CN105051178A - 用于在微生物发酵中控制代谢物产生的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于控制厌氧微生物发酵培养物的代谢谱的方法。具体来说,通过控制向培养物提供的溶解的CO2量来控制发酵过程的代谢谱。还提供了一种通过微生物对气体基质的发酵产生一种或多种产物的方法,所述方法是经由将尾气CO2从反应器供给到第二反应器中或通过使尾气CO2再循环到同一个反应器中来实现的。
Description
技术领域
本发明大体上涉及用于控制微生物发酵的一种或多种产物的产生的方法。具体来说,本发明涉及用于控制向微生物培养物提供的二氧化碳的量的方法。在具体实施方案中,通过控制向培养物提供的溶解的CO2的量来控制发酵过程的代谢谱。
背景技术
乙醇正迅速成为全世界主要的富氢液体运输燃料。在2002年,在世界范围内,乙醇的消耗量估计有108亿加仑。由于欧洲、日本、美国以及一些发展中国家对乙醇的关注增加,燃料乙醇工业的全球市场也已经被预测在未来会急剧增长。
举例来说,在美国,使用乙醇生产E10,即10%乙醇在汽油中的混合物。在E10共混物中,乙醇组分充当氧合剂,从而提高燃烧效率并且减少空气污染物的产生。在巴西,乙醇满足了约30%的运输燃料需求,作为在汽油中共混的氧合剂或独立作为纯燃料这两者。并且,在欧洲,围绕温室气体(GHG)排放的后果的环境问题已经促使欧盟(EuropeanUnion,EU)为成员国设立有关诸如生物质衍生的乙醇之类的可持续运输燃料消耗量的强制目标。
绝大多数的燃料乙醇是经由传统的基于酵母的发酵工艺生产的,这些发酵工艺使用作物衍生的碳水化合物,如从甘蔗提取的蔗糖或从粮食作物提取的淀粉,作为主要的碳源。然而,这些碳水化合物原料的成本会受到它们作为人类食物或动物饲料的价值所影响,而用于生产乙醇的产生淀粉或蔗糖的作物的种植并非在所有地区均是经济上可持续的。因此,所关注的是,研发使更低的成本和/或更丰富的碳资源转换成燃料乙醇的技术。
CO是诸如煤或石油和石油衍生产品之类的有机材料不完全燃烧的主要富含自由能的副产物。举例来说,据报道,澳大利亚的钢铁工业每年产生并且向大气中释放超过500,000吨的CO。
长期以来已经认识到的是,可以使用催化工艺来使主要由CO和/或CO和氢气(H2)组成的气体转化成多种燃料和化学品。然而,还可以使用微生物来使这些气体转化成燃料和化学品。这些生物过程尽管一般比化学反应要慢,但是与催化工艺相比具有若干优势,包括更高的特异性、更高的收率、更低的能量成本以及更大的抗毒性。
微生物依靠CO作为它们唯一的碳源生长的能力最初是在1903年被发现的。这随后被确定为利用自养生长的乙酰辅酶A(乙酰CoA)生化途径(也被称为伍兹-扬达尔途径(Woods-Ljungdahlpathway)和一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS)途径)的生物体的特性。包括一氧化碳营养型生物体、光合生物体、产甲烷型生物体以及产乙酸型生物体在内的很多厌氧生物体已经被证实将CO代谢成各种最终产物,即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐以及乙醇。虽然使用CO作为唯一的碳源,但是所有这些生物体均产生这些最终产物中的至少两种。
厌氧细菌,如来自梭菌属(Clostridium)的那些厌氧细菌已经被证实经由乙酰辅酶A生化途径由CO、CO2以及H2产生乙醇。举例来说,由气体产生乙醇的杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)的各种菌株描述于WO00/68407、EP117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO98/00558以及WO02/08438中。细菌产乙醇梭菌菌种(Clostridiumautoethanogenumsp)也已知会由气体产生乙醇(Abrini等人,ArchivesofMicrobiology161,第345-351页(1994))。
然而,微生物通过气体发酵的乙醇产生始终与乙酸盐和/或乙酸的共同产生相关。由于一些可利用碳被转化成乙酸盐/乙酸而非乙醇,因此使用这类发酵工艺的乙醇生产效率可能小于理想的生产效率。而且,除非乙酸盐/乙酸副产物可以用于一些其它目的,否则它可能会引起废物处理问题。乙酸盐/乙酸由微生物转化成甲烷并且因此有可能导致温室气体排放。
在本领域中已经认识到控制用于发酵的生物反应器内用于培养细菌或微生物的液体营养培养基的参数的重要性。2007年7月18日提交并且以引用的方式并入本文的NZ556615特别描述了对这种液体营养培养基的pH值和氧化还原电位的调控。举例来说,在厌氧产乙酸型细菌的培养中,通过将培养物的pH值提高到高于约5.7,同时将培养物的氧化还原电位维持在低水平(-400mV或以下),所述细菌以比在更低的pH值条件下高得多的速率将作为发酵副产物而产生的乙酸盐转化成乙醇。NZ556615还认识到可以使用不同的pH值水平和氧化还原电位以根据细菌所发挥的主要作用(即生长、由乙酸盐和气体含CO基质产生乙醇、或由气体含CO基质产生乙醇)来优化条件。
US7,078,201和WO02/08438也描述了通过改变当中进行发酵的液体营养培养基的条件(例如pH值和氧化还原电位)来改进用于生产乙醇的发酵工艺。
可以通过将一种或多种pH值调节剂或缓冲剂添加到培养基中来调节液体营养培养基的pH值。举例来说,可以使用诸如NaOH等碱和诸如硫酸等酸来根据需要升高或降低pH值。可以通过添加一种或多种还原剂(例如甲基紫精)或氧化剂来调节氧化还原电位。或者,可以通过向发酵提供过量的气体基质以使得微生物被“过度供给”气体来调节培养基的pH值。
可以使用类似的工艺来生产其它醇,如丁醇,如将对本领域技术人员来说显而易见的那样。
本发明的目的在于提供一种系统和/或方法,所述系统和/或方法至少在某种程度上有助于克服上述缺点或至少向公众提供一种有用的选择。
发明内容
在本发明的第一个方面,提供了一种用于控制包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的发酵培养物的代谢谱的方法,所述方法包括:
a.使包含CO和CO2的气体基质流到包含所述微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中;以及
b.调节溶解在所述培养物中的CO2的量以使得所述培养物的代谢发生改变。
在一个实施方案中,通过控制CO2向所述生物反应器的流动来调节溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量。在一个实施方案中,提高溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量使所述微生物的代谢发生改变以使得衍生自丙酮酸盐的一种或多种产物的产生增加。在一个实施方案中,减少溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量使所述微生物的代谢发生改变以使得衍生自丙酮酸盐的一种或多种产物的产生减少。
在一个实施方案中,所述衍生自丙酮酸盐的一种或多种产物选自由以下各项组成的组:2,3-丁二醇(2,3-BDO)、乳酸盐、丁二酸盐、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠檬酸苹果酸盐(citramalate)、丁二烯、以及聚乳酸(PLA)。
在一个实施方案中,在约250kPag至约450kPag(或大于500kPag)的压力下进行发酵,以使得溶解在所述液体营养培养基中的CO2的浓度增加。在某些实施方案中,所述压力大于250kPag、或大于300kPag、或大于350kPag、或大于400kPag、或大于450kPag、或大于500kPag。
在一个替代性实施方案中,使所述反应器中的压力降低或减到最低以与衍生自丙酮酸盐的一种或多种产物相比,促进衍生自乙酰辅酶A的一种或多种产物的产生。在某些实施方案中,所述生物反应器中的压力是约大气压至约200kPag或维持在低于200kPag、或小于150kPag、或小于100kPag、或小于50kPag、或大气压。
在一个实施方案中,使CO2分压升高以增加溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量。
在一个实施方案中,通过增加向发酵提供的气体基质中CO2的量来增加溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量。在一个实施方案中,向生物反应器中提供的基质中CO2的浓度是至少10%、或至少15%、或至少18%、或至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%。在某些实施方案中,向所述生物反应器中提供的基质中CO2的浓度是15%至65%、或约20%至约50%、或约25%至约45%。在其中向发酵施加压力的实施方案中,所述发酵所需的CO2的量减少。在大于约50kPag的压力存在下,基质流中所提供的CO2的量显著少于在大气压下提供时的量。在具体实施方案中,在大于约50kPag的压力下供给时,向所述生物反应器中提供的基质中CO2的浓度是约1%至约50%。
在本发明的第二个方面,提供了一种用于提高衍生自丙酮酸盐的至少一种产物的产生的方法,所述方法包括:
