KR102157256B1 - 미생물 발효에서 대사산물 생산 조절 시스템 및 방법 - Google Patents

미생물 발효에서 대사산물 생산 조절 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

혐기성 미생물 발효 배양체의 대사 프로파일을 제어하는 방법이 제공된다. 특히, 발효 공정의 대사 프로파일은 배양체에 제공되는 CO2 용존량을 조절함으로써 제어된다. 또한 반응기의 테일 가스 CO2를 제2반응기로 공급하거나, 또는 테일 가스 CO2를 동일한 반응기로 재순환시킴으로써 가스성 기질의 미생물 발효에 의해 하나 이상의 생성물을 생산하는 방법이 제공된다.

Description

미생물 발효에서 대사산물 생산 조절 시스템 및 방법{A SYSTEM AND METHOD FOR CONTROLLING METABOLITE PRODUCTION IN A MICROBIAL FERMENTATION}
본 발명은 포괄적으로 미생물 발효에 의한 하나 이상의 생성물 생산 조절 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 미생물 배양체에 제공되는 이산화탄소량을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시태양들에서, 발효 공정의 대사 프로파일은 배양체에 제공되는 CO2 용해량에 의해 조절된다.
에탄올은 전세계에서 빠르게 주요한 수소- 농후(hydrogen-rich) 액체 수송 연료가 되고 있다. 2002년에 에탄올의 전세계 소비는 108억 갤런으로 추산되었다. 유럽, 일본, 미국 및 일부 개발 도상국가들에서 에탄올에 대한 관심의 증가로 인하여, 연료 에탄올 산업에 대한 세계 시장도 미래에 급격하게 증가할 것으로 예상된다.
예를 들면, 미국에서, 에탄올은 E10, 휘발유 중 에탄올의 10% 혼합물을 제조하는데 이용된다. E10 블렌드에서, 에탄올 성분은 산화제로서 작용하는데, 이는 연소 효율을 개선시키고 공기 오염물질의 생성을 감소시킨다. 브라질에서는, 에탄올은 휘발유 중에 혼합된 산화제로서, 또는 그 자체 순수 연료로서 모두 수송 연료 수요의 대략 30%를 충족시킨다. 또한, 유럽에서는, 온실 가스(GHG) 방출의 결과를 둘러싼 환경적 관심은 유럽 연합(EU)이 회원국들에게 바이오매스 유래 에탄올과 같은 지속 가능한 수송 연료의 소비에 대한 의무적인 목표를 설정하도록 유도해오고 있다.
연료 에탄올의 대부분은, 주요 탄소원으로서, 사탕수수로부터 추출된 수크로오스 또는 곡물 작물로부터 추출된 전분과 같은 작물 유래 탄수화물을 이용하는 전통적인 효모 기초 발효 공정을 통해 제조된다. 그러나, 이들 탄수화물 공급 원료의 비용은 인간 식품 또는 동물 사료로서 그 가치에 의하여 영향을 받기 하지만, 에탄올 제조를 위한 전분 또는 수크로오스-생산 작물의 경작은 모든 지형에 있어서 경제적으로 지속 가능하지 않다. 그러므로, 더 저렴하고/하거나 더 풍부한 탄소 자원을 연료 에탄올로 전환시키는 기술을 개발하는 것이 관심의 대상이 된다.
CO는 석탄 또는 오일 및 오일 유래 생성물과 같은 유기물의 불완전 연소의 주요한 자유 에너지 농후 부산물이다. 예를 들면, 호주 철강 산업은 매년 CO를 500,000 톤 넘게 생산하여 대기 중으로 방출하는 것으로 보고되고 있다.
촉매 공정은 주로 CO 및/또는 CO 및 수소(H2)로 이루어진 가스를 다양한 연료 및 화학물질로 전환시키는데 이용될 수 있는 것으로 오랫동안 인식되어 오고 있다. 그러나, 미생물도 이러한 가스를 연료 및 화학물질로 전환시키는데 이용될 수 있다. 이러한 생물학적 공정은 일반적으로 화학적 반응보다 느리지만, 더 높은 특이성, 더 높은 수율, 더 낮은 에너지 비용 및 중독에 대한 더 높은 내성을 포함하여, 촉매 공정보다 더 나은 몇 가지 장점을 갖고 있다.
미생물이 CO를 자신의 유일한 탄소원으로서 이용하여 성장하는 성능은 1903년에 최초로 발견되었다. 이는 독립영양 성장의 아세틸 조효소 A(아세틸 CoA) 생화학적 경로(우즈-륭달(Woods-Ljungdahl) 경로 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 CoA 합성효소(CODH/ACS) 경로라고도 알려져 있음)을 이용하는 유기체들의 특성이라는 것이 후에 알려졌다. 일산화탄소영양(carboxydotrophic) 미생물, 광합성 미생물, 메탄 생성 미생물 및 아세트산 생성 미생물을 포함한 혐기성 미생물의 대다수는 CO를 다양한 최종 산물, 즉 CO2, H2, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사시키는 것으로 나타났다. 반면에 유일한 탄소원으로서 CO를 사용하면, 이러한 모든 유기체들은 그러한 최종 생성물들 중 적어도 2종을 생성한다.
클로스트리듐 (Clostridium)속으로부터 유래된 것들과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학적 경로를 통해 CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생성하는 것으로 입증되었다. 예를들면, WO 00/68407호, EP 117309호, 미국 특허 번호 제5,173,429호, 제5,593,886호 및 제6,368,819호, WO 98/00558호 및 WO 02/08438호에는 가스로부터 에탄올을 생성하는 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii)의 다양한 균주가 기재되어 있다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 종(Clostridium autoethanogenum sp) 세균도 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 알려져 있다(Abrini 등, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).
그러나, 가스의 발효를 통해 미생물에 의한 에탄올 생성은 항상 아세테이트 및/또는 아세트산의 공통 생성과 연관되어 있다. 이용 가능한 탄소 중 일부가 에탄올보다는 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 그러한 발효 공정을 이용한 에탄올의 생산 효율은 바람직한 수준에 못 미칠 수 있다. 또한, 아세테이트/아세트산 부산물이 일부 다른 목적을 위해 이용될 수 없으면, 그것은 폐기물 처분 문제를 야기할 수 있다. 아세테이트/아세트산이 미생물에 의하여 메탄으로 전환되므로, 온실 가스 배출에 기여하는 가능성을 갖는다.
발효용으로 이용되는 생물반응기 내에서 세균 또는 미생물을 배양하는데 이용되는 액체 영양 배지의 매개변수들을 조절하는 중요성은 해당 기술 분야에 인식되어 왔다. 2007년 7월 18일에 제출되고 본원에 참고 인용된 뉴질랜드 특허 제556615호는 특히, 그러한 액체 영양 배지의 pH 및 산화환원 전위의 조작을 기재하고 있다. 예를들면, 혐기성 아세트산 생성 세균의 배양에 있어서, 배양체의 산화환원 전위를 낮은 수준 (-400mW 이하)으로 유지하면서, 배양체의 pH를 약 5.7 이상으로 증가시킴으로써, 세균은 발효의 부산물로서 생성된 아세테이트를 더 낮은 pH 조건 하에서보다 훨씬 더 높은 속도로 에탄올로 전환시킨다. 뉴질랜드 특허 제556615호는 세균이 수행하는 주요 역할(즉, 성장, 아세테이트 및 가스성 CO 함유 기질로부터 에탄올 생성 또는 가스 함유 기질로부터 에탄올 생성)에 따라 조건을 최적화하는데 상이한 pH 수준 및 산화환원 전위들이 이용될 수 있다는 것을 또한 인식하고 있다.
미국 특허 제7,078,201호 및 WO 02/98438호는 또한 발효가 수행되는 액체 영양 배지의 조건(예컨대, pH 및 산화환원 전위)을 다양하게 함으로써 에탄올을 생성하는 발효 공정을 개선하는 것을 기재하고 있다.
액체 영양 배지의 pH는 하나 이상의 pH 조절 작용제 또는 완충제를 배지에 첨가함으로써 조절될 수 있다. 예를들면, NaOH와 같은 염기 및 황산과 같은 산은 필요에 따라 pH를 증가시키거나 감소시키는데 이용될 수 있다. 산화환원 전위는 하나 이상의 환원제(예컨대, 메틸 바이올로젠) 또는 산화제를 첨가함으로써 조절될 수 있다. 달리 배지의 pH는 미생물이 가스로 "과도 공급"되도록 과량의 가스성 기질을 발효에 제공함으로써 조정될 수 있다.
부탄올과 같은 다른 알코올을 제조하는데 유사한 공정들이 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 적어도 일부 방식으로 상기 단점들을 극복하는 시스템 및/또는 공정을 제공하거나, 적어도 공중에 유용한 선택을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에서 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 (carboxydotrophic acetogenic) 미생물을 포함하는 발효 배양체의 대사 프로파일을 조절하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기 (bioreactor)에 CO 및 CO2를 포함하는 가스성 (gaseous) 기질을 유동시키는 단계; 및
b. 배양체의 대사가 변경되도록 배양체 중에 용해되는 CO2 양을 조정하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양은 생물반응기로의CO2 유동을 조절함으로써 조정된다. 하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 증가시키면 피루베이트에서 유래되는 하나 이상의 생성물의 생산이 증가되도록 미생물 대사가 변경된다. 하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 감소시키면 피루베이트에서 유래되는 하나 이상의 생성물의 생산이 감소되도록 미생물 대사가 변경된다.
하나의 실시태양에서 피루베이트에서 유래되는 하나 이상의 생성물은 2,3-부탄디올 (2,3-BDO), 락테이트, 숙시네이트, 메틸 에틸 케톤 (MEK), 2-부탄올, 프로판디올, 2-프로판올, 이소프로판올, 아세토인, 이소-부탄올, 시트라말레이트, 부타디엔, 및 폴리락트산 (PLA)으로 이루어진 군에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 농도가 증가되도록 발효는 약 250 내지 약 450 kPag (또는 500 kPag 이상)의 압력에서 진행된다. 소정의 실시태양들에서, 압력은 250 kPag 이상 또는 300 kPag 이상, 또는 350 kPag 이상, 또는 400 kPag 이상, 또는 450 kPag 이상, 또는 500 kPag 이상이다.
대안의 실시태양에서, 피루베이트에서 유래되는 하나 이상의 생성물과 비교하여 아세틸 coA에서 유래되는 하나 이상의 생성물의 생산을 촉진하기 위하여 반응기 압력을 감소 또는 최소화한다. 소정의 실시태양들에서, 생물반응기 압력은 약 대기압 내지 약 200 kPag이거나 200 kPag 이하, 또는 150 kPag 이하, 또는 100 kPag 이하, 또는 50 kPag 이하, 또는 대기압으로 유지된다.
하나의 실시태양에서 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 증가시키기 위하여 CO2 부분압이 증가된다.
하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양은 발효에 제공되는 가스성 기질 중의 CO2 양을 증가시킴으로써 증가된다. 하나의 실시태양에서 생물반응기에 제공되는 기질 중의 CO2 농도는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 18%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%이다. 소정의 실시태양들에서, 생물반응기에 제공되는 기질 중의 CO2 농도는 15% 내지 65%, 또는 약 20% 내지 약 50%, 또는 약 25% 내지 약 45%이다. 가압 발효의 실시태양들에서, 발효에서 요구되는 CO2 양은 감소된다. 약 50 kPag 이상의 압력에서, 기질 스트림에 제공되는CO2 양은 대기압에서 제공될 때보다 실질적으로 적다. 특정 실시태양들에서, 생물반응기에 제공되는 기질 중의 CO2 농도는 약 50 kPag 이상의 압력에서 공급될 때 약 1% 내지 약 50%이다.
