JP7110283B2 - 微生物発酵における代謝産物生成を制御するためのシステム及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般的には、微生物発酵による１つ以上の生成物の生成を制御するための方
法に関する。特に、本発明は、微生物培養に提供される二酸化炭素の量を制御するための
方法に関する。特定の実施形態では、培養物に提供される溶解ＣＯ２の量を制御すること
によって、発酵工程の代謝プロファイルが制御される。

エタノールは、世界中で、主要な水素豊富液体交通燃料に急速になりつつある。２００
２年のエタノールの世界的規模での消費は、推定１０億８千万ガロンであった。欧州、日
本、米国及びいくつかの新興国において関心が高まっているために、燃料エタノール産業
の世界市場もまた、将来的に急激に成長することが予測されている。

例えば、米国では、エタノールは、Ｅ１０、すなわちガソリン中のエタノールの１０％
混合物を生成するために使用されている。Ｅ１０配合物中では、エタノール成分は、燃焼
の効率を改善しかつ大気汚染物質の生成を減少させる、酸素添加剤として作用する。ブラ
ジルでは、エタノールは、ガソリン中に配合される酸素添加剤として、またはそれ自体が
純粋な燃料としての両方で、交通燃料需要のおよそ３０％を満たしている。また欧州では
、温室効果ガス（ＧＨＧ）排出の結果を取り巻く環境上の懸念が、欧州連合（ＥＵ）を誘
起し、加盟国にバイオマス誘導エタノール等の持続性交通燃料の消費対する義務的な目標
値を設定させた。

大部分の燃料エタノールは、主要な炭素源として、サトウキビから抽出されたショ糖ま
たは穀粒作物から抽出されるデンプン等の穀物由来の炭水化物を使用する従来の酵母系発
酵工程を介して生成される。しかしながら、これらの炭水化物供給原料のコストは、ヒト
の食物または動物用飼料としてのこれらの価値によって影響を受け、一方でエタノール生
産のためのデンプンまたはショ糖生産穀物の収穫は、全ての地理的条件において経済的に
持続可能であるわけではない。したがって、より低コストの及び／またはより大量の炭素
資源を燃料エタノールに変換するための技術を開発することは興味深いことである。

ＣＯは、石炭または石油もしくは石油由来製品等の有機材料の不完全燃焼の主な自由エ
ネルギーに富む副生成物である。例えば、オーストラリアの鉄鋼業界は、年間５００，０
００トンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出することが報告されている。

触媒プロセスを使用して、主としてＣＯ及び／またはＣＯならびに水素（Ｈ_２）からな
るガスを種々の燃料及び化学物質に変換し得ることが長い間認識されてきた。しかしなが
ら、微生物を使用して、これらのガスを燃料及び化学物質に変換することもできる。これ
らの生物学的プロセスは、一般的に化学反応よりも遅いが、より高い特異性、より高い収
率、より低いエネルギーコスト、及び被毒に対するより大きな抵抗性を含む、触媒プロセ
スを超えるいくつかの利点を有する。

微生物が唯一の炭素源としてのＣＯ上で増殖する能力は、１９０３年に初めて発見され
た。これは、独立栄養増殖のアセチルコエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）生化学的経路（
Ｗｏｏｄｓ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡ
シンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても知られる）を使用する微生物の特性である
ことが後に決定された。カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）菌、
光合成菌、メタン生成菌及び酢酸産生菌を含む多数の嫌気性菌が、ＣＯを種々の最終産物
、すなわち、ＣＯ_２、Ｈ_２、メタン、ｎ－ブタノール、酢酸塩、及びエタノールに代謝す
ることが示されている。ＣＯを唯一の炭素源として使用しながら、全てのこうした微生物
は、これらの最終産物のうちの少なくとも２つを生成する。

クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属からのもの等の嫌気性細菌は、アセチ
ルＣｏＡ生化学的経路を介して、ＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２からエタノールを生成することが
立証されている。例えば、ガスからエタノールを生成するクロストリジウム・ルジュング
ダーリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）の様々な菌株が、ＷＯ
００／６８４０７号、ＥＰ １１７３０９号、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５
，５９３，８８６号、及び同第６，３６８，８１９号、ＷＯ ９８／００５５８号及びＷ
Ｏ ０２／０８４３８号に記載されている。細菌クロストリジウム・オートエタノゲナム
菌種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ｓｐ）もまたガスか
らエタノールを生成することが知られている（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ａｒｃｈｉｖ
ｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１，ｐｐ３４５－３５１（１９９４））。

しかしながら、ガスの発酵による微生物でのエタノール生成は、常に酢酸塩及び／また
は酢酸の同時生成を伴う。利用可能な炭素の一部が、エタノールよりはむしろ酢酸塩／酢
酸に変換されるために、こうした発酵工程を使用するエタノール生成の効率は、望ましい
ものよりも低い場合がある。さらに、酢酸塩／酢酸副生成物がいくつかの他の目的に使用
され得ない限り、これは廃棄物処理問題が生じる。酢酸塩／酢酸は、微生物によってメタ
ンに変換され、したがって、温室効果ガス排出に寄与する可能性を有する。

発酵用に使用されるバイオリアクター内で細菌または微生物を培養するために使用され
る液体栄養培地のパラメータを制御することの重要性は、当該技術分野において認識され
ている。２００７年７月１８日に出願され、参照により本明細書に組み込まれるＮＺ ５
５６６１５号は、特に、こうした液体栄養培地のｐＨ及び酸化還元電位の操作を記載して
いる。例えば、嫌気性酢酸産生細菌の培養において、培養物の酸化還元電位を低レベル（
－４００ｍＶ以下）にて維持しつつ、培養物のｐＨを約５．７より高く上昇させることに
よって、細菌は発酵の副生成物として生成された酢酸塩を、より低いｐＨ条件下での場合
よりもはるかに高い速度でエタノールに変換する。ＮＺ ５５６６１５号は、異なるｐＨ
レベル及び酸化還元電位が、細菌が実行する主要な役割（すなわち、増殖すること、酢酸
塩及びガス状ＣＯ含有基質からエタノールを生成すること、または基質を含有するガス体
からエタノールを生成すること）に応じて、条件を最適化するために使用され得ることを
さらに認識している。

ＵＳ ７，０７８，２０１号及びＷＯ ０２／０８４３８号はまた、発酵が行われてい
る液体栄養培地の条件（例えば、ｐＨ及び酸化還元電位）を変化させることによって、エ
タノールを生成するための発酵工程を改善することを記載している。

液体栄養培地のｐＨは、１つ以上のｐＨ調節剤または緩衝液を培地に添加することによ
って調整されてもよい。例えば、ＮａＯＨなどの塩基及び硫酸などの酸が、要求に応じて
ｐＨを増加または減少させるために使用されてもよい。酸化還元電位は、１つ以上の還元
剤（例えば、メチルビオロゲン）または酸化剤を添加することによって調整されてもよい
。あるいは、培地のｐＨは、微生物がガスによって「過剰供給される」ように、過剰量の
ガス状基質を発酵物に提供することによって調整されてもよい。

当業者には明白であるように、同様なプロセスがブタノールなどの他のアルコールを生
成するために使用されてもよい。

上記の不利点を克服する方向へと少なくともある程度向かうシステム及び／またはプロ
セスを提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することが、本発明の
目的である。

本発明の第１の態様において、少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物
を含む発酵培養物の代謝プロファイルを制御するための方法が提供され、本方法は、
ａ．ＣＯ及びＣＯ２を含むガス状基質を、液体栄養培地中の微生物の培養物を含むバ
イオリアクターに流し込むことと、
ｂ．培養物の代謝が変更されるように、培養物中に溶解するＣＯ２の量を調整するこ
とと、を含む。

一実施形態では、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量は、バイオリアクターへのＣＯ
２の流量を制御することによって調整される。一実施形態では、液体栄養培地中に溶解す
るＣＯ２の量を増加させることは、ピルビン酸塩に由来する１つ以上の生成物の生成が増
加するように微生物の代謝を変更させる。一実施形態では、液体栄養培地中に溶解するＣ
Ｏ２の量を減少させることは、ピルビン酸塩に由来する１つ以上の生成物の生成が減少す
るように微生物の代謝を変更させる。

一実施形態では、ピルビン酸塩に由来する１つ以上の生成物は、２，３－ブタンジオー
ル（２，３－ＢＤＯ）、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、２－ブタ
ノール、プロパンジオール、２－プロパノール、イソプロパノール、アセトイン、イソ－
ブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、及びポリ乳酸（ＰＬＡ）からなる群から選択
される。

一実施形態では、発酵は、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の濃度が増加するように、
約２５０～約４５０ｋＰａｇ（または５００ｋＰａｇ超）圧力で行われる。特定の実施形
態では、圧力は、２５０ｋＰａｇ超、または３００ｋＰａｇ超、または３５０ｋＰａｇ超
、または４００ｋＰａｇ超、または４５０ｋＰａｇ超、または５００ｋＰａｇ超である。

代替実施形態では、リアクター内の圧力は、ピルビン酸塩に由来する１つ以上の生成物
と比べて、アセチルｃｏＡに由来する１つ以上の生成物の生成を促進するために、減少さ
れまたは最小限に抑えられる。特定の実施形態では、バイオリアクター内の圧力は、およ
そ大気圧から約２００ｋＰａｇまでであるか、または２００ｋＰａｇ以下、もしくは１５
０ｋＰａｇ未満、もしくは１００ｋＰａｇ未満、もしくは５０ｋＰａｇ未満、もしくは大
気圧に維持される。

一実施形態では、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量を増加させるために、ＣＯ２分
圧を増加させる。

一実施形態では、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量は、発酵に提供されるガス状基
質中のＣＯ２の量を増加させることによって、増加される。一実施形態では、バイオリア
クターに提供される基質中のＣＯ２の濃度は、少なくとも１０％、または少なくとも１５
％、または少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、また
は少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なく
とも４５％である。特定の実施形態では、バイオリアクターに提供される基質中のＣＯ２
の濃度は、１５％～６５％、または約２０％～約５０％、または約２５％～約４５％であ
る。圧力が発酵物にかけられる実施形態においては、発酵物によって要求されるＣＯ２の
量を減少させる。約５０ｋＰａｇ超の圧力の存在下では、基質流中に提供されるＣＯ２の
量は、大気圧で提供される場合よりも実質的に少ない。特定の実施形態では、バイオリア
クターに提供される基質中のＣＯ２の濃度は、約５０ｋＰａｇ超の圧力で供給されるとき
、約１％～約５０％である。

本発明の第２の態様では、ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物の生成を増
加させるための方法が提供され、本方法は、
ａ．液体栄養培地中に少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養
物を含むバイオリアクターに、ＣＯ及びＣＯ２を含む基質を流し込むことと、
ｂ．液体栄養培地中に提供される溶解ＣＯ２の量を増加させるように、バイオリアク
ターに流されるＣＯ２の量を調整することと、を含む。

本発明の第３の態様では、ピルビン酸塩由来生成物とアセチルｃｏ－Ａ由来生成物との
比を制御するための方法が提供され、本方法は、
ａ．液体栄養培地中に少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養
物を含むバイオリアクターに、ＣＯ及びＣＯ２を含む基質を流し込むことと、
ｂ．バイオリアクターへの二酸化炭素の流量を調整し、その結果、液体栄養培地中に
溶解するＣＯ２の量が、それによって、ピルビン酸塩由来生成物とアセチルＣｏＡ由来生
成物との比を制御するようにすることと、を含む。

本発明の一実施形態では、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量を増加させることは、
ピルビン酸塩由来生成物の生成を増加させることによって、ピルビン酸塩由来生成物とア
セチルＣｏＡ由来生成物との比を増加させる。一実施形態では、液体栄養培地中に溶解す
るＣＯ２の量を減少させることは、ピルビン酸塩由来生成物の生成を減少させることによ
って、ピルビン酸塩由来生成物とアセチルＣｏＡ由来生成物との比を減少させる。