a.使包含CO和CO2的基质流到包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中;以及
b.调节流到所述生物反应器中的CO2的量以使得在所述液体营养培养基中所提供的溶解的CO2的量增加。
在本发明的第三个方面,提供了一种用于控制丙酮酸盐衍生产物与乙酰辅酶A衍生产物的比率的方法,所述方法包括:
a.使包含CO和CO2的基质流到包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中;以及
b.调节二氧化碳向所述生物反应器的流动以使得溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量从而控制丙酮酸盐衍生产物与乙酰辅酶A衍生产物的比率。
在本发明的一个实施方案中,使溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量增加会通过增加丙酮酸盐衍生产物的产生而提高丙酮酸盐衍生产物与乙酰辅酶A衍生产物的比率。在一个实施方案中,使所述液体营养培养基中溶解的CO2的量减少会通过减少丙酮酸盐衍生产物的产生而降低丙酮酸盐衍生产物与乙酰辅酶A衍生产物的比率。
在第四个方面,提供了一种用于控制包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的发酵培养物的代谢谱的方法,所述方法包括:
使包含CO和CO2的气体基质流到包含所述微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中;
监测离开所述生物反应器的排出流中CO2的浓度;以及
调节溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量以使得所述培养物的代谢得到控制。
在第五个方面,提供了一种用于提高一种或多种产物的产生的方法,所述方法包括:
向容纳一种或多种微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中提供包含CO的基质;以及
使所述基质发酵以产生一种或多种液体产物和CO2。
在一个实施方案中,对一种或多种发酵条件进行调节以增加由所述培养物所消耗的CO的量和由所述培养物产生的CO2的量。在一个实施方案中,通过改变发酵中的质量传递来增加由所述培养物所消耗的CO的量。在一个实施方案中,通过提高所述气体基质向所述生物反应器中的流动速率来增加由所述培养物所消耗的CO的量。在一个实施方案中,通过提高所述生物反应器中所述液体营养培养基的搅拌速率来增加由所述培养物所消耗的CO的量。在一个实施方案中,通过增加气泡表面积来增加由所述培养物所消耗的CO的量。
在一个实施方案中,增加由所述微生物培养物所消耗的CO的量增加了离开所述生物反应器的出口流中CO2的量。在一个实施方案中,所述出口流中CO2的量是至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%、或至少50%。
在第六个方面,提供了一种用于增加包含至少一种微生物的培养物的液体营养培养基中溶解的CO2的量的方法,所述方法包括:
将包含CO的进料气流和液体营养培养基引入到至少一个生物反应器中以形成发酵液,所述生物反应器还包括用于使所述发酵液的一部分从靠近所述生物反应器的顶部的点循环到靠近所述生物反应器的底部的点的下降管;
使所述CO在所述生物反应器中发酵成液体产物和包含CO2的气体排出流;
c.将所述气体排出流的至少一部分通到所述生物反应器的下降管或第二生物反应器中,所述下降管是位于靠近所述生物反应器的顶部处的气体排出流的来源;以及
d.将所述气体排出流和所述液体营养培养基沿着所述下降管混合以形成气液混合物,从而提高所述气液混合物上的流体静压,以使得来自所述排出气流的CO2在所述下降管的底部部分处溶解到所述液体营养培养基中。
在一个具体的实施方案中,将来自第一生物反应器的排出气流通到第二生物反应器的下降管中。在另一个实施方案中,使来自第一生物反应器的排出气流再循环到第一生物反应器的下降管中。或者,将来自第一生物反应器的排出气流通到第一生物反应器或第二生物反应器的气体入口中。此外,第二反应器的进料流可以是任选地与新鲜进料气流混合的来自第一反应器的排出气流或尾气流的一部分。可以串联方式添加额外的生物反应器并且排出气流通到相同或不同的生物反应器中,如上文所述。
在另一个方面,提供了一种用于通过微生物对气体基质的发酵产生一种或多种产物的方法,所述方法包括:
a.在包含一种或多种一氧化碳营养型微生物在液体营养培养基中的培养物的第一反应器中,接收包含CO的气体基质;
b.使所述包含CO的气体基质发酵以产生一种或多种液体产物和包含CO2的排出气体;
c.将所述包含CO2的排出气体供给到第二生物反应器中,所述第二生物反应器包含一种或多种一氧化碳营养型微生物在液体营养培养基中的培养物;以及
d.使所述包含CO2的排出气体发酵以产生一种或多种产物。
在一个实施方案中,在被供给到所述第二生物反应器中之前,将所述包含CO2的排出气体与一种或多种气体基质共混。在一个实施方案中,将另外的气体基质添加到所述第二生物反应器中以用作微生物发酵的基质。
在一个实施方案中,在所述第一生物反应器和所述第二生物反应器中提供的所述一种或多种微生物是相同的。在一个实施方案中,所述微生物发酵产生至少两种产物。在一个实施方案中,在所述第一生物反应器与所述第二生物反应器之间,所述两种产物的产生比率是不同的。在一个实施方案中,所述发酵产生至少一种醇和至少一种副产物。在一个实施方案中,在所述第一生物反应器和所述第二生物反应器中所述至少一种产物与所述至少一种副产物的比率是不同的。在一个实施方案中,所述产物是乙醇并且所述副产物是2,3-丁二醇(2,3-BDO)。在一个实施方案中,在所述第二生物反应器中,乙醇(EtOH)与2,3-BDO的比率更低。
在一个实施方案中,所述一种或多种微生物选自包括以下各项的组:产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)以及科斯卡塔梭菌(Clostridiumcoskatii)。
在一个实施方案中,可以将离开所述第二生物反应器的尾气再循环到所述第一生物反应器中用作基质。
在本发明的另一个方面,提供了一种用于控制包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的发酵培养物的代谢谱的方法,所述方法包括:
a.使包含CO的气体基质流到包含所述微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中以提供发酵液;以及
b.提高CO经由铁氧还蛋白依赖性一氧化碳脱氢酶的氧化速率以提高所述发酵液中还原型铁氧还蛋白的水平;
其中还原型铁氧还蛋白的水平提高使得来自乙酰辅酶A的丙酮酸盐发酵速率提高。
附图说明
图1示出了本发明的微生物的代谢途径。
图2是示出了在发酵期间压力对代谢物浓度的影响的图表。
图3是示出了液体营养培养基中溶解的CO2对2,3-丁二醇产生的影响的图表。
图4是示出了实施例2的微生物培养物的CO利用率的图表。
图5是示出了实施例3A中入口流中CO2的浓度对代谢物浓度的影响的图表。
图6是示出了实施例3A的微生物培养物对CO、CO2以及H2的摄取量的图表。
图7是示出了实施例3B中随时间推移代谢物浓度的图表。
图8是示出了实施例3B的气体组成的图表。
图9是示出了微生物培养物对实施例3C的入口气流的各种组分的摄取量的图表。
图10是示出了实施例3C中入口气流中CO2逐渐增加对代谢物浓度的影响的图表。
图11是示出了根据实施例3D在使入口流中CO2的浓度循环的情况下代谢物浓度的图表。
图12是示出了微生物培养物对实施例3D的入口流中各种组分的摄取量的图表。
图13是示出了实施例3E的代谢物浓度的图表。
图14是示出了微生物培养物对实施例3E的入口流中各种组分的摄取量的图表。
图15是示出了实施例4的代谢物浓度的图表。
图16是所计算的溶解CO2与2,3-丁二醇产生速率的关系图。
图17是根据本发明的一个实施方案的系统的图示。
图18是示出了微生物培养物对实施例4的入口流中各种组分的摄取量的图表。
具体实施方式
本申请的发明人已经发现了用于控制由一种或多种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的培养物产生的代谢产物的方法和系统。具体来说,本申请的发明人已经发现了一种用于提高在发酵过程中衍生自丙酮酸盐的一种或多种产物的产生的方法。
以下是总体上给出的对包括本发明的优选实施方案在内的本发明的说明。本文在下文中的标题“实施例”下给出的公开内容中进一步例证了本发明,所述公开内容提供了支持本发明的实验数据、本发明的各个方面的具体实施例以及实施本发明的方式。
定义
如本文所用的“丁二醇”指的是所述二醇的所有结构异构体,包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和2,3-丁二醇以及其立体异构体。术语“2,3-丁二醇”应当被解释成包括所述化合物的所有对映形式和非对映形式,包括(R,R)型、(S,S)型和内消旋型、外消旋形式、部分立体异构纯形式和/或基本上立体异构纯形式。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置,它包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、或适合于气-液接触的其它容器或其它装置。如本文随后所述,在一些实施方案中,所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而,在提到向生物反应器或发酵反应物中添加基质,例如包含一氧化碳的基质时,在适当时应当被理解为包括向这些反应器中的任何一个或这两个中进行添加。
术语“包含一氧化碳的基质”和类似术语应当被理解为包括例如其中一氧化碳可供一种或多种细菌菌株利用以进行生长和/或发酵的任何基质。
“包含一氧化碳的气体基质”包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。所述气体基质通常将含有主要比例的CO,优选地至少约15体积%至约95体积%的CO。
“包含CO2的基质”包括含有一定水平的二氧化碳的任何基质流。然而,应当了解的是,所述气体基质可以替代的形式提供。举例来说,所述含有CO2的气体基质可以溶解于液体中的形式提供。基本上,使用含有二氧化碳的气体使液体饱和,然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说,可以使用微泡分散发生器(Hensirisak等人,用于需氧发酵的微泡分散发生器的按比例放大(Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation);AppliedBiochemistryand Biotechnology,第101卷,第3期/2002年10月)。再举例来说,可以使所述含有CO2和H2的气体基质吸附到固体载体上。
术语“提高效率”、“提高的效率”等在用于发酵工艺时包括但不限于提高以下各项中的一个或多个:催化所述发酵的微生物的生长速率、在升高的丁二醇浓度下的生长速率和/或产物产生速率、每单位体积所消耗的基质产生的所需产物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、以及产生的所需产物相比于发酵的其它副产物的相对比例。
术语“生产率”或“生产速率”是产品的体积生产率。在连续系统中,体积生产率被计算为产品的稳态浓度与液体停留时间的比率。在分批系统中,体积生产率被计算为浓度和在分批系统中产生所述浓度所需的时间。体积生产率是以克/升/天为单位来报告的。
除非上下文另有要求,否则如本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意在涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段这两者。
如本文所用的术语“衍生自丙酮酸盐的产物”或类似术语意图涵盖具有丙酮酸盐前体的发酵产物。这些产物包括但不限于2,3-丁二醇、乳酸盐、丁二酸盐、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠檬酸苹果酸盐、丁二烯以及聚乳酸。
如本文所用的术语“乙酰辅酶A衍生产物”、“衍生自乙酰辅酶A的产物”或类似术语意图涵盖具有乙酰辅酶A前体的发酵产物。这些产物包括但不限于乙醇、乙酸、丙酮、丁醇、3-羟基丁酸盐和异丁烯、3-羟基丙酸盐(3HP)以及脂肪酸。
已经发现在发酵过程中在微生物培养物正表现出应激迹象期间2,3-丁二醇的产生增加。本申请的发明人已经鉴定出对应于2,3-丁二醇的量增加的数个应激指标,包括微生物培养物的乳酸盐产生、微生物培养物的pH值升高、以及微生物培养物的生物质浓度降低。有趣的是,本申请的发明人已经证实微生物培养物的2,3-丁二醇产生不是应激指标,并且有可能提供具有提高的2,3-丁二醇生产率的健康的并且稳定的微生物培养物。
先前已经证实的是,提高的2,3-丁二醇生产率受微生物培养物的氢耗速率的影响(WO2012131627)。
CO2对发酵的影响
本申请的发明人已经发现通过改变向微生物培养物提供的CO2的量,会影响到微生物的代谢途径。通过改变向微生物培养物提供的CO2的量,可以对培养物的代谢进行调控。
本申请的发明人已经惊人地证实了在向微生物培养物提供增加量的二氧化碳时丙酮酸盐衍生产物的产生增加。相应地,已经发现在减少溶解在微生物培养物中的CO2的量时,衍生自乙酰辅酶A的产物的产生增加,并且丙酮酸盐衍生产物的产生减少。
先前已经证实的是,在发酵条件下向一氧化碳营养型培养物提供包含CO和任选的氢气的基质引起了醇和酸的产生。先前还已经证实了乙醇的产生,伴有包括2,3-丁二醇和乙酸在内的另外的副产物的产生。
本申请的发明人现在已经发现,通过另外向微生物培养物供给二氧化碳,可以控制代谢途径的丙酮酸盐分支的代谢。上文所述的代谢途径更详细地示于图1和下文中。
一氧化碳营养型产乙酸菌使用伍德-扬达尔途径将碳固定到乙酰辅酶A中(Drake,Küsel,Matthies,Wood以及Ljungdahl,2006;Wood,1991),所述乙酰辅酶A用作诸如乙酸盐和乙醇等产物和脂肪酸生物合成的前体。除乙酰辅酶A之外,细胞中另一种关键中间体是丙酮酸盐(丙酮酸),它用作如2,3-丁二醇、乳酸或丁二酸的产物以及生长和生物质形成所需的氨基酸、维生素、或核酸的前体。乙酰辅酶A可以在由丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)所催化的单个可逆性酶促步骤中被直接转化成丙酮酸盐或反之亦然,该丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶有时还被称为丙酮酸合酶(EC1.2.7.1)。PFOR反应如下在反应1中所示:
(1)乙酰辅酶A+CO2+还原型铁氧还蛋白+2H+<->丙酮酸盐+氧化型铁氧还蛋白
ΔGO'=-4.6kcal/mol(19.2kJ/mol)(Thauer,Jungermann,Decker以及Pi,1977)。
在自养生长的一氧化碳营养型产乙酸菌中,所有所产生的丙酮酸盐必须首先经过乙酰辅酶A。由于乙酰辅酶A是C2化合物并且丙酮酸盐是C3化合物,因此需要并入CO2分子(反应1)。用于这个反应的能量由还原型铁氧还蛋白提供(E0'=-398mV)。
提高丙酮酸盐形成速率的策略在于提高这个反应中离析物或反应物的水平(动态平衡)。举例来说,提高进料气中CO2的水平将提高丙酮酸盐自乙酰辅酶A的形成速率,而逆反应减少直到反应在丙酮酸盐形成的方向上几乎是不可逆的时候为止。类似地,可以通过例如提高CO经由铁氧还蛋白依赖性一氧化碳脱氢酶的氧化速率来提高还原型铁氧还蛋白的水平。
丙酮酸盐(丙酮酸)是具有2.5的非常低的pKa的一种酸,并且因此在更高的浓度下通过破坏ATP形成所需的必要的跨膜质子梯度而对细菌造成威胁(和Dürre,2011)。细菌的代谢库(sink)在于产生2,3-丁二醇,所述2,3-丁二醇将允许它中和丙酮酸并且挽救细胞。提高进料气中CO2的水平因此将间接地经由丙酮酸盐形成速率提高来增加2,3-丁二醇的形成。由丙酮酸盐产生2,3-丁二醇的反应如下在反应2中所示:
(2)2丙酮酸盐<->乙偶姻+2CO2
乙偶姻+NAD(P)H+H+<->2,3-丁二醇+NAD(P)+
乳酸和丁二酸是丙酮酸盐衍生产物,它们代表了另一个代谢库,并且尽管它们是弱得多的酸(分别具有pKa4.2和pKa5.6),但是它们在更高的水平下同样会对细菌造成威胁。另一方面,限制它们的产生可以增加丙酮酸盐池并且引起2,3-丁二醇产生增加。
本申请的发明人已经证实了,通过提高反应器中CO2的浓度和/或通过提高反应器中CO的浓度或提高CO由CODH氧化的速率,从而使得还原型铁氧还蛋白的水平升高,可以相对于乙酰辅酶A增加丙酮酸盐的产生。
具体来说,本申请的发明人已经证实了,可以通过提高溶解在反应器的液体培养基中的CO2浓度来提高乙酰辅酶A衍生产物(例如乙醇)与丙酮酸盐衍生产物(例如2,3-丁二醇)的比率。可以通过增加向发酵提供的气体基质中CO2的量来增加溶解在液体营养培养基中的CO2的量。在一个实施方案中,向生物反应器中提供的基质中CO2的浓度是至少10%、或至少15%、或至少18%、或至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少35%、或至少40%、或至少45%。在某些实施方案中,向所述生物反应器中提供的基质中CO2的浓度是15%至65%、或约20%至约50%、或约25%至约45%。
虽然向培养物提供的低溶解CO2浓度(例如入口气流中0%至10%的CO2)将产生约30:1至约20:1的乙醇与2,3-丁二醇的比率,但是本申请的发明人已经证实了,向培养物提供升高的CO2浓度(例如入口气流中10%-65%的CO2)将产生约20:1至1:1,优选地10:1至1:1的乙醇与2,3-丁二醇的比率。
在需要低的丙酮酸盐衍生产物产生的情况下,可以低的溶解CO2浓度为目标。还可以使用这种方法以提高乙酰辅酶A衍生产物的产生。举例来说,在入口气流中具有0%-10%CO2的入口气流将产生高的乙醇与2,3-丁二醇的比率。
此外,已经发现增加由培养物所消耗的CO的量会增加所产生的CO2的量,这进而增加丙酮酸盐衍生产物的产生。可以通过改变发酵中的质量传递、提高气体基质向生物反应器的流动速率和/或通过提高生物反应器中液体营养培养基的搅拌速率来增加由培养物所消耗的CO的量。还可以通过增加气泡表面积来增加由培养物所消耗的CO的量。通常,可以通过以细小气泡形式引入气体基质来实现高质量传递。本领域技术人员将了解用于引入气体基质的装置,如喷射器。
溶解的CO2和压力
本申请的发明人已经鉴定出用于控制和调节向微生物培养物提供的溶解的CO2的量以控制发酵的代谢谱的多种方法。用于调节溶解在液体营养培养基中的CO2的量的一种这样的方法包括调节系统的压力。
本申请的发明人已经证实了提高生物反应器中的压力将使得发酵培养基中溶解的CO2的量增加。为了提高丙酮酸盐衍生产物的产生,应当在约250kPag至约450kPag(或大于500kPag)的压力下进行发酵,以使得溶解在液体营养培养基中的CO2的浓度升高。在某些实施方案中,所述压力大于250kPag、或大于300kPag、或大于350kPag、或大于400kPag、或大于450kPag、或大于500kPag。
为了产生更高水平的丙酮酸盐衍生产物,在其中在50kPag或更大的压力下向反应器中提供CO2的情况下,在基质中需要的CO2浓度更低。由于培养物经由利用CO而产生CO2,因此如果压力相当高的话,可以向反应器中供给具有极低CO2浓度的入口气流。在某些实施方案中,在50kPag或更高的压力下向反应器提供的CO2的量少于10%、或少于5%、或少于1%。在某些实施方案中,在50kPag或更大的压力下基本上不向反应器中提供CO2。优选地,在50kPag或更大的压力下供给的入口气流的CO2浓度是约0%至50%。
本申请的发明人已经证实了2,3-丁二醇的产生受发酵罐中CO2分压量的影响,所述CO2分压量进而会使得溶解在液体营养培养基中的CO2的量发生变化。气流的更高的CO2分压将使溶解在液体营养培养基中的CO2的量增加。在优选的实施方案中,将以约50kPag至约500kPag的分压向反应器供给CO2。
此外,本申请的发明人已经证实还有可能通过逐渐增加向反应器供给的CO2的量来逐渐增加溶解的CO2的量。
一些气流中CO2的量可能不足以使得液体营养培养基中能够有足量的溶解CO2。为了克服这一问题,本申请的发明人已经提供了一种通过使尾气或排出气体从生物反应器的出口再循环到生物反应器的入口来增加CO2的量的方法和系统。为了独立于CO的分压和总压力使CO2分压以及因此溶解的CO2的量发生改变,可以使排出气体/尾气再循环到同一个反应器中。反应器内的发酵过程将使得CO和H2被高度转化,并且因此尾气将主要由CO2和任何惰性气体种类组成。因此,使尾气再循环将允许独立于CO分压和总压力对CO2分压加以控制。
使用双反应器系统允许离开第一生物反应器的包含CO2的排出气体被通到第二生物反应器中。通过将包含CO2的排出气体供给到第二生物反应器的下降管中而不是供给到反应容器中,提高了反应器中CO2的分压。在CO2-液体混合物沿下降管向下行进时,流体静压头提高,从而增加了溶解在溶液中的CO2的量。
为了使尾气从第一反应器再循环到第二反应器或接收反应器中,第一反应器的顶空压力必须略高于在接收反应器的下降管处的压力,以克服管线损耗和喷射器压降。为了使“尾气”从它自身的顶空再循环,可以使尾气再循环到气体入口或下降管中,其中所述下降管将需要引射器(eductor)以捕集尾气(在下降管中使用液体流来夹带尾气)。被再循环到下降管中的CO2的量将被控制以使得在加减速期间溶解在液体营养培养基中的CO2将得到优化。图17提供了具有向下降管提供的富含CO2的基质的循环式环管反应器的图示,其中(1)是上升管;(2)是下降管;(3)是进料气;(4)是尾气/排出气体;(5)是其中来自不同反应器或同一反应器的尾气的富含CO2的气体进入下降管中的点;以及(6)是使气体/液体混合物循环穿过上升管和下降管的回路泵。
生物反应器
可以在任何合适的生物反应器中进行发酵,如连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器、气升式反应器、鼓泡塔反应器(BCR)、膜反应器(如中空纤维膜生物反应器(HFMBR))或滴流床反应器(TBR)。此外,在本发明的一些实施方案中,生物反应器可以包括其中培养微生物的第一生长反应器,以及第二发酵反应器,可以向所述第二发酵反应器中供给来自生长反应器的发酵液并且其中可以产生大部分的发酵产物(例如乙醇和乙酸盐)。本发明的生物反应器被适配成接收含有CO和/或H2的基质。
发酵基质
在发酵反应中使用包含一氧化碳和氢气或二氧化碳中的至少一种的基质以在本发明的方法中产生一种或多种产物。优选地,所述基质是气体基质。所述气体基质可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源,如从内燃机(例如汽车)排烟获得的废气。在某些实施方案中,所述工业过程选自由以下各项组成的组:铁金属产品制造(如钢厂)、非铁产品制造、石油炼制过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产、焦炭制造以及天然气重整。在这些实施方案中,可以在将气体基质排放到大气中之前,使用任何简便的方法从工业过程对它进行捕集。根据气体基质的组成,也可能期望在将它引入到发酵中之前对它进行处理以去除任何不希望有的杂质,如尘粒。举例来说,可以使用已知的方法对气体基质进行过滤或洗涤。
在本发明的其它实施方案中,气体基质可以源自于生物质的气化。气化工艺涉及生物质在空气或氧气的限制供给下的部分燃烧。所得气体通常主要包含CO和H2,具有极小体积的CO2、甲烷、乙烯以及乙烷。举例来说,在食品,诸如来自甘蔗的糖、或来自玉米或谷物的淀粉的提取和加工期间获得的生物质副产物或由林业产业产生的非食物生物质废物可以被气化以产生适用于本发明中的含有CO的气体。
含有CO的基质通常将含有主要比例的CO,如至少约15体积%至约100体积%的CO、40体积%至95体积%的CO、40体积%至60体积%的CO、以及45体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中,所述基质包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%的CO、或约55体积%的CO、或约60体积%的CO。具有较低浓度的CO(如6%)的基质也可以是适当的,特别是在还存在H2和CO2时。
通常,将一氧化碳以气态添加到发酵反应中。然而,本发明不应当被认为限于添加呈这种状态的基质。举例来说,可以液体形式提供一氧化碳。举例来说,可以使用含有一氧化碳的气体使液体饱和,然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说,可以使用如上文所述的微泡分散发生器。
在一个实施方案中,将二氧化碳以气态添加到发酵中。在替代性实施方案中,以碳酸盐或碳酸氢盐形式提供二氧化碳。
在本发明的一个实施方案中,可以在发酵反应中使用两种或更多种不同基质的组合。
此外,常常期望提高基质流的CO浓度(或气体基质中的CO分压)并且因此提高以CO作为基质的发酵反应的效率。提高气体基质中CO的分压使得CO向发酵培养基中的质量传递增加。用于向发酵反应中进料的气流的组成可能对该反应的效率和/或成本具有显著的影响。举例来说,O2可能会降低厌氧发酵工艺的效率。在发酵之前或之后在发酵工艺的阶段中对不需要的或不必要的气体进行处理可能增加对这些阶段的负担(例如在将气流在进入生物反应器中之前进行压缩的情况下,可能使用不必要的能量来压缩在发酵中不需要的气体)。因此,可能期望处理基质流,特别是来源于工业来源的基质流以去除不需要的组分并且提高所需组分的浓度。
在某些实施方案中,在包含CO的基质中提供很少的氢气或不提供氢气。
物流的共混
可能期望将包含CO和H2的重整基质流与一种或多种另外的物流共混以提高发酵反应的效率、醇产生和/或总碳捕获量。不希望受理论所束缚,在本发明的一些实施方案中,一氧化碳营养型细菌根据以下使CO转化成乙醇:
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
然而,在H2存在下,总体转化可以如下:
6CO+12H2→3C2H5OH+3H2O
因此,可以将具有高CO含量的物流与包含CO和H2的重整基质流共混以提高CO:H2比而优化发酵效率。举例来说,工业废物流,如来自钢厂的废气具有高CO含量,但是包括极少的H2或不包括H2。因而,可能期望将包含CO和H2的一种或多种物流与包含CO的废物流共混,之后将共混的基质流提供到发酵罐中。发酵的总效率、醇生产率和/或总碳捕获量将取决于共混的物流中CO和H2的化学计量。然而,在具体实施方案中,共混的物流可以基本上以如下摩尔比包含CO和H2:20:1、10:1、5:1、3:1、2:1、1:1或1:2。
此外,可能期望在发酵的不同阶段以特定的比率提供CO和H2。举例来说,可以在启动和/或快速微生物生长阶段期间向发酵阶段提供具有相对高的H2含量(如1:2的CO:H2)的基质流。然而,当生长阶段减慢以使得培养物维持在基本上稳定的微生物密度时,可以增加CO的含量(如至少1:1或2:1或更高,其中H2浓度可以大于或等于零)。
物流的共混还可以具有另外的优势,特别是在包含CO的废物流在性质上是间歇性的情况下。举例来说,可以将包含CO的间歇性废物流与包含CO和H2的基本上连续的重整基质流共混并且向发酵罐中提供。在本发明的具体实施方案中,基本上连续的共混物流的组成和流动速率可以根据间歇性物流而改变以维持向发酵罐提供具有基本上连续的组成和流动速率的基质流。
培养基
将了解的是,为了使一种或多种微生物生长以及使基质向乙醇和/或乙酸盐进行发酵,除了基质之外,还将需要向生物反应器中供给合适的营养培养基。营养培养基将含有足以允许所使用的微生物生长的组分,如维生素和矿物质。仅举例来说,适用于培养产乙醇梭菌的厌氧培养基是本领域已知的,如例如由Abrini等人(产乙醇梭菌新菌种,一种由一氧化碳产生乙醇的厌氧细菌(Clostridiumautoethanogenum,sp.Nov.,AnAnaerobicBacteriumThatProducesEthanolFromCarbonMonoxide);Arch.Microbiol.,161:345-351(1994))所述。本文以下的“实施例”部分提供了合适培养基的另外的实例。