본 발명의 제2양태에서 피루베이트에서 유래되는 적어도 하나의 생성물의 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기에 CO 및 CO2를 포함하는 기질을 유동시키는 단계; 및
b. 액체 영양 배지에 제공되는 CO2 용해량이 증가되도록 생물반응기로 유동되는CO2 양을 조정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제3 양태에서 아세틸 Co-A 유래 생성물에 대한 피루베이트 유래 생성물의 비율을 조절하는 방법이 제공되고, 상기 방법은
a. 액체 영양 배지 중의 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기에 CO 및 CO2를 포함하는 기질을 유동시키는 단계; 및
b. 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양 이에 따라 아세틸 CoA 유래 생성물에 대한 피루베이트 유래 생성물의 비율을 조절하도록 생물반응기로의 이산화탄소 유동을 조정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 증가하면 피루베이트 유래 생성물의 생산을 증가시켜 아세틸 CoA 유래 생성물에 대한 피루베이트 유래 생성물의 비율이 증가된다. 하나의 실시태양에서, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 용해량을 감소하면 피루베이트 유래 생성물의 생산을 감소시켜 아세틸 CoA 유래 생성물에 대한 피루베이트 유래 생성물의 비율이 감소된다.
발명의 제4 양태에서 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물을 포함하는 발효 배양체의 대사 프로파일을 조절하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기에 CO 및 CO2를 포함하는 가스성 기질을 유동시키는 단계; 및
b. 생물반응기에서 유출되는 유출 스트림 중 CO2 농도를 감시하는 단계; 및
c. 배양체의 대사가 조절되도록 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 조정하는 단계를 포함한다.
발명의 제5 양태에서 하나 이상의 생성물의 생산을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 하나 이상의 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기에 CO를 포함하는 기질을 제공하는 단계; 및
b. 하나 이상의 액체 생성물 및 CO2를 생산하기 위하여 기질을 발효하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서 하나 이상의 발효 조건들은 배양체에 의한 CO 소비량 및 CO2 생산량이 증가되도록 조정된다. 하나의 실시태양에서 발효 중 물질이동 (mass transfer)을 변경시켜 배양체에 의한 CO 소비량은 증가된다. 하나의 실시태양에서, 생물반응기로의 가스성 기질의 유량을 증가시켜 배양체에 의한 CO 소비량은 증가된다. 하나의 실시태양에서 생물반응기에서 액체 영양 배지의 교반속도를 증가시켜 배양체에 의한 CO 소비량은 증가된다. 하나의 실시태양에서 기포 표면적을 증가시켜 배양체에 의한 CO 소비량은 증가된다.
하나의 실시태양에서, 미생물 배양체에 의한 CO 소비량이 증가되면 생물반응기에서 유출되는 출구 스트림 중의 CO2 양이 증가된다. 하나의 실시태양에서, 출구 스트림 중의 CO2 양은 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%, 또는 적어도 50%이다.
제6 양태에서, 적어도 하나의 미생물 배양체를 포함하는 액체 영양 배지 중의 CO2 용해량을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 발효 브로쓰 (broth)를 형성하기 위하여 CO를 포함하는 공급 가스 스트림 및 액체 영양 배지를 적어도 하나의 생물반응기에 도입하는 단계, 상기 생물반응기는 발효 브로쓰 일부를 생물반응기 최상부 인접 지점에서 생물반응기 바닥 인접 지점으로 순환시키는 하강관 (downcomer)을 더욱 포함하고;
b. 생물반응기 중의CO를 액체 생성물 및 CO2를 포함하는 가스 유출 스트림으로 발효시키는 단계;
c. 가스 유출 스트림의 적어도 일부를 생물반응기 최상부에 인접한 가스 유출 스트림이 소스인 생물반응기의 하강관 또는 제2생물반응기로 통과시키는 단계; 및
d. 가스-액체 혼합물을 형성하고 이에 따라 가스-액체 혼합물에 대한 정수압이 증가하여 가스 유출 스트림의 CO2가 하강관의 바닥부에 있는 액체 영양 배지에 용해되도록 하강관을 따라 가스 유출 스트림 및 액체 영양 배지를 혼합하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에서 제1 생물반응기로부터의 가스 유출 스트림은 제2생물반응기의 하강관을 통과한다. 또 다른 실시태양에서 제1 생물반응기로부터의 가스 유출 스트림은 제1 생물반응기의 하강관으로 재순환된다. 대안으로, 제1 생물반응기로부터의 가스 유출 스트림은 제1 또는 제2생물반응기의 가스 입구를 통과한다. 추가로, 제2반응기로의 공급 스트림은 임의선택적으로 신품 (fresh) 공급 가스 스트림과 혼합되는 제1 반응기의 유출 또는 테일 (tail) 가스 스트림의 일부이다. 추가 생물반응기들은 일렬로 추가될 수 있고 상기된 바와 같이 가스 유출 스트림들은 동일하거나 상이한 생물반응기들을 통과한다.
추가 양태에서 가스성 기질의 미생물 발효에 의한 하나 이상의 생성물을 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 하나 이상의 일산화탄소영양 미생물 배양체를 포함하는 제1 반응기에서, CO를 포함하는 가스성 기질을 수용하는 단계;
b. 하나 이상의 액체 생성물 및 CO2를 포함하는 유출 가스를 생산하기 위하여 CO를 포함하는 가스성 기질을 발효하는 단계;
c. CO2를 포함하는 유출 가스를 제2생물반응기에 공급하는 단계, 상기 제2생물반응기는 액체 영양 배지 중의 하나 이상의 일산화탄소영양 미생물 배양체를 포함하고;
d. 하나 이상의 생성물을 생산하기 위하여 CO2를 포함하는 유출 가스를 발효하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, CO2를 포함하는 유출 가스는 하나 이상의 가스성 기질들과 혼합된 후 제2생물반응기에 공급된다. 하나의 실시태양에서, 미생물 발효에서 기질로서 사용되기 위하여 추가 가스성 기질이 제2생물반응기에 첨가된다.
하나의 실시태양에서 제1 생물반응기 및 제2생물반응기에 제공되는 하나 이상의 미생물은 동일하다. 하나의 실시태양에서 미생물 발효는 적어도 2종의 생성물을 생산한다. 하나의 실시태양에서 두 생성물의 생산 비율은 제1 생물반응기 및 제2생물반응기에서 다르다. 하나의 실시태양에서, 발효는 적어도 하나의 알코올 및 적어도 하나의 부산물을 생산한다. 하나의 실시태양에서 적어도 하나의 부산물에 대한 적어도 하나의 생성물의 비율은 제1 및 제2생물반응기들에서 다르다. 하나의 실시태양에서 생성물은 에탄올이고 부산물은 2,3-부탄디올 (2,3-BDO)이다. 하나의 실시태양에서 2,3-BDO에 대한 에탄올 (EtOH)의 비율은 제2생물반응기에서 더욱 낮다.
하나의 실시태양에서 하나 이상의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium
ragsdalei), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium
carboxidivorans) 및 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서 제2생물반응기에서 유출되는 테일 가스는 기질로 사용되기 위하여 제1 생물반응기로 재순환된다.
본 발명의 추가 양태에서 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물을 포함하는 발효 배양체의 대사 프로파일을 조절하는 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 액체 영양 배지 중의 미생물 배양체를 포함하는 생물반응기에 발효 브로쓰를 제공하기 위하여 CO를 포함하는 가스성 기질을 유동시키는 단계; 및
b. 발효 브로쓰 중 환원형 페레독신 수준을 증가시키기 위하여 페레독신 의존성 일산화탄소 탈수소효소를 통해 CO 산화율을 증가시키는 단계; 를 포함하고,
증가된 수준의 환원형 페레독신은 아세틸 CoA로부터 피루베이트 발효 속도를 증가시킨다.
도 1은 본 발명의 미생물 대사 경로를 도시한 것이다.
도 2는 발효 과정에서 대사산물 농도에 대한 압력 영향을 보이는 그래프이다.
도 3은 2,3-부탄디올 생산에 대한 액체 영양 배지 중에 용해된 CO2의 영향을 보이는 그래프이다.
도 4는 실시예 2미생물 배양체의 CO 이용을 보이는 그래프이다.
도 5는 실시예 3A에서 대사산물 농도에 대한 입구 스트림 중 CO2 농도 영향을 보이는 그래프이다.
도 6은 실시예 3A에서 미생물 배양체에 의한 CO, CO2 및 H2 흡수를 보이는 그래프이다.
도 7은 실시예 3B에서 시간 경과에 따른 대사산물의 농도를 보이는 그래프이다.
도 8은 실시예 3B에서 가스 조성을 보이는 그래프이다.
도 9는 실시예 3C에서 미생물 배양체에 의한 입구 가스 스트림의 다양한 성분들의 흡수를 보이는 그래프이다.
도 10은 실시예 3C에서 대사산물 농도에 대한 입구 가스 스트림 중 CO2 의 점증적 증가 영향을 보이는 그래프이다.
도 11은 실시예 3D에 따라 입구 스트림 중의 CO2 농도가 순환할 때 대사산물 농도를 보이는 그래프이다.
도 12는 실시예 3D에서 미생물 배양체에 의한 입구 가스 스트림의 다양한 성분들의 흡수를 보이는 그래프이다.
도 13은 실시예 3E에서 대사산물 농도를 보이는 그래프이다.
도 14는 실시예 3E에서 미생물 배양체에 의한 입구 가스 스트림의 다양한 성분들의 흡수를 보이는 그래프이다.
도 15는 실시예 4에서 대사산물 농도를 보이는 그래프이다.
도 16은 계산된 용해 CO2 대 2,3 부탄디올 생산율을 보이는 플롯이다.
도 17은 본 발명의 하나의 실시태양에 의한 시스템을 도시한 것이다.
도 18은 실시예 4에서 미생물 배양체에 의한 입구 가스 스트림의 다양한 성분들의 흡수를 보이는 그래프이다.
본 발명자들은 하나 이상의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물 배양체에 의해 생산되는 대사산물을 제어하는 방법 및 시스템을 발견하였다. 특히 본 발명자들은 발효 공정에서 피루베이트에서 유래되는 하나 이상의 생성물의 생산을 증가시키는 방법을 찾았다.
이하에는, 본 발명의 상세한 설명을 제공하는데, 여기에는 일반적인 용어로 다양한 실시태양들이 제공된다. 본 발명은 아래의 "실시예"라는 제목 아래 제공된 설명에서 더욱 예시되는데, 이는 본 발명을 뒷받침하는 실험적 데이터와, 본 발명의 양태들의 구체적인 실시예와, 본 발명을 실시하는 예시적인 수단을 제공한다.
정의
본 발명에 사용된 "부탄디올"이라는 용어는 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올 및 2,3-부탄디올을 비롯한 디올의 모든 구조 이성질체와 부분 입체 이성질체를 모두 가리킨다. "2,3-부탄디올"이라는 용어는 일부 부분 입체 이성질체적으로 순수하고 및/또는 실질적으로 부분 입체 이성질체적으로 순수한 형태인 (R,R), (S,S) 및 메조 폼 라세미를 비롯한 이 화합물의 모든 거울상 이성질체 및 부분 입체 이성질체 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"생물 반응기"라는 용어는 1개 이상의 용기 및/또는 타워 또는 파이프 배열로 이루어지는 발효 장치를 말하며, 여기에는 연속 교반 탱크 반응기 [Continuous Stirred Tank Reactor (CSTR)], 고정화 셀 반응기 [Immobilized Cell Reactor (ICR)], 트리클 베드 반응기 [Trickle Bed Reactor (TBR)], 기포 컬럼 (Bubble Column), 가스 리프트 발효기 (Gas Lift Fermenter), 고정식 혼합기 (Static Mixer), 또는 기체-액체 접촉에 적합한 기타의 용기 또는 기타 장치가 있다. 후술하는 바와 같이, 일부 실시 상태에 있어서, 생물 반응기는 제1 성장용 반응기와, 제2발효용 반응기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 생물 반응기 또는 발효 반응기에 일산화탄소를 포함하는 기질 등의 기질을 첨가하는 것을 말할 때에는, 이는 적당한 이들 반응기 중 어느 하나, 또는 두 가지 반응기에 첨가하는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"일산화탄소를 포함하는 기질"이라는 용어는 예컨대, 성장 및/또는 발효를 위하여 일산화탄소가 1종 이상의 세균 균주에 사용될 수 있는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"일산화탄소를 포함하는 가스상 기질"로는 일산화탄소 일정량을 함유하는 임의의 기체가 포함된다. 가스상 기질은 약 15 부피% 내지 약 95 부피% 등의 높은 비율의 CO를 함유한다.
"CO2를 포함하는 기질"은 일정량의 이산화탄소 함유하는 임의의 기질 스트림을 포함한다. 그러나, 가스상 기질은 다른 형태일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 예를들면, CO2를 함유한 가스상 기질은 액체에 용해되어 제공될 수 있다. 실질적으로, 이산화탄소를 함유하는 기체로 액체를 포화시키고, 이에 이어 이 액체를 생물 반응기에 첨가할 수 있다. 이는 표준 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 미세 기포 분산 생성기 (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October, 2002)를 사용할 수 있다. 추가 예시로, CO2 및 H2를 함유한 가스상 기질이 고체 지지체에 흡착될 수 있다.
"효율을 증가시키다", "증가된 효율" 등의 용어들은 발효 공정과 관련하여 사용될 경우, 비제한적인 예로서 다음 중 하나 이상, 즉, 발효를 촉매하는 미생물의 성장 속도, 및/또는 부탄디올 농도 상승의 생성물 생산율, 소비된 기질당 생산된 소망 생성물 부피, 소망 생성물의 생산율 및 생산 수준, 및 다른 발효 부산물과 비교하여 생산된 소망 생성물의 상대 비율의 증가를 포함한다.
용어들 “생산성” 또는 “생산율”은 생성물의 부피 생산성이다. 연속 시스템에서 부피 생산성은 정상 상태 생성물 농도 및 액체 체류시간 간의 비율로 계산된다. 회분 시스템에서 부피 생산성은 농도 및 회분 시스템에서 상기 농도 생성에 요구된 시간으로 계산된다. 부피 생산성은 g/L/day으로 보고된다.
별도로 언급하지 않은 한, 본 발명에 사용된 "발효시키는", "발효 공정", 또는 "발효 반응" 등의 용어는 공정에 의한 성장기 및/또는 생성물의 생합성기를 모두 포함시키고자 하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 “피루베이트에서 유래되는 생성물” 또는 유사 용어들은 피루베이트 전구체를 가지는 발효 생성물을 포괄 의도이다. 이들 생성물은, 제한되지는 않지만, 2,3-부탄디올, 락테이트, 숙시네이트, 메틸 에틸 케톤 (MEK), 2-부탄올, 프로판디올, 2-프로판올, 이소프로판올, 아세토인, 이소-부탄올, 시트라말레이트, 부타디엔, 및 폴리락트산을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “아세틸 CoA 유래 생성물”, “아세틸 coA에서 유래되는 생성물” 또는 유사 용어들은 아세틸 CoA 전구체를 가지는 발효 생성물을 포괄할 의도이다. 이들 생성물은 제한되지는 않지만 에탄올, 아세트산, 아세톤, 부탄올, 3-히드록시부티레이트 및 이소부틸렌, 3-히드록시 프로피오네이트 (3HP) 및 지방산을 포함한다.
미생물 배양체가 스트레스 징후들을 보일 때 발효 공정에서2,3-부탄디올 생산은 증가한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 미생물 배양체에 의한 락테이트 생성, 미생물 배양체pH 증가, 및 미생물 배양체의 바이오매스 농도 감소를 포함한 2,3-부탄디올 양을 증가시키는 여러 스트레스 지표들을 확인하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 미생물 배양체에 의한2,3-부탄디올 생산은 스트레스 지표가 아니고, 2,3-부탄디올 생산성을 증가시키는 건강하고 안정적인 미생물 배양체를 제공하는 것이 가능하다는 것을 보였다.
이미 2,3-부탄디올 생산성 증가는 미생물 배양체에 의한 수소 소비율에 의해 영향을 받는다고 알려졌다 (WO2012131627).
발효에 대한Co 2 영향
본 발명자들은 미생물 배양체에 제공되는CO2 양을 변경시키면, 미생물의 대사 경로가 영향을 받는다는 것을 보였다. 미생물 배양체에 제공되는CO2 양을 변경시킴으로써, 배양체의 대사를 조작할 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 미생물 배양체에 이산화탄소량이 증가하면 피루베이트 유래 생성물 생산은 증가한다는 것을 알았다. 이에 상응하여 미생물 배양체 중에 용해되는 CO2 양이 감소되면 아세틸 coA에서 유래되는 생성물 생산이 증가되고, 피루베이트 유래 생성물 생산은 감소된다는 것을 알았다.
발효 조건들에서 일산화탄소영양 배양체에 CO 및 임의선택적으로 수소를 포함하는 기질을 제공하면 알코올 및 산이 생산된다는 것이 이미 밝혀졌다. 또한 에탄올은, 2,3-부탄디올 및 아세트산을 포함하는 추가 부산물과 함께 생산된다는 것이 이미 밝혀졌다.
이제 본 발명자들은 미생물 배양체에 이산화탄소를 추가로 공급하면, 대사 경로에서 피루베이트 대사가 조절된다는 것을 알았다. 상기 대사 경로는 도 1 및 이하 더욱 상세히 보여진다.
Figure 112015090154661-pct00001
일산화탄소영양 아세트산 생성균 (acetogen)은 우즈-륭달 경로를 이용하여 탄소를, 생성물 예컨대 아세테이트 및 에탄올 및 지방산 생합성의 전구체로 기능하는 아세틸-CoA에 고정시킨다 (Drake, Kusel, Matthies, Wood, ＆ Ljungdahl, 2006; Wood, 1991). 아세틸-CoA 외에도, 세포 내 다른 핵심 중간체는 피루베이트 (피루브산)이고 생성물 예컨대 2,3-부탄디올, 락트산, 또는 숙신산, 및 아미노산, 비타민, 또는 성장 및 바이오매스 형성에 요구되는 핵산의 전구체로 기능한다. 아세틸-CoA는 때로 피루베이트 합성효소 (EC 1.2.7.1)라고도 칭하는 피루베이트: 페레독신 산화환원효소 (PFOR)에 의해 촉매되는 단일, 가역적 효소 단계에서 피루베이트로 전환되거나 또는 역이 성립한다. PFOR 반응은 다음 반응 1을 따르는 것으로 보인다:
(1) 아세틸-CoA + CO2 + 환원형 페레독신 + 2H+ <-> 피루베이트 + 산화형 페레독신
△GO' = -4.6 kcal/mol (19.2kJ/mol) (Thauer, Jungermann, Decker, ＆ Pi, 1977)
독립영양적으로 성장하는 일산화탄소영양 아세트산 생성균에서 생성된 모든 피루베이트는 먼저 아세틸-CoA를 거쳐야 한다. 아세틸-CoA는 C2화합물이고 피루베이트는 C3 화합물이므로, CO2 분자가 통합될 필요가 있다 (반응 1). 이러한 반응을 위한 에너지는 환원형 페레독신에 의해 제공된다 (E0’ = -398 mV).
피루베이트 형성율을 증가시키는 전략은 본 반응에서 추출물 또는 반응물 수준을 높이는 것이다 (동적 평형). 예를들면, 공급 가스 중CO2 수준을 높이면 아세틸-CoA로부터의 피루베이트 형성율이 증가되고, 반응이 피루베이트 형성 방향으로 거의 비가역적인 지점까지 역반응은 감소한다. 유사하게, 예를들면, 페레독신-의존성 일산화탄소 탈수소효소를 통한 CO 산화율 증가로 환원형 페레독신 수준은 증가된다.
피루베이트 (피루브산)는 pK가 2.5로 매우 낮은 산이므로 고농도에서 ATP 형성에 필수적인 막 횡단 양성자 구배를 파괴함으로써 세균에 위협적일 수 있다 (Kopke ＆ Durre, 2011). 세균을 위한 소모자 (sink)는 2,3-부탄디올을 생산하는 것이고 이는 피루브산을 중화시켜 세포를 생존시킨다. 따라서 공급 가스 중 CO2 수준 증가로 피루베이트 형성율 증가를 통해 간접적으로2,3-부탄디올 형성을 증가시킨다. 피루베이트에서2,3-부탄디올 생성 반응은 반응 2와 같다:
(2) 2피루베이트 <-> 아세토인 + 2CO2
아세토인 + NAD(P)H + H+ <-> 2,3-부탄디올 + NAD(P)+
락트산 및 숙신산은 또 다른 소모자인 피루베이트-유래 생성물이고 훨씬 약한 산 (각각 pKa 4.2및 5.6)이지만, 고농도에서는 세균에 또한 위협적이다. 한편, 이들 생산을 제한하면 피루베이트 풀 (pool)이 증가되고 2,3-부탄디올 생산 증가로 이어진다.
본 발명자들은 반응기 중의 CO2 농도 증가 및/또는 반응기 중의 CO 농도 또는 환원형 페레독신 수준을 증가시키는 CODH에 의한 CO 산화율 증가로, 아세틸-CoA에 비하여 피루베이트 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 보였다.
특히, 본 발명자들은 피루베이트 유래 생성물, 예를들면, 2,3-부탄디올에 대한 아세틸-CoA 유래 생성물, 예를들면, 에탄올의 비율은, 반응기의 액체 배지 중에 용해되는 CO2 농도를 증가시킴으로써 증가된다는 것을 보였다. 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양은 발효에 제공되는 가스성 기질 중의 CO2 양을 증가시킴으로써 증가된다. 하나의 실시태양에서 생물반응기에 제공되는 기질 중의 CO2 농도는 적어도 10%, 또는 적어도 15%, 또는 적어도 18%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 25%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 35%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 45%이다. 소정의 실시태양들에서, 생물반응기에 제공되는 기질 중의 CO2 농도는 15% 내지 65%, 또는 약 20% 내지 약 50%, 또는 약 25% 내지 약 45%이다.
배양체에 제공되는 낮은 CO2 용해 농도 (예를들면, 입구 가스 스트림 중0 내지 10% CO2)는 에탄올 대 2,3-부탄디올 비율을 약 30:1 내지 약 20:1로 생성하지만, 본 발명자들은 배양체에 제공되는 증가된 CO2 농도 (예를들면 입구 가스 스트림 중10-65% CO2)는 에탄올 대 2,3-부탄디올 비율을 약 20:1 내지 1:1, 바람직하게는 10:1 내지 1:1로 생성한다는 것을 보였다.
낮은 피루베이트 유래 생성물 생산이 요망되면, 낮은 CO2 용해 농도를 목표로 한다. 본 방법은 또한 아세틸-CoA 유래 생성물 생산을 증가시키기 위하여 적용될 수 있다. 예를들면, 입구 가스 스트림 중 0-10% CO2인 가스 입구 스트림은 높은 에탄올 대 2,3-부탄디올 비율로 이어진다.
또한, 배양체에 의한 CO 소비량이 증가되면 CO2 생산량이 증가되고, 이는 피루베이트 유래 생성물 생산 증가로 이어진다는 것을 알았다. 발효에서 물질 이동 변경, 생물반응기로의 가스성 기질 유량 증가 및/또는 생물반응기에서 액체 영양 배지 교반속도 증가로 배양체에 의한 CO 소비량은 증가된다. 배양체에 의한 또한 기포 표면적 증가로 CO 소비량은 증가된다. 전형적으로, 가스성 기질을 미세 기포들로 도입함으로써 높은 물질 이동이 달성된다. 당업자들은 가스성 기질 도입 수단, 예컨대 스파저를 이해할 것이다.
용해 CO 2 및 압력
본 발명자들은 발효 대사 프로파일을 조절하기 위하여 미생물 배양체에 제공되는 CO2 용해량을 조절 및 조정하는 다수의 방법들을 확인하였다. 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 조정하는 하나의 방법은 시스템에 대한 압력 조정을 포함한다.
본 발명자들은 생물반응기에서 압력 증가는 발효 배지에서 CO2 용해량 증가로 이어진다는 것을 보였다. 피루베이트-유래 생성물 생산을 증가시키기 위하여, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 농도가 증가되도록 발효는 약 250 내지 약 450 kPag (또는 500 kPag 이상)의 압력에서 수행되어야 한다. 소정의 실시태양들에서, 압력은 250 kPag 이상 또는 300 kPag 이상 또는 350 kPag 이상 또는 400 kPag 이상, 또는 450 kPag 이상 또는 500 kPag 이상이다.
CO2가 50 kPag 이상의 압력으로 반응기에 제공되는 경우, 더욱 높은 수준의 피루베이트 유래 생성물을 생산하기 위하여 기질에서 더욱 낮은 농도의 CO2가 필요하다. 배양체는 CO 이용을 통해 CO2를 생산하므로, 압력이 실질적으로 높은 경우 최소 CO2 농도를 가지는 입구 가스 스트림이 반응기에 공급된다. 소정의 실시태양들에서 50 kPag 이상의 압력으로 반응기에 제공되는CO2 양은, 10% 이하, 또는 5 % 이하, 또는 1% 이하이다. 소정의 실시태양들에서50 kPag 이상의 압력에서 반응기에는 실질적으로 CO2가 제공되지 않는다. 바람직하게는, 50 kPag 이상의 압력으로 제공되는 입구 가스 스트림에서 CO2 농도는 약 0% 내지 50%이다.
본 발명자들은 2,3-부탄디올 생산은, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 변화시키는 발효기 중 CO2 부분압에 의해 영향을 받는다는 것을 보였다. 가스 스트림에서 더 높은 CO2 부분압은 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 증가시킨다. 바람직한 실시태양들에서, CO2는 반응기에 약 50 kPag 내지 약 500 kPag의 부분압으로 공급된다.
또한, 본 발명자들은 반응기에 공급되는CO2 양을 점차 증가시킴으로써 CO2 용해량을 점차적으로 증가할 수 있다는 것을 보였다.
일부 가스성 스트림 중의 CO2 양은 액체 영양 배지에서 충분한 CO2 용해량이 되기에는 충분하지 않을 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 생물반응기 출구로부터 테일 또는 유출 가스를 생물반응기 입구로 재순환함으로써 CO2 양을 증가시키는 방법 및 시스템을 제공한다. CO 부분압 및 총 압력과 무관하게 CO2 부분압, 따라서 용해 CO2를 변경시키기 위하여, 유출 가스/테일 가스는 동일한 반응기로 재순환된다. 반응기 내에서 발효 공정은 높은 CO 및 H2 전환을 보이고, 따라서 테일 가스는 주로 CO2 및 임의의 불활성 가스 종들로 이루어진다. 따라서, CO 부분압 및 총 압력에 무관하게 테일 가스 재순환으로 CO2 부분압은 조절될 수 있다.
2개의 반응기 시스템을 사용함으로써 제1 생물반응기에서 유출되는 CO2를 포함하는 유출 가스는 제2생물반응기를 통과한다. CO2를 포함하는 유출 가스를 반응기 용기보다 제2생물반응기의 하강관에 공급함으로써, 반응기에서 CO2 부분압이 증가된다. CO2-액체 혼합물이 하강관을 따라 이동되면, 정수두 (hydrostatic head)가 증가되어, 따라서 용액 중에 용해되는 CO2 양이 증가된다.
테일 가스를 제1 반응기에서 제2또는 수용 반응기에 재순환하기 위하여, 제1 반응기의 헤드스페이스 (headspace) 압력은 라인 손실 및 스파저 압력 강하를 극복하기 위하여 수용 반응기의 하강관에서의 압력보다 약간 더 높아야 한다. 자체 헤드스페이스로부터 "테일 가스”를 순환하기 위하여, 테일 가스는 가스 입구 또는 하강관으로 재순환되고, 하강관 테일 가스를 포집할 수 있는 이덕터 (eductor)가 필요할 수 있다 (테일 가스를 동반하도록 하강관에서 액체 유동을 이용). 하강관으로 재순환되는CO2 액체 영양 배지에 용해된 CO2가 램핑 (ramping) 과정에서 최적화되도록 조절되어야 한다. 도 17은 하강관에 CO2-농후 기질이 제공되는 순환 루프 반응기를 나타내고, (1)은 상승관 (riser); (2)는 하강관; (3)은 공급 가스; (4)는 테일 /유출 가스; (5)는 별도 반응기 또는 동일한 반응기의 테일 가스로부터 CO2-농후 가스가 하강관에 진입하는 지점; 및 (6)은 상승관 및 하강관을 통해 가스/액체 혼합물을 순환시키는 루프 펌프이다.
