収率は、図１７に示される。ｐｔａが欠失した実験的細胞（ＭＤ１２０６）は、ｐｔａを過剰発現する対照細胞（ＭＣＭ２７３２）よりも、グルコース上でより高いイソプレンの累積収率で終了する。６０時間の時点が使用されて、上記表７−３に値が代入された。全収率は、次式を使用して計算された：
グルコース上の％重量収率＝イソプレン合計（ｔ）／［（供給重量（０）−供給重量（ｔ）＋８３．５）＊０．５９）］、
式中、０．５９はグルコース供給液中のグルコースの重量％であり、８３．５はｔ＝０で発酵槽内にバッチ添加された供給物のグラム数である。各供給物は、その重量％が独立して測定された。
経時的にそれぞれ１５Ｌの発酵中で得られたグルコース上のイソプレンの収率（以前の４０時間にわたる）は、図１８に示される。ｐｔａが欠失した実験的細胞ｔｈａｔｉｓｆｏｒ（ＭＤ１２０６）は、ｐｔａを過剰発現する対照細胞（ＭＣＭ２７３２）よりも、グルコース上でより高いイソプレンのピーク「４０時間」収率で終了する。「４０時間」収率は、次式を使用して計算された：
グルコース上の％重量収率＝全イソプレン（ｔｉｎｉｔｉａｌ−ｔ−４０）／［（供給重量（ｔｉｎｉｔｉａｌ−ｔ−４０）＊０．５９）］、
式中、０．５９はグルコース供給液中のグルコースの重量％である。各供給物は、その重量％が独立して測定された。
実施例８：追加的な酢酸循環株の構築
本実施例は、酢酸生産、酢酸循環、およびアセチルＣｏＡ生産に関与する遺伝子に変異を含有する、追加的な株の構築を記載する。ａｃｋＡ遺伝子は、過剰発現されて酢酸のアセチルＣｏＡへの変換を駆動した。別の株では、ａｃｔＰが欠失し、膜を越える酢酸輸送が最小化された。理論に束縛されることなく、酢酸生産が膜を越える輸送に連動すれば、これは、プロトン勾配の脱共役のために、エネルギー損失をもたらし得ると考えられる。
標準分子生物学的技術を使用して、ａｃｋＡの過剰発現のためのコンストラクトが構築された（配列番号１０９）。簡単に述べると、シームレスクローニングおよびアセンブリーによって、ａｃｋＡの隣接領域が、対立遺伝子交換カセット中の異種プロモーター（ＧＩ１．２）に融合された（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ａｃｔＰ欠失コンストラクトはまた、同種の隣接領域を対立遺伝子交換カセットに融合させることで生成された（配列番号１１０）。ａｃｋＡおよびａｃｔＰベクター（図１９）が単離され、次にＭＤ１２０５に形質転換されて、それぞれＤＷ１２４２およびＭＤ１２４３が生成された。テトラサイクリン耐性について陽性組み込み体が選択されて、未標識欠失株は、５％スクロース上の継代によって同定された。最終的な変異株は、ＰＣＲおよび配列決定によって確認された。ｐＭＣＭ１２２５およびｐＥＷＬ１４２１のＤＷ１２４２への同時形質転換はＤＷ１２４５を生成し、ＭＤ１２４３への同時形質転換はＭＤ１２４５を生成した。
Figure 0006744819
Figure 0006744819
実施例９：イソプレン収率および増殖速度に対する実施例８株の効果
本実施例は、ｙｆｉＱ遺伝子の欠失およびａｃｔＰ欠失またはａｃｋＡ過剰発現のどちらかを保有する細胞内で、イソプレン生産および増殖速度測定した。
Ｉ．材料と方法
ＬＢ培地、酵母抽出物およびＭｇＳＯ４非含有ＴＭ３培地、１０％酵母抽出物、１ＭのＭｇＳＯ４、５０％グルコース、２００ｍＭのＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｍＬカルベニシリン、アルミホイルシール、４８ウェル滅菌５ｍＬブロック、Ｂｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシールメンブレン、アルミホイルシール、９６ウェルマイクロタイタープレート、９６ウェルガラスブロックは、Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃから購入されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣには５９７３Ｎ質量分光計が装着された。
ＴＭ培地（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物非含有）、１％グルコース、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足ＴＭ３培地を調製した。一晩培養物を補足ＴＭ３培地中に０．２光学濃度（ＯＤ）で接種することで、４８ウェル滅菌ブロック内で２ｍＬの１日培養を開始した。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、２時間培養した。２時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤが６００ｎｍで測定され、細胞は２００μＭのＩＰＴＧによって誘導された。ＯＤ読み取りはＩＰＴＧ誘導後に４時間にわたり毎時実施されて、増殖速度が判定された。ＯＤ測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＴＭ３培地中で適切に希釈して、６００ｎｍでマイクロタイタープレート内で実施された。
ＩＰＴＧ誘導の２、３、および４時間後に、１００μＬのイソプレンサンプルが９６ウェルガラスブロック内に収集された。ガラスブロックはアルミホイルで密封されて、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養された。３０分間後、ブロックを水浴中で２分間７０℃に維持し、ＧＣ／ＭＳ内でイソプレンヘッドスペース測定を実施して、比生産性を判定した。
ＩＩ．結果
ａｃｔＰ欠失（ＭＤ１２４５）およびａｃｋＡ過剰発現（ＤＷ１２４５）細胞は、どちらも対照細胞と比較して、より高い二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）を示し、改善された呼吸速度を示す（図２０Ａ〜Ｄ）。どちらの細胞も対照と比較して、改善されたイソプレン力価および比生産性を示し、ａｃｔＰ細胞は、イソプレン収率の改善を示した（図２１Ａ〜Ｄ）。これらの結果は、酢酸生産および／または酢酸循環周辺の改善を示し、イソプレン生産のいくつかの異なるパラメータに対する有益な効果を有する。理論により拘束されることなく、解糖およびホスホケトラーゼを通じて流動を最適化することで、この効果を達成することが可能である。
実施例１０：ペントースリン酸経路調節株の構築
本実施例は、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の調節に関与する遺伝子の変異を含有する株の構築を記載する。
理論により拘束されることなく、ホスホケトラーゼ発現宿主における炭素流の均衡に重要なペントースリン酸経路の４つの遺伝子は、ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｒｐｅ、およびｒｐｉＡであると考えられる。Ｘ５Ｐに向かう循環炭素を最大化することは、解糖、ペントースリン酸経路、およびホスホケトラーゼを介する流動間の配分を最適化し得る。以下に記載されるコンストラクトは、染色体中のｙｆｉＱ遺伝子座に、全ての４つの非酸化的ペントースリン酸遺伝子を組み込んで、過剰発現するようにデザインされた。このコンストラクトは、ＰＰＰを介した炭素の経路指示を改善する単なる一試行に相当し、これは、このコンストラクトの精密化は、より多くのプロモーター、ターミネーターの追加、遺伝子再配置などによって、ホスホケトラーゼを介した流動平衡を保つための最適発現レベルを判定するのを助ける可能性が非常に高い。
ＰｆｋＡを調節することで、上で論じたＰＰＰの４つの遺伝子の他に、ペントースリン酸経路の調節が達成され得る。理論により拘束されることなく、ＰｆｋＡは、主要な侵入点を制御して解糖中のノードを調節すると考えられ、ホスホケトラーゼ（ＰＫＬ）が適切に機能するためには、ホスホフルクトキナーゼの活性が低下されなくてはならない可能性が高い。これは、利用可能フルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）を増大させ、別のホスホケトラーゼ基質であるキシルロース−５−リン酸（Ｘ５Ｐ）に向かう、ペントースリン酸を介する炭素流を駆動する。
Ｉ．ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｒｐｅ、およびｒｐｉＡ変異株の構築
ＰＰＰ遺伝子は最適化されて、ｇＢｌｏｃｋｓ二本鎖の遺伝子断片としてＩＤＴから注文された。全ての４つの遺伝子は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にＴＯＰＯクローン化され、引き続くクローニングに先だって配列決定された。初期ベクターは、ＧＩ１．２またはＧＩ１．６プロモーターおよび相同組換えのための側面に位置する部位を用いて、シームレスアセンブリー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって構築された。単一オペロン中に全ての４つのＰＰＰ遺伝子がある最終的なベクターもまた、シームレスクローニング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって構築された（図２２）（配列番号１１１）。このプラスミドは、対立遺伝子交換のためにＭＤ１２０５に形質転換されて、株はテトラサイクリン耐性によって単離された。非依存性株は、５％スクロース耐性によって選択され、適切なゲノム遺伝子座の挿入の存在は、ＰＣＲによって確認された。この細胞は、ＭＤ１２８０として冷凍された。ＭＤ１２８０は、ｐＭＣＭ１２２５およびｐＥＷＬ１４２１で同時形質移入されて、ＭＤ１２８４が生成された。
Figure 0006744819
Figure 0006744819
ＩＩ．ｐｆｋＡ変異株の構築
部分的機能性タンパク質分解タグが生成され、ｐｆｋＡが下方制御された。ＷＴ ＢＬ２１バックグラウンドでＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓリコンビニアリングを使用して（製造業者の推奨プロトコルに従って）、ｔｍＲＮＡ中の最後のアミノ酸位置から３番目のランダム変異が、ＰｆｋＡのＣ末端に融合された（図２３）。次に変異体は、増殖プロファイラー中でＴＭ３グルコース中の増殖についてスクリーニングされた。（図２４）。最後の位置から３番目にイソロイシン（Ｉ）がある変異体は、天然アミノ酸ロイシン（Ｌ）と非常に類似する可能性が高い。したがってこれは、「ＷＴ」タグの高タンパク質分解速度のために、最も緩慢に増殖した。アルギニン（Ｒ）がある変異体はより軽微な効果を示し、スレオニン（Ｔ）は障害性が最も少なかった。これらの３つの変異株が選択され、Ｒ６Ｋ対立遺伝子交換方法を使用して、ＭＤ１２０５またはＭＤ１２８０内に移動された。簡単に述べると、下に列挙されるプライマーから生成されるＰＣＲ断片は、シームレスクローニング反応（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてｔｅｔ−ｓａｃ（ＴＳ）およびＲ６Ｋ断片と共に使用されて、対立遺伝子交換のためのプラスミドが得られる（配列番号１１２）。次にこれらのプラスミドは、テトラサイクリン耐性について選択することで、ＭＤ１２０５またはＭＤ１２８０内に導入され、次に引き続く５％スクロース含有培地上への播種によって、逆選択された。ｐｆｋＡに個別タンパク質分解タグの変異を保有する株は、ＰＣＲおよび配列決定によって同定された。ｐＭＣＭ１２２５およびｐＥＷＬ１４２１は、標準分子生物学的技術を使用して各細胞に形質移入された。株の詳細については、表１０−２を参照されたい。
Figure 0006744819
実施例１１：イソプレン収率に対するペントースリン酸経路調節の効果
Ｉ．材料と方法
ＬＢ培地、酵母抽出物およびＭｇＳＯ４非含有ＴＭ３培地、１０％酵母抽出物、１ＭのＭｇＳＯ４、５０％グルコース、２００ｍＭのＩＰＴＧ、５０ｍｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０ｍｇ／ｍＬカルベニシリン、アルミホイルシール、４８ウェル滅菌５ｍＬブロック、Ｂｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒシールメンブレン、アルミホイルシール、９６ウェルマイクロタイタープレート、９６ウェルガラスブロックは、Ｚｉｎｓｓｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃから購入されたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０ ＧＣには５９７３Ｎ質量分光計が装着された。
ＴＭ培地（ＭｇＳＯ４および酵母抽出物非含有）、１％グルコース、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２％酵母抽出物、および適切な抗生物質を組み合わせることで、補足ＴＭ３培地を調製した。一晩培養物を補足ＴＭ３培地中に０．２光学濃度（ＯＤ）で接種することで、４８ウェル滅菌ブロック内で２ｍＬの１日培養を開始した。ブロックをＢｒｅａｔｈｅ Ｅａｓｉｅｒメンブレンで密封し、６００ｒｐｍおよび３４℃で、２時間培養した。２時間の増殖後、マイクロタイタープレート内でＯＤが６００ｎｍで測定され、細胞は２００μＭのＩＰＴＧによって誘導された。ＯＤ読み取りはＩＰＴＧ誘導後に４時間にわたり毎時実施されて、増殖速度が判定された。ＯＤ測定は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＴＭ３培地中で適切に希釈して、６００ｎｍでマイクロタイタープレート内で実施された。
ＩＰＴＧ誘導の２、３、および４時間後に、１００μＬのイソプレンサンプルが９６ウェルガラスブロック内に収集された。ガラスブロックはアルミホイルで密封されて、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ上で４５０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で３０分間培養された。３０分間後、ブロックを水浴中で２分間７０℃に維持し、ＧＣ／ＭＳ内でイソプレンヘッドスペース測定を実施して、比生産性を判定した。
ＩＩ．結果
ペントースリン酸経路の上方制御とｐｆｋＡの下方制御の双方がある細胞は、流加条件下でアッセイされた。ペントースリン酸経路の上方制御のみがある細胞（ＭＤ１２８４）は、対照ＭＤ１２０７細胞と比較して良好に機能した（図２５Ａ〜Ｄおよび２６Ａ〜Ｄ）。ＰＰＰ上方制御細胞は、対照よりも改善された増殖を示し、さらにより迅速な瞬間イソプレン／ＣＯ２生産およびより高い収率を示した。したがって４つの非酸化的遺伝子の組み合わせを使用したペントースリン酸経路の上方制御は、イソプレン生産に有益である。これは、ＰＫＬ（キシルロース−５−リン酸）のために利用可能な基質の増大に、または経路を通過する全体的流動に利益をもたらし得るペントースリン酸の中間体（グリセルアルデヒド−３−リン酸またはセドヘプツロース−７−リン酸など）のより効果的な均衡に、起因し得る。タンパク質分解タグによるｐｆｋＡの下方制御がある全ての細胞は、発育不良であり、性能が対照細胞に及ばなかった（図２７Ａ〜Ｂ）。これはおそらく、実施例１０における増殖に対する幅広い効果にもかかわらず、全ての３つのタグに対する高すぎる分解速度のためであった。ｐｆｋＡタグの追加的な変異は、増殖速度を改善させる可能性が高い一方で、解糖およびホスホケトラーゼ間の適切な流動配分をなおも駆動する。