发酵
用于由气体基质产生乙醇和其它醇的方法是已知的。示例性方法包括例如WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925、WO2009/064200、US6,340,581、US6,136,577、US5,593,886、US5,807,722以及US5,821,111中所述的那些方法,这些文献中的每一篇以引用的方式并入本文。
发酵条件
所述发酵应当理想地在用于使基质向乙醇和/或乙酸盐进行发酵的适当条件下进行。应当考虑的反应条件包括温度、培养基流动速率、pH值、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜式反应器的话)、接种物水平、确保基质水平不会变成具有限制性的最大基质浓度和将基质引入到生物反应器中的速率、以及避免产物抑制的最大产物浓度。
最佳的反应条件将部分地取决于所使用的具体微生物。然而,一般来说,优选的是,在高于环境压力的压力下进行发酵。在升高的压力下进行操作允许CO从气相向液相的传递速率显著增加,其中CO可以由微生物摄取作为用于产生乙醇的碳源。这进而意味着在将生物反应器维持在高压而非大气压时可以缩短停留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流动速率)。
此外,由于给定的CO向产物的转化率部分地随基质停留时间而变化,并且实现所需的停留时间进而要求生物反应器具有所需的体积,因此使用加压系统可以大幅减小所需的生物反应器的体积,并且因此降低发酵设备的资金成本。根据美国专利号5,593,886中所给出的实施例,可以按线性比例减小反应器的体积以提高反应器的操作压力,即在10个大气压的压力下操作的生物反应器仅需要是在1个大气压的压力下操作的那些生物反应器的体积的十分之一。
在高压下进行气体向产物发酵的益处也已在别处有所描述。举例来说,WO02/08438描述了在30psig和75psig的压力下进行气体向乙醇的发酵,分别得到150克/升/天和369克/升/天的乙醇生产率。然而,发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵每天每升产生的乙醇是前者的1/20至1/10。
适用于使包含CO的基质进行厌氧发酵的发酵条件的实例详述于WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925以及WO2009/064200中。应当认识到的是,其中所报道的发酵条件可以容易地根据本发明的方法加以改进。
微生物
在各个实施方案中,使用一氧化碳营养型细菌的一种或多种菌株的培养物进行发酵。在各个实施方案中,所述一氧化碳营养型细菌选自穆尔氏菌(Moorella)、梭菌(Clostridium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、真杆菌(Eubacterium)、丁酸杆菌(Butyribacterium)、醋菌(Oxobacter)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、甲烷八叠球菌以及脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)。许多厌氧细菌已知能够进行CO向包括正丁醇和乙醇在内的醇和乙酸的发酵,并且适用于本发明的方法中。适用于本发明中的这些细菌的实例包括梭菌属的那些细菌,如杨氏梭菌的菌株,包括WO00/68407、EP117309、美国专利号5,173,429、5,593,886和6,368,819、WO98/00558以及WO02/08438中所述的那些;食一氧化碳梭菌的菌株(Liou等人,InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology33:第2085-2091页)、拉氏梭菌的菌株(WO/2008/028055)以及产乙醇梭菌的菌株(Abrini等人,ArchivesofMicrobiology161:第345-351页)。其它合适的细菌包括穆尔氏菌属的那些细菌,包括穆尔氏菌属菌种HUC22-1(Sakai等人,BiotechnologyLetters29:第1607-1612页),以及氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)的那些细菌(Svetlichny,V.A.,Sokolova,T.G.等人(1991),SystematicandAppliedMicrobiology14:254-260)。另外的实例包括热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermoautotrophica)、产生瘤胃球菌(Ruminococcusproductus)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、普氏醋菌(Oxobacterpfennigii)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)(Simpa等人,CriticalReviewsinBiotechnology,2006第26卷.第41-65页)。此外,应当了解的是,其它产乙酸型厌氧细菌也可能适用于本发明,如将由本领域技术人员所了解。还将了解的是,本发明可以应用于两种或更多种细菌的混合培养物。
在一个实施方案中,所述微生物选自产乙酸型一氧化碳营养型生物体的组,该组包括菌种产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌(Clostridiumdrakei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、乙酸梭菌(Clostridiumaceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、马氏梭菌(Clostridiummagnum)、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculumbacchii)、热醋穆尔氏菌、卵形鼠孢菌(Sporomusaovate)、食甲基丁酸杆菌、布劳特氏菌(Blautiaproducta)、粘液真杆菌、凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacterkiuvi)。
这些一氧化碳营养型产乙酸菌是根据它们在厌氧条件下利用诸如一氧化碳(CO)以及含一氧化碳(CO)的二氧化碳(CO2)等气体一碳(C1)来源和/或氢气(H2)作为能量来源并且依靠这些物质化能自养生长,从而形成乙酰辅酶A、乙酸盐以及其它产物的能力来定义的。它们共有相同的发酵模式,即伍德-扬达尔途径或还原性乙酰辅酶A途径,并且根据由以下各项组成的酶组的存在来定义:一氧化碳脱氢酶(CODH)、氢化酶、甲酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶、以及一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶(CODH/ACS),所述组合是这种类型的细菌的特征并且是它们所特有的(Drake,Küsel,Matthies,Wood以及Ljungdahl,2006)。
与使基质转化成生物质、次级代谢物以及丙酮酸盐,然后由所述丙酮酸盐形成产物(经由乙酰辅酶A或直接)的糖发酵细菌的化能异养生长对比,在产乙酸菌中,基质被直接引导形成乙酰辅酶A,然后由所述乙酰辅酶A形成产物、生物质、以及次级代谢物。
在另一个实施方案中,所述微生物选自一群一氧化碳营养型梭菌,包括菌种产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”以及相关的分离株。
这些包括但不限于菌株产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau以及Nyns,1994)、产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528=ATCC55383)(Tanner,Miller以及Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11T”(ATCCBAA-622)(WO2008/028055)、以及相关的分离株,如“科斯卡塔梭菌”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属菌种MT351”(Tyurin和Kiriukhin,2012)、“梭菌属菌种MT653”(Berzin,Kiriukhin以及Tyurin,2012a)、“梭菌属菌种MT683”(Berzin,2012)、“梭菌属菌种MT962”(Berzin,Kiriukhin以及Tyurin,2013)、“梭菌属菌种MT1121”(Berzin,Kiriukhin以及Tyurin,2012b)、“梭菌属菌种MT1230”(Kiriukhin和Tyurin,2013)、或“梭菌属菌种MT1962”(Berzin,Tyurin以及Kiriukhin,2013)、以及其突变株,如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-AcevedoO.,使用杨氏梭菌由合成气生产生物乙醇(ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsingClostridiumljungdahlii),博士论文,北卡罗来纳州立大学(NorthCarolinaStateUniversity),2010)或“梭菌属菌种MT896”(Berzin,Kiriukhin以及Tyurin,2012c)。
这些菌株形成了梭菌rRNA集群I(Collins等人,1994)内的一个子集群,在16SrRNA基因水平上具有至少99%同一性,但仍是不同的菌种,如由DNA-DNA复性和DNA指纹图谱实验(WO2008/028055、美国专利2011/0229947)所确定。
这个集群中的菌株由共同的特征限定,具有相似的基因型和表型这两者,并且它们都共有相同的能量保存和发酵代谢的模式。这个集群中的菌株缺少细胞色素并且经由Rnf复合体来保存能量。
这个集群中的所有菌株均具有相似的基因型,所述基因型具有约4.2MBp的基因组尺寸(等人,2010)和约32摩尔%的GC组成(Abrini等人,1994;等人,2010;Tanner等人,1993)(WO2008/028055;美国专利2011/0229947),以及编码以下酶的保守的必要关键基因操纵子:伍德-扬达尔途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶、以及一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(等人,2010,2011)。已经发现在所有菌种中负责气体摄取的伍德-扬达尔途径基因的组织和数量是相同的,尽管在核酸序列和氨基酸序列上存在差异(等人,2011)。
这些菌株均具有相似的形态和尺寸(呈对数生长的细胞是0.5-0.7×3-5μm),是嗜温的(最佳生长温度是30℃-37℃)和严格厌氧菌(Abrini等人,1994;Tanner等人,1993)(WO2008/028055)。此外,它们均共有相同的主要系统发育性状,如相同的pH值范围(pH4-7.5,最佳的初始pH值是5.5-6)、以相似的生长速率依靠含CO的气体进行强自养生长、以及相似的代谢谱,其中乙醇和乙酸是主要的发酵最终产物,并且在一定条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等人,1994;等人,2011;Tanner等人,1993)(WO2008/028055)。在所有菌种的情况下均观测到吲哚的产生。然而,这些菌种在对各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、或其它基质(例如甜菜碱、丁醇)的基质利用率方面有所不同。此外,发现这些菌种中的一些是针对某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型菌种,而其它则不是。此外,已经证实在这些生物体中的多种生物体中将羧酸还原成它们相应的醇(Perez,Richter,Loftus以及Angenent,2012)。这些性状因此不是一种生物体如产乙醇梭菌或杨氏梭菌所特有的,而是一氧化碳营养型合成乙醇的梭菌的一般性状,并且可以预期的是,机制在这些菌株间起相似作用,尽管在性能上可能存在差异(Perez等人,2012)。
适用于本发明中的一种示例性微生物是产乙醇梭菌。在一个实施方案中,所述产乙醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心(GermanResourceCentreforBiologicalMaterial,DSMZ)以识别保藏号19630保藏的菌株的识别特征的产乙醇梭菌。在另一个实施方案中,所述产乙醇梭菌是具有DSMZ保藏号DSMZ10061的识别特征的产乙醇梭菌。这些菌株对基质组成,特别是H2和CO的基质组成的变化具有特定的耐受性并且因而特别适合于与蒸汽重整工艺组合使用。
适用于根据本发明的一个方面由包含CO2和H2的基质产生乙酸盐的一种示例性微生物是伍氏醋酸杆菌。
可以使用本领域已知用于使用厌氧细菌进行培养和使基质发酵的多种方法对用于本发明的方法中的细菌进行培养。举例来说,可以利用在以下文章中大体上描述的使用气体基质进行发酵的那些方法:(i)K.T.Klasson等人,(1991).用于合成气发酵资源的生物反应器(Bioreactorsforsynthesisgasfermentationsresources).ConservationandRecycling,5;145-165;(ii)K.T.Klasson等人,(1991).用于合成气发酵的生物反应器设计(Bioreactordesignforsynthesisgasfermentations).Fuel.70.605-614;(iii)K.T.Klasson等人,(1992).合成气向液体燃料或气体燃料的生物转化(Bioconversionofsynthesisgasintoliquidorgaseousfuels).EnzymeandMicrobialTechnology.14;602-608;(iv)J.L.Vega等人,(1989).气体基质发酵的研究:一氧化碳向乙酸盐的转化(StudyofGaseousSubstrateFermentation:CarbonMonoxideConversiontoAcetate),2.连续培养(ContinuousCulture).Biotech.Bioeng.34.6.785-793;(v)J.L.Vega等人,(1989).气体基质发酵的研究:一氧化碳向乙酸盐的转化(Studyofgaseoussubstratefermentations:Carbonmonoxideconversiontoacetate),1.分批培养(Batchculture),BiotechnologyandBioengineering.34.6.774-784;(vi)J.L.Vega等人,(1990).用于煤合成气发酵的生物反应器设计(DesignofBioreactorsforCoalSynthesisGasFermentations).Resources,ConservationandRecycling.3.149-160;所有这些文章均以引用的方式并入本文。
发酵产物
本发明的方法可以用于生产多种烃类产品中的任一种。这包括醇、酸和/或二醇。更具体地说,本发明可以适用于发酵以生产丁酸盐、丙酸盐、己酸盐、乙醇、丙醇、丁醇、2,3-丁二醇、丙烯、丁二烯、异丁烯以及乙烯。在一个实施方案中,本发明可以用于生产醇,包括但不限于丙醇和丁醇。然后可以使一种或多种醇与乙酸盐反应以生产一种或多种产品,包括乙酸丙酯或乙酸丁酯。本领域技术人员将了解的是,本发明不限于所提到的醇和产品,任何适当的醇和/或酸均可以用于生产产品。
这些产物和其它产物可以具有用于许多其它工艺的价值,如生产塑料、药物以及农用化学品。在一个实施方案中,发酵产物用于生产汽油范围的烃(约8碳)、柴油烃(约12碳)或喷气燃料烃(约12碳)。
本发明的方法还可以应用于需氧发酵、应用于其它产物的厌氧发酵或需氧发酵,所述产物包括但不限于异丙醇。本发明的方法还可以应用于需氧发酵、以及应用于其它产物的厌氧发酵或需氧发酵,所述产物包括但不限于异丙醇。
本发明还使得由发酵产生的烃产物的至少一部分在蒸汽重整工艺中被重复使用。这可能是由于除CH4以外的烃能够与蒸汽在催化剂上反应产生H2和CO而得以进行。在一个具体的实施方案中,使乙醇再循环以用作蒸汽重整工艺的原料。在另一个实施方案中,使烃原料和/或产物在用于蒸汽重整工艺中之前穿过预重整器。穿过预重整器部分地完成了蒸汽重整工艺的蒸汽重整步骤,这可以提高产氢效率并且减小蒸汽重整炉的所需容量。
本发明的方法还可以应用于需氧发酵、以及应用于其它产物的厌氧发酵或需氧发酵,所述产物包括但不限于异丙醇。
更具体地说,本发明可以适用于向乙醇和/或乙酸盐的发酵。然后可以使这些产物共同反应以生产包括酯在内的化学产品。在本发明的一个实施方案中,使由发酵产生的乙醇和乙酸盐共同反应以生产乙酸乙酯。乙酸乙酯可以具有用于许多其它工艺的价值,如生产包括表面涂料和稀释剂的溶剂以及制造药物以及调味剂和香精。
产物回收
可以使用已知的方法来回收发酵反应的产物。示例性方法包括WO07/117157、WO08/115080、US6,340,581、US6,136,577、US5,593,886、US5,807,722以及US5,821,111中所述的那些。然而,简单地说并且举例来说,可以通过诸如分馏或蒸发和萃取发酵等方法从发酵液中回收乙醇。
将乙醇从发酵液中蒸馏产生了乙醇和水的共沸混合物(即95%的乙醇和5%的水)。随后可以经由使用分子筛乙醇脱水技术获得无水乙醇,该技术也是本领域公知的。
萃取发酵程序涉及使用对发酵生物体存在低毒性风险的水混溶性溶剂来从稀发酵液中回收乙醇。举例来说,油醇是可以用于这种类型的萃取工艺中的溶剂。将油醇连续地引入到发酵罐中,此时,这种溶剂上升,从而在发酵罐的顶部形成层,将它经由离心机连续地萃取和进料。然后容易将水和细胞与油醇分离并且返回到发酵罐中,而将负载乙醇的溶剂供给到闪蒸单元中。大部分的乙醇被气化和冷凝,而油醇是非挥发性的并且被回收以在发酵中重新使用。
还可以使用本领域已知的方法从发酵液中回收可以作为发酵反应中的副产物产生的乙酸盐。
举例来说,可以使用包括活性炭过滤器的吸附系统。在这种情况下,优选的是,首先使用合适的分离单元从发酵液中去除微生物细胞。产生无细胞发酵液以进行产物回收的多种基于过滤的方法是本领域已知的。然后使无细胞的含有乙醇和乙酸盐的渗透物穿过容纳活性炭的柱以吸附乙酸盐。呈酸(乙酸)形式,而非呈盐(乙酸盐)形式的乙酸盐更容易由活性炭吸附。因此优选的是,在使发酵液穿过活性炭柱之前,将发酵液的pH值降低到小于约3以使大部分的乙酸盐转化成乙酸形式。
可以通过使用本领域已知的方法进行洗脱来回收被吸附到活性炭上的乙酸。举例来说,可以使用乙醇来洗脱结合的乙酸盐。在某些实施方案中,可以使用由发酵过程本身所产生的乙醇来洗脱乙酸盐。由于乙醇的沸点是78.8℃并且乙酸的沸点是107℃,因此可以容易使用基于挥发性的方法,如蒸馏将乙醇和乙酸盐彼此分离。
用于从发酵液中回收乙酸盐的其它方法也是本领域已知的并且可以被使用。举例来说,美国专利号6,368,819和6,753,170描述了可以用于从发酵液中萃取乙酸的溶剂和共溶剂系统。如同对于乙醇的萃取发酵所述的基于油醇的系统的实例一样,美国专利号6,368,819和6,753,170中所述的系统描述了可以在存在或不存在发酵的微生物的情况下与发酵液混合以萃取乙酸产物的水不混溶性溶剂/共溶剂。然后通过蒸馏将含有乙酸产物的溶剂/共溶剂与发酵液分离。然后可以使用第二蒸馏步骤从溶剂/共溶剂系统中纯化乙酸。
可以通过连续地将发酵液的一部分从发酵生物反应器中取出,将微生物细胞从发酵液中分离(方便地通过过滤),并且同时或依次从发酵液中回收一种或多种产物来从发酵液中回收发酵反应的产物(例如乙醇和乙酸盐)。使用上文所述的方法,在乙醇的情况下,它可以方便地通过蒸馏来回收,并且乙酸盐可以通过吸附在活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞放回发酵生物反应器中。还优选地将在已经去除了乙醇和乙酸盐之后剩余的无细胞渗透物放回发酵生物反应器中。在将无细胞渗透物放回生物反应器中之前,可以将另外的营养物质(如B族维生素)添加到所述无细胞渗透物中以补充营养培养基。此外,如果如上文所述对发酵液的pH值进行调节以增强乙酸对活性炭的吸附,那么应当将pH值重新调节到与发酵生物反应器中的发酵液的pH值类似的pH值,之后将其放回生物反应器中。
可以在消化中对从生物反应器中回收的生物质进行厌氧消化以产生生物质产物,优选地甲烷。这种生物质产物可以用作蒸汽重整工艺的原料或用于产生补充热量以驱动本文所限定的一个或多个反应。
实施例
现在将通过以下实施例来进一步阐明本发明。
实施例1:微阵列实验
发酵
在处在37℃并且含有CO作为唯一的能量和碳源的1.5L生物反应器中使用产乙醇梭菌DSM23693进行发酵,如下文所述。使用成分明确的液体培养基使培养物生长,该液体培养基每升含有:MgCl、CaCl2(2mM)、KCl(25mM)、H3PO4(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)。将培养基转移到生物反应器中并且补充以B族维生素溶液并且使用0.2mMCr(II)溶液还原。为了实现无氧环境,将反应容器用氮气吹扫。在接种之前,将气体转变成含有30%CO和70%N2的气体混合物,将该气体混合物连续地向反应器供给。将气体流量最初设定在100毫升/分钟并且将搅拌设定在300rpm。以0.3毫升/小时向生物反应器中给予Na2S。在发酵的生长阶段期间以50rpm的间隔使搅拌增加到900rpm。在分批模式下0.8天之后,以1.8毫升/分钟的液体速率将生物反应器切换成连续模式(稀释率:1.7d-1)。随后调节气体流量以达到4摩尔/升/天的CO摄取量。最大气体流量是每单位发酵罐体积435毫升/升。在达到稳定阶段之后,通过使CO2浓度从0%变成25%来开始实验。为了避免CO摄取量发生任何变化,将CO流量和总气体流量保持恒定,而将CO2流量和N2流量相对于彼此进行调节。仅在由先前进料方案产生的95%的代谢物被洗掉并且代谢物已经再次在新的水平上稳定了至少两天以使得可以提取数据进行分析之后,转换气体组成。获取培养基样品以测量生物质和代谢物并且定期对流入气体和流出气体进行顶空分析。
取样程序
使用预先冷却的管从生物反应器中采集样品;所采集的样品的量等同于在600nm下所测量的OD2。从生物反应器中采集三份样品以进行微阵列分析来比较气体组成和时间关于不同的EtOH:BDO比率对基因表达谱的影响。在反应器中存在30%CO和70%N2的气体混合物和23:1的EtOH:BDO比率的情况下采集第一份样品。在存在30%CO、40%N2以及30%CO2的气体混合物和13:1的EtOH:BDO比率的情况下采集第二份样品,在改变气体组成之后7小时之时采集这一样品。在存在与第二份样品相同的气体混合物,但是存在4:1的EtOH:BDO比率的情况下采集第三份样品,在将CO2添加到气体组成中之后3天时采集这一样品。在采集之后,将样品在4℃下以4000RPM离心10分钟,并且去除上清液,随后将沉淀物在液氮中快速冷冻并且储存在-80℃直到使用为止。
RNA提取
在将样品从-80℃复原之后,使用RiboPureTM细菌试剂盒(Ambion公司,件号AM1925)对样品进行提取。
微阵列分析
通过罗氏公司(Roche)使用标准技术来进行微阵列分析。
实施例2:压力对发酵的影响
图2、图3以及图4示出了在低压和高压这两者下进行的发酵的结果,以表明对发酵液中存在的溶解的CO2量以及由发酵产生的代谢物的浓度这两者的影响。在这些实验中的每一个中,用产乙醇梭菌的培养物对容纳液体营养培养基的生物反应器进行接种。向所述生物反应器提供包含CO和CO2的气体基质。
图2示出了第一个实验的结果,其中在不同的压力下进行发酵以确定压力对溶解的CO2的量和反应器中产生的2,3-丁二醇(2,3-BDO)的浓度的影响。
图2示出了从第0天-第6天在高压下(在反应器的顶空处是320kPag,并且在反应器底部是约420kPag),发酵液中溶解的CO2的量和所产生的2,3-BDO的浓度这两者均增加。当从第6天-第22天在低压下操作发酵(在顶空处是50kPag,并且在底部是约150kPag)时,发酵液中溶解的CO2的量和2,3-BDO的浓度这两者均减少。
图3清楚地表明了发酵液中溶解的CO2的量与2,3-丁二醇浓度之间的相关性。
图4表明了CO向CO2的转化对发酵的影响。当操作发酵以使得由细菌消耗的CO的量增加时,产生作为发酵副产物的CO2。CO由CODH(二氧化碳脱氢酶)转化成CO2产生了还原型铁氧还蛋白。高水平的还原型铁氧还蛋白是为乙酰辅酶A转化成丙酮酸盐所需的,这会引起2,3-丁二醇的产生增加,以及其它衍生自丙酮酸盐的产物的产生增加。
实施例3:提高溶解的CO
2
浓度
进行一组实验,这些实验证实了在发酵中溶解的CO2的水平引起了2,3-丁二醇的产生增加。
3A:作为提高2,3-BDO产生的一种方式,改变CO2入口浓度
在这个实验期间,在操作28天之后,使发酵液的入口气体的CO2浓度在一个步骤中从0%变成25%。CO摄取量在整个实验期间保持恒定并且在入口气体中CO的浓度保持在30%。如图5中所示,当CO2从0%变成25%时,观测到2,3-丁二醇的产生大幅增加。
图6描绘了在第25天-第31天之间发酵液中CO2浓度的变化。在第25天,向发酵提供的入口流中CO2的量是0%。在第28天,入口流的CO2浓度增加到25%。图6清楚地示出了在CO2增加之后,CO摄取量保持不变,这表明下文所详述的BDO产生的增加不能被解释成进入系统的碳更多。此外,在增加之后CO2的产生保持不变。图5清楚地表明了发酵的代谢物产生的相应变化。当向发酵液中添加CO2时,2,3-BDO的浓度从第28天时约0.6g/L的浓度增加到第31天时2.0g/L的浓度。乙醇浓度降低,并且乙醇与2,3-BDO的比率从第20天时的约20:1下降到第31天时的约5:1。
3B:在启动时高CO2入口浓度
这个实验被设计成证实在发酵开始时存在CO2时高CO2浓度对2,3-BDO产生的影响。如图7中所示,在达到稳定的操作条件后,存在显著的2,3-BDO产生,乙醇与2,3-BDO的比率是2:1。平均入口CO2浓度是42%并且平均出口CO2浓度是67.4%。在整个实验期间,使用50%的CO并且对气体流量和CO摄取量进行调节以使乙醇和2,3-BDO的产生达到最大。在数天内排出气流中CO、CO2以及H2的浓度示于图8中。
3C:CO2入口浓度逐渐增加
在这个实验的持续时间内,逐渐增加发酵液的入口气流中CO2的浓度以确定CO2对发酵的代谢物产生谱的影响。图10示出了入口流中CO2的增加对代谢物浓度的影响。使CO2浓度在第6天从0%增加到10%;在第9天从10%增加到15%;并且在第13天从15%增加到20%。在入口流中CO2的浓度每一次增加时,观测到2,3-BDO浓度出现相应增加。图9示出了在实验的持续时间内微生物培养物的CO、CO2以及H2的摄取量。
3D:CO2的循环
进行这个实验以确定使CO2入口浓度循环的影响。设置发酵以使入口流中CO2的量每小时在0%与20%之间循环。图11示出了在实验过程中代谢物的产生。使CO2入口浓度循环具有将2,3-BDO的产生维持在略微增加的浓度的作用。图12示出了在实验的持续时间内微生物培养物对入口气体的各种组分的摄取量。
3E:双反应器系统的第二反应器的CO2浓度增加
