TWI638891B - 微生物共培養系統及其應用 - Google Patents

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Abstract

一種微生物共培養系統(co-culture system)，其係包含：(1)一基質，其係含有一醣類；(2)一第一菌株及一第二菌株之至少一者，其中該第一菌株係具有固定一碳氧化物的能力，該第二菌株係具有於發酵反應中代謝一胺基酸的能力，且其中該第一菌株係於發酵反應中產生一第一代謝物，該第二菌株係於發酵反應中產生一第二代謝物；以及(3)一第三菌株，其具有於發酵反應中代謝該醣類、該第一代謝物及該第二代謝物以生成丁酸及/或丁醇的能力，其中，當於該共培養系統存在該第二菌株時，該基質更含有該胺基酸。

Description

微生物共培養系統及其應用
本發明係關於一種微生物共培養系統及其應用，尤其是關於該共培養系統在生產有機化合物(例如丁酸與丁醇等)的應用。特定言之，本發明共培養系統中的微生物可交互利用彼此於發酵反應中所產生的代謝物及代謝副產物，從而提高整體發酵之生產效率及碳轉化率。
自20世紀初以來，隨著生質燃料(biofuel)的發展，工業上便廣泛使用細菌、酵母菌、黴菌等微生物以進行發酵反應，將生質燃料轉化為較具經濟效益的有機化合物，例如有機酸以及醇類。其中，在生成有機化合物的微生物發酵方法中，以丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)發酵程序(如第1圖所示)最廣為使用。於ABE發酵路徑中，透過微生物，可以將含有醣類之原料(玉米、薯類、糖蜜等)轉化為丙酮酸(pyruvate)，再進一步將丙酮酸轉化為乙醯-輔酶A(acetyl-CoA)，以生成例如乙酸、乙醇、丁酸、或丁醇等較具經濟效益之有機化合物。
然而，上述將丙酮酸轉化為乙醯-輔酶A的過程會伴 隨著例如二氧化碳之碳氧化物的釋放(如第1圖所示)而導致從原料到產物之不必要的碳源損失(carbon loss)。已知，於ABE發酵程序中，將原料轉化為產物的碳轉化率最高僅約66%，導致有機化合物的產率不佳，造成不必要的成本及資源浪費。
有鑒於上述關於成本及資源浪費的問題，業界持續致力於發酵微生物菌種的選育及改良。在單一微生物發酵方面，歐洲專利申請案WO 2009/154624 A1係揭示一使用經基因改良之酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)進行發酵反應的方法，其藉由將ABE發酵路徑中與乙酸生合成相關之基因(pta、ack)加以剔除，以提高發酵產物的專一性；美國專利申請案US 2008/0248540A1則揭示一使用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)進行發酵以生產丁酸，再藉由化學反應將丁酸轉化為丁醇的方法；然而，前述二方法皆因無法有效提升產率而缺乏經濟效益。多重微生物發酵方面，美國專利US 8,420,359 B2係揭示一發酵系統，該系統結合了乳酸發酵程序與ABE發酵程序，以乳酸發酵程序所生成的代謝產物(即，乳酸)作為ABE發酵程序中的共基質，以增加主產物(即，丁醇)的產量；美國專利US 8,293,509 B2則揭示一種以雙槽發酵系統生產丁醇的方法，該系統係配置有二個不同的微生物發酵槽，藉由串連該二發酵槽，回收並利用特定之副產物；然而，前述二發酵系統皆必須使用二個以上之發酵槽，且必須針對不同的發酵系統進行個別控制，並非理想的作法。本發明即針對前述需求所為之研究成果。
本案發明人經戮力研究而完成一種微生物共培養系統，此系統中所包含的微生物可穩定共生，且可交互利用彼此於發酵反應中所產生的代謝物或代謝副產物，具有互補關係(如第2A、2B、2C圖所示)。將此系統應用於發酵反應中，可將多元料源轉化為例如丁酸、丁醇等有機化合物，且可達到有效利用原料、減少不必要之能源損失、提供良好的目標產物產率等需求。
因此，本發明之一目的，在於提供一種微生物共培養系統(co-culture system)，其係包含：(1)一基質，其係含有一醣類；(2)一第一菌株及一第二菌株之至少一者，其中該第一菌株係具有固定碳氧化物的能力，該第二菌株係具有於發酵反應中代謝一胺基酸的能力，且其中該第一菌株係於發酵反應中產生一第一代謝物，該第二菌株係於發酵反應中產生一第二代謝物；以及(3)一第三菌株，其具有於發酵反應中代謝該醣類第一代謝物及該第二代謝物以生成丁酸及/或丁醇的能力，其中，當於該共培養系統存在該第二菌株時，該基質更含有該胺基酸。較佳地，該微生物共培養系統更包含一共基質(co-substrate)，其較佳係選自以下之至少一者：乳酸、及氣態基質。
本發明之另一目的，在於提供一種生產丁酸之方法，其係包含：提供一如上述之微生物共培養系統，其中該第三菌株於發酵反應之代謝物係包含丁酸；以及將該微生物共培養系 統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應。較佳地，該方法更包含對該發酵產物進行一分離純化操作
本發明之又一目的，在於提供一種生產丁醇之方法，其係包含：提供一如上述之微生物共培養系統；將該微生物共培養系統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應；以及視需要進行一化學轉化反應以將丁酸轉化為丁醇。較佳地，該方法更包含於進行該化學轉化反應之前，先對該發酵產物進行一分離純化操作。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖係丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)發酵路徑之示意圖，其中，①係EMP路徑；②係丙酮酸-鐵氧還原蛋白氧化還原酶(pyruvate-ferredoxin oxidoreductase)；③係乙醯輔酶A-乙醯基轉移酶/巰解酶(acetyl CoA-acetyl transferase/thiolase)；④係β-羥基丁醯-輔酶A脫氫酶(β-hydroxy butyryl CoA dehydrogenase)；⑤係巴豆酸酶(crotonase)；⑥係丁醯-輔酶A脫氫酶(butytyl CoA dehydrogenase)；⑦係磷酸丁醯轉移酶(phosphotransbutyrylase)；⑧係丁酸激酶(butyrate kinase)；⑨係丁醛脫氫酶(butyraldehyde dehydrogenase)；⑩係丁醇脫氫酶(butanol dehydrogenase)；⑪係磷酸乙醯轉移酶(phosphotransacetylase)；⑫係乙酸激酶(acetate kiase)；⑬係乙酵脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase)；⑭係乙醇脫氫酶 (ethanol dehydrogenase)；⑮係輔酶A轉移酶(CoA transferase)；⑯係乙醯乙酸脫羧酶(acetoacetate decarboxylase)；⑰係鐵氧還原蛋白NAD(P)+還原酶(ferredoxin-NAD(P)+ reductase)；⑱係氫化酶(hydrogenase)；⑲係丁醯-輔酶A-乙酸轉移酶(bytyryl CoA-acetate transferase)；⑳係乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)。
第2A係本發明微生物共培養系統之一具體實施態樣之示意圖，其顯示本發明第一菌株及第三菌株之代謝物、代謝副產物的交互利用情形；第2B係本發明微生物共培養系統之另一具體實施態樣之示意圖，其顯示本發明第二菌株及第三菌株之代謝物、代謝副產物的交互利用情形；第2C圖係本發明微生物共培養系統之又一具體實施態樣之示意圖，其顯示本發明第一菌株、第二菌株、及第三菌株之代謝物、代謝副產物的交互利用情形；第3圖說明本發明第一菌株進行固定碳氧化物作用而將碳氧化物納入發酵反應的步驟中以生成乙酸(鹽)之代謝過程示意圖；第4A圖說明本發明第三菌株以碳水化合物作為碳源進行發酵反應以生成丁酸(鹽)之代謝過程示意圖；以及第4B圖說明本發明第三菌株以碳水化合物或有機酸作為碳源進行發酵反應以生成丁酸(鹽)之代謝過程示意圖。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。另，本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」等詞，係實質上代表與所述之數值相差在20%以內者，較佳在10%以內者，且更佳在5%以內者。
於本發明中，所謂的「微生物」係指肉眼無法看見的生物體(例如：細菌、真菌)，且可包括於自然界中自然存在的野生型(wild type)，以及因任何因素(天然或人為)所產生的突變型(mutant)。所謂「發酵反應」係指微生物於厭氧氛圍下代謝一或多種物質以產生有機化合物的過程。所謂「培養基」係指可提供微生物菌株生長、繁殖所需的養分與條件(如酸鹼值、溼度等)之必要成分物質，通常係視所欲培養之微生物菌株而調整組成，例如可添加以下之一或多者以調整原料至一所欲的pH值(例如：pH6)：氯化氫、氫氧化鈉、氫氧化銨(NH4OH)、硫酸銨((NH4)2SO4)、氯化銨(NH4Cl)、乙酸銨、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO3)、檸檬酸(citric acid)、含水硫酸鎂(MgSO4˙7H2O)、含水硫酸鐵(FeSO4˙7H2O)、含水硫酸錳(MnSO4˙7H2O)，或調整其他物理、化學或生理性質。所謂「基質(substrate)」，係指能夠 在微生物發酵反應中作為原料，進入發酵反應之代謝路徑而被轉化為其他物質者。所謂「碳氧化物」係指一氧化碳、二氧化碳、或其組合
除非另外單獨限定，否則於本說明書中所述的化學名稱即指該化學名稱的所有異構型式，舉例言之，但不限於，鏡像異構物(enantiomer)、非鏡像異構物(diastereomer)及構形異構物(conformational isomer)。舉例來說，「乳酸」、「葡萄糖」、「木糖」、「半乳糖」等詞即同時包括D型(D form)及L型(L form)異構物。當該醣類可同時存在開環及環狀型式時，其椅型(chair form)的構形異構物及α、β異構物均包括在內。
於本說明書中，所謂「碳轉化率」係指在發酵反應中，所生成之有機化合物的總碳數與所消耗碳源的總碳數的比值，以如下式1進行計算。
先前技術多為針對單一菌株之單槽發酵工藝改良，或為複數個發酵槽的系統(此即，所使用的菌株有其個別之發酵槽，再將各發酵槽串接)。不同於先前技術，本發明係提供一種微生物共培養系統(co-culture system)，其係包含：(1)一基質，其係含有一醣類；(2)一第一菌株及一第二菌株之至少一者，其中該第一菌株係具有固定碳氧化物的能力，該第二菌株係具有於發酵反應中代謝一胺基酸的能力，且其中該第一菌株係於發酵反應中產生一第一 代謝物，該第二菌株係於發酵反應中產生一第二代謝物；以及(3)一第三菌株，其具有於發酵反應中代謝該醣類及該代謝物以生成丁酸及/或丁醇的能力，其中，當於該共培養系統存在該第二菌株時，該基質更含有該胺基酸。較佳地，該微生物共培養系統更包含一共基質(co-substrate)，其較佳係選自以下之至少一者：乳酸、及氣態基質。