第４の態様では、少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物を含む発酵培
養物の代謝プロファイルを制御するための方法が提供され、本方法は、
ａ．液体栄養培地中に微生物の培養物を含むバイオリアクターに、ＣＯ及びＣＯ２を
含むガス状基質を流し込むことと、
ｂ．バイオリアクターを出る流出流中のＣＯ２濃度を監視することと、
ｃ．培養物の代謝が制御されるように、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量を調整
することと、を含む。

第５の態様では、１つ以上の生成物の生成を増加させるための方法が提供され、本方法
は、
ａ．ＣＯを含む基質を、液体栄養培地中に１つ以上の微生物の培養物を収容するバイ
オリアクターに提供することと、
ｂ．基質を発酵させ、１つ以上の液体生成物とＣＯ２とを生成することと、を含む。

一実施形態では、培養物によって消費されるＣＯの量及び培養物によって生成されるＣ
Ｏ２の量を増加させるために、１つ以上の発酵条件が調整される。一実施形態では、培養
物によって消費されるＣＯの量は、発酵における質量移動を変更することによって、増加
される。一実施形態では、培養物によって消費されるＣＯの量は、バイオリアクターへの
ガス状基質の流速を増加させることによって、増加される。一実施形態では、培養物によ
って消費されるＣＯの量は、バイオリアクター内の液体栄養培地の撹拌の速度を増加させ
ることによって、増加される。一実施形態では、培養物によって消費されるＣＯの量は、
気泡表面積を増加させることによって、増加される。

一実施形態では、微生物培養によって消費されるＣＯの量を増加させることは、バイオ
リアクターを出る出口流中のＣＯ２の量を増加させる。一実施形態では、出口流中のＣＯ
２の量は、少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、また
は少なくとも４５％、または少なくとも５０％である。

第６の態様では、少なくとも１つの微生物の培養物を含む液体栄養培地中の溶解ＣＯ２
の量を増加させるための方法が提供され、本方法は、
ａ．ＣＯを含む供給ガス流及び液体栄養培地を少なくとも１つのバイオリアクターに
導入し、発酵ブロスを形成すること（このバイオリアクターは、バイオリアクターの頂部
近くのポイントからバイオリアクターの底部近くのポイントまで発酵ブロスの一部を循環
させるための下降管をさらに備える）と、
ｂ．バイオリアクター内でＣＯを液体生成物とＣＯ２を含むガス流出流とに発酵させ
ることと、
ｃ．ガス流出流の少なくとも一部に、バイオリアクターの頂部近くに位置するガス流
出流のソースであるバイオリアクターの下降管をまたは第２のバイオリアクターのいずれ
かを通過させることと、
ｄ．ガス流出流と液体栄養培地を下降管に沿って混合し、ガス－液体混合物を形成し
、それによって、ガス－液体混合物の上の静圧を増加させることで、流出ガス流からのＣ
Ｏ２を下降管の底部において液体栄養培地に溶解させることと、を含む。

特別な実施形態において、バイオリアクターからの流出ガス流は、第２のバイオリアク
ターの下降管まで渡される。別の実施形態では、第１のバイオリアクターからの流出ガス
流は、第１のバイオリアクターの下降管に再循環される。あるいは、第１のバイオリアク
ターからの流出ガス流は、第１または第２のバイオリアクターのいずれかのガス流入口に
渡される。さらに、第２のリアクターへの供給流は、任意選択的に新鮮な供給ガス流と混
合された、第１のリアクターからの流出ガス流または排ガス流の一部であり得る。追加の
バイオリアクターは、直列に追加することができ、流出ガス流は、上述のように同一また
は異なるバイオリアクターを通過させることができる。

さらなる態様では、ガス状基質の微生物発酵によって１つ以上の生成物を生成するため
の方法が提供され、本方法は、
ａ．液体栄養培地中の１つ以上のカルボキシド栄養性微生物の培養物を含む第１のリ
アクターにおいて、ＣＯを含むガス状基質を受け取ることと、
ｂ．ＣＯを含むガス状基質を発酵させて、１つ以上の液体生成物とＣＯ２を含む流出
ガスとを生成することと、
ｃ．ＣＯ２を含む流出ガスを第２のバイオリアクターに供給すること（該第２のバイ
オリアクターは、液体栄養培地中の１つ以上のカルボキシド栄養性微生物の培養物を含む
）と、
ｄ．ＣＯ２を含む流出ガスを発酵させて、１つ以上の生成物を生成することと、を含
む。

一実施形態では、ＣＯ２を含む流出ガスは、第２のバイオリアクターに供給される前に
、１つ以上のガス状基質とブレンドされる。一実施形態では、追加のガス状基質は、微生
物発酵における基質として使用するために第２のバイオリアクターに添加される。

一実施形態では、第１のバイオリアクター及び第２のバイオリアクター内で提供される
１つ以上の微生物は同一である。一実施形態では、微生物発酵は、少なくとも２つの生成
物を生成する。一実施形態では、２つの生成物の生成比は、第１のバイオリアクターと第
２のバイオリアクター間で異なる。一実施形態では、発酵は少なくとも１つのアルコール
と少なくとも１つの副生成物とを生成する。一実施形態では、少なくとも１つの生成物と
少なくとも１つの副生成物との比は、第１及び第２のバイオリアクターで異なる。一実施
形態では、生成物はエタノールであり、副生成物は２，３－ブタンジオール（２，３－Ｂ
ＤＯ）である。一実施形態では、エタノール（ＥｔＯＨ）と２，３－ＢＤＯとの比は、第
２のバイオリアクターにおいてより低い。

一実施形態では、１つ以上の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ルジュン
グダーリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・
ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・カ
ルボキシディボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ）、
及びクロストリジウム・コスカチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ）から
なる群から選択される。

一実施形態では、第２のバイオリアクターから流出する排ガスは、基質として使用する
ために第１のバイオリアクターに再循環され得る。

本発明のさらなる態様では、少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物を
含む発酵培養物の代謝プロファイルを制御するための方法が提供され、本方法は、
ａ．ＣＯを含むガス状基質を、液体栄養培地中に微生物の培養物を含むバイオリアク
ターに流し込み、発酵ブロスを提供することと、
ｂ．フェレドキシン依存性一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介してＣＯ酸化の速度を増
加させて、発酵ブロス中の還元フェレドキシンのレベルを増加させることと、を含み、
還元フェレドキシンのレベルの増加は、アセチルｃｏＡからのピルビン酸塩発酵の速度
を増加させる。

本発明の微生物の代謝経路を示す。 圧力の発酵中の代謝産物濃度に及ぼす効果を示すグラフである。 液体栄養培地中の溶解ＣＯ２の２，３－ブタンジオール生成に及ぼす効果を示すグラフである。 実施例２の微生物培養物中のＣＯの利用率を示すグラフである。 実施例３Ａについての入口流中のＣＯ２濃度の代謝産物濃度に及ぼす効果を示す図である。 実施例３Ａについての微生物培養物によるＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２の取り込みを示すグラフである。 実施例３Ｂについての経時的な代謝産物の濃度を示すグラフである。 実施例３Ｂについてのガス組成を示すグラフである。 微生物培養物による実施例３Ｃの入口ガス流の種々の成分の取り込みを示すグラフである。 実施例３Ｃについての入口ガス流中のＣＯ_２を段階的に増加させることの代謝産物濃度に及ぼす効果を示すグラフである。 実施例３Ｄに従って、入口流中のＣＯ２の濃度が循環される場合の代謝産物濃度を示すグラフである。 微生物培養物による入口流中の種々の成分の取り込みを示すグラフである。 実施例３Ｅについての代謝産物濃度を示すグラフである。 微生物培養物による実施例３Ｅの入口流中の種々の成分の取り込みを示すグラフである。 実施例４についての代謝産物濃度を示すグラフである。 計算された溶解ＣＯ_２対２，３－ブタンジオール生成速度のプロットである。 本発明の一実施形態によるシステムの表現である。 微生物培養物による実施例４の入口流中の種々の成分の取り込みを示すグラフである。

本発明者は、１つ以上のカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養物によって生成さ
れる代謝生成物を制御するための方法及びシステムを発見した。特に、本発明者は、発酵
工程においてピルビン酸塩に由来する１つ以上の生成物の生成を増加させるための方法を
見出した。

以下は、一般的な用語で示す、本発明の好ましい実施形態を含む、本発明の説明である
。本発明は、以下の本発明の見出し「実施例」のもとに示す開示においてさらに例示され
、実施例は、本発明を支援する実験データ、本発明の態様の具体例、及び本発明を実行す
る手段を提供する。
用語の定義

本明細書で使用される「ブタンジオール」は、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタ
ンジオール、１，４－ブタンジオールならびに２，３－ブタンジオール及びその立体異性
体を含む、全てのジオールの構造異性体を指す。用語「２，３－ブタンジオール」は、（
Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）ならびにメソ型、ラセミ体のもの、部分的に立体異性体的に純粋な
形態及び／または実質的に立体異性体的に純粋な形態を含む、全てのエナンチオマー及び
ジアステレオマー形態を含むと解釈されるべきである。

用語「バイオリアクター」は、１つ以上の容器及び／またはタワーもしくは配管配置か
らなる発酵装置を含み、連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化菌体リアクター（Ｉ
ＣＲ）、細流床リアクター（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト型発酵槽、静的ミキサー、ま
たはガス－液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置を含む。本明細書で以降記載され
るように、いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の増殖リアクター及び第
２の発酵リアクターを備えてもよい。然る故に、基質、例えば一酸化炭素を含む基質のバ
イオリアクターまたは発酵反応への添加を言及するとき、必要に応じて、これらのリアク
ターのいずれかまたは両方への添加を含むと理解されるべきである。

用語「一酸化炭素を含む基質」及び同様な用語は、その中の一酸化炭素が、細菌の１つ
以上の菌株にとって、例えば増殖及び／または発酵のために利用可能である任意の基質を
含むと理解されるべきである。

「一酸化炭素を含むガス状基質」は、あるレベルの一酸化炭素を含有する任意のガスを
含む。ガス状基質は、典型的には、大部分を占めるＣＯ、好ましくは、少なくとも約１５
％～約９５体積％のＣＯを含有するであろう。

「ＣＯ２を含む基質」は、あるレベルの二酸化炭素を含有する任意の基質流を含む。し
かしながら、ガス状基質は代替形態で提供されてもよいことを理解するべきである。例え
ば、ＣＯ２を含むガス状基質は、液体中に溶解されて提供されてもよい。要するに、液体
は二酸化炭素含有ガスで飽和され、その後この液体がバイオリアクターに添加される。こ
れは、標準的な手法を使用して達成することができる。例として、マイクロバブル懸濁液
発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ．ａｌ．Ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂ
ｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１，Ｎｕｍｂｅｒ ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２
００２）を使用することができる。さらなる例として、ＣＯ２及びＨ２を含有するガス状
基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。

用語「効率を増加させる」、「効率の増加」等は、発酵工程に関して使用されるとき、
限定されるものではないが、発酵を触媒する微生物の増殖の速度、高濃度のブタンジオー
ルにおける増殖速度及び／または生成物生成速度、消費される基質１体積当たりで生成さ
れる所望の生成物の体積、所望の生成物の生成の速度または生成のレベル、及び発酵の他
の副生成物と比べての生成された所望の生成物の相対的比率のうちの１つ以上を増加させ
ることを含む。

用語「生産性」または「生産速度」は、生成物の体積測定生産性である。連続システム
においては、体積測定生産性は、生成物の定常状態濃度と液体保持時間との比として計算
される。バッチシステムにおいては、体積測定生産性は、濃度とバッチシステムにおいて
該濃度を生成するために必要とされる時間として計算される。体積測定生産性は、ｇ／Ｌ
／日として報告される。