実施例１２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）標準およびアセチル化調節株の構築
本実施例は、標準株、および細胞内タンパク質アセチル化調節に関与する遺伝子の変異を含有する株の構築を記載する。本実施例はまた、メバロン酸経路およびイソプレンシンターゼを発現するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株内におけるイソプレン生産に対する、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失の効果の測定を記載する。
Ｉ．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＰ．トレムロイデス（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）イソプレンシンターゼおよびホスホケトラーゼ経路の発現のためのコンストラクトを用いた標準株の構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）コドン最適化Ｐ．トレムロイデス（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）イソプレンシンターゼおよびＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ホスホケトラーゼ遺伝子は、ＤＮＡ２．０によって合成された。分子生物学的技術を使用して、遺伝子がＰＣＲ増幅され、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ｍｉｃｒｏｎプラスミドまたは染色体への挿入に適するコンストラクトにクローン化された。次にコンストラクトは、以下の構造を有する：上流相同性−プロモーター−遺伝子−ターミネーター−マーカー−下流相同性）。酵母細胞は形質転換されて、形質転換体が選択された。いくつかのコロニーが選択されて、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのバクトペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）に接種され培養される。ＤＮＡは培養物から単離されて、精製される。コンストラクトは、誤り耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅され、配列決定されて、ＤＮＡ配列が修正されたことが確認される。さらに、いくつかの株では、１つまたは複数のＭＶＡ経路ポリペプチドが、同様に酵母宿主細胞で発現される。
ＩＩ．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を含有する標準株の構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルトランスフェラーゼの欠失もまた含有する、上述されるような株が、を標準分子生物学プロトコル使用して生成される。
ＩＩＩ．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）組換え株におけるイソプレンの生産
上に記載されるイソプレンシンターゼ形質転換体の１５および３６時間培養物の１ｍｌが、ヘッドスペースバイアルに移される。バイアルは密封されて、３０℃で５時間培養される。ヘッドスペースガスが測定されて、イソプレンは上に記載される方法によって同定される。
実施例１３：ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）または酢酸循環調節のどちらかに関与する遺伝子の変異をさらに含有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチル化調節株の構築
本実施例は、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）または酢酸循環の調節に関与する遺伝子の変異をさらに含有する、実施例１２からの酵母株の構築を記載する。本実施例はまた、イソプレン生産に対するこれらの変異体の効果の測定も記載する。
Ｉ．１つまたは複数のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＰＰ遺伝子の過剰発現、または酢酸循環遺伝子の発現または過剰発現を含有する標準株の構築
上記実施例１２作成される株（変異アセチル化タンパク質、イソプレンシンターゼ、ホスホケトラーゼおよびＭＶＡ経路ポリペプチドを含有する）は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＰＰ遺伝子の変異を含有する株を生成するようにさらに操作される。これらは、標準分子生物学プロトコルを使用して生成される。ホスホケトラーゼ発現宿主における炭素流均衡に関与する、酵母ペントースリン酸経路内のＫＬ１、ＴＡＬ１、ＲＰＥ１、およびＲＫＩ１遺伝子が、酵母中の発現について最適化される。遺伝子は、標準分子生物学的技術を使用してクローン化されアセンブルされて、ＰＰＰ経路の４つの活性の異なる量を発現する。これらのプラスミドは酵母細胞に変換されて、株が単離され冷凍される。独立した株は、ＰＣＲによって確認される。代案としては、またはそれに加えて、上記の実施例１２で生成される株は、酢酸循環遺伝子の変異を含有するようにさらに操作される。コンストラクトの１つのセットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ホスホトランスアセチラーゼ （サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化されてＤＮＡ２．０によって合成された）を発現し、さらに別のシリーズは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アセチルＣｏＡシンターゼの過剰発現ありまたはなしで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酢酸キナーゼ（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためにコドン最適化されてＤＮＡ２．０によって合成された）を発現する。酢酸キナーゼおよびアセチルＣｏＡシンターゼのためのさらなる遺伝子が、導入される。
ＩＩ．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）組換え株におけるイソプレンの生産
上に記載されるイソプレンシンターゼ形質転換体の１５および３６時間培養物の１ｍｌが、ヘッドスペースバイアルに移される。バイアルは密封されて、３０℃で５時間培養される。ヘッドスペースガスが測定されて、イソプレンは上に記載される方法によって同定される。
実施例１４：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）標準およびアセチル化調節株の構築
本実施例は、標準株、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）における細胞内タンパク質アセチル化調節に関与する遺伝子の変異を含有する株の構築を記載する。本実施例はまた、メバロン酸経路およびイソプレンシンターゼを発現するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株内におけるイソプレン生産に対する、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失の効果の測定を記載する。
Ｉ．イソプレンシンターゼ、ＭＶＡ経路、およびＰＫＬを発現するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株の構築
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）コドン最適化ウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）またはＰ．トレムロイデス（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）イソプレンシンターゼ、Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＰＫＬおよびＥ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ｍｖａＥおよびｍｖａＳａｒｅをコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０．によって合成された。標準分子生物学的技術を使用して、ソホロース誘導性プロモーターの制御下にあるｐＴｒｅｘ３ｇなどのベクターに、遺伝子がクローン化される。ｐｙｒ２トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）プロトプラストは、上記コンストラクトの混合物で形質転換され、形質転換体は、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）が添加されたａｍｄＳ選択プレート上で選択される。安定した形質転換体は、グルコース−ソホロース炭素源を含有する培地中で培養され、免疫ブロットによって、ＩｓｐＳ、ＰＫＬ、およびＭＶＡ経路タンパク質の発現についてスクリーニングされる。全てのタンパク質を発現する株は、イソプレン生産についてスクリーニングされる。胞子の製精およびさらなる操作のために、イソプレン生産株が選択される。
ＩＩ．トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の欠失を含有する株の構築
標準分子生物学プロトコルを使用して、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）アセチルトランスフェラーゼの欠失を含有するイソプレン産生株が生成された。簡単に述べると、ｈｐｈ遺伝子側面に位置するｌｏｘＰを含有するカセットが、標的アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の内部または側面に位置する、２〜４ｋｂの染色体ＤＮＡに挿入される。このカセットはＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロトプラストに形質転換されて、フォーゲルプレート上でハイグロマイシン耐性形質転換体が選択される。安定した形質転換体は、カセット挿入のためにＰＣＲによってスクリーニングされて、標的遺伝子座の中断が確認され、引き続いて胞子が精製される。得られた株は、イソプレンを産生し、アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が欠失していることが確認される。
ＩＩＩ．Ｐｔａを通じた酢酸循環のための株の構築
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）コドン最適化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｔａをコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０によって合成される。標準分子生物学的技術を使用して、遺伝子は、ｈｐｈ標識テロメアベクター上のｃｂｈ１からなどのソホロース誘導性プロモーターの制御下でクローン化される。このＤＮＡを使用して、リジンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失ありまたはなしのイソプレン産生トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のプロトプラストが変換される。形質転換体は、ハイグロマイシンを含有するフォーゲルプレート上で選択される。
ＩＶ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｓ１を通じた酢酸循環株の構築
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）コドン最適化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｃｋＡをコードする遺伝子は、ＤＮＡ２．０によって合成される。標準分子生物学的技術を使用して、遺伝子は、ｈｐｈ標識テロメアベクター上のｃｂｈ１からなどのソホロース誘導性プロモーターの制御下でクローン化される。ソホロース誘導性プロモーターからのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｃｓ１遺伝子の第２のカセット発現が、ベクターにクローン化される。このＤＮＡを使用して、リジンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子欠失ありまたはなしのイソプレン産生トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のプロトプラストが変換される。形質転換体は、ハイグロマイシンを含有するフォーゲルプレート上で選択される。
Ｖ．トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の組換え株のイソプレンの生産
表１１に示される株の培養物は、グルコース−ソホロースによって誘導され、１５および３６時間目に、各培養物から１ｍＬがヘッドスペースバイアルに移される。バイアルは密封されて、３２℃で５時間培養される。ヘッドスペースガスが測定されて、イソプレンは上に記載される方法によって同定される。ブロスは清澄化され、ＭＶＡはＨＰＬＣによって同定される。
Figure 0006744819
















配列
Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）ｍｖａＥ
Figure 0006744819
 Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）ｍｖａＳ
Figure 0006744819
 Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＥ
Figure 0006744819
 Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ｍｖａＳ
Figure 0006744819
 Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ｍｖａＥ
Figure 0006744819
 Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ｍｖａＳ
Figure 0006744819
 Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＥ
Figure 0006744819
 Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）ｍｖａＳ
Figure 0006744819
 Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２（ｍｖａＥ）
Figure 0006744819
 Ｅ．ガリナーラム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２（ｍｖａＳ）
Figure 0006744819

























Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）（ｍｖａＥ）
Figure 0006744819
 Ｌ．グレイ−（Ｌ．ｇｒａｙｉ）（ｍｖａＳ）
Figure 0006744819
 Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）（ｍｖａＥ）
Figure 0006744819
 Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）（ｍｖａＳ）
Figure 0006744819
 Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）（ｍｖａＥ）
Figure 0006744819
 Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）（ｍｖａＳ）
Figure 0006744819
 アセトアセチル（Ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ）−ＣｏＡ−シンターゼ
Figure 0006744819
 Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＥ
Figure 0006744819
 Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）ｍｖａＳ
Figure 0006744819
 Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）（ｍｖａＥ）
Figure 0006744819
 Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）（ｍｖａＳ）
Figure 0006744819
 ＭＥＡウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼ
Figure 0006744819
 ｉｓｐＡ
Figure 0006744819
 ＭＥＡウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレンシンターゼ
Figure 0006744819
 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたアモルファジエンシンターゼ
Figure 0006744819
 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のためにコドン最適化されたファルネセンシンターゼ
Figure 0006744819
 ｐＭＣＭ１２２５−ｐＣＬ−Ｐｔｒｃ−Ｕｐｐｅｒ＿ＧｃＭＭ＿１６３（エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＥＧ２）
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ２３１１４からのホスホケトラーゼのアミノ酸配列
Figure 0006744819
 マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ）ＡＴＣＣ２３１１４からのホスホケトラーゼのコドン最適化されたＤＮＡ配列
Figure 0006744819
 ｐＭＣＳ１０１９の配列
Figure 0006744819
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 プラスミドｐＭＣＳ８２６のＤＮＡ配列
Figure 0006744819
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 ＭＣＳ５３４
ｃｇｃｔａａｃｔｇｃａｔａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃ 配列番号３２
ＭＣＳ５３５
ｇｃｔｇｇａｇａｃｃｇｔｔｔａａａｃｔｔｔａａｃｔａｇａｃｔｔｔａ 配列番号３３
ｏＭＣＳ５３６
ｔａａａｇｔｃｔａｇｔｔａａａｇｔｔｔａａａｃｇｇｔｃｔｃｃａｇｃ 配列番号３４
ＭＣＳ５３７
ｇｔｔｔｔｔｔｔａｃｃｔｃｃｔｔｔａｔｇｃａｇｔｔａｇｃｇ 配列番号３５
ＭＣＳ４８８
ｔｔａｇｃｇｔｔｃａａａｃｇｇｃａｇａａｔｃｇｇ 配列番号３６
ＭＣＳ５６２
Figure 0006744819
 ＭＣＳ５０４
Figure 0006744819
 ＭＣＳ５１６
Figure 0006744819
 ＭＣＳ５４５
Figure 0006744819
 ＭＣＭ１０３３
ＡＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴ 配列番号４１
ＭＣＭ１０３５
ＣＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧ配列番号４２
ＭＣＭ１０３８
ＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＡ 配列番号４３
ＭＣＭ１０３９
ＴＴＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧＣＡ 配列番号４４
ＭＣＳ５８０
ａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇｇｃ 配列番号４５
ＭＣＳ５８４
Figure 0006744819
 ＭＣＭ１０４２
Figure 0006744819
 ＭＣＭ１０４３
Figure 0006744819
 ＭＣＭ１０４６
Figure 0006744819
 ＭＣＭ１０４８
Figure 0006744819
 サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）アセチルトランスフェラーゼｇｉ｜１６５０３８１０｜ｅｍｂ｜ＣＡＤ０５８３５．１｜
Figure 0006744819
 ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＧＣＮ５ファミリーＮ−アセチルトランスフェラーゼ
Figure 0006744819
 ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）タンパク質アセチルトランスフェラーゼＥＦＤ６６２４７
Figure 0006744819
 マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）アセチルトランスフェラーゼｇｉ｜１５６０８１３８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿２１５５１３．１｜
Figure 0006744819
 マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アセチルトランスフェラーゼｇｉ｜１１８４６８１８７｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿８８９６９７．１｜
Figure 0006744819
 サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＮＡＤ依存性デアセチラーゼｇｉ｜１６７６４５７６｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿４６０１９１．１｜
Figure 0006744819
 ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）ＮＡＤ依存性デアセチラーゼｇｉ｜４９９４７１４３４｜ｒｅｆ｜ＷＰ＿０１１１５８０７４．１｜
Figure 0006744819
 マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＮＡＤ依存性タンパク質デアシラーゼｇｉ｜６１４１０３４９４｜ｓｐ｜Ｐ９ＷＧＧ３．１｜ＮＰＤ＿ＭＹＣＴＵ
Figure 0006744819
 ａｃｓＡＵｐｐＫＤ３
Figure 0006744819
 ａｃｓＡＤｎＧＩ１．６ｐＫＤ３Ｒ
Figure 0006744819
 ＣＭＰ５３４
ｇｔｇｃａａａｔｔｃａｃａａｃｔｃａｇｃｇｇ 配列番号６１
ＣＭＰ５３５
ｃａｃｃａａｃｇｔａｔｃｇｇｇｃａｔｔｇｃ 配列番号６２
ＴＳＦｏｒ
ｔｃｃｔａａｔｔｔｔｔｇｔｔｇａｃａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇ 配列番号６３
ＴＳＲｅｖ
ｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｇａｇａａａｔａａａａｇａａａａｔｇｃｃａ 配列番号６４
ａｃｔＰＵｐＦｏｒ
ｔｔｔａｔｔｔｃｔｃａａｃａａｇａｔｇｇｇｃａｇｇｃｔａｔｃｇｃｇａｔｇｃｃａｔｃｇｔａａｃ 配列番号６５
ａｃｔＰＵｐＲｅｖ
ｇｇａｇａｇａｔｔａｃａｔｇａｔｇｃｔｔｇｔａｃｃｔｃａｔｇｃａｇｇａ 配列番号６６
ａｃｔＰＤｏｗｎＦｏｒ
ａａｇｃａｔｃａｔｇｔａａｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃｃｃｇｇｔｃｇｃｃｔｇａ 配列番号６７
ａｃｔＰＤｏｗｎＲｅｖ
ａｇｔｇｔｃａａｃａａａａａｔｔａｇｇａｃｇｔａａｃｃａｃｃａｔｔｔａｃｔｇｔｃｔｇｔｇｇａ 配列番号６８
ａｃｔＰＴｅｓｔＦｏｒ
ｃｔｇｇｃｇｔａｇｔｃｇａｇａａｇｃｔｇｃｔｔｇａ 配列番号６９
ａｃｔＰＴｅｓｔＲｅｖ
ｇｃａｔａｇｃｇｇａａｃａｔｇａａｔｔｔａｇａｇｔ 配列番号７０
ａｃｋＡＵｐＦｏｒ
ｔｔｔａｔｔｔｃｔｃａａｃａａｇａｔｇｇｃｇｇａｔｃｇａｇｃａｔａｇｔｃａｔｃａｔｃｔｔｇｔａｃｔ 配列番号７１
ａｃｋＡＵｐＧＩＲｅｖ
ｃｇｇｔｔｇａｔｔｔｇｔｔｔａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔａｔｔｔｇｃｔｃａｇｇａｔｇｔｇｇｃａｔｎｇｔｃａａｇｇｇｃｇａａｔｔｔｇａｃｇａｃｔｃａａｔｇａａｔａｔｇｔａｃｔ 配列番号７２
ａｃｋＡＤｏｗｎＧＩＦｏｒ
ａｃｃａｃｔａａａｃａａａｔｃａａｃｃｇｃｇｔｔｔｃｃｃｇｇａｇｇｔａａｃｃｔａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｔｃｇａｇｔａａｇｔｔａｇｔａｃｔｇｇｔｔｃｔｇａ 配列番号７３
ａｃｋＡＤｏｗｎＲｅｖ
ａｇｔｇｔｃａａｃａａａａａｔｔａｇｇａｇｔａｃｃｃａｔｇａｃｃａｇａｃｃｔｔｃｃａｇｃ 配列番号７４
ａｃｋＡＵｐＰＬＲｅｖ
Figure 0006744819
 ａｃｋＡＤｏｗｎＰＬＦｏｒ
Figure 0006744819
 ａｃｋＡＥＸＴｅｓｔＦｏｒ
ｔｇｃａｇｇｃｇａｃｇｇｔａａｃｇｔｔｃａｇｃａｔ 配列番号７７
ａｃｋＡＥＸＴｅｓｔＲｅｖ
ｇｔｇｇａａｇａｔｇａｔｃｇｃｃｇｇａｔｃｇａｔａ 配列番号７８
Ｒ６ＫＴＳＲｅｖ
ａｇｔｇｔｃａａｃａａａａａｔｔａｇｇａｃｔｇｔｃａｇｃｃｇｔｔａａｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｇｔ 配列番号７９
ａｃｔＰＲ６ＫＦｏｒ
ｇｇｔｇｇｔｔａｃｇｃａｇｔｔｃａａｃｃｔｇｔｔｇａｔａｇｔａｃｇｔａ 配列番号８０
ａｃｔＰＲ６ＫＲｅｖ
ｇｇｔｔｇａａｃｔｇｃｇｔａａｃｃａｃｃａｔｔｔａｃｔｇｔｃｔｇｔｇｇａ 配列番号８１
ｙｆｉＱＤＯＷＮＦｏｒ
ＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴ 配列番号８２
ｙｆｉＱＤＯＷＮＧＩ１．６Ｒｅｖ
Figure 0006744819
 ｙｆｉＱＤＯＷＮＧＩ１．２Ｒｅｖ
Figure 0006744819
 ｙｆｉＱＵＰＧＩＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｙｆｉＱＵＰＲｅｖ
ＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＡ 配列番号８６
ｙｆｉＱＴｅｓｔＦｏｒ
ＧＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＡ 配列番号８７
ｙｆｉＱＴｅｓｔＲｅｖ
ＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＡＴＴＧＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴ 配列番号８８
ｒｐｅＲ６ＫＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｒｐｅＲ６ＫＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｔｋｔＲ６ＫＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｔｋｔＲ６ＫＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｒｐｉＲ６ＫＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｒｐｉＲ６ＫＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｔａｌＲ６ＫＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｔａｌＲ６ＫＲｅｖ
ＧＡＣＣＧＧＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡ 配列番号９６
Ｒ６ＫＰｌａｓｍｉｄＦｏｒ
ＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＴＧＡ 配列番号９７
Ｒ６ＫＰｌａｓｍｉｄＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｐｆＫＡｔｍＲＮＡＸＡＡＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡｔｍＲＮＡＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡＵＰＦｏｒ
ＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＧＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＴＣＣＴＡＣＡＴ 配列番号１０１
ｐｆｋＡＵＰＲｅｖ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡＤＯＷＮＲＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡＤＯＷＮＩＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡＤＯＷＮＴＦｏｒ
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡＤＯＷＮＲｅｖ
ＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＧＴＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＣＧＴ 配列番号１０６
ｐｆｋＡＴｅｓｔＦｏｒ
ＣＴＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＧＣＧＧＴＡ 配列番号１０７
ｐｆｋＡＴｅｓｔＲｅｖ
ＧＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴ 配列番号１０８
ａｃｋＡ過剰発現プラスミド
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 ａｃｔＰ欠失プラスミド
Figure 0006744819
 ペントースリン酸経路上方制御プラスミド
Figure 0006744819
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 ｐｆｋＡｔｍＲＮＡ対立遺伝子交換ベクター
Figure 0006744819
Figure 0006744819
 ＰＬ．６構成的プロモーター−λプロモーター、ＧｅｎＢａｎｋＮＣ＿００１４１６
Figure 0006744819

Claims (21)

  1. イソプレンを産生できる組換え細胞であって、
    （ｉ）ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸であって、前記細胞が前記ＹｆｉＱポリペプチドの活性が前記ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸発現の低下、減衰、または欠失によって調節されるように修飾されている、核酸；
    （ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および
    （ｉｉｉ）イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸
    を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養がイソプレンの生産を提供する、組換え細胞。
  2. イソプレノイド前駆体を産生できる組換え細胞であって、
    （ｉ）ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸であって、前記細胞が前記ＹｆｉＱポリペプチドの活性が前記ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸発現の低下、減衰、または欠失によって調節されるように修飾されている、核酸；および
    （ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸
    を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が前記イソプレノイド前駆体の生産を提供する、組換え細胞。
  3. イソプレノイドを産生できる組換え細胞であって、
    （ｉ）ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸であって、前記細胞が前記ＹｆｉＱポリペプチドの活性が前記ＹｆｉＱポリペプチドをコードする核酸発現の低下、減衰、または欠失によって調節されるように修飾されている、核酸；
    （ｉｉ）ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；および
    （ｉｉｉ）ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする異種核酸
    を含んでなり、適切な培地中の前記組換え細胞の培養が前記イソプレノイドの生産を提供する、組換え細胞。
  4. 前記細胞が、
    （Ｉ）ＰａｔポリペプチドおよびＡｃｕＡポリペプチドからなる群から選択される１つまたは複数のアセチルトランスフェラーゼをコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が前記１つまたは複数のアセチルトランスフェラーゼの活性が前記１つまたは複数のアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸発現の低下、減衰、または欠失によって調節されるように修飾されている、核酸
    をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  5. 前記細胞が、
    （ＩＩ）ＳｒｔＮポリペプチドから選択されるデアセチラーゼをコードする核酸であって、前記細胞が前記ＳｒｔＮポリペプチドの活性が前記ＳｒｔＮポリペプチドをコードする核酸発現の増大によって調節されるように修飾されている、核酸
    をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  6. 前記イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）またはポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、またはウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）×ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）交配種に由来するポリペプチドである、請求項１、４および５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 前記ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドが、（ａ）２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素；（ｂ）アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合してＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素；および（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  8. 前記組換え細胞が、
    （ａ）ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種核酸；
    （ｂ）１つまたは複数の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸；
    （ｃ）１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が、ペントースリン酸経路タンパク質をコードする核酸の発現および／またはペントースリン酸経路タンパク質の活性が調節されるように修飾されており、かつ前記ペントースリン酸経路タンパク質が、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、リボース−５−リン酸エピメラーゼ（ｒｐｉＡ）およびホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ）からなる群から任意的に選択される、１つまたは複数の核酸；
    （ｄ）１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が、酢酸循環タンパク質をコードする核酸の発現、および／または酢酸循環タンパク質の活性が調節されるように修飾されており、かつ前記酢酸循環タンパク質が、アセチル補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）からなる群から任意的に選択される、１つまたは複数の核酸； および
    （ｅ）ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｄｈＲ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄＡ、ｇｌｔａ、ａｃｓ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、ａｃｔＰ、ｐｆｋＡ、ｒｐｅ、ｒｐｉＡ、ｔｋｔａ、ｔａｌＢ、ｐｇｌ、ｅｄｄ、およびｅｄａからなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸であって、前記細胞が核酸の発現および／またはタンパク質の活性が調節されるように修飾されている、１つまたは複数の核酸
    のうちの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
  9. １つまたは複数のアセチル化タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、ＭＶＡ経路の１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸、イソプレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、ポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、１つまたは複数のペントースリン酸経路タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、１つまたは複数の酢酸循環タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸、または請求項８（ｅ）に記載の１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸が、
    （ａ）誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター下に置かれる；
    （ｂ）１つまたは複数のマルチコピープラスミドにクローニングされる；または
    （ｃ）前記細胞の染色体に組み込まれる、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  10. 前記組換え細胞が、グラム陽性細菌細胞、グラム陰性細菌細胞、真菌細胞、糸状菌細胞、藻類細胞または酵母細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  11. 前記イソプレン生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項１および４〜１０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  12. 前記イソプレン生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）イソプレン対二酸化炭素比、（ｖ）比生産性、または（ｖｉ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレン生産が少なくとも５％増大される、請求項１１に記載の組換え細胞。
  13. （ａ）請求項１および４〜１２のいずれか一項に記載の組換え細胞をイソプレンの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレンを生産するステップと、任意的にさらに（ｃ）イソプレンを回収するステップとを含んでなる、イソプレンを生産する方法。
  14. 前記イソプレノイド前駆体が、メバロン酸（ＭＶＡ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、およびイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）からなる群から選択される、請求項２、４、５および７〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 前記イソプレノイド前駆体の生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項２、４、５、７〜１０および１４のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  16. 前記イソプレノイド前駆体の生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレノイド前駆体の生産が少なくとも５％増大される、請求項１５に記載の組換え細胞。
  17. （ａ）請求項２、４、５、７〜１０および１４〜１６のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイド前駆体の生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイド前駆体を生産するステップと、さらに任意的に（ｃ）イソプレノイド前駆体を回収するステップとを含んでなる、イソプレノイド前駆体を生産する方法。
  18. 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パトコウロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピネン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項３〜５および７〜１０のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  19. 前記イソプレノイドの生産が、アセチル化タンパク質をコードする核酸の発現および／またはアセチル化タンパク質の活性が調節されるように修飾されていない組換え細胞と比較して増大される、請求項３〜５、７〜１０および１８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  20. 前記イソプレノイド生産の増大が、（ｉ）力価、（ｉｉ）瞬間収率、（ｉｉｉ）累積収率、（ｉｖ）比生産性、または（ｖ）細胞生産性指数の増大を含んでなる、イソプレノイド生産が少なくとも５％増大される、請求項１９に記載の組換え細胞。
  21. （ａ）請求項３〜５、７〜１０および１８〜２０のいずれか一項に記載の組換え細胞を、イソプレノイドの生成に適した条件下で培養するステップと、（ｂ）イソプレノイドを生産するステップと、さらに任意的に（ｃ）イソプレノイドを回収するステップとを含んでなる、イソプレノイドを生産する方法。
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