於本發明之微生物共培養系統中，該基質係含有一醣類。其中，醣類(又稱「碳水化合物」)的例子包括，但不限於，單醣(例如：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、阿拉伯糖(arabinose)、來蘇糖(lyxose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔羅糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose))；雙醣(例如：蔗糖(sucrose)、麥芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、乳酮糖(lactulose)、海藻糖(trehalose)、纖維二糖(cellobiose))；寡糖(例如：水蘇糖(stachyose)、麥芽三糖(maltotriose)、麥芽四糖(maltotetrose)、麥芽五糖(maltopentaose))；以及多醣(例如：澱粉、纖維素、肝糖、環糊精(cyclodextrin)、阿拉伯聚糖(arabinoxylans)、關華豆膠(guar gum)、阿拉伯膠(gum arabic)、幾丁質(chitin)、樹膠(gum)、海藻酸鹽(alginate)、果膠(pectin)、結冷膠(gellan))。於本發明部分具體實施態樣中，係使用含有葡萄糖或木糖的基質，以提 供發酵反應所需之碳源。
一般而言，在微生物生長、繁殖的過程中，胺基酸是作為蛋白質合成所需之氮源。然而，不同於前述用途，在根據本發明之微生物共培養系統中，基質中的胺基酸(若含有)是作為發酵反應所需之碳源，而被進一步代謝為其它有機化合物。其中，合宜之胺基酸來源的例子包括酵母萃取物(yeast extract)、蛋白水解物、及蛋白腖(peptone)、玉米浸漬液(corn steep liquor，CSL)、乳清(whey)、豆粕、魚粉、肉骨粉、酵母粉、豆粉，但不以此為限。於本發明部分具體實施態樣中，係使用含有蛋白腖的基質，以提供發酵反應所需之碳源。
於本發明微生物共培養系統中，只要存在具有固定一碳氧化物之能力的第一菌株以及具有於發酵反應中代謝一胺基酸之能力的第二菌株之至少一者即可。換言之，在本發明之微生物共培養系統中，可以存在第一菌株而不存在第二菌株，可以存在第二菌株而不存在第一菌株，或者同時存在第一菌株與第二菌株。其中，當於本發明之微生物共培養系統存在該第二菌株時，所採用之基質更含有於發酵反應中提供第二菌株所需之碳源的胺基酸。
可以任何具有固定碳氧化物之能力的微生物作為第一菌株。所謂「固定碳氧化物」係指藉由生物化學反應將碳氧化物轉化為有機化合物的過程，舉例言之，已知自然界中有許多微生物可利用Wood-Ljungdahl(WL)路徑來固定其生存環境中的碳氧化物，並將碳氧化物轉化成乙醯-輔酶A(如第3圖所示)。
可利用Wood-Ljungdahl(WL)路徑以固定碳氧化物的菌株包括，但不限於，高斯卡提梭菌(Clostridium coskatii)、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、困難梭菌(Clostridium difficile)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、熱乙酸莫爾氏菌(Moorella thermoacetica，原為熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum))、嗜熱自營甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、自營脫硫桿菌(Desulfobacterium autotrophicum)、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、嗜熱自營梭菌(Clostridium thermoautotrophicum)、蟻酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、甲醇醋酸桿菌(Acetobacterium carbinolicum)、凱伍醋酸桿菌(Acetobacterium kivui)、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)、瘤胃聚乙酸菌(Acetitomaculum ruminis)、潮濕厭氧醋菌(Acetoanaerobium noterae)、以及拜氏醋酸桿菌(Acetobacterium bakii)。除前述之野生型菌種外，該可利用Wood-Ljungdahl(WL)路徑以固定碳氧化物的菌株亦可為一透過遺傳工程操作所獲得的基因改造菌株，只要該菌株係具有Wood-Ljungdahl(WL)路徑且具有固定碳氧化物之能力即可，例如將原先不具有Wood-Ljungdahl(WL)路徑相關基因之微生物，或僅具有部份Wood-Ljungdahl(WL)路徑相關基因之微生物，藉由遺傳工程操作之方式置入Wood-Ljungdahl(WL)路徑相關基因，使其具備固定碳氧化物之能力。
可於本發明微生物共培養系統中使用前述可利用Wood-Ljungdahl(WL)路徑以固定碳氧化物的菌株作為第一菌株。較佳地，該第一菌株係選自以下之至少一者：高斯卡提梭菌、將達梭菌、自產乙醇梭菌、拉氏梭菌、甘油利用泰瑞孢子菌、及糞味梭菌。
當使用本發明微生物共培養系統於發酵反應中時，第一菌株係可固定碳氧化物，產生一第一代謝物，該第一代謝物係包含乙酸。舉例言之，於本發明部分具體實施態樣中，係使用將達梭菌、甘油利用泰瑞孢子菌、或糞味梭菌作為第一菌株，以固定碳氧化物，並於發酵反應中產生乙酸。
於本發明之微生物共培養系統中，可以任何具有於發酵反應中代謝胺基酸之能力的微生物作為第二菌株。所謂「於發酵反應中代謝胺基酸」係指胺基酸被當作發酵反應的基質，而被進一步代謝而轉化為其它有機化合物。此處的胺基酸的用途係不同於已知者，習知的胺基酸用途是作為蛋白質合成所需之氮源，然而，本文之「於發酵反應中代謝胺基酸」所指的胺基酸係作為第二菌株進行發酵反應所需之碳源，而被代謝利用。適用為本發明微生物共培養系統中的第二菌株的例子可參照下列文獻中所述之胺基酸代謝菌株：The amino acid-fermenting clostridia.J Gen Microbiol.67(1)：47-56(1971)、Enumeration of amino acid fermenting bacteria in the human large intestine：effects of pH and starch on peptide metabolism and dissimilation of amino acids.FEMS Microbiol Ecol.15(4)：355-368(1998)、以及The first 1000 cultured species of the human gastrointestinal microbiota.FEMS Microbiol Rev.38(5)：996-1047(2014)，該等文獻之全文併於此處以供參考。較佳地，該第二菌株的例子包括，但不限於，屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、肉毒芽孢梭菌肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、及巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)。
當使用本發明微生物共培養系統於發酵反應中時，第二菌株係可代謝胺基酸，產生一第二代謝物，該第二代謝物係包含乙酸。前述代謝另會產生例如碳氧化物及氫氣之代謝副產物。舉例言之，於本發明部分具體實施態樣中，係使用屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)、或產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)作為本發明微生物共培養系統中的第二菌株，以於發酵反應中代謝胺基酸產生乙酸及少量丁酸，且代謝副產物為碳氧化物及氫氣。特定言之，於本發明具體實施態樣中，可使用美國專利申請案US 14/794,341所揭露之屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)菌株ITRI04005作為本發明微生物共培養系統中的第二菌株，該菌株係寄存於德國菌種保藏中心(DSMZ)，寄存編號為DSM 32078，且寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910680。
再一方面，於本發明微生物共培養系統中，可以任何可於發酵反應中代謝以下物質之至少一者以生成丁酸及/或丁醇的微生物作為第三菌株：(i)醣類、(ii)第一菌株於發酵反應中所產生的第一代謝物、以及(iii)第二菌株於發酵反應中所產生 的第二代謝物。
舉例言之，該第三菌株可以是可利用丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)路徑(如第1、4A、4B圖所示)進行發酵反應的菌株，其例子包括但不限於，梭菌屬(Clostridium sp.)菌株。其它適合作為第三菌株且可於發酵反應中生成丁酸及/或丁醇的微生物的例子包括，但不限於，安愛羅斯代普布替雷熙克菌(Anaerostipes butyraticus)、糞厭氧棒狀菌(Anaerostipes caccae)、安愛羅斯代普菌屬(Anaerostipes sp.)、穗狀丁酸弧菌(Butyrivibrio crossotus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、瘤胃溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、梭菌屬(Clostridiales sp.)、糞球菌ART55/1(Coprococcus ART55/1)、靈巧糞球菌(Coprococcus catus)、陪伴糞球菌(Coprococcus comes)、一致糞球菌(Coprococcus eutactus)、兩形真桿菌(Eubacterium biforme)、溶纖維真桿菌(Eubacterium cellulosolvens)、細長真桿菌(Eubacterium dolichum)、龐大真桿菌(Eubacterium hadrum)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、L2-7真杆菌(Eubacterium L2-7)、黏液真桿菌(Eubacterium limosum)、氧化還原真桿菌(Eubacterium oxidoreducens)、细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、口臭真杆菌(Eubacterium saburreum)、A2-194真杆菌(Eubacterium A2-194)、凸腹真桿菌(Eubacterium ventriosum)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)、毛螺科菌屬(Lachnospiraceae sp.)