생물반응기
발효는 연속 교반 탱크 반응기, 고정화 세포 반응기, 가스-리프트 반응기, 기포 컬럼 반응기(BCR), 중공 섬유막 생물반응기(HFMBR: hollow fibre membrane bioreactor)와 같은 막 반응기 또는 트리클 베드 반응기 등과 같은 임의의 적당한 생물반응기에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 일부 실시태양들에 있어서, 생물반응기는 미생물이 배양되는 제1 성장 반응기, 및 성장 반응기로부터 발효 브로쓰가 공급될 수 있고 대부분의 발효 생성물(예컨대, 에탄올 및 아세테이트)이 생성될 수 있는 제2발효 반응기를 포함할 수 있다. 본 발명의 생물반응기는 CO 및/또는 H2 함유 기질을 수용하도록 개조된다.
발효 기질
본 발명의 방법에서 일산화탄소 및 수소 또는 이산화탄소 중 적어도 하나를 포함하는 기질이 발효 반응에 사용되어 하나 이상의 생성물을 생산한다. 바람직하게는 기질은 가스성 기질이다. 가스상 기질은 산업 공정의 부산물로서 얻어진 폐기물이거나, 또는 엔진 연소 (예컨대, 자동차) 배기 가스 등의 다른 공급원으로부터의 폐기물일 수 있다. 소정의 실시태양들에서, 산업 공정은 제강공정 등의 철 금속 생성물 제조, 비철 생성물 제조, 석유 제련 공정, 석탄의 기체화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조 및 코크 제조로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 실시태양들에 있어서, 가스성 기질은 대기로 방출되기 전에 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포집할 수 있다. 가스상 기질의 조성에 따라서, 이는 발효에 도입하기 전에 먼지 입자 등의 임의의 바람직하지 않은 불순물을 제거하기 위하여 전처리 하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 가스상 기질을 공지의 방법으로 여과 또는 스크러빙 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양들에서, 가스상 기질은 바이오매스의 기체화로부터 유래할 수도 있다. 기체화 공정은 공기 또는 산소의 제한된 공급량 하에서 바이오매스를 불완전 산화시키는 것을 포함한다. 생성된 기체는 보통 주로 CO와 H2를 함유하고, 미량의 CO2, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 함유한다. 예컨대, 사탕 수수로부터 설탕, 또는 옥수수 또는 곡물로부터 녹말 등의 음식물의 추출 및 가공 중에 얻는 바이오매스 부산물, 또는 임산에 의하여 생성된 음식물이 아닌 바이오매스를 기체화하여, 본 발명에 사용하기에 적합한 CO를 함유하는 기체를 생성하는 것이 가능하다.
CO를 함유하는 기질은 적어도 약 15 내지 약 100 부피%, 40 내지 95 부피%, 40 내지 60 부피%, 45 내지 55 부피%의 CO 등과 같이, CO를 높은 비율로 함유한다. 특정 실시태양들에서, 이 기질은 약 25 부피%, 또는 약 30 부피%, 약 35 부피%, 또는 약 40 부피%, 또는 약 45 부피%, 또는 약 50 부피%, 또는 약 55 부피%, 또는 약 60% 부피%의 CO를 포함한다. H2와 CO2가 모두 존재하는 경우, 더 낮은 농도, 가령, 6%의 CO를 함유하는 기질도 적합할 수 있다.
전형적으로, 일산화탄소는 기체 상태로 발효 반응에 첨가된다. 그러나, 본 발명은 이러한 상태로 기질을 첨가하는 것으로 한정되는 것으로 간주되어서는 아니된다. 예컨대, 일산화탄소는 액체 상태로 제공될 수도 있다. 예를 들어, 일산화탄소를 함유하는 기체로 액체를 포화시키고, 이에 이어 이 액체를 생물 반응기에 첨가할 수 있다. 이는 표준 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기된 바와 같이 미세 기포 분산 생성기를 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서 이산화탄소는 기체 상태로 발효에 첨가된다. 대안의 실시태양에서, 이산화탄소는 탄산염 또는 탄산수소염으로 제공된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 2이상의 상이한 기질들의 조합이 발효 반응에서 사용될 수 있다.
또한, 기질 스트림 중 CO 농도 (또는 가스성 기질에서 CO 부분압)을 증가 이에 따라 CO가 기질인 발효 반응 효율을 증가시키는 것이 때로는 바람직하다. 가스성 기질에서 CO 부분압을 증가시키면 발효 배지로의 CO 물질 이동이 증가된다. 발효 반응에 공급되는 가스 스트림 조성은 반응 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 줄 수 있다. 예를들면, O2는 혐기성 발효 공정 효율을 낮출 수 있다. 발효 전후에 발효 공정 단계들에서 원하지 않거나 불필요한 가스 처리는 이러한 단계들에서 부담을 증가시킨다 (예를들면 생물반응기에 도입되기 전에 가스 스트림이 압축되는 경우, 발효에 필요하지 않은 가스들을 압축하기 위하여 불필요한 에너지가 사용된다). 따라서, 원하지 않는 성분들을 제거하고 원하는 성분들의 농도를 높이기 위하여 기질 스트림, 특히 산업적 공급원에서 유래되는 기질 스트림을 처리하는 것이 바람직하다.
소정의 실시태양들에서, CO 함유 기질에서 수소는 거의 또는 전혀 제공되지 않는다.
스트림들의 혼합
발효 반응의 효율, 알코올 제조 및/또는 전체 탄소 포획을 개선시키기 위해서는, CO 및 H2를 포함하는 개질된 기질 스트림을 하나 이상의 추가적인 스트림과 혼합하는 것이 바람직할 수 있다. 이론에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 일부 실시태양들에 있어서, 일산화탄소영양 세균은 하기 식에 따라 CO를 에탄올로 전환시킨다:
6CO + