CN109486720B - 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109486720B
CN109486720B CN201811548717.4A CN201811548717A CN109486720B CN 109486720 B CN109486720 B CN 109486720B CN 201811548717 A CN201811548717 A CN 201811548717A CN 109486720 B CN109486720 B CN 109486720B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
xylulose
xylitol
producing
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811548717.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109486720A (zh
Inventor
张涛
江波
朱雯惠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201811548717.4A priority Critical patent/CN109486720B/zh
Publication of CN109486720A publication Critical patent/CN109486720A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109486720B publication Critical patent/CN109486720B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种产L‑木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供的枯草芽孢杆菌可以木糖醇为底物，生产L‑木酮糖，经验证，该菌株能够产4‑木糖醇脱氢酶，酶活达到0.95U/mL。应用该菌株通过发酵法制备L‑木酮糖具有安全环保的特点，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

Description

一种产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
4-木糖醇脱氢酶第二个结构元素和序列与典型短链脱氢酶一致，其氨基酸基因序列与短链脱氢酶/还原酶家族成员有高度相似性，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可合成多种碳水化合物。目前，XDH酶能催化木糖醇进行氧化反应生成L-木酮糖，利用单一底物木糖醇生产L-木酮糖。
随着糖尿病、肥胖等健康问题的普及，人们对低糖食品、功能性调味剂以及一些低卡路里的甜味剂倾注了越来越多的关注。其中很大一部分是关于稀有糖的研究和开发。L-木酮糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以用于糖尿病患者血液中葡萄糖水平的降低。目前，已有以L-木酮糖作为主要成分的降血糖药物通过审核。由于体内葡萄糖内酯主要在肝脏内代谢，代谢产物包括L-木酮糖，因此，尿液中的L-木酮糖的含量变动可以表征这一代谢过程的正常与否。由此可知L-木酮糖在医疗保健等领域发具有很大的应用前景。
自然界中，L-木酮糖的含量极少，有L-木酮糖制备方法的研究报道较少。目前，L-木酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、产物得率低等问题。4-木糖醇脱氢酶(xylitol 4-dehydrogenase，EC 1.1.1.10)隶属氧化还原酶，能够在NAD+存在的情况下氧化木糖醇生成L-木酮糖。在这种情况下，对辅因子进行控制对进一步提高目的产物产量来说非常关键。通过辅因子再生技术生物转化合成产物，基于长远考虑是最具潜力的。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一株产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌，可转化木糖醇生成L-木酮糖，对L-木酮糖的生产具有重要的意义。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SK46.001，已于2017年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2017165。
本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物包括所述产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌活性成分。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物含有所述产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物为药物。
在本发明的一种实施方式中，所述药物由所述产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌细胞和药学上可接受的载体组成。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物为食品。
在本发明的一种实施方式中，所述食品由所述枯草芽孢杆菌的发酵液和食品上可接受的载体组成。
本发明的第三个目的是提供所述枯草芽孢杆菌的应用，具体用于化学、食品及制药领域。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是应用所述枯草芽孢杆菌生产L-木酮糖，所述方法包括向终浓度为20-100g/L的木糖醇加入2×109～1.5×1010CFU菌体/g木糖醇的细胞，37℃保温3-24h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体步骤为：以含20-100g/L的木糖醇的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50mM，pH 10.0)为反应体系，按照2×109～1.5×1010CFU菌体/g木糖醇的浓度加入枯草芽孢杆菌细胞，37℃保温3-24h。
本发明还要求保护所述枯草芽孢杆菌在生产含L-木酮糖的产品方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。
本发明的有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌可以木糖醇为底物，生产L-木酮糖，经验证，该菌株能够产4-木糖醇脱氢酶，酶活达到0.95U/mL。应用该菌株通过发酵法制备L-木酮糖具有安全环保的特点，在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。
生物材料保藏
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK46.001，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SK46.001，已于2017年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2017165。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌SK46.001产4-木糖醇脱氢酶验证；其中，自左向右第一条泳道为2000marker；第二泳道为xdh基因(795bp)；
图2为枯草芽孢杆菌SK46.001发酵及酶活曲线；
图3为枯草芽孢杆菌SK46.001转化生产L-木酮糖的曲线。
具体实施方式
用半胱氨酸咔唑比色法检测L-木酮糖的生成量：将转化液经适当稀释后，移取1mL转化液，加入0.2mL半胱氨酸盐酸盐溶液，6mL硫酸溶液，摇匀后立即加入0.2mL咔唑酒精溶液，60℃水浴保温10min，冷却10min。以空白调零，在560nm处测定吸光度。
计算生产的木酮糖含量，计算酶活。酶活单位(U/mL)：每毫升发酵液每分钟产生1μg L-木酮糖的酶量为1个酶活力单位。
实施例1菌株产4-木糖醇脱氢酶的能力验证
设计P1:5-GGGAATTCCATATGAGCGGTGAATATGACGTTAACCTGCG-3和P2：5-CGGGATCCTTAATGATGATG ATGATGCCAG ATGGTAAAGC CA-3两条引物，对菌株编码4-木糖醇脱氢酶的基因进行验证，结果显示扩增出一条795bp左右的片段，说明该菌株存在编码4-木糖醇脱氢酶的基因，见图1。
实施例2枯草芽孢杆菌SK46.001的培养和发酵
种子培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，以双蒸水配制。
发酵培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，蔗糖(5g/L)，尿素(5g/L)，FeSO4·7H2O(0.01g/L)，MgSO4(0.05g/L)，MnSO4(0.01g/L)，pH 8.0，以双蒸水配制。
用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃，200rpm，培养12～14h。以2％的接种量接种至发酵培养基中，37℃，200rpm，并定时取样，测定OD600，酶活数据见图2。枯草芽孢杆菌SK46.001发酵15h酶活为0.95U/mL，OD达到2.6；发酵21h酶活为0.44U/mL，OD为1.88。
实施例3L-木酮糖的转化生产
(1)全细胞转化：1mL的反应体系中，加入1mL的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50mM，pH 10.0)溶解的20g/L的木糖醇，1mL的发酵液离心收集得到的菌体，37℃保温3h，然后煮沸10min以终止酶反应。
(2)用半胱氨酸咔唑比色法检测L-木酮糖的生成量，计算酶活。转化液经适当稀释后，移取1mL转化液，加入0.2mL 15g/L的半胱氨酸盐酸盐溶液，6mL体积分数为70％的硫酸溶液，摇匀后立即加入0.2mL 1.2g/L咔唑酒精溶液，60℃水浴保温10min，冷却10min。以空白调零，在560nm处测定吸光度。通过标准曲线计算生产的木酮糖含量，计算酶活。
结果如图3所示，反应3h，L-木酮糖的产量达148mg/L；反应6h后，L-木酮糖的产量达到175mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggaattcca tatgagcggt gaatatgacg ttaacctgcg 40
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggatcctt aatgatgatg atgatgccag atggtaaagc ca 42