、莫亞拉產吲哚菌(Moryella indoligenes)、少食八疊球菌(Parasporobacterium paucivorans)、 瘤胃假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio ruminis)、偽丁酸撒拉尼羅拉菌(Pseudobutyrivibrio xylanivorans)、盲腸羅斯氏菌(Roseburia cecicola)、糞便羅斯拜瑞氏菌(Roseburia faecis)、羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、羅斯氏腸菌(Roseburia intestinalis)、羅斯氏尹琳妮佛倫菌(Roseburia inulinivorans)、孢子細菌樹紫苑菌(Sporobacterium olearium)、安黑羅克斯阿克踏利斯菌(Anerococcus octavius)、不解糖嗜腖菌(Peptoniphilus asaccharolyticus)、蛋白腖菌(Peptoniphilus)、杜爾丹尼菌(duerdenii)、蛋白腖哈雷菌(Peptoniphilus harei)、蛋白腖淚菌(Peptoniphilus lacrimalis)、吲哚嗜腖菌(Peptoniphilus indolicus)、弗消化鏈球菌艾弗嗜腖菌(Peptoniphilus ivorii)、嗜腖菌屬(Peptoniphilus sp.)、賽德門特巴克特海卓斯班卓依克菌(Sedimentibacter hydroxybenzoicus)、優桿歐都例牡藤菌(Anaerovorax odorimutans)、產線齦溝菌(Filifactor alocis)、巴克氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、驕弱真桿菌(Eubacterium infirmum)、细小真杆菌(Eubacterium minutum)、纏結優桿菌(Eubacterium nodatum)、溝跡優桿菌(Eubacterium sulci)、念珠狀真桿菌(Eubacterium moniliforme)、黃單胞菌科(llyobacter delafielaii)、草酸桿菌屬(Oxobacter pfenningii)、最大八叠球菌(Sarcina maxima)、速生熱分枝菌(Thermobrachium celere)、布替利西柯普利卡柯倫菌(Butyricicoccus pullicaecorum)、A2-207真杆菌(Eubacterium A2-207)、甲酸芽殖菌(Gemmiger formicilis)、厭氧棒移動菌(Anaerobaculum mobile)、巴羅斯波拉咕魯踏里咖菌(Pelospora glutarica)、噬熱楊斯安斯菌(Thermoanaerobacter yonseiensis)、圓柱狀真桿菌(Eubacterium cylindroides)、隱藏真桿菌(Eubacterium saphenum)、多曲真杆菌(Eubacterium tortuosum)、尤氏真桿菌舒蒂卡亞種(Eubacterium yurii margaretiae)、厭氧消化球菌(Peptococcus anaerobius)、黑色消化球菌(Peptococcus niger)、芽孢腸狀菌屬(Sporotomaculum hydroxybenzoicum)、胺基酸球腸菌(Acidaminococcus intestini)、發酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、馬加斯福利亞基摩斯菌(Megasphaera genomosp)、巨球形菌(Megasphaera micronuciformis)、哈拉阿羅比撒喀哩提克菌(Halanaerobium saccharolyticum)、巴羅拉哈斯巴拉伊特米迪亞菌(Brachyspira intermedia)、雛禽短螺旋體(Brachyspira alvinipulli)、徐特沃斯壓斯阿特里額斯菌(Shuttleworthia satelles)、產氫厭氧球菌(Anaerococcus hydrogenalis)、解乳厭氧球菌(Anaerococcus lactolyticus)、普氏厭氧球菌(Anaerococcus prevotii)、四聯厭氧球菌(Anaerococcus tetradius)、陰道厭氧球菌(Anaerococcus vaginalis)、嗜鹼菌(Alkaliphilus metalliredigens)、阿克阿里福里額斯菌(Alkaliphilus oremlandii)、黑羅福斯提斯斯特克里猴米尼斯菌(Anaerofustis stercorihominis)、蒲斯瑞德拉米巴克德阿拉克特里克斯菌(Pseudoramibacter alactolyticus)、黑羅特克斯歐里何米尼斯菌(Anaerotruncus colihominis)、法克里巴克替利亞cf.普阿斯奈特伊菌(Faecalibacterium cf.prausnitzii)、法克里巴克替利亞普阿斯奈特伊菌(Faecalibacterium prausnitzii)、魯米弄克咖西貝克替李亞菌(Ruminococcaceae bacterium)、斯伯 特里居里恩法里阿伯菌(Subdoligranulum variabile)、斯模安羅阿羅貝特替里亞斯模薩哈羅莉替克菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、卡巴斯基滴不拉清佩西福克菌(Carboxydibrachium pacificum)、卡巴斯基豆特門斯哈卓基弄福門斯菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、騰沖嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、利熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter wiegelii)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae bacterium)、肉食桿菌屬(Carnobacterium sp.)、迪門斯波拉菌屬(Desmospora sp.)、長醋絲菌(Acetonema longum)、斯模系尼額斯卡巴斯基黛福倫斯菌(Thermosinus carboxydivorans)、娜卓安羅碧娥斯安羅芙莉娥斯菌(Natranaerobius thermophiles)、哈崙安羅畢恩普昂福倫(Halanaerobium praevalens)、斯拜爾貝特替里亞安羅芙莉倫菌(Symbiobacterium thermophilum)、斯達克福昂德替里亞那薩爾斯菌(Stackebrandtia nassauensis)、英特爾斯波郎吉因克福恩菌(Intrasporangium calvum)、两面神菌菌屬(Janibacter sp.)、橙黃小單孢菌(Micromonospora aurantiaca)、小單孢菌屬(Micromonospora sp.)、海洋放線菌(Salinispora arenicola)、撒利尼斯波拉特皮卡菌(Salinispora tropica)、福如克西波拉瑪莉絲菌(Verrucosispora maris)、克里貝拉福拉替達菌(Kribbella flavida)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae bacterium)、類諾卡氏菌科屬(Nocardioides sp.)、彎曲熱單孢菌(Thermomonospora curvata)、會縮嗜鹽原體(Haloplasma contractile)、印度脫硫元螺菌(Desulfurispirillum indicum)、脫鐵桿菌屬(Deferribacter desulfuricans)、鐵還原紅螺菌(Rhodoferax ferrireducens)、及橙 色標樁菌(Stigmatella aurantiaca)。除前述之野生型菌種外，該可於發酵反應中生成丁酸及/或丁醇的微生物亦可為一透過遺傳工程操作所獲得的基因改造菌株，只要該菌株具有於發酵反應中生成丁酸及/或丁醇的微生物之能力即可，例如將原先不具有ABE路徑相關基因，或僅具有部份ABE路徑相關基因之微生物，藉由遺傳工程操作之方式置入ABE路徑相關基因，使其具備進行發酵反應以生成丁酸及/或丁醇之能力。
較佳地，該第三菌株係梭菌屬(Clostridium sp.)菌株。更佳地，該第三菌株係選自以下之至少一者：酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、阿吉替南斯梭菌(Clostridium argentinense)、金黃丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、食纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)、解醣cf.梭菌(Clostridium cf.saccharolyticum)、困難梭菌(Clostridium difficile)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、諾維氏梭菌(Clostridium novyi)、類腐敗梭菌(Clostridium paraputrificum)、帕斯庫伊梭菌(Clostridium pascui)、胜肽戈登氏梭菌(Clostridium peptidivorans)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、西瑪克梭菌(Clostridium schirmacherense)、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、近端梭菌SB4(Clostridium subterminale SB4)、共生梭菌(Clostridium symhiosum)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、大 洋溫層梭菌(Clostridium tepidiprofundi)、第三梭菌(Clostridium tertium)、破傷風形梭芽孢桿菌(Clostridium tetanomorphum)、及耐熱梭菌(Clostridium thermopalmarium)。
當使用本發明微生物共培養系統於發酵反應中時，第三菌株係可代謝以下至少一者，以生成丁酸及/或丁醇：(i)醣類、(ii)第一菌株於發酵反應中所產生的第一代謝物、及(iii)第二菌株於發酵反應中所產生的第二代謝物。前述第三菌株之代謝反應另會產生例如碳氧化物及氫氣之代謝副產物。舉例言之，於本發明部分具體實施態樣中，係使用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)作為本發明微生物共培養系統中的第三菌株，以於發酵反應中進行上述代謝而產生丁酸(酪丁酸梭菌)或丁酸與丁醇(拜氏梭菌)，且代謝副產物為碳氧化物及氫氣。
一般而言，先前技術所使用的混菌發酵系統必須外加合成氣(syngas)始可作用(此可參見例如WO 2014/113209 A1，該文獻全文併於此處以供參考)。然而，在本發明之微生物共培養系統中，由於可經由第一菌株的固定碳氧化物作用將第二菌株及/或第三菌株於發酵反應中所產生的碳氧化物回收，重新納入發酵反應的步驟中，故可於不外加氣體基質(例如合成氣)的情況下，透過不同菌株彼此之間的互補關係，達到有效利用碳源、減少不必要的碳源損失的效果。
視需要地，可於本發明微生物共培養系統中外加乙酸，以提供第三菌株進行發酵反應時所需的碳源(如第4B圖所 示)。或者，可於本發明微生物共培養系統中更包含一共基質(co-substrate)，以提供額外的碳源，進一步提高本發明微生物共培養系統中有機化合物(例如：丁酸、丁醇)的產量。該共基質可為任何合宜的碳化合物，只要對各該菌株、固定碳氧化物作用的進行、或發酵反應的進行沒有不利的影響即可。較佳地，該共基質之碳化合物的例子包括，但不限於，乳酸(lactic acid)、氣態基質(gaseous substrate)、或其組合。其中，該氣態基質可以為合成氣(syngas)及工業製程廢氣(industrial waste gas)之至少一者。
當於本發明微生物共培養系統中採用含有醣類之基質，並以乳酸為共基質時，可以例如每重量份醣類大約1至10重量份共基質之用量配比來提供一混合基質。於本發明一具體實施態樣中，係以採用含有葡萄糖之基質，並以乳酸為共基質，以提供一混合基質，其中葡萄糖與乳酸的含量(重量)比為大約1：1至1：10(葡萄糖：乳酸)。
於本發明微生物共培養系統中，作為第一菌株、第二菌株及第三菌株的微生物菌種係彼此不同且不重覆。特定而言，當以斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)作為微生物共培養系統中的第二菌株時，第一菌株及第三菌株不為斯蒂克蘭德氏梭菌；當以肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)作為微生物共培養系統中的第二菌株時，第一菌株及第三菌株不為肉毒芽孢梭菌；當以食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)作為微生物共培養系統中的第一菌株時，第二菌株及第三菌株不為食氧 化碳梭菌；當以困難梭菌(Clostridium difficile)作為微生物共培養系統中的第一菌株時，第二菌株及三菌株不為困難梭菌。
於本發明微生物共培養系統中，由於第一菌株可透過固定碳氧化物作用來固定第二菌株及/或第三菌株於發酵反應中所產生的碳氧化物(例如二氧化碳)以將發酵反應中所釋放的碳氧化物重新納入發酵反應的步驟中，故可更有效利用碳源、減少不必要的碳源損失；第二菌株可透過發酵反應代謝胺基酸，所產生的第二代謝物可進一步被第三菌株所利用，故相當於增加了額外的碳源；此外，第三菌株於發酵反應中除了代謝基質中所含醣類，還可進一步代謝第一菌株於發酵反應中所產生的第一代謝物(例如乙酸)及第二菌株於發酵反應中所產生的第二代謝物(例如乙酸)，故可提供良好的目標產物(例如：丁酸、丁醇)產率(如第2A、2B、2C圖所示)。
因此，本發明亦提供一種生產丁酸之方法，其係包含提供一如上述之微生物共培養系統，其中該第三菌株於發酵反應之代謝物係包含丁酸；以及將該微生物共培養系統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應。較佳地，本發明之生產丁酸的方法更包含對該發酵產物進行一分離純化操作，以提升丁酸產物的純度。舉例言之，該分離純化操作可為選自以下之至少一者：萃取(extraction)、蒸餾(distillation)、蒸發(evaporation)、離子交換(ion-exchange)、電透析(electrodialysis)、過濾(filtration)、及逆滲透(reverse osmosis)，但不以此為限。
如後附實施例所示，當使用本發明之生產丁酸的方 法，其中該發酵反應的碳轉化率可高於理論值(即，66%)。
本發明另提供一種生產丁醇之方法，其係包含提供一如上述之微生物共培養系統；將該微生物共培養系統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應；以及視需要進行一化學轉化反應以將丁酸轉化為丁醇。舉例言之，該化學轉化反應可為選自以下之至少一者：催化性氫化反應(catalytic hydrogenation)、及酯化氫解反應(esterification-hydrogenolysis)，但不以此為限。較佳地，本發明之生產丁醇的方法更包含於進行化學轉化反應之前，先對該發酵產物進行一分離純化操作。舉例言之，該分離純化操作可為選自以下之至少一者：萃取(extraction)、蒸餾(distillation)、蒸發(evaporation)、離子交換(ion-exchange)、電透析(electrodialysis)、過濾(filtration)、及逆滲透(reverse osmosis)，但不以此為限。
於根據本發明之生產丁酸或生產丁醇之方法中，所涉之厭氧氛圍係指氧氣含量低於5ppm，較佳低於0.5ppm，更佳低於0.1ppm之氛圍。可採用任何合宜之手段以提供所欲之厭氧氛圍。舉例言之，但不以此為限，可於發酵反應進行之前，先於發酵反應容器中通入惰性的氣體(例如：氮氣或二氧化碳)且進行曝氣，以排出存在於該反應容器中的空氣，提供所欲之厭氧氛圍；或者，於厭氧操作箱中進行發酵反應，厭氧操作箱是採用鈀催化劑將密閉箱體內的氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣催化生成水，從而提供所欲之厭氧氛圍。
於本發明之生產丁酸或生產丁醇之方法中，基質與 菌株的混合順序並無特殊限制。可於發酵反應開始之前或發酵反應進行過程中，視需要一次性地或多次分批地添加基質，且可視需要補充菌株。例如，可於發酵反應進行前，即一次性地將基質與菌株混合；也可將基質分為等量或不等量的二或多批，於發酵反應開始之前或發酵反應進行過程中，分批加入發酵反應器中。
視需要地，可於進行本發明之生產丁酸或生產丁醇的方法之前，先對本發明微生物共培養系統之菌株進行前培養，以使菌株生長直到對數生長期(log phase)(即，OD600為約1.0至1.2時)。再使用該經前培養之菌株以進行發酵反應，生產所欲之丁酸或丁醇。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
於以下實施例中，所使用之物料來源或物料組成如下：
(a)RCM(Reinforced Clostridial Medium)培養基(購自：Merck；其含有肉類萃取物：10克/升；蛋白腖：10克/升；酵母萃取物：3克/升；D(+)葡萄糖：5克/升；氯化鈉：5克/升；乙酸鈉：3克/升；L-半胱胺酸鹽酸鹽(L-cysteine hydrochloride)：0.5克/升；澱粉：1克/升；以及瓊脂：0.5克/升；pH6.0)。
(b)CGM(Clostridial Growth Medium)培養基(酵母萃取物：5 克/升；蛋白腖：5克/升；硫酸銨((NH4)2SO4)：3克/升；磷酸氫二鉀(K2HPO4)：1.5克/升；含水硫酸鎂(MgSO4˙7H2O)：0.6克/升；含水硫酸鐵(FeSO4˙7H2O)：0.03克/升；Resazurin儲存溶液(stock solution)：0.1%(重量/體積)；pH6.0)。
(c)CSL-CGM(Corn steep liquor based CGM medium)培養基(硫酸銨((NH4)2SO4)：3克/升；磷酸氫二鉀(K2HPO4)：1.5克/升；含水硫酸鎂(MgSO4˙7H2O)：0.6克/升；含水硫酸鐵(FeSO4˙7H2O)：0.03克/升；Resazurin儲存溶液(stock solution)：0.1%重量/體積；CSL：3.5、5、7、10、12、15、或18%(體積/體積)；pH為6.0)。
(d)mPETC培養基(依中華民國專利公開號201441366調配)。
(e)P2培養基(酵母萃取物：5克/升；乙酸銨：2.2克/升；含水硫酸錳(MnSO4˙7H2O)：0.01克/升；氯化鈉：1克/升；含水硫酸鎂(MgSO4˙7H2O)：0.2克/升；含水硫酸鐵：0.01克/升；對胺苯甲酸(p-amino benzoic acid，PABA)：1毫克/升；生物素：0.01毫克/升；MES緩衝液：39克/升；pH6.0)。
於以下實施例中，係以如下操作，於所使用之氣密容器(例如氣密血清瓶、離心管)中提供厭氧氛圍。將氣密容器與橡膠塞以鋁箔包覆，並以高溫高壓(121℃，1.2大氣壓)滅菌，確保不會受其他微生物的干擾。於氣密容器完成滅菌後，以烘箱去除外部殘餘水氣，防止殘餘水氣於操作時造成微生物汙染。經由厭氧操作箱附屬之傳遞箱，將烘乾之氣密容器送入厭氧操作箱內，稍微鬆開封口的鋁箔後，以厭氧操作設備內附屬的鈀催化劑 (購自Thermo scientific公司，產品編號：BR0042)，催化氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣生成水，從而將氣密容器中的氧氣去除，以提供厭氧氛圍。
於以下實施例中，係以如下操作提供經除氧的培養基。將配置好的培養基，以高溫高壓(121℃，1.5大氣壓)滅菌15分鐘，並於培養基尚未冷卻至室溫之前，經由厭氧操作箱附屬之傳遞箱將培養基送入厭氧操作箱內，稍微鬆開盛裝培養基之容器的上蓋，讓水蒸氣釋出，並藉由厭氧操作設備內附屬的鈀催化劑，催化氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣生成水，以進行培養基之除氧。於培養基冷卻至室溫之後，進一步於其中加入L-半胱胺酸鹽酸鹽(0.5克/升)，以降低培養基之氧化還原電位(redox potential)至微生物所適之範圍)，從而提供經除氧的培養基。
實施例1：第一菌株/第三菌株之微生物共培養系統於生產有機酸之應用
1-1. 選取菌株
選取可固定碳氧化物的將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株BCRC 17797或甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)菌株BCRC 14553作為第一菌株，以及選取可於發酵反應中代謝醣類或有機化合物以生成有機酸(例如：乙酸、丁酸)的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535作為第三菌株。
1-2. 前培養
(a)將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株BCRC 17797：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升之經除氧且額外添加10克/升之果糖的RCM培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養歷時約48小時，以使菌株生長至OD600(波長為600奈米時的吸光度值)為約1.0至1.2。
(b)甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)菌株BCRC 14553、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升之經除氧的RCM培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養歷時約14至16小時，以使菌株生長至OD600(波長為600奈米時的吸光度值)為約1.0至1.2。
1-3. 發酵試驗
試驗1-3-1
混合葡萄糖及CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，分別於第7及24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配 Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表1。
由表1可知，培養7小時後，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高的葡萄糖(即，基質)消耗率。另一方面，無論培養7或24小時，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率，皆明顯高於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統。前述結果顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗1-3-2
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃 度為12克/升且CSL濃度為約3.5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表2。
由表2可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之 基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。其中，丁酸碳轉化率甚至超過了傳統ABE發酵的理論最大值(即，66%)。
試驗1-3-3
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升且CSL濃度為約5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第17小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表3。
由表3可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果再次顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。其中，丁酸碳轉化率甚至超過了傳統ABE發酵的理論最大值(即，66%)。
試驗1-3-4
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為9克/升且CSL濃度為約7%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表4。
表4
由表4可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果亦顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。其中，丁酸碳轉化率甚至超過了傳統ABE發酵的理論最大值(即，66%)。
試驗1-3-5
提供一CSL濃度為約15%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)，並對該培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入60毫升前述經除氧的CSL-CGM培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表5。
由表5可知，即使在未添加葡萄糖(即，基質)而僅添加CSL(含有蛋白質、乳酸、及少量的醣類)的情況下，仍可於同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的培養基中偵測到丁酸的產出，且其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率均高達91.55%。此結果顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可於沒有葡萄糖的條件下，將胺基酸或乳酸轉化為丁酸等產物，且可提供優異之碳轉化率(遠高於理論值66%)。
試驗1-3-6
混合乳酸鹽(lactate)及CGM培養基，以提供一乳酸濃度為15克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入50毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約20%之接種率分別接種實驗1.2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第120小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙 酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表6。
由表6可知，即使在未添加葡萄糖(即，基質)而僅添加乳酸的情況下，仍可於同時存在有甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的培養基中偵測到丁酸的產出，且其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率分別為87.96%及88.04%，均高於理論值(即，66%)。此結果顯示，甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可於沒有葡萄糖的條件下，將乳酸轉化為丁酸等產物，且可提供優異之碳轉化率(遠高於理論值66%)。
實施例2：第二菌株/第三菌株之微生物共培養系統於生產有機酸之應用
2-1. 選取菌株
選取可於發酵反應中代謝胺基酸的屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)菌株BCRC 14511或產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌株BCRC 11259作為第二菌株，以及選取可於發酵反應中代謝醣類或有機化合物以生成有機酸(例如：乙酸、丁酸)的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535作為第三菌株。
2-2. 前培養
取屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)菌株BCRC 14511、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)菌株BCRC 11259、或酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535之單一菌落，接種於10毫升之經除氧的RCM培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養歷時約14至16小時，以使菌株生長至OD600(波長為600奈米時的吸光度值)為約1.0至1.2。
2-3. 發酵試驗
試驗2-3-1
混合葡萄糖及CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，分別於第7及24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果亦於表7。
由表7可知，培養7小時後，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、以及有機酸生成效率。另一方面，無論培養7或24小時，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，皆明顯高於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統。前述結果顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗2-3-2
混合葡萄糖、乳酸鹽(lactate)、及CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為3克/升且乳酸濃度為7克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表8。
由表8可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。其中，丁酸碳轉化率甚至超過了傳統ABE發酵的理論最大值(即，66%)。
試驗2-3-3
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為12克/升且CSL濃度為約3.5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述之二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表9。
由表9可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果再次顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗2-3-4
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升且CSL濃度為約5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第17小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表10。
由表10可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果亦顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗2-3-5
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為9克/升且CSL濃度為約7%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。其後，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表11。
由表11可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之葡萄糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果亦顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗2-3-6
提供一CSL濃度為約15%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)，並對該培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入60毫升前述經除氧的CSL-CGM培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表12。
由表12可知，即使在未添加葡萄糖(即，基質)而僅添加CSL(含有蛋白質、乳酸、及少量的醣類)的情況下，仍可於同時存在屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統之培養基中偵測到丁酸的產出，且其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率均高達95.46%(遠高於理論值66%)。此結果顯示，屍毒梭菌菌株BCRC 14511與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可於沒有葡萄糖的條件下，將胺基酸或乳酸轉化為丁酸等產物，且可提供優異之碳轉化率。
試驗2-3-7
混合木糖、乳酸鹽(lactate)、及CGM培養基，以提供一木糖濃度為2克/升且乳酸濃度為5克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗2.2所提供之經前培養之產芽孢梭菌菌株BCRC 11259以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第30小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中木糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化 率以及有機酸碳轉化率，結果示於表13。
由表13可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統，同時存在產芽孢梭菌菌株BCRC 11259及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統具有明顯較高之木糖(即，基質)消耗率、乳酸(即，共基質)消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，產芽孢梭菌菌株BCRC 11259與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率。
實施例3：第一菌株/第二菌株/第三菌株之微生物共培養系統於生產有機酸或醇之應用
3-1.選取菌株
選取可固定碳氧化物的將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株BCRC 17797、甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)菌株BCRC 14553、或糞味梭菌(Clostridium scatologenes)菌株BCRC 14540作為第一菌株，選取可於發酵反應中代謝胺基酸的屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)菌株BCRC 14511作為第二菌株，以及選取可於發酵反應中代謝醣 類或有機化合物以生成有機酸或醇(例如：乙酸、丁酸、丁醇)的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BCRC 14488作為第三菌株。
3-2. 前培養
(a)將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)菌株BCRC 17797：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升之經除氧且額外添加10克/升之果糖的RCM培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養歷時約48小時，以使菌株生長至OD600(波長為600奈米時的吸光度值)為約1.0至1.2。
(b)甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)菌株BCRC 14553、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)菌株BCRC 14540、屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)菌株BCRC 14511、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)菌株BCRC 14535、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)BCRC 14488：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升之經除氧的RCM培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養歷時約14至16小時，以使菌株生長至OD600(波長為600奈米時的吸光度值)為約1.0至1.2。
3-3. 發酵試驗
試驗3-3-1
混合葡萄糖、乳酸鹽(lactate)、及CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為5克/升且乳酸濃度為5克/升之混合培養基 (pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表14。
由表14可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的葡萄糖(即，基質)消耗率不佳且幾乎無法代謝乳酸(即，共基質)，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統的葡萄糖消耗率、乳酸消耗率、有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率皆明顯提升。前述結果顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之共培養系統可提供較佳之基質與共基質利用率、發酵產物產率、以及碳轉化率，且其碳轉化率遠高於理論值(即，66%)。
試驗3-3-2
混合葡萄糖及CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述三氣密血清瓶之第一氣密瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第二氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第三氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該三氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第7小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表15。
由表15可知，相較於第二組或第三組微生物共培養系統，第一組微生物共培養系統具有明顯較高之有機酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，相較於同時培養有二菌株之共培養系統，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可提供更佳之發酵產物產率、以及碳轉化率。
試驗3-3-3
混合乳酸鹽(lactate)及CGM培養基，以提供一乳酸濃度為10克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於另一氣密血清瓶中，則以約30%之接種率接種經前培養之酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別 計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，結果示於表16。
由表16可知，相較於僅存在酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535之系統之幾乎無法代謝乳酸，同時存在將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之系統則可有效代謝乳酸並生成有機酸。此結果顯示，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可於沒有葡萄糖的條件下，將乳酸轉化為乙酸、丁酸等產物，並提供優異之發酵產物產率。
試驗3-3-4
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為12克/升且CSL濃度為約3.5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述三氣密血清瓶之第一氣密瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第二氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第三氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該三氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表17。
由表17可知，相較於第二組或第三組微生物共培養系統，第一組微生物共培養系統具有明顯較高之丁酸碳轉化率及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，相較於同時培養有二菌株之共培養系統，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可提供更佳之碳轉化率。
試驗3-3-5
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升且CSL濃度為約5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述三氣密血清瓶之第一氣密瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第二氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第三氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該三氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表18。
由表18可知，相較於第二組或第三組微生物共培養系統，第一組微生物共培養系統具有明顯較高之丁酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，相較於同時培養有二菌株之共培養系統，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可提供更佳之丁酸產率及碳轉化率。
試驗3-3-6
混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，以提供一葡萄糖濃度為10克/升且CSL濃度為約7%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中分別注入60毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述三氣密血清瓶之第一氣密瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第二氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第三氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該三氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸 的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表19。
由表19可知，相較於第二組或第三組微生物共培養系統，第一組微生物共培養系統具有明顯較高之丁酸生成效率、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率。前述結果顯示，相較於同時培養有二菌株之共培養系統，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可提供更佳之丁酸產率及碳轉化率。
試驗3-3-7
提供一CSL濃度為約15%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)，並對該培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中注入60毫升前述經除氧的CSL-CGM培養基。
於上述三氣密血清瓶之第一氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株 BCRC 14535；於第二氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535；於第三氣密血清瓶中，以約30%之接種率分別接種經前培養之屍毒梭菌菌株BCRC 14511及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該三氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及丁酸的產量，結果示於表20。
由表20可知，相較於第二組或第三組微生物共培養系統，第一組微生物共培養系統之乳酸消耗率較低，但丁酸生成效率較高。前述結果顯示，相較於同時培養有二菌株之共培養系統，將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可消耗較少之乳酸，但具有較佳之丁酸生成效率。
試驗3-3-8
混合乳酸鹽(lactate)及CGM培養基，以提供一乳 酸濃度為15克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入50毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約20%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第43小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表21。
由表21可知，甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可提供88.34%之碳轉化率(遠高於理論值66%)。
試驗3-3-9
混合乳酸鹽(lactate)及CSL-CGM培養基，以提供一乳酸濃度為20克/升且CSL濃度為約5%之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入50毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約20%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第65小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率，結果示於表22。
由表22可知，甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可消耗18.4克/升之乳酸，產生13.1克/升之丁酸，其丁酸碳轉化率為98%(遠高於理論值66%)，另可產生4克/升之乙酸。
試驗3-3-10
混合乳酸鹽(lactate)及mPETC培養基，以提供一乳酸濃度為6克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基 進行除氧。其後，於二氣密血清瓶中分別注入50毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述二氣密血清瓶之一者中，以約20%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535，同時額外通入每平方英吋20磅(20psi)的合成氣(20%二氧化碳，80%氫氣)，以進一步提供一氣態基質(稱為「通入合成氣」實驗組)；於另一氣密血清瓶中，重複前述菌株接種步驟，但未額外通入任何氣體，此為「未額外通氣」控制組。接著，將該二氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第48小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率，結果示於表23。
由表23可知，相較於「未額外通氣」控制組之微生物共培養系統，「通入合成氣」實驗組之微生物共培養系統的乙酸產量明顯提升。此結果顯示，甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株之共培養系統可有效利用合成氣(二氧化碳與氫氣)，生產更多的乙酸，提供較佳之發酵產物產率。
試驗3-3-11
重覆試驗3-3-10之步驟，但以實驗3-2之經前培養之糞味梭菌菌株BCRC 14540取代甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553。結果示於表24。
由表24可知，相較於「未額外通氣」控制組之微生物共培養系統，「通入合成氣」實驗組之微生物共培養系統的乙酸產量明顯提升。此結果顯示，糞味梭菌菌株BCRC 14540、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、與酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535等三菌株所組成之共培養系統亦可有效利用合成氣(二氧化碳與氫氣)，生產更多的乙酸，提供較佳之發酵產物產率。
試驗3-3-12
混合葡萄糖及P2培養基，以提供一葡萄糖濃度為20克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。 其後，於一氣密血清瓶中注入50毫升前述經除氧的混合培養基。
於上述之氣密血清瓶中，以約20%之接種率分別接種實驗3.2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及拜氏梭菌BCRC 14488。接著，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第96小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖的消耗量以及乙酸、丁酸、丁醇的產量，且計算總產物碳轉化率，結果示於表25。
由表25可知，同時培養有可生成醇類之拜氏梭菌菌株BCRC 14488、將達梭菌菌株BCRC17797、以及屍毒梭菌菌株BCRC14511之系統，可於厭養條件下進行發酵反應，生成有機酸及醇，且其總產物之碳轉化率可達86.18%，遠高於理論值(即，66.%)。
3-4. 穩定性測試
試驗3-4-1
混合乳酸鹽(lactate)及CGM培養基，以提供一乳酸濃度為20克/升之混合培養基(pH為6.0)，並對該混合培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入50毫升前述經除氧的混 合培養基。
接著，以進行如下步驟第一批次發酵：於上述之氣密血清瓶中，分別以約20%之接種率接種實驗3-2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535。其後，將該氣密血清瓶置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析。
接著，以如下步驟進行第二批次發酵：取40毫升完成上述第一批次發酵之菌液，離心(6000g、10分鐘)後收集菌體。以CGM培養基重新懸浮並清洗菌體後離心(6000g、10分鐘)，其後，將菌體重新培養於上述經除氧之乳酸濃度為20克/升之混合培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第24小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析。
分別計算上述第一批次與第二批次發酵培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率以及有機酸碳轉化率，結果示於表26。
由表26可知，第二批次發酵所得之乳酸消耗量、乙酸產量、丁酸產量、丁酸碳轉化率、以及有機酸碳轉化率幾乎與第一批次發酵所得者相同。此結果顯示，本發明微生物共培養系統可維持穩定之微生物菌相以及穩定之微生物菌株交互作用。
試驗3-4-2
重覆試驗3-4-1之步驟，但以CSL為約25%之CSL-CGM(pH為6.0)取代其中該乳酸濃度為20克/升之混合培養基。結果示於表27。
由表27可知，第二批次發酵所得之乳酸消耗量、乙酸產量、及丁酸產量幾乎與第一批次發酵所得者相同。此結果再次顯示，本發明微生物共培養系統可維持穩定之微生物菌相以及穩定之微生物菌株交互作用。
試驗3-4-3
以不同比例混合葡萄糖及CSL-CGM培養基，分別提 供一葡萄糖濃度為10克/升且CSL濃度為約3.5%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)、一葡萄糖濃度為8克/升且CSL濃度為約10%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)、以及一CSL濃度為約12%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)，並對前述該等培養基進行除氧。其後，於三氣密血清瓶中分別注入100毫升前述經除氧之培養基。
另一方面，取實驗3-2所提供之經前培養之將達梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535並混合均勻，並以PVA(polyvinyl alcohol)對該混合菌株進行固定化，以提供一共培養PVA顆粒。接著，以約5%(體積/體積)之接種量，將所得之共培養PVA顆粒分別接種於上述經除氧的培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第50或60小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中葡萄糖、乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率，結果示於表28。
由表28可知，不論將共培養PVA顆粒(同時含有將達 梭菌菌株BCRC 17797、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535)置於上述何種條件之CSL-CGM培養基中進行發酵反應，其丁酸碳轉化率皆高於理論值(即，66%)。
試驗3-4-4
提供一CSL濃度為約18%之CSL-CGM培養基(pH為6.0)，並對前述培養基進行除氧。其後，於一氣密血清瓶中注入100毫升前述經除氧之培養基。
另一方面，取實驗3-2所提供之經前培養之甘油利用泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535並混合均勻，並以PVA(polyvinyl alcohol)對該混合菌株進行固定化，以提供一共培養PVA顆粒。接著，以約5%(體積/體積)之接種量，將所得之共培養PVA顆粒接種於上述經除氧之培養基中，並置於37℃之厭氧培養箱中培養，於第50小時取樣並以Agilent 1100系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX-87 H(300mm x 7.8mm)管柱分析，並分別計算前述培養基中乳酸的消耗量以及乙酸、丁酸的產量，且計算其丁酸碳轉化率，結果示於表29。
由表29可知，將共培養PVA顆粒(同時含有甘油利用 泰瑞孢子菌菌株BCRC 14553、屍毒梭菌菌株BCRC 14511、以及酪丁酸梭菌菌株BCRC 14535)置於CSL濃度為約18%之CSL-CGM培養基中進行發酵反應，其丁酸碳轉化率遠高於理論值(即，66%)，且可生產2.7克/升之乙酸。
以上結果清楚顯示，本發明之微生物共培養系統可維持穩定之微生物菌相以及穩定之微生物菌株交互作用，微生物於此共培養系統中可穩定共生，且可交互利用彼此於發酵反應中所產生的代謝物或代謝副產物(如第2A、2B、2C圖所示)。因此，將本發明共培養系統應用於發酵反應中，可將多元料源轉化為例如丁酸、丁醇等有機化合物，且可達到有效利用原料、減少不必要之能源損失、提供良好的目標產物產率等需求。

Claims (19)

  1. 一種微生物共培養系統(co-culture system)，其係包含一氣密容器以及存在於該氣密容器中之下列各者：(1)一基質，其係含有一醣類；(2)一第一菌株及一第二菌株之至少一者，其中該第一菌株係具有固定一碳氧化物的能力，該第二菌株係具有於發酵反應中代謝一胺基酸的能力，且其中該第一菌株係於發酵反應中產生一第一代謝物，該第二菌株係於發酵反應中產生一第二代謝物；以及(3)一第三菌株，其具有於發酵反應中代謝該醣類、該第一代謝物及該第二代謝物以生成丁酸及/或丁醇的能力，且係於發酵反應中產生一代謝副產物，該代謝副產物係包含碳氧化物及氫氣，其中，當於該共培養系統存在該第二菌株時，該基質更含有該胺基酸。
  2. 如請求項1之微生物共培養系統，其中該第一代謝物及第二代謝物係包含乙酸。
  3. 如請求項1之微生物共培養系統，其中該第一菌株係於該固定碳氧化物的作用中固定該代謝副產物中的碳氧化物。
  4. 如請求項1之微生物共培養系統，其中該第一菌株係利用Wood-Ljungdahl(WL)路徑以固定碳氧化物的菌株。
  5. 如請求項4之微生物共培養系統，其中該第一菌株係選自以下之至少一者：高斯卡提梭菌(Clostridium coskatii)、將達梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自產乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、甘油利用泰瑞孢子菌(Terrisporobacter glycolicus)、及糞味梭菌(Clostridium scatologenes)。
  6. 如請求項1之微生物共培養系統，該第二菌株係選自以下之至少一者：屍毒梭菌(Clostridium cadaveris)、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes)、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、及巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)。
  7. 如請求項1之微生物共培養系統，其中該第三菌株係梭菌屬(Clostridium sp.)菌株。
  8. 如請求項7之微生物共培養系統，其中該第三菌株係選自以下之至少一者：酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、阿吉替南斯梭菌(Clostridium argentinense)、金黃丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、肉毒芽孢梭菌(Clostridium botulinum)、食氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、食纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)、解醣cf.梭菌 (Clostridium cf.saccharolyticum)、困難梭菌(Clostridium difficile)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、諾維氏梭菌(Clostridium novyi)、類腐敗梭菌(Clostridium paraputrificum)、帕斯庫伊梭菌(Clostridium pascui)、胜肽戈登氏梭菌(Clostridium peptidivorans)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、糞味梭菌(Clostridium scatologenes)、西瑪克梭菌(Clostridium schirmacherense)、斯蒂克蘭德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、近端梭菌SB4(Clostridium subterminale SB4)、共生梭菌(Clostridium symbiosum)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、大洋溫層梭菌(Clostridium tepidiprofundi)、第三梭菌(Clostridium tertium)、破傷風形梭芽孢桿菌(Clostridium tetanomorphum)、及耐熱梭菌(Clostridium thermopalmarium)。
  9. 如請求項1之微生物共培養系統，更包含一共基質(co-substrate)，該共基質係選自以下之至少一者：乳酸、及氣態基質(gaseous substrate)。
  10. 如請求項9之微生物共培養系統，其中該氣態基質係選自以下之至少一者：合成氣(syngas)、及工業製程廢氣(industrial waste gas)。
  11. 如請求項9之微生物共培養系統，當該共基質為乳酸，該醣類與乳酸之重量比係為1：1至1：10。
  12. 一種生產丁酸之方法，其係包含：提供一如請求項1至11項中任一項之微生物共培養系統，其中該第三菌株於發酵反應之代謝物係包含丁酸；以及將該微生物共培養系統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應。
  13. 如請求項12之方法，其中該發酵反應的碳轉化率係高於66%。
  14. 如請求項12之方法，更包含對該發酵產物進行一分離純化操作。
  15. 如請求項14之方法，其中該分離純化操作係選自以下之至少一者：萃取(extraction)、蒸餾(distillation)、蒸發(evaporation)、離子交換(ion-exchange)、電透析(electrodialysis)、過濾(filtration)、及逆滲透(reverse osmosis)。
  16. 一種生產丁醇之方法，其係包含：提供一如請求項1至11項中任一項之微生物共培養系統；將該微生物共培養系統置於一厭氧氛圍下以進行發酵反應；以及視需要進行一化學轉化反應以將丁酸轉化為丁醇。
  17. 如請求項16之方法，其中該化學轉化反應係選自以下之至少一者：催化性氫化反應(catalytic hydrogenation)、及酯化氫解反應(esterification-hydrogenolysis)。
  18. 如請求項16之方法，更包含於進行該化學轉化反應之前，先對該發酵產物進行一分離純化操作。
  19. 如請求項18之方法，其中該分離純化操作係選自以下之至少一者：萃取(extraction)、蒸餾(distillation)、蒸發(evaporation)、離子交換(ion-exchange)、電透析(electrodialysis)、過濾(filtration)、及逆滲透(reverse osmosis)。
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