这个实验被设计成证实将来自第一生物反应器的排出气流通到第二生物反应器的入口流中,从而提高CO2浓度的作用。图13示出了在发酵过程的第14天与第20天之间双反应器系统的第二生物反应器中代谢物浓度的曲线图。在第14天时,从第一生物反应器向第二生物反应器提供的CO2的量增加,因此第二生物反应器中CO2的总量从17.8%达到43.8%。在第14天与第21天之间,反应器中2,3-BDO的浓度从约8g/L增加到约14g/L。乙醇与2,3-BDO的比率从第14天时的4:1降低到大约第20天时的2:1并且在实验的其余部分内保持相对恒定。图14示出了在发酵过程中微生物培养物的CO、CO2以及H2摄取量。
实施例4:通过控制CO利用率来提高2,3-BDO的产生。
证实气体流量和搅拌对代谢物产生的影响。
这个实验被设计成证实质量传递的变化对微生物培养物的代谢物产生的影响。在实验过程中,使搅拌速率和气体流量发生改变,从而引起离开反应器的气体以及发酵的代谢谱发生变化。
参考图15,可以看到从第6天到第8天,2,3-BDO浓度增加,对应于生物反应器内搅拌速率的增加以及流向反应器的气体流量的降低。如图18中所示,在第5.6天时,CO摄取量保持恒定,但是CO的利用率提高,因此出口气体中的CO2增加。这是通过提高搅拌速率(rpm)以及降低气体流量,以使得出口气体中的CO从26%减少到12.5%来进行的。在气体流量从240毫升/分钟/升降低到160毫升/分钟/升时,CO摄取量保持不变。出口流中的CO2从37%增加到48%。CO利用率从53%增加到79%。由于这种增加,溶解的CO2增加而CO的摄取量没有出现任何增加。CO利用率的增加与2,3-BDO产生的增加呈正相关关系,这是因为更高的CO利用率对应于更多的溶解CO2。
发酵液中溶解的CO2对2,3-丁二醇生产率的影响
来自在不同的顶空压力下使用不同的出口CO2浓度进行的多次运行的组合数据被绘制成图以显示发酵液中溶解的CO2与2,3-丁二醇的产生的关系。图16是溶解的CO2与2,3-BDO产生速率的关系图。该图示出了发酵液中溶解的CO2量的增加对应于2,3-丁二醇生产率的增加。
下表呈现了多次实验的结果,再次显示了溶解的CO2与2,3-BDO的浓度和生产率之间的相关性。
表
已经在本文中参考某些优选的实施方案对本发明进行描述以使得读者能够实施本发明而无需过多的实验。本领域技术人员将了解的是,本发明容许本发明包括所有这些变化和修改。此外,提供题目、标题等以促进读者对这份文件的理解,并且不应当被视作限制本发明的范围。
在上文和下文所引用的所有申请、专利以及出版物(如果有的话)的全部公开内容在此以引用方式并入本文。
在本说明书中对任何现有技术的提及不是并且不应当被视作承认或以任何形式表明该现有技术构成了美利坚合众国或世界上任何国家的公知常识的一部分。
在整个本说明书以及所附的任一项权利要求中,除非上下文另有要求,否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等将被解释成具有包括性的含义而不是排他性的含义,也就是说具有“包括但不限于”的含义。
Claims (22)
1.一种用于控制包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的发酵培养物的代谢谱的方法,所述方法包括:
a.使包含CO和CO2的气体基质流到包含所述微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中以产生至少一种衍生自乙酰辅酶A的产物和至少一种衍生自丙酮酸盐的产物;以及
b.调节溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量以使得所述至少一种衍生自丙酮酸盐的产物的产生得到控制。
2.如权利要求1所述的方法,其中增加溶解在所述培养基中的CO2的量以使所述至少一种衍生自丙酮酸盐的产物的产生增加。
3.如权利要求1所述的方法,其中减少溶解在所述培养基中的CO2的量以使所述至少一种衍生自丙酮酸盐的产物的产生减少。
4.如权利要求1所述的方法,其中通过控制CO2向所述生物反应器的流动来调节溶解在所述培养基中的CO2的量。
5.如权利要求1所述的方法,其中调节所述CO2的分压以调节溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量。
6.如权利要求1所述的方法,其中在大于250kPag的压力下进行所述发酵以使得溶解在所述液体营养培养基中的CO2的浓度增加。
7.如权利要求1所述的方法,其中在小于200kPag的压力下进行所述发酵以使得溶解在所述液体营养培养基中的CO2的浓度降低。
8.如权利要求1所述的方法,其中向所述生物反应器中提供的所述气体基质中所述CO2的浓度是约15%至约65%。
9.如权利要求1所述的方法,其中向所述生物反应器中提供的所述气体基质中所述CO2的浓度随时间推移逐渐增加。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述至少一种衍生自丙酮酸盐的产物选自由以下各项组成的组:2,3-丁二醇、乳酸盐、丁二酸盐、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠檬酸苹果酸盐、丁二烯以及聚乳酸(PLA)。
11.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括监测离开所述生物反应器的排出流中CO2的浓度以监测由所述生物反应器内的所述培养物所利用的CO2的量。
12.如权利要求1所述的方法,其中调节溶解在所述液体营养培养基中的CO2的量控制了丙酮酸盐衍生产物与乙酰辅酶A衍生产物的比率。
13.一种用于通过微生物对气体基质的发酵产生一种或多种产物的方法,所述方法包括:
a.在包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物在液体营养培养基中的培养物的第一生物反应器中接收包含CO的气体基质;
b.使所述包含CO的气体基质发酵以产生一种或多种液体产物和包含CO2的排出气体;
c.将所述包含CO2的排出气体通回到所述第一生物反应器中或通到第二生物反应器中,其中所述第二生物反应器包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物在液体营养培养基中的培养物;以及
d.使所述包含CO2的排出气体在所述第一生物反应器或所述第二生物反应器中发酵以产生至少一种产物。
14.如权利要求13所述的方法,其中将所述包含CO2的排出气体在供给到所述第二生物反应器中之前与至少一种气体基质共混。
15.如权利要求14所述的方法,其中将至少一种另外的气体基质供给到所述第二生物反应器中以用作所述发酵中的基质。
16.如权利要求13所述的方法,其中所述第一生物反应器产生乙酰辅酶A衍生产物和丙酮酸盐衍生产物并且所述乙酰辅酶A衍生产物与所述丙酮酸盐衍生产物的比率是约30:1至约20:1。
17.如权利要求13所述的方法,其中所述第二生物反应器比所述第一生物反应器产生更低的乙酰辅酶A衍生产物与丙酮酸盐衍生产物的比率。
18.如权利要求13所述的方法,其中所述至少一种衍生自丙酮酸盐的产物选自包括以下各项的组:2,3-丁二醇、乳酸盐、丁二酸盐、甲基乙基酮(MEK)、2-丁醇、丙二醇、2-丙醇、异丙醇、乙偶姻、异丁醇、柠檬酸苹果酸盐、丁二烯以及聚乳酸(PLA)。
19.如权利要求13所述的方法,所述方法还包括获得由所述第二生物反应器产生的排出气流以及将它通到所述第一生物反应器中以用作基质。
20.一种用于控制包含至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物的发酵培养物的代谢谱的方法,所述方法包括:
a.使包含CO的气体基质流到包含所述微生物在液体营养培养基中的培养物的生物反应器中以提供发酵液;以及
b.提高CO经由铁氧还蛋白依赖性一氧化碳脱氢酶氧化的速率以提高所述发酵液中还原型铁氧还蛋白的水平;
其中所述还原型铁氧还蛋白的水平提高使得来自乙酰辅酶A的丙酮酸盐发酵速率提高。
21.如权利要求1、13或20中任一项所述的方法,其中所述至少一种一氧化碳营养型产乙酸型微生物选自由以下各项组成的组:穆尔氏菌(Moorella)、梭菌(Clostridium)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、醋酸杆菌(Acetobacterium)、真杆菌(Eubacterium)、丁酸杆菌(Butyribacterium)、醋菌(Oxobacter)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、以及脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)。
22.如权利要求1、13或20中任一项所述的方法,其中所述至少一种微生物选自由以下各项组成的组:产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridiumljundgahlii)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxydivorans)以及科斯卡塔梭菌(Clostridiumcoskatii)。
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