文脈が他のことを要求する場合を除いて、言い回し「発酵すること」、「発酵工程」ま
たは「発酵反応」及び同様のものは、本明細書において使用される際、プロセスの成長段
階と生成物生合成段階の両方を包含することが意図される。

本明細書で使用される用語「ピルビン酸塩由来の生成物」または同様な用語は、ピルビ
ン酸塩前駆体を有する発酵生成物を包含することが意図される。これらの生成物は、限定
されるものではないが、２，３－ブタンジオール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケ
トン（ＭＥＫ）、２－ブタノール、プロパンジオール、２－プロパノール、イソプロパノ
ール、アセトイン、イソ－ブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、及びポリ乳酸（Ｐ
ＬＡ）を含む。

本明細書で使用される用語「アセチルＣｏＡ由来生成物」、「アセチルＣｏＡに由来す
る生成物」または同様な用語は、アセチルＣｏＡ前駆体を有する発酵生成物を包含するこ
とが意図される。これらの生成物は、限定されるものではないが、エタノール、酢酸、ア
セトン、ブタノール、３－ヒドロキシブチレートならびにイソブチレン、３－ヒドロキシ
プロピオネート（３ＨＰ）、及び脂肪酸を含む。

発酵工程における２，３－ブタンジオールの生成は、微生物培養物が、ストレスの徴候
を呈する時間中に増加することが発見されている。本発明者は、２，３－ブタンジオール
の量における増加と一致するストレスのいくつかの指標を特定し、これらは、微生物培養
物による乳酸塩の生成、微生物培養物のｐＨの増加、及び微生物培養物のバイオマス濃度
の減少を含む。興味深いことに、本発明者は、微生物培養物による２，３－ブタンジオー
ルの生成がストレスの指標ではないこと、及び２，３－ブタンジオールの生産性の増加を
有する、健常かつ安定した微生物培養物を提供することが可能であることを立証した。

２，３－ブタンジオール生産性の増加は、微生物培養物による水素消費の速度によって
影響されることが以前に示されている（ＷＯ ２０１２１３１６２７号）。
Ｃｏ２の発酵に及ぼす効果

本発明者は、微生物培養物に提供されるＣＯ２の量を変更することによって、微生物の
代謝経路が影響を受けることを見出した。微生物培養物に提供されるＣＯ２の量を変更す
ることによって、培養物の代謝は操作され得る。

本発明者は、驚くべきことに、ピルビン酸塩由来生成物の生成が、増加した量の二酸化
炭素が微生物培養物に提供されるときに増加することを示した。同様に、微生物培養物中
に溶解するＣＯ２の量が減少するとき、アセチルＣｏＡに由来する生成物の生成が増加し
、ピルビン酸由来生成物の生成が減少することを見出した。

発酵条件下で、カルボキシド栄養性菌培養物にＣＯ及び任意選択的に水素を含む基材を
提供することが、アルコール及び酸の生成をもたらすことが以前に示されている。エタノ
ールの生成が、２，３－ブタンジオール及び酢酸を含む追加の副生成物を伴うことも以前
に立証されている。

本発明者は、ここで、微生物培養物に二酸化炭素を追加的に供給することによって、代
謝経路のピルビン酸塩アームの代謝が制御され得ることを発見した。上述の代謝経路を図
１及び以下に詳細に示す。

カルボキシド栄養性アセトゲンは、炭素を、酢酸ならびにエタノールなどの生成物のた
めの及び脂肪酸生合成のための前駆体としての役目を果たすアセチル－ＣｏＡに固定する
ために、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する（Ｄｒａｋｅ，Ｋuｓｅｌ，Ｍａ
ｔｔｈｉｅｓ，Ｗｏｏｄ，＆ Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ，２００６；Ｗｏｏｄ，１９９１）。
アセチル－ＣｏＡ以外の、細胞中の他の重要な中間体は、２，３－ブタンジオール、乳酸
、もしくはコハク酸、ならびに増殖及びバイオマス形成に必要とされるアミノ酸、ビタミ
ン、または核酸のような生成物に対して前駆体として働くピルビン酸塩（ピルビン酸）で
ある。アセチル－ＣｏＡは、ピルビン酸塩：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦ
ＯＲ）（時として、ピルビン酸塩シンターゼ（ＥＣ １．２．７．１）とも呼ばれる）に
よって触媒される単一の可逆的酵素ステップにおいて、ピルビン酸塩に直接変換され得る
（逆もまた同様）。ＰＦＯＲ反応は、以下の反応１の通りである。
（１）アセチル－ＣｏＡ＋ＣＯ_２＋還元フェレドキシン＋２Ｈ＋⇔ピルビン酸塩＋酸化フェロドキシン
ΔＧ^Ｏ’＝－４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ（１９．２ｋＪ／ｍｏｌ）（Ｔｈａｕｅｒ
，Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｄｅｃｋｅｒ，＆ Ｐｉ，１９７７）。

独立栄養的に増殖するカルボキシド栄養性アセトゲンでは、全ての生成されたピルビン
酸塩は、まず初めにアセチル－ＣｏＡを経験せねばならない。アセチル－ＣｏＡはＣ２化
合物であり、ピルビン酸塩はＣ３化合物であるので、ＣＯ_２の分子は組み込まれる必要が
ある（反応１）。この反応のエネルギーは、還元フェレドキシンによりもたらされる（Ｅ
_０’＝－３９８ｍＶ）。

ピルビン酸塩形成の速度を増加させるための戦略は、この反応における遊離体または反
応体のレベルを増加させることである（動的平衡）。例えば、供給ガス中のＣＯ２のレベ
ルを増加させることは、アセチル－ＣｏＡからのピルビン酸塩形成速度を増加させること
になり、一方逆の反応は、反応がピルビン酸塩形成の方向において実質的に不可逆的であ
るポイントまで減少する。同様に、還元フェレドキシンのレベルは、例えば、フェレドキ
シン依存性一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介してＣＯの酸化を増加させることによって、
増加させることができる。

ピルビン酸塩（ピルビン酸）は、２．５の非常に低いｐＫａを有する酸であり、したが
って、より高い濃度においては、ＡＴＰ形成に必要とされ膜を横切る重要なプロトン濃度
勾配を破壊することで、細菌には脅威である（Ｋoｐｋｅ ＆ Ｄuｒｒｅ，２０１１）。
細菌についてのシンクは、ピルビン酸を中和させ細胞を守ることになる２，３－ブタンジ
オールを生成することである。供給ガス中のＣＯ２のレベルを増加させることは、したが
って、ピルビン酸塩形成の速度の増加を介して間接的に２，３－ブタンジオール形成を増
加させることになる。ピルビン酸塩からの２，３－ブタンジオールの生成についての反応
は、反応２の通りである。
（２）２ピルビン酸塩⇔アセトイン＋２ＣＯ_２
アセトイン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋⇔２，３－ブタンジオール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋

乳酸及びコハク酸は、別のシンクを表すピルビン酸塩由来生成物であり、これらは非常
に弱い酸（それぞれ、ｐＫａ４．２及び５．６）ではあるが、これらはまた、より高いレ
ベルで細菌への脅威を引き起こす。一方、これらの生成を制限することは、ピルビン酸塩
の貯留を増加させ、２，３－ブタンジオール生成の増加をもたらす。

本発明者は、リアクター内のＣＯ２の濃度を増加させることによって及び／またはリア
クター内のＣＯの濃度もしくは還元フェレドキシンのレベルの増加につながるＣＯＤＨに
よるＣＯ酸化の速度を増加させることによって、ピルビン酸塩のアセチル－ＣｏＡに対す
る生成を増加させることができることを示した。

特に、本発明者は、アセチル－ＣｏＡ由来生成物、例えばエタノールと、ピルビン酸塩
由来生成物、例えば２，３－ブタンジオールとの比は、リアクターの液体培地中に溶解す
るＣＯ２の濃度を増加させることによって、増加させることができることを立証した。液
体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量は、発酵に提供されるガス状基質中のＣＯ２の量を増
加させることによって、増加させることができる。一実施形態では、バイオリアクターに
提供される基質中のＣＯ２の濃度は、少なくとも１０％、または少なくとも１５％、また
は少なくとも１８％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なく
とも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５
％である。特定の実施形態では、バイオリアクターに提供される基質中のＣＯ２の濃度は
、１５％～６５％、または約２０％～約５０％、または約２５％～約４５％である。

培養物に提供される、低い溶解ＣＯ２濃度（例えば、入口ガス流中の０～１０％のＣＯ
２）は、エタノールを２，３－ブタンジオールに対して、約３０：１～約２０：１の比で
生成することになるが、本発明者は、培養物に提供されるＣＯ２濃度の増加（例えば、入
口ガス流中の１０～６５％のＣＯ２）は、エタノールを２，３－ブタンジオールに対して
、約２０：１～約１：１、好ましくは１０：１～１：１の比で生成することになることを
示した。

ピルビン酸塩由来生成物の低い生成が望ましい例では、低い溶解ＣＯ２濃度が標的とさ
れてもよい。この方法は、アセチル－ＣｏＡ由来生成物の生成を増加させるためにも用い
られ得る。例えば、入口ガス流中０～１０％のＣＯ２を伴うガス入口流は、エタノールの
２，３－ブタンジオールに対する高い比をもたらすことになる。

さらに、培養物によって消費されるＣＯの量を増加させることが、生成されるＣＯ２の
量を増加させ、これが転じてピルビン酸由来生成物の生成を増加させることを見出した。
培養物によって消費されるＣＯの量は、発酵における質量移動を変更し、バイオリアクタ
ーへのガス状基質の流速を増加させることによって及び／またはバイオリアクター内の液
体栄養培地の撹拌の速度を増加させることによって、増加させることができる。培養物に
よって消費されるＣＯの量はまた、気泡表面積を増加させることによっても増加させるこ
とができる。典型的には、高質量移動は、ガス状基質を細かい気泡として導入することに
よって達成され得る。当業者であれば、スパージャなどのガス状基質を導入するための手
段を理解するであろう。
溶解ＣＯ２及び圧力

本発明者は、発酵の代謝プロファイルを制御するために、微生物培養物に提供される溶
解ＣＯ２の量を制御かつ調整するための多くの方法を特定した。液体栄養培地中に溶解す
るＣＯ２の量を調整するための１つのこうした方法は、システムに対する圧力を調整する
ことを含む。

本発明者は、バイオリアクター内の圧力を増加させることが、発酵培地中の溶解ＣＯ２
の量の増加をもたらすことになることを立証した。ピルビン酸塩由来生成物の生成を増加
させるために、発酵は約２５０～約４５０ｋＰａｇ（または５００ｋＰａｇ超）の圧力で
行われるべきであり、それによって、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の濃度が増加され
る。特定の実施形態では、圧力は２５０ｋＰａｇ超、または３００ｋＰａｇ超、または３
５０ｋＰａｇ超、または４００ｋＰａｇ超、または４５０ｋＰａｇ超、または５００ｋＰ
ａｇ超である。

ＣＯ２が、５０ｋＰａｇ以上の圧力でリアクターに提供される例では、より高いレベル
のピルビン酸塩由来生成物を生成するために、基質中においてより低い濃度のＣＯ２が必
要とされる。培養物はＣＯの利用率を通してＣＯ２を生成するので、圧力が実質的に高い
場合には、最小のＣＯ２濃度を伴う入口ガス流がリアクターに供給され得る。特定の実施
形態では、５０ｋＰａｇ以上の圧力でリアクターに提供されるＣＯ２の量は、１０％未満
、または５％未満、または１％未満である。特定の実施形態では、５０ｋＰａｇ以上の圧
力においては、ＣＯ２はリアクターに実質的に提供されない。好ましくは、５０ｋＰａｇ
以上の圧力で供給される入口ガス流のＣＯ２濃度は、約０％～５０％である。

本発明者は、２，３－ブタンジオールの生成が、発酵槽中のＣＯ２の分圧の量によって
影響を受け、これが転じて液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量を変更することを示した
。ガス流のより高いＣＯ２分圧が、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２の量を増加させるこ
とになる。好ましい実施形態では、ＣＯ２は、約５０ｋＰａｇ～約５００ｋＰａｇの分圧
でリアクターに供給されることになる。

さらに、本発明者は、リアクターに供給されるＣＯ２の量を徐々に増加させることによ
って、溶解ＣＯ２の量を徐々に増加させることも可能であることを立証した。

一部のガス状流中のＣＯ２の量は、液体栄養培地中の溶解ＣＯ２の十分な量を可能にす
るのに十分でない場合がある。この問題を克服するために、本発明者は、バイオリアクタ
ーの出口からバイオリアクターの入口まで排ガスまたは流出ガスを再循環させることによ
って、ＣＯ２の量を増加させるための方法及びシステムを提供した。ＣＯ２分圧の量、し
たがって溶解ＣＯ２の量を変更するために、ＣＯ分圧及び全圧力から独立して、流出ガス
／排ガスは同じリアクターに再循環され得る。リアクター内部の発酵工程は、ＣＯ及びＨ
２の高変換をもたらすことになり、したがって、排ガスは、主としてＣＯ２及び任意の不
活性ガス種から構成されることになる。このようなことから、排ガスを再循環させること
は、ＣＯ２分圧がＣＯ分圧及び全圧力から独立して制御されることを可能にする。

二リアクターシステムは、第１のバイオリアクターから流出するＣＯ２を含む流出ガス
が、第２のバイオリアクターまで渡されることを可能にする。ＣＯ２を含む流出ガスを、
リアクター容器よりはむしろ第２のバイオリアクターの下降管に送り込むことによって、
リアクター内のＣＯ２の分圧が増加される。ＣＯ２－液体混合物が下降管を下に移動する
と、静水頭が増加し、それによって溶液中に溶解するＣＯ２の量が増加される。

排ガスを第１のリアクターから第２のリアクターまでもしくは受取リアクターまで再循
環させるためには、第１のリアクターのヘッドスペースの圧力は、ライン損失及びスパー
ジャ圧下降を克服するように、受取リアクターの下降管における圧力よりもわずかに高い
必要がある。「排ガス」をそれ自体のヘッドスペースから再循環させるためには、排ガス
はガス入口または下降管のいずれかに再循環されることが可能であり、この下降管は排ガ
スを捕捉する（排ガスを搬入するために下降管内の液体流を使用して）ためにエダクタを
必要とする。下降管に再循環されるＣＯ２の量は、液体栄養培地中に溶解するＣＯ２がラ
ンピング時に最適化されるように、制御されることになる。図１７は、下降管に提供され
るＣＯ２富化基質で循環されるループリアクターの表現を提供し、ここでは（１）は上昇
管であり、（２）は下降管であり、（３）は供給ガスであり、（４）は排ガス／流出ガス
であり、（５）は別個のリアクターまたは同一のリアクターのいずれかからの排ガスから
のＣＯ２富化ガスが下降管に入るポイントであり、及び（６）は、ガス／液体混合物を、
上昇管及び下降管を経て循環させるループポンプである。
バイオリアクター

発酵は、連続撹拌槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化菌体リアクター、ガスリフト型リ
アクター、気泡塔リアクター（ＢＣＲ）、中空繊維膜バイオリアクター（ＨＦＭ）などの
膜反応器または細流床リアクター（ＴＢＲ）などの任意の好適なバイオリアクター内で行
われてもよい。また、本発明のいくつかの実施形態では、バイオリアクターは、その中で
微生物が培養される第１の増殖リアクターと、増殖リアクターからの発酵ブロスが送り込
まれることができ、その中で発酵生成物（例えば、エタノール及び酢酸塩）の大部分が産
生され得る第２の発酵リアクターとを備えてもよい。本発明のバイオリアクターは、ＣＯ
及び／またはＨ_２含有基質を受け取るよう適合されている。
発酵基質

一酸化炭素と、水素または二酸化炭素のうちの少なくとも１つとを含む基質が、本発明
の方法において１つ以上の生成物を生成するために、発酵反応において使用される。好ま
しくは、この基質はガス状基質である。ガス状基質は、工業プロセスの副生成物として得
られた廃棄ガス、または内燃機関（例えば、自動車）の排気ガスからなどのいくつかの他
の供給源によるものであってもよい。特定の実施形態では、工業プロセスは、製鋼工業な
どの鉄金属製品製造過程、非鉄金属製品製造過程、石油精製処理、石炭ガス化、電力生産
、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、コークス製造及び天然ガス
改質からなる群から選択される。これらの実施形態では、ガス状基質は、これが大気中に
放出される前に、任意の通常的な方法を使用して、工業プロセスから捕捉され得る。ガス
状基質の組成に応じて、それを発酵に導入する前に、塵埃粒子などのいかなる望ましくな
い不純物も除去するために、ガス状基質を処理することが望ましい場合もある。例えば、
ガス状基質は、既知の方法を用いて濾過されるかまたは洗浄されてもよい。

本発明の他の実施形態では、ガス状基質は、バイオマスのガス化を発生源としてもよい
。ガス化のプロセスは、空気または酸素の制限された供給におけるバイオマスの部分的燃
焼を伴う。得られたガスは、典型的には、最小体積のＣＯ_２、メタン、エチレン及びエタ
ンと共に、主としてＣＯ及びＨ_２を含む。例えば、サトウキビからの糖、またはトウモロ
コシもしくは穀類からのデンプンなどの食料の抽出及び処理中に得られるバイオマス副生
成物、あるいは山林業によって発生した非食物バイオマス廃棄物がガス化され、本発明に
おける使用に好適なＣＯ含有ガスを生成してもよい。

ＣＯ含有基質は、典型的には、少なくとも約１５％～約１００体積％のＣＯ、４０％～
９５体積％のＣＯ、４０％～６０体積％のＣＯ、及び４５％～５５体積％のＣＯなどの、
主比率のＣＯを含有する。特定の実施形態では、基質は約２５％、または約３０％、また
は約３５％、または約４０％、または約４５％、または約５０％のＣＯ、または約５５％
のＣＯ、または約６０体積％のＣＯを含む。Ｈ_２もＣＯ_２も存在するとき、６％などのＣ
Ｏのより低い濃度を有する基質が適切な場合もある。

典型的には、一酸化炭素は、ガス状態で発酵反応に添加されることになる。しかしなが
ら、本発明は、この状態における基質の添加に限定されるものとみなされるべきではない
。例えば、一酸化炭素は、液体で提供されることが可能である。例えば、液体は、一酸化
炭素含有ガスで飽和され、その後この液体がバイオリアクターに添加されてもよい。これ
は、標準的手法を使用して達成することができる。例として、上述のマイクロバブル懸濁
液発生装置が使用され得る。

一実施形態では、二酸化炭素は、ガス状態で発酵に添加される。代替実施形態では、二
酸化炭素は、炭酸塩または重炭酸塩として提供される。

本発明の一実施形態では、２つまたはそれ以上の異なる基質の組み合わせが、発酵反応
において使用されてもよい。

さらに、基質流のＣＯ濃度（またはガス状基質中のＣＯ分圧）を増加させること、した
がって、ＣＯが基質である発酵反応の効率を増加させることが望ましい場合が多い。ガス
状基質中のＣＯ分圧を増加させることは、発酵培地へのＣＯ質量移動を増加させる。発酵
反応を供給するために使用されるガス流の組成は、この反応の効率及び／またはコストに
対してかなりの影響を有する。例えば、Ｏ２は、嫌気性発酵工程の効率を低下させ得る。
発酵の前後の発酵工程の段階における望ましくないまたは不必要なガスの処理は、こうし
た段階に対する負担を増加させ得る（例えば、ガス流がバイオリアクターに流入する前に
圧縮される場合、不必要なエネルギーが、発酵においては必要とされないガスを圧縮する
ために使用され得る）。したがって、望ましくない成分を除去しかつ望ましい成分の濃度
を増加させるように、基質流、特に工業発生源に由来する基質流を処理することが望まし
い場合がある。

特定の実施形態では、水素がＣＯ含有基材に提供されることはほとんどない。
流れのブレンド化

発酵反応の効率、アルコール産生及び／または全体の炭素捕捉を改善するために、ＣＯ
及びＨ２を含む改質された基質流を、１つ以上のさらなる流れとブレンドすることが望ま
しい場合がある。理論に縛られるわけではないが、本発明のいくつかの実施形態において
は、カルボキシド栄養性細菌は、以下に従ってＣＯをエタノールに変換する。
６ＣＯ＋３Ｈ_２Ｏ→Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋４ＣＯ_２
しかしながら、Ｈ２の存在下では、全体の変換は以下の通りであり得る。
６ＣＯ＋１２Ｈ_２→３Ｃ_２Ｈ_５ＯＨ＋３Ｈ_２Ｏ

この結果、発酵効率を最適化するために、高ＣＯ含有量を有する流れは、ＣＯ及びＨ２
を含む改質された基質とブレンドされ、ＣＯ：Ｈ２比を増加させることができる。例とし
て、製鋼工場からの排ガスなどの工業的廃棄流は、高ＣＯ含有量を有するが、最小のＨ２
を含むかまたはＨ２を含まない。このように、ブレンドされた基質流を発酵槽に提供する
前に、ＣＯ及びＨ２を含む１つ以上の流れを、ＣＯを含む廃棄流とブレンドすることは望
ましい可能性がある。発酵の全体的効率、アルコール生産性及び／または全体的炭素捕捉
は、ブレンドされた流れ内のＣＯ及びＨ２の化学量論組成に依存することになる。しかし
ながら、特別な実施形態では、ブレンドされた流れは、以下のモル比：２０：１、１０：
１、５：１、３：１、２：１、１：１、または１：２で、ＣＯ及びＨ２を実質的に含んで
もよい。

さらに、発酵の異なる段階において、ＣＯ及びＨ２を特定比で提供することが望ましい
場合もある。例えば、比較的高いＨ２含有量（１：２のＣＯ：Ｈ２など）を有する基質流
が、運転開始時及び／または急速な微生物増殖相の間の発酵段階に提供されてもよい。し
かしながら、増殖相がゆっくりであるとき、培養が実質的に定常状態の微生物密度を維持
するように、ＣＯ含有量を増加させてもよい（例えば、少なくとも１：１もしくは２：１
またはそれ以上、この場合、Ｈ２濃度はゼロよりも大きいかまたはゼロに等しくてもよい
）。

流れのブレンド化はまた、特にＣＯを含む廃棄流が本質的に間欠性である例では、さら
なる利点を有し得る。ＣＯを含む間欠流は、実質的に連続性のＣＯ及びＨ２を含む改質さ
れた基質流とブレンドされ、発酵槽に提供されることができる。本発明の特別な実施形態
では、実質的に連続性の混合流の組成及び流量は、実質的に連続性の組成及び流量の基質
流の発酵槽への提供を維持するために、間欠流に従って変化してもよい。
培地

１つ以上の微生物の増殖及び基質のエタノール及び／または酢酸塩への発酵が起こるた
めに、この基質に加えて、好適な栄養培地がバイオリアクターに供給される必要があるこ
とを理解されるであろう。栄養培地は、使用される微生物の増殖を許容するのに十分なビ
タミン及びミネラルなどの成分を含有することになる。例示のためのみであるが、Ａｂｒ
ｉｎｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ
．Ｎｏｖ．，Ａｎ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｈａｔ Ｐｒｏｄｕｃ
ｅｓ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｆｒｏｍ Ｃａｒｂｏｎ Ｍｏｎｏｘｉｄｅ；Ａｒｃｈ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，１６１：３４５－３５１（１９９４））によって記載されるように、ク
ロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ）の増殖に好適な嫌気性培地は、当該技術分野において既知である。本明細書
の「実施例」の部分は、後に好適な培地のさらなる例を提供する。
発酵

エタノール及び他のアルコールをガス状基質から生成するためのプロセスは既知である
。例示のプロセスは、例えば、それぞれが、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ
２００７／１１７１５７号、ＷＯ ２００８／１１５０８０号、ＷＯ ２００９／０２２
９２５号、ＷＯ ２００９／０６４２００号、ＵＳ ６，３４０，５８１号、ＵＳ ６，
１３６，５７７号、ＵＳ ５，５９３，８８６号、ＵＳ ５，８０７，７２２号、及びＵ
Ｓ ５，８２１，１１１号に記載されているものを含む。
発酵条件

基質のエタノール及び／または酢酸塩への発酵が起こるために適切な条件下で発酵は行
われるべきである。考慮されるべきである反応条件は、基質レベルが制限されるようにな
らず、かつ最大生成物濃度が生成物阻害を引き起こすことを回避することを保証するため
の、温度、培地流量、ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクターを使用
する場合）、接種原レベル、最大基質濃度、及びバイオリアクターへの基質の導入の速度
を含む。

最適な反応条件は、使用される特定の微生物に部分的には依存することになる。しかし
ながら、一般には、周囲圧よりも高い圧力で発酵が行われることが好ましい。増加した圧
力における運転は、ガス相から、ＣＯがエタノールの生成用の炭素源として微生物によっ
て取り込まれ得る液相までのＣＯ移動の速度における著しい増加を可能にする。このこと
は、転じて、保持時間（投入ガス流量によって除算するバイオリアクター内の液体体積と
して定義）が、バイオリアクターが周囲圧よりはむしろ高圧で維持されるときに低下する
ことを意味する。

また、所定のＣＯの生成物に対する変換率が、一部分は基質保持時間の関数であり、所
望の保持時間を達成することが、転じてバイオリアクターの必要とされる体積を決定する
ので、加圧システムの使用は、必要とされるバイオリアクターの容積を大きく低減するこ
とができ、その結果、発酵設備の資本コストを大きく低減することができる。米国特許第
５，５９３，８８６号で提供される実施例によると、リアクター容積は、リアクター運転
圧力における増加に直線的に比例して低減させることができ、すなわち、１０気圧の圧力
で運転されるバイオリアクターは、１気圧の圧力で運転されるもののわずか１０分の１の
容積だけを必要とする。

高圧においてガスの生成物への発酵を行うことの利点は、別の文献でも記載されている
。例えば、ＷＯ ０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で行わ
れるガスのエタノールへの発酵が、それぞれ１５０ｇ／ｌ／日及び３６９ｇ／ｌ／日のエ
タノール生産性をもたらすことを記載している。しかしながら、大気圧で同様な培地及び
投入ガス組成を使用して行われた例示の発酵では、１０～２０倍少ない一日当たりのエタ
ノール毎リットルを生成することが認められた。

ＣＯを含む基質の嫌気的発酵に好適な発酵条件の例は、ＷＯ ２００７／１１７１５７
号、ＷＯ ２００８／１１５０８０号、ＷＯ ２００９／０２２９２５号、及びＷＯ ２
００９／０６４２００号に詳説されている。これらに報告される発酵条件は、本発明の方
法に従って容易に修正できることが認識される。
微生物

種々の実施形態では、発酵は、カルボキシド栄養性細菌の１つ以上の菌株の培養物を使
用して行われる。種々の実施形態では、カルボキシド栄養性細菌は、ムーレラ属（Ｍｏｏ
ｒｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ルミノコッカス属（Ｒ
ｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクテリウム属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、
ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリバクテリウム属（Ｂｕｔｙｒｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オキソバクター属（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ）、メタノサルチナ属（
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノサルチナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）
、及びデスルホトマクルム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）から選択される。多
くの嫌気性細菌は、ＣＯの、ｎ－ブタノールならびにエタノールを含むアルコール、及び
酢酸への発酵を行うことができることが知られていて、本発明のプロセスにおける使用に
好適である。本発明における使用に好適であるこうした細菌の例は、クロストリジウム・
ルジュングダーリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）（ＷＯ ００
／６８４０７号、ＥＰ １１７３０９号、米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５
９３，８８６号、ならびに同第６，３６８，８１９号、ＷＯ ９８／００５５８号及びＷ
Ｏ ０２／０８４３８号に記載されているものを含む）、クロストリジウム・カルボキシ
ディボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ）（Ｌｉｏｕ
ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３３：ｐｐ２
０８５－２０９１）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａ
ｇｓｄａｌｅｉ）（ＷＯ／２００８／０２８０５５号）及びクロストリジウム・オートエ
タノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）（Ａｂｒｉｎ
ｉ ｅｔ ａｌ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １６１：ｐｐ３
４５－３５１）などの菌種などのクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）のもの
を含む。他の好適な細菌は、ムーレラ菌種（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ）ＨＵＣ２２－１（
Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９：ｐｐ１
６０７－１６１２）を含むムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）のもの、及びカルボキシドサ
ーマス属のもの（Ｓｖｅｔｌｉｃｈｎｙ，Ｖ．Ａ．，Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ
ａｌ（１９９１），Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ １４：２５４－２６０）を含む。さらなる例は、ムーレラ・サーモアセチカ（
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、ムーレラ・サーモトロフィカ（Ｍｏ
ｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ルミノコッカス・プロダクツ
ス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、アセトバクテリウム・ウッディ
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）、ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｂ
ｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、オキソバクター
・フェニジイ（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ，）、メタノサルチナ・バルケ
リ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、メタノサルチナ・アセチボラン
ス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、デスルホトマクルム・
クズネツォビイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｉｉ）（Ｓｉ
ｍｐａ ｅｔ．ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，２００６ Ｖｏｌ．２６．Ｐｐ４１－６５）を含む。さらに、当業者に理解され
るように、他の酢酸産生嫌気性細菌も本発明に適用可能であり得ることを理解されたい。
本発明は、２つまたはそれ以上の細菌の混合培養に適用されてもよいことも理解されるで
あろう。

一実施形態において、微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリ
ジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・カルボ
キシジボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、ク
ロストリジウム・アセチクム、クロストリジウム・フォルミコアセチクム、クロストリジ
ウム・マグナム、アセトバクテリウム・ウーディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏ
ｏｄｉｉ）、アルカリバクラム・バッチィ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉ
ｉ）、ムーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、
スポロミュサ・オヴァタ（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔｅ）、ブチリバクテリウム・メ
チロトロフィカム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｍ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ユーバクテリ
ウム・リモーサム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）、サーモアナエロバクタ
ー・キウヴィ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉ）種を含む酢酸生成
性カルボキシド栄養性生物の群から選択される。

これらのカルボキシド栄養性アセトゲンは、アセチル－ＣｏＡ、アセテート及び他の生
成物を形成する嫌気条件下でエネルギー源として、ガス状の１つの炭素（Ｃ１）源、例え
ば一酸化炭素（ＣＯ）ならびに一酸化炭素（ＣＯ）及び／または水素（Ｈ２）を有する二
酸化炭素（ＣＯ２）などの上で化学自己栄養的に利用して成長するそれらの能力によって
定義される。それらは、発酵の同じ形態、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌまたは還元的な
アセチル－ＣｏＡ経路を共有しており、ならびに一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ
）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ葉酸シンテターゼ
、メチレン－テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル－テトラヒドロ葉酸シクロヒ
ドロラーゼ、メチレン－テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナー
ゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）からなる酵素の組の存在によって
定義されており、その組み合わせは、この種の細菌に特有であって固有である（Ｄｒａｋ
ｅ、Ｋuｓｅｌ、Ｍａｔｔｈｉｅｓ、Ｗｏｏｄ、＆Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、２００６）。

基質をバイオマス、二次代謝産物及びピルビン酸塩（これから、その後生成物が形成さ
れる（アセチル－ＣｏＡを介してまたは直接的に））に変換する糖発酵細菌のカルボキシ
ド栄養性増殖とは対照的に、アセトゲンにおいては、基質がアセチル－ＣｏＡに直接搬送
され、その後、これから生成物、バイオマス、及び二次代謝産物が形成される。

さらなる実施形態において、微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリイ
、及び「Ｃ．ラグスダレイ」種ならびに関連した分離株を含むカルボキシド栄養性クロス
トリジウムのクラスターから選択される。

これらは、限定されるものではないが、Ｃ．オートエタノゲナムＪＡＩ－１Ｔ（ＤＳＭ
１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ、Ｎａｖｅａｕ、＆Ｎｙｎｓ、１９９４）、Ｃ．オートエタ
ノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ ／２００９／０６４２００）、Ｃ
．オートエタノゲナムＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．リュングダリイＰＥＴ
ＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ、Ｍｉｌｌｅｒ、＆Ｙａ
ｎｇ、１９９３）、Ｃ．リュングダリイＥＲＩ－２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国特許第
５，５９３，８８６号）、Ｃ．リュングダリイＣ－０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（米国特
許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．リュングダリイＯ－５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米
国特許第６，３６８，８１９号）、または「Ｃ．ラグスダレイＰ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ Ｂ
ＡＡ－６２２）（ＷＯ ２００８／０２８０５５）株、及び関連した分離株、例えば「Ｃ
．コスカチィ（Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ）」（米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、
「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ３５１」（Ｔｙｕｒｉｎ＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０１２
）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ６５３」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔ
ｙｕｒｉｎ、２０１２ａ）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ６８３」（Ｂｅｒｚｉｎ、２
０１２）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ９６２」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ
、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１３）、「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ１１２１」（Ｂｅｒｚｉ
ｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｂ）、「クロストリジウムｓｐ．Ｍ
Ｔ１２３０」（Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１３）、または「クロストリジ
ウムｓｐ．ＭＴ１９６２」（Ｂｅｒｚｉｎ、Ｔｙｕｒｉｎ、＆Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、２０
１３）など、及びそれらの突然変異株、例えばＣ．リュングダリイＯＴＡ－１（Ｔｉｒａ
ｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒ
ｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇ
ｄａｈｌｉｉ．ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１０）または「クロストリジウムｓｐ．ＭＴ８９６」（Ｂｅｒ
ｚｉｎ、Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ、＆Ｔｙｕｒｉｎ、２０１２ｃ）などを含む。

これらの株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子レベル上で少なくとも９９％の同一性を有する
ものの、ＤＮＡ－ＤＮＡ再結合やＤＮＡ指紋採取実験によって決定されるような（ＷＯ
２００８／０２８０５５号、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）異なる種である、
クロストリジウム属のｒＲＮＡクラスターＩ内にサブクラスターを形成する（Ｃｏｌｌｉ
ｎｓ ｅｔ ａｌ、１９９４）。

このクラスターの株は、類似の遺伝子型と表現型の両方を有する、共通の特徴によって
定義されており、それらは全て、エネルギー変換及び発酵性代謝の同じ形態を共有する。
このクラスターの株は、シトクロムを欠いており、エネルギーをＲｎｆ複合体によって保
存する。

このクラスターの全ての株は、４．２ＭＢｐ周辺のゲノムサイズを有する類似の遺伝子
型（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及び３２ｍｏｌ％周辺のＧＣ組成（Ａｂｒｉ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔａｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９３）（ＷＯ ２００８／０２８０５５号；米国特許出願第２０１１
／０２２９９４７号）を有し、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素（一酸化炭素デ
ヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒ
ドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉
酸レダクターゼ、及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル－ＣｏＡシンターゼ）、ヒ
ドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン
酸塩：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダ
クターゼ（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，２０１１）をコード化する必須の重要
な遺伝子オペロンを保存している。ガスの取り込みに関与する、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄ
ａｈｌ経路遺伝子の構成や数は、核酸及びアミノ酸配列における差にもかかわらず、全種
において同じであることが分かっている（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ、２０１１）。

株は全て、類似の形態やサイズを有しており（対数的に成長する細胞は、０．５～０．
７×３～５μｍの間にあり）、中温性（３０～３７℃の間の最適の成長温度）であり、厳
密に嫌気性生物である（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ、１９９４、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ、１９９３）（ＷＯ ２００８／０２８０５５号）。さらに、これらは全て、同一のｐ
Ｈ範囲（５．５～６の最適な初期ｐＨを伴う、ｐＨ４～７．５の）、類似の増殖速度を伴
うＣＯ含有ガス上の強力な独立栄養増殖、及び主要な発酵最終産物としてエタノールなら
びに酢酸、及び特定の条件下で形成される少量の２，３－ブタンジオールならびに乳酸を
伴う類似の代謝プロファイルなどの同じ主要な系統発生的形質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ
ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９３）（ＷＯ ２００８／０２８０５５号）。インドールの生成が、全て
の株で観察された。しかしながら、これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラ
ビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン
、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の基質利用率で差が
ある。さらに、種の一部は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対して栄
養要求性株であり、一方その他のものは栄養要求性株ではないことが確認されている。ま
た、カルボン酸のその対応するアルコールへの還元も、これらの微生物のある範囲で示さ
れている（Ｐｅｒｅｚ，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｌｏｆｔｕｓ，＆ Ａｎｇｅｎｅｎｔ，２０１
２）。したがって、これらの形質は、Ｃ．オートエタノゲナム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎ
ｏｇｅｎｕｍ）またはＣ．リュングダリイ（Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）のような１つ
の微生物に特異的ではなく、性能差が存在し得るが、むしろカルボキシド栄養性のエタノ
ール合成クロストリジウム菌に一般的な形質であり、機構がこれらの株全体で同様に作用
し得ることが予測される（Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

本発明における使用で好適な、１つの例示の微生物は、クロストリジウム・オートエタ
ノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）である。一実施
形態では、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）は、識別受託番号１９６３０のもと、Ｇｅｒｍａｎ Ｒｅｓｏ
ｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ
）において受託された株の識別特性を有するクロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）である。別の実施形態では、
ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭＺ１００６１の識別特性を有するクロストリジウム・オートエタ
ノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）である。これら
の株は、基質組成における変化、特にＨ_２及びＣＯに対して特定の耐容性を有し、よって
、水蒸気改質プロセスとの組み合わせにおける使用に特に適切である。

本発明の一態様による、ＣＯ２とＨ２とを含む基質からの酢酸塩の生成における使用に
好適な１つの例示の微生物は、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ）である。

本発明の方法で使用される細菌の培養は、嫌気性細菌を使用して基質を培養し発酵させ
るために当該技術分野において既知のいくつものプロセスを使用して行われてもよい。例
として、発酵用にガス状基質を用いる以下の文献において一般的に記載されるプロセスが
利用されてもよい。すなわち、（ｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１
）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎｓ ｒｅｓｏｕｒｓｅｓ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌｉ
ｎｇ，５；１４５－１６５；（ｉｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１
）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｆｅ
ｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｕｅｌ．７０．６０５－６１４；（ｉｉｉ）Ｋ．Ｔ．Ｋｌａ
ｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ ｇａｓ ｉｎｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｏｒ ｇａｓｅｏｕｓ ｆｕｅｌｓ．Ｅｎ
ｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４；６０２－６０８
；（ｉｖ）Ｊ．ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｇａｓｅ
ｏｕｓ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｃａｒｂｏｎ Ｍｏｎｏｘｉ
ｄｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ Ａｃｅｔａｔｅ．２．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３４．６．７８５－７９３；（ｖ） Ｊ．
ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇａｓｅｏｕｓ ｓｕｂ
ｓｔｒａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｃｏｎ
ｖｅｒｓｉｏｎ ｔｏ ａｃｅｔａｔｅ．１．Ｂａｔｃｈ ｋｕｒｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３４．６．７７４－７８４；（
ｖｉ）Ｊ．ｌ．Ｖｅｇａ，ｅｔ ａｌ。（１９９０）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅ
ａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃｏａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎｓ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ
．３．１４９－１６０（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）。
発酵生成物

本発明の方法は、種々の炭化水素生成物のいずれかを生成するために使用され得る。こ
の炭化水素としては、アルコール、酸及び／またはジオールを含む。より具体的には、本
発明は、酪酸塩、プロピオン酸塩、カプロン酸塩、エタノール、プラパノール、ブタノー
ル、２，３－ブタンジオール、プロピレン、ブタジエン、イソ－ブチレン及びエチレンを
生成するための発酵に適用可能であり得る。一実施形態では、本発明は、限定されるもの
ではないが、プロパノール及びブタノールを含むアルコールを生成するために使用され得
る。アルコール（複数可）は、次いで酢酸塩と反応させ、酢酸プロピルまたは酢酸ブチル
を含む生成物（複数可）を生成することができる。当業者であれば、本発明が言及された
アルコール及び生成物に限定されるものではなく、任意の適切なアルコール及び／または
酸が生成物を生成するために使用され得ることを理解するであろう。

これらの及び他の生成物は、プラスチック、医薬品及び農薬の生成などの沢山の他のプ
ロセス用に価値のあるものであり得る。一実施形態では、発酵生成物は、ガソリンレンジ
の炭化水素（約８個の炭素）、ディーゼル炭化水素（約１２個の炭素）またはジェット燃
料炭化水素（約１２個の炭素）を生成するために使用される。

本発明の方法はまた、好気性発酵に、及び限定されないがイソプロパノールを含む他の
生成物の嫌気性または好気性発酵に適用され得る。本発明の方法はまた、好気性発酵に、
及び限定されないがイソプロパノールを含む他の生成物の嫌気性または好気性発酵に適用
され得る。

本発明はまた、発酵によって生成された炭化水素生成物の少なくとも一部が、水蒸気改
質プロセスにおいて再利用されることも提供する。これは、ＣＨ_４以外の炭化水素が触媒
の上方で水蒸気と反応し、Ｈ_２及びＣＯを生成することができるために、行われる場合が
ある。特別な実施形態では、エタノールは、水蒸気改質プロセス用の供給原料として使用
されるよう再循環される。さらなる実施形態では、炭化水素供給原料及び／または生成物
は、これらが水蒸気改質プロセスで使用される前に、前改質装置を通過させる。前改質装
置を通過させることは、水蒸気改質プロセスの水蒸気改質ステップを部分的に完了させ、
これは、水素生成の効率を増加させ、蒸気改質炉の必要とされる容積を減少させることが
できる。

本発明の方法はまた、好気性発酵に、及び限定されないがイソプロパノールを含む他の
生成物の嫌気性または好気性発酵に適用され得る。

より具体的には、本発明は、エタノール及び／または酢酸塩の発酵に適用可能であり得
る。これらの生成物は、その後反応させ、エステルを含む化学生成物を一緒に生成する。
本発明の一実施形態では、発酵によって生成されたエタノール及び酢酸塩は、一緒に反応
させて、酢酸エチルを生成する。酢酸エチルは、表面コーティング及び稀釈剤を含む溶媒
の生成などの多くの他のプロセスに、同様に医薬品及び香料ならびにエッセンスの製造に
おいて価値があり得る。
生成物回収

発酵反応の生成物は、既知の方法を使用して回収され得る。例示の方法は、ＷＯ ０７
／１１７１５７号、ＷＯ ０８／１１５０８０号、ＵＳ ６，３４０，５８１号、ＵＳ
６，１３６，５７７号、ＵＳ ５，５９３，８８６号、ＵＳ ５，８０７，７２２号及び
ＵＳ ５，８２１，１１１号に記載されているものを含む。しかしながら、簡単にかつ例
示としては、エタノールは、分別蒸留発酵または蒸発などの方法によって、及び抽出発酵
によって、発酵ブロスから回収されてもよい。

エタノールの発酵ブロスからの蒸留は、エタノール及び水の共沸混合物（すなわち、９
５％のエタノール及び５％の水）をもたらす。無水エタノールが、当該技術分野において
周知でもある、分子篩エタノール脱水技術の使用を通して引き続いて得られる。

抽出発酵手法は、エタノールを希釈発酵ブロスから回収するために、発酵微生物に対し
て低い毒性リスクで存在する水混和性溶媒の使用を伴う。例えば、オレイルアルコールは
、このタイプの抽出プロセスにおいて使用され得る溶媒である。オレイルアルコールは、
発酵槽に連続的に導入され、この溶媒が発酵槽の頂部において層を形成しながら上昇する
際に、これが連続的に抽出され、遠心機に送り込まれる。次いで、水及び細胞がオレイル
アルコールから容易に分離され、発酵槽に戻され、一方エタノールを含む溶媒は、フラッ
シュ蒸発ユニットに送り込まれる。エタノールの大部分は蒸発され、濃縮され、一方オレ
イルアルコールは非揮発性であるため、発酵における再利用のために回収される。

発酵反応において副生成物として生成され得る酢酸塩もまた、当該技術分野において既
知の方法を使用して、発酵ブロスから回収され得る。

例えば、活性炭フィルターを伴う吸着システムが使用されてもよい。この場合、微生物
細胞が、好適な分離ユニットを使用して、発酵ブロスから先ず初めに除去されることが好
ましい。生成物回収用の無細胞発酵ブロスを生成する多数の濾過に基づく方法が、当該技
術分野において既知である。次いで、無細胞のエタノール及び酢酸塩を含有する透過液に
、活性炭を収容するカラムを通過させ、酢酸塩を吸着させる。塩（酢酸塩）形態よりはむ
しろ酸形態での酢酸塩（酢酸）は、活性炭によってより容易に吸着される。したがって、
酢酸塩の大部分を酢酸形態に変換するために、発酵ブロスに活性炭カラムを通過させる前
に、発酵ブロスのｐＨを約３未満に低下させることが好ましい。

活性炭に吸着された酢酸は、当該技術分野において既知の方法を使用する溶出によって
回収されてもよい。例えば、結合酢酸塩を溶出するために、エタノールを使用することが
できる。特定の実施形態において、発酵工程によって生成されたエタノールそれ自体を、
酢酸塩を溶出するために使用してもよい。エタノールの沸点は７８．８℃であり、酢酸の
沸点は１０７℃であるために、エタノール及び酢酸塩は、蒸留などの揮発性に基づく方法
を使用して、互いから容易に分離され得る。

発酵ブロスから酢酸塩を回収するための他の方法もまた当該技術分野において既知であ
り、これらを使用してもよい。例えば、米国特許第６，３６８，８１９号及び同第６，７
５３，１７０号は、発酵ブロスからの酢酸の抽出用に使用され得る溶媒及び共溶媒系を記
載している。エタノールの抽出発酵について記述されるオレイルアルコールに基づく系の
例と同様に、米国特許第６，３６８，８１９号及び同第６，７５３，１７０号に記載され
る系は、酢酸生成物を抽出するために、発酵微生物の存在下または不在下のいずれかで発
酵ブロスと混合され得る水混和性溶媒／共溶媒を記述している。次いで、酢酸生成物を含
有する溶媒／共溶媒が、蒸留によってブロスから分離される。その後、第２の蒸留ステッ
プが、溶媒／共溶媒系から酢酸を精製するために使用されてもよい。

発酵反応の生成物（例えば、エタノール及び酢酸塩）は、発酵バイオリアクターからブ
ロスの一部を連続的に取り出し、微生物細胞をブロスから分離し（通常、濾過によって）
、１つ以上の生成物をブロスから同時にまたは逐次的に回収することによって、発酵ブロ
スから回収され得る。エタノールの場合には、これは蒸留によって好都合に回収され得、
酢酸塩は上述の方法を使用して、活性炭上の吸着によって回収され得る。分離された微生
物細胞は、発酵バイオリアクターに戻されることが好ましい。エタノール及び酢酸塩が取
り出された後に残る無細胞透過液もまた、発酵バイオリアクターに戻されることが好まし
い。無細胞透過液がバイオリアクターに戻される前に、栄養培地を補充するために、追加
の栄養素（ビタミンＢなど）が無細胞透過液に添加されてもよい。また、ブロスのｐＨが
、活性炭に対する酢酸の吸着を強めるために上記したように調整された場合、そのｐＨは
、バイオリアクターに戻される前に、発酵バイオリアクターにおけるブロスのそれに類似
のｐＨに再調整されるべきである。

バイオリアクターから回収されたバイオマスは、バイオマス生成物、好ましくはメタン
を生成するために、消化において嫌気性消化を受けてもよい。このバイオマス生成物は、
水蒸気改質プロセス用の供給原料として使用されてもよく、または本明細書で定義される
反応のうちの１つ以上を進行させるための補助熱を発生させるために使用されてもよい。

本発明は、以下の実施例を通して、ここでさらに説明される。
実施例１：マイクロアレイ実験
発酵

Ｃ．オートエタノゲナム（Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）ＤＳＭ２３６９３に
よる発酵を、以下に記載される通りに、１．５Ｌのバイオリアクター内で３７℃にて、及
びＣＯ含有ガスを唯一のエネルギーならびに炭素源として行った。１リットル当たりＭｇ
Ｃｌ、ＣａＣｌ_２（２ｍＭ）、ＫＣｌ（２５ｍＭ）、Ｈ_３ＰＯ_４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１０
０μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する規定
液体培地を、培養増殖に使用した。培地をバイオリアクターに移し、ビタミンＢ溶液で補
充し、０．２ｍＭのＣｒ（ＩＩ）溶液で還元した。嫌気性状態を達成するために、リアク
ター容器を窒素でスパージした。接種前に、ガスを３０％のＣＯ及び７０％のＮ２を含有
するガス混合物に切り替え、リアクターに連続的に送り込んだ。ガス流量は、１００ｍｌ
／分に設定し、撹拌を３００ｒｐｍに設定した。Ｎａ_２Ｓを０．３ｍｌ／時でバイオリア
クターに投入した。発酵の増殖期中、撹拌を５０ｒｍｐの間隔で９００ｒｐｍまで増大さ
せた。バッチモードにおける０．８日後に、バイオリアクターを、１．８ｍｌ／分の液体
速度（希釈速度１．７ｄ^－１）の連続モードに切り替えた。ガス流量を、順次調整して、
４ｍｏｌ／Ｌ／ｄのＣＯ取り込みに到達させた。最大ガス流量は、発酵槽容積当たり４３
５ｍｌ／Ｌであった。定常状態に達した後に、ＣＯ２濃度を０％から２５％まで変化させ
ることによって、実験を開始した。ＣＯ取り込みにおけるいかなる変化も回避するために
、ＣＯ２及びＮ２流量を互いに対して調整しつつ、ＣＯ流量及び総ガス流量を一定に保持
した。ガス組成は、データが分析用に抽出され得るように、前の供給領域からの代謝産物
の９５％が洗浄され、代謝産物が少なくとも２日間にわたって新しいレベルで再度安定化
された時にだけ切り替えられた。培地サンプルは、バイオマス及び代謝産物を測定するた
めに採取され、流入ガス及び流出ガスのヘッドスペース分析を、規則的な間隔で行った。
サンプリング手順

サンプルを、前冷却したチューブを用いてバイオリアクターから採集し、採集されたサ
ンプルの量は、６００ｎｍで測定されたＯＤ ２と等価であった。異なるＥｔＯＨ：ＢＤ
Ｏ比に関して、ガス組成及び遺伝子発現プロファイルにわたる時間効果を比較するために
、３つのサンプルをマイクロアレイ分析用にバイオリアクターから採集した。第１のサン
プルは、ＣＯ ３０％及びＮ２ ７０％のガス混合物及びリアクター内に存在する２３：
１のＥｔＯＨ：ＢＤＯ比から採集した。第２のサンプルは、１３：１のＥｔＯＨ：ＢＤＯ
比を伴うＣＯ ３０％、Ｎ２ ４０％及びＣＯ２ ３０％のガス混合物から採集し、この
サンプルは、ガス組成が変更された後７時間で採集した。第３のサンプルは、第２のサン
プルと同じガス混合物から採集したが、これは４：１のＥｔＯＨ：ＢＤＯ比を伴い、この
サンプルは、ガス組成物へのＣＯ２の添加後３日で採集した。採集後、サンプルを４℃に
て４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、上澄みを除去し、続いてペレットを液体窒素中
で急速凍結し、使用するまで－８０℃で保存した。
ＲＮＡ抽出

サンプルを－８０℃から取り出した後に、ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）－Ｂａｃｔｅｒｉ
ａ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，部品番号ＡＭ１９２５）を用いて、サンプルを抽出した。
マイクロアレイ分析

マイクロアレイ分析を、標準的手法を用いてＲｏｃｈｅによって行った。
実施例２：圧力の発酵に及ぼす効果

図２、図３及び図４は、発酵ブロス中に存在する溶解ＣＯ２の量、及び発酵によって生
成された代謝産物の濃度の双方に及ぼす効果を立証するための、低圧及び高圧の両方で行
われた発酵からの結果を示す。これらの実験のそれぞれでは、液体栄養培地を含むバイオ
リアクターに、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）の培養物を接種した。ＣＯ及びＣＯ２を含むガス状基質を
バイオリアクターに提供した。

図２は、第１の実験からの結果を示し、ここでは発酵を異なる圧力で行い、圧力の溶解
ＣＯ２の量に及ぼす効果及びリアクター内で生成された２，３－ブタンジオール（２，３
－ＢＤＯ）の濃度に及ぼす効果を立証した。

図２は、高圧において、０日目から６日目まで（リアクターのヘッドスペースにおいて
３２０ｋＰａｇ、及びリアクターの底部において約４２０ｋＰａｇ）、発酵ブロス中の溶
解ＣＯ２の量、及び生成された２，３－ＢＤＯの濃度の両方が増加したことを示している
。発酵が低圧で運転されたとき、６日目から２２日目まで（ヘッドスペースにおいて５０
ｋＰａｇ、及び底部において約１５０ｋＰａｇ）、発酵ブロス中の溶解ＣＯ２の量、及び
２，３－ＢＤＯの濃度の両方が減少した。

図３は、発酵ブロス中の溶解ＣＯ２の量と２，３－ブタンジオール濃度との間の相関を
明らかに示している。

図４は、ＣＯのＣＯ２への変換の発酵に及ぼす効果を立証している。細菌によるＣＯ消
費の量が増加するように発酵が運転されたとき、ＣＯ２が発酵の副生成物として生成され
た。ＣＯＤＨ（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ）によるＣＯのＣＯ２への変換は、還元フェ
レドキシンを生じさせた。高レベルの還元フェレドキシンは、アセチルＣｏＡをピルビン
酸塩に変換するために必要とされ、これは２，３－ブタンジオール生成の増加、及びピル
ビン酸塩に由来する他の生成物の生成の増加をもたらした。
実施例３：溶解ＣＯ２濃度を増加させること

発酵物中の溶解ＣＯ２のレベルが、２，３－ブタンジオールの生成の増加をもたらすこ
とを立証する１組の実験を行った。
３Ａ：２，３－ＢＤＯ生成を増加させる方法としてのＣＯ_２入口濃度における変化

この実験中に、発酵ブロスへの入口ガスのＣＯ_２濃度を、２８日間の運転後１段階で０
％から２５％まで変化させた。ＣＯ取り込みを実験全体で一定に保持し、入口ガスにおけ
るＣＯの濃度を３０％で保持した。図５に示すように、ＣＯ_２を０％から２５％まで変化
させたとき、２，３－ブタンジオール生成の大幅な増加が観察された。

図６は、２５日目～３１日目の発酵ブロス中のＣＯ２濃度における変化を描写する。２
５日目には、発酵物に提供された入口流中のＣＯ２の量は０％であった。２８日目には、
入口流のＣＯ２濃度は、２５％まで増加した。図６は、ＣＯ２が増加後にＣＯ取り込みは
同じままであることを明白に示し、このことは、以下に詳説されるＢＤＯ生成の増加は、
システムに流入するより多量の炭素では説明することができないことを示唆している。さ
らに、ＣＯ２生成は、その増加後には同じ状態のままであった。図５は、発酵の代謝産物
生成における対応する変化を明確に立証している。ＣＯ２が発酵ブロスに添加されたとき
、２，３－ＢＤＯ濃度は、２８日目の０．６ｇ／Ｌ周辺から３１日目の２．０ｇ／Ｌまで
増加した。エタノール濃度は減少し、エタノールと２，３－ＢＤＯとの比は、２０日目の
約２０：１から３１日目の約５：１まで低下した。
３Ｂ：開始時の高ＣＯ２入口濃度

この実験は、ＣＯ_２が発酵の開始時に存在するときの高ＣＯ２濃度の２，３－ＢＤＯの
生成に及ぼす影響を示すよう設計された。図７に示すように、安定運転条件に一旦到達す
ると、２：１でのエタノール：２，３－ＢＤＯ比で、相当量の２，３－ＢＤＯ生成が存在
した。平均入口ＣＯ２濃度は４２％であって、平均出口ＣＯ２濃度は６７．４％であった
。実験全体を通して、５０％のＣＯが使用され、ガス流量及びＣＯ取り込みは、エタノー
ル及び２，３－ＢＤＯ生成を最大化するよう調整された。数日間にわたる流出ガス流中の
ＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２の濃度を図８に示す。
３Ｃ：ＣＯ２入口濃度における段階的増加

ＣＯ２が発酵物の代謝産物生成プロファイルに及ぼす効果を決定するために、この実験
の持続時間にわたって、発酵ブロスへの入口ガス流中のＣＯ２の濃度を逐次増加させた。
図１０は、入口流中のＣＯ２の増加の代謝産物濃度に及ぼす効果を示している。ＣＯ２濃
度は、６日目で０％から１０％まで、９日目で１０％から１５％まで、及び１３日目で１
５％から２０％まで増加した。入口流中のＣＯ２濃度における各増加において、２，３－
ＢＤＯ濃度の対応する増加が観察された。図９は、実験の持続時間にわたる微生物培養物
のＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２の取り込みを示している。
３Ｄ：ＣＯ２の循環

ＣＯ２入口濃度を循環させる効果を決定するために、この実験を行った。入口流中のＣ
Ｏ２の量が毎時０％から２０％まで循環されるように、発酵を設定した。図１１は、実験
の過程にわたる代謝産物生成を示している。ＣＯ２入口濃度の循環は、２，３－ＢＤＯの
生成をわずかに増加した濃度で維持するための効果を有した。図１２は、実験の持続時間
にわたる微生物培養物による入口ガスの種々の成分の取り込みを示している。
３Ｅ：二リアクターシステムの第２のリアクターへのＣＯ２濃度における増加

第１のバイオリアクターからの流出ガス流を第２のバイオリアクターの入口流まで渡し
、それによってＣＯ_２濃度を増加させる効果を立証するために、この実験を設計した。図
１３は、発酵工程の１４日目から２０日目の二リアクターシステムの第２のバイオリアク
ター内の代謝産物濃度のプロットを示している。１４日目には、第１のバイオリアクター
から第２のバイオリアクターに提供されたＣＯ２の量は、ＣＯ２の総量が第２のバイオリ
アクター内で１７．８％から４３．８％まで進むように、増加した。１４日目から２１日
目まででは、リアクター内の２，３－ＢＤＯの濃度は、約８ｇ／Ｌから約１４ｇ／Ｌまで
増加した。エタノールと２，３－ＢＤＯとの比は、１４日目の４：１から２０日目周辺の
２：１まで減少し、実験の残りの期間中は比較的一定のままであった。図１４は、発酵の
過程にわたる微生物培養物についてのＣＯ、ＣＯ_２及びＨ_２の取り込みを示している。
実施例４：ＣＯ利用率を制御することによる２，３－ＢＤＯ生成の増加
ガス流量及び撹拌の代謝産物生成に及ぼす効果の立証

この実験は、質量移動における変化の微生物培養物の代謝産物生成に及ぼす効果を立証
するよう設計した。実験の過程にわたって、撹拌速度及びガス流量を変化させ、リアクタ
ーに流入するガス、及び発酵の代謝産物プロファイルに変更をもたらした。

図１５を参照すると、２，３－ＢＤＯ濃度における増加を、６日目から８日目に見るこ
とができ、これはバイオリアクター内の撹拌速度における増加及びリアクターへのガス流
量における減少に一致した。図１８に示すように、５．６日日目に、ＣＯ取り込みは一定
に保持されたが、ＣＯの利用率は改善され、したがって、出口ガス中のＣＯ２は増加した
。これは、撹拌速度（ｒｐｍ）を増加することによって、及び出口ガス中のＣＯが２６％
から１２．５％まで減少するように、ガス流量を減少させることによってなされた。ＣＯ
の取り込みは、ガス流量が２４０ｍｌ／分／Ｌから１６０ｍｌ／分／Ｌまで低下されても
、同じ状態のままであった。出口流中のＣＯ２は、３７％から４８％まで増加した。ＣＯ
利用率は、５３％から７９％まで増加した。この増加の結果として、溶解ＣＯ２は、ＣＯ
取り込みにおけるいかなる増加もなく、増加した。ＣＯ利用率における増加が、より高い
ＣＯ利用率がより多くの溶解ＣＯ２に対応するために、ＣＯ利用率における増加は、２，
３－ＢＤＯ生成における増加に正相関した。
発酵ブロス中の溶解ＣＯ２の２，３－ブタンジオール生産性に及ぼす効果

発酵ブロス中の溶解ＣＯ_２の２，３－ブタンジオールの生成に対する関係を示すために
、異なるヘッドスペースの圧力において異なる出口ＣＯ_２濃度を用いた多くの実験からの
組み合されたデータをプロットした。図１６は、溶解ＣＯ_２対２，３－ＢＤＯ生成速度の
プロットである。このプロットは、発酵ブロス中の溶解ＣＯ２の量の増加が、２，３－ブ
タンジオールの生産性の増加に一致することを示している。

この表は、いくつかの実験からの結果を提示し、溶解ＣＯ_２及び２，３－ＢＤＯの濃度
と生産性との間の相関を再び示す。

本発明は、本明細書の読者が過度の実験を要することなく本発明を実施することを可能
にするために、特定の好ましい実施形態を参照して記述された。当業者であれば、本発明
が、全てのこうした変形形態及び修正形態を含む発明の影響下にあることを理解するであ
ろう。さらに、表題、見出し等は、本文書の読者の理解力を高めるために提供されるもの
であって、本発明の範囲を限定するものとして読み取られるべきではない。

上記及びもしあれば下記で引用される全ての出願、特許、及び刊行物の開示全体は、参
照により本明細書に組み込まれる。

本明細書における任意の先行技術に対する言及は、この先行技術がアメリカ合衆国また
は世界のいかなる国においても周知の一般知識の一部を形成するという承認または任意の
形態の示唆ではなく、またそのように受け取られるべきではない。

この明細書及び後続する任意の特許請求の範囲全体を通して、文脈が他のものを要求す
る場合を除いて、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉ
ｎｇ）」及び同様のものは、排他的な意味とは対照的に包括的な意味に、すなわち、「限
定されるものではないが、～を含む」という意味に、解釈されることになる。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．少なくとも１つのカルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）の酢酸産生微生物を含む発酵培養物の代謝プロファイルを制御するための方法であって、
ａ．ＣＯ及びＣＯ _２ を含むガス状基質を、液体栄養培地中の前記微生物の培養物を含むバイオリアクターに流入させ、アセチルＣｏＡに由来する少なくとも１つの生成物と、ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物とを生成することと、
ｂ．ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物の前記生成が制御されるように、前記液体栄養培地中に溶解するＣＯ _２ の量を調整することと、を含む方法。
２．前記培地中に溶解するＣＯ _２ の前記量が、ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物の前記生成が増加するように、増加させられる、上記１に記載の方法。
３．前記培地中に溶解するＣＯ _２ の前記量が、ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物の前記生成が減少するように、減少させられる、上記１に記載の方法。
４．前記培地中に溶解するＣＯ _２ の前記量が、前記バイオリアクターへのＣＯ _２ の前記流入を制御することによって調整される、上記１に記載の方法。
５．前記ＣＯ _２ 分圧が、前記液体栄養培地中に溶解するＣＯ _２ の前記量を調整するために、調整される、上記１に記載の方法。
６．前記発酵が、前記液体栄養培地中に溶解するＣＯ _２ の濃度が増加するように、２５０ｋＰａｇ超の圧力で行われる、上記１に記載の方法。
７．前記発酵が、前記液体栄養培地中に溶解するＣＯ _２ の濃度が減少するように、２００ｋＰａｇ未満の圧力で行われる、上記１に記載の方法。
８．前記バイオリアクターに提供される前記ガス状基質中のＣＯ _２ の濃度が、約１５％～約６５％である、上記１に記載の方法。
９．前記バイオリアクターに提供される前記ガス状基質中のＣＯ _２ の濃度が、経時的に徐々に増加する、上記１に記載の方法。
１０．ピルビン酸塩に由来する前記少なくとも１つの生成物が、２，３－ブタンジオール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、２－ブタノール、プロパンジオール、２－プロパノール、イソプロパノール、アセトイン、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、及びポリ乳酸（ＰＬＡ）からなる群から選択される、上記１に記載の方法。
１１．前記バイオリアクター内の前記培養物によって利用されるＣＯ _２ の前記量を監視するために、前記バイオリアクターから流出する流出流における前記ＣＯ _２ 濃度を監視することをさらに含む、上記１に記載の方法。
１２．前記液体栄養培地中に溶解するＣＯ _２ の前記量を調整することが、ピルビン酸塩由来生成物とアセチルＣｏＡ由来生成物との比を制御する、上記１に記載の方法。
１３．ガス状基質の微生物発酵によって、１つ以上の生成物を生成するための方法であって、
ａ．ＣＯを含むガス状基質を、液体栄養培地中の少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養物を含む第１のバイオリアクター内で受け取ることと、
ｂ．ＣＯを含む前記ガス状基質を発酵させて、１つ以上の液体生成物とＣＯ _２ を含む流出ガスとを生成することと、
ｃ．ＣＯ _２ を含む前記流出ガスを、前記第１のバイオリアクターに戻すこと、または第２のバイオリアクターに渡すことのいずれかを行うことであって、前記第２のバイオリアクターが、液体栄養培地中の少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養物を含む、ことと、
ｄ．ＣＯ _２ を含む前記流出ガスを前記第１または第２のバイオリアクター内で発酵させて、少なくとも１つの生成物を生成することと、を含む方法。
１４．ＣＯ _２ を含む前記流出ガスが、前記第２のバイオリアクターに供給される前に、少なくとも１つのガス状基質とブレンドされる、上記１３に記載の方法。
１５．少なくとも１つの追加のガス状基質が、前記発酵における基質として使用するために前記第２のバイオリアクターに供給される、上記１４に記載の方法。
１６．前記第１のバイオリアクターが、アセチルＣｏＡ由来生成物とピルビン酸塩由来生成物とを生成し、アセチルＣｏＡ由来生成物とピルビン酸塩由来生成物との比が、約３０：１～約２０：１である、上記１３に記載の方法。
１７．前記第２のバイオリアクターが、前記第１のバイオリアクターよりも、アセチルＣｏＡ由来生成物とピルビン酸塩由来生成物との低い比を生じる、上記１３に記載の方法。
１８．ピルビン酸塩に由来する前記少なくとも１つの生成物が、２，３－ブタンジオール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、２－ブタノール、プロパンジオール、２－プロパノール、イソプロパノール、アセトイン、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、及びポリ乳酸（ＰＬＡ）からなる群から選択される、上記１３に記載の方法。
１９．前記第２のバイオリアクターから生じた流出ガス流を採取することと、これを基質として使用するために前記第１のバイオリアクターに渡すことと、をさらに含む、上記１３に記載の方法。
２０．少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物を含む発酵培養物の代謝プロファイルを制御するための方法であって、
ａ．ＣＯを含むガス状基質を、液体栄養培地中の前記微生物の培養物を含むバイオリアクターに流入させて、発酵ブロスを提供することと、
ｂ．フェレドキシン依存性一酸化炭素デヒドロゲナーゼを介するＣＯ酸化の速度を増加させて、前記発酵ブロス中の還元フェレドキシンのレベルを増加させることと、を含み、
還元フェレドキシンの前記レベルの増加が、アセチルＣｏＡからのピルビン酸塩発酵の速度を増加させる、方法。
２１．前記少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物が、ムーレラ属（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクテリウム属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブチリバクテリウム属（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オキソバクター属（Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ）、メタノサルチナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、及びデスルホトマクルム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）からなる群から選択される、上記１、１３、または２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記少なくとも１つの微生物が、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・ルジュングダーリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ）、及びクロストリジウム・コスカチイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ）からなる群から選択される、上記１、１３、または２０のいずれかに記載の方法。

Claims (5)

1. ガス状基質の微生物発酵によって、１つ以上の生成物を生成するための方法であって、
   ａ．ＣＯを含むガス状基質を、液体栄養培地中の少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸酸性微生物の培養物を含む第１のバイオリアクター内で受け取ることと、
   ｂ．ＣＯを含む前記ガス状基質を発酵させて、１つ以上の液体生成物とＣＯ_２を含む流出ガスとを生成することであって、前記第１のバイオリアクターが、アセチルＣｏＡ由来生成物とピルビン酸塩由来生成物とを生成し、アセチルＣｏＡ由来生成物のピルビン酸塩由来生成物に対する比が、３０：１～２０：１である、ことと、
   ｃ．ＣＯ_２を含む前記流出ガスを、第２のバイオリアクターに渡すことであって、前記第２のバイオリアクターが、液体栄養培地中の少なくとも１つのカルボキシド栄養性の酢酸産生微生物の培養物を含む、ことと、
   ｄ．ＣＯ_２を含む前記流出ガスを前記第２のバイオリアクター内で発酵させて、前記第１のバイオリアクターにより生じるアセチルＣｏＡ由来生成物のピルビン酸塩由来生成物に対する比よりも、低いアセチルＣｏＡ由来生成物のピルビン酸塩由来生成物に対する比を生じる、ことと、を含む方法。
2. ＣＯ_２を含む前記流出ガスが、前記第２のバイオリアクターに供給される前に、少なくとも１つのガス状基質とブレンドされる、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つの追加のガス状基質が、前記発酵における基質として使用するために前記第２のバイオリアクターに供給される、請求項２に記載の方法。
4. ピルビン酸塩に由来する少なくとも１つの生成物が、２，３－ブタンジオール、乳酸塩、コハク酸塩、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、２－ブタノール、プロパンジオール、２－プロパノール、イソプロパノール、アセトイン、イソブタノール、シトラマル酸塩、ブタジエン、及びポリ乳酸（ＰＬＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第２のバイオリアクターから生じた流出ガス流を採取することと、これを基質として使用するために前記第１のバイオリアクターに渡すことと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

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