Claims (8)

1.一株产L-木酮糖的枯草芽孢杆菌SK46.001，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SK46.001，已于2017年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2017165。
2.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SK46.001，或枯草芽孢杆菌SK46.001和其代谢产物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SK46.001菌体和药学上可接受的载体组成。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SK46.001菌体和食品上可接受的载体组成。
5.一种生产L-木酮糖的方法，其特征在于，向终浓度为20-100g/L的木糖醇加入2×109～1.5×1010CFU菌体/g木糖醇的权利要求1所述枯草芽孢杆菌SK46.001细胞，35～37℃保温3～24h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤为：以含20～100g/L的木糖醇的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液为反应体系，按照2×109～1.5×1010CFU菌体/g木糖醇的浓度加入枯草芽孢杆菌细胞，35～37℃保温3～24h。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SK46.001在生产含L-木酮糖的产品方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含L-木酮糖的产品为α-葡萄糖苷酶抑制剂。
CN201811548717.4A 2018-12-18 2018-12-18 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用 Active CN109486720B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811548717.4A CN109486720B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811548717.4A CN109486720B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109486720A CN109486720A (zh) 2019-03-19
CN109486720B true CN109486720B (zh) 2020-08-04

Family

ID=65710661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811548717.4A Active CN109486720B (zh) 2018-12-18 2018-12-18 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109486720B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112980731B (zh) * 2021-03-12 2022-10-04 南京工业大学 一株产l-木酮糖菌株及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1254244B1 (en) * 2000-01-21 2010-04-14 Danisco A/S Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
BR112013016264A2 (pt) * 2010-12-22 2018-06-19 Danisco Us Inc produção biológica de açúcares de pentose com o uso de células recombinantes
EP3339426B1 (en) * 2011-10-07 2022-08-24 Danisco US Inc. Utilization of phosphoketolase in the production of mevalonate, isoprenoid precursors, and isoprene
JP6744819B2 (ja) * 2014-02-20 2020-08-19 ダニスコ・ユーエス・インク メバロン酸、イソプレン、イソプレノイド前駆体、イソプレノイド、およびアセチルＣｏＡ由来産物の生産向上のための組換え微生物

Also Published As

Publication number Publication date
CN109486720A (zh) 2019-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sinha et al. Biohydrogen production from various feedstocks by Bacillus firmus NMBL-03
CN101445786B (zh) 一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法
TWI638891B (zh) 微生物共培養系統及其應用
Rocha et al. Physiological diversity within the Kluyveromyces marxianus species
JP2011004764A (ja) ペントース含有基質からの乳酸の製造
CN106434483B (zh) 一种布氏乳杆菌及其应用
CN104630166A (zh) 微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法
CN101475967A (zh) 一种混菌发酵木质纤维素制备丁酸的方法
CN109486720B (zh) 一种产l-木酮糖的枯草芽孢杆菌及其应用
CN102199632B (zh) 一种转化dl-乳酸制备丙酮酸的方法
CN102146415A (zh) 氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除菌及其制备方法
CN102433288B (zh) 一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法
CN106191140B (zh) 微生物发酵生产甘油酸的菌株hd1025和方法
CN110093302B (zh) 一种乳杆菌突变菌株及其应用
CN102533607B (zh) 一株产β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
CN101486984A (zh) 一种氧化葡糖杆菌及利用其制备木酮糖的方法
US7083955B2 (en) Preparation of lactic acid from a pentose-containing substrate
JP5051727B2 (ja) 耐熱性エタノール生産酵母及びこれを用いたエタノール生産方法
CN100526470C (zh) 一种功能性甜味剂d-塔格糖的制备方法
CN102433290B (zh) 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法
CN114134056A (zh) 酿酒酵母zjs10041及其在发酵产s-腺苷蛋氨酸中的应用
KR101975105B1 (ko) 사과 당절임에서 분리된 당 분해능 및 가스 생성능이 우수한 카자크스타니아 세르바지이 균주
CN101781625B (zh) 一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用
CN103937733A (zh) 一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法
CN111073830B (zh) 一株高产γ-谷氨酰转肽酶的干酪乳杆菌及其在L-茶氨酸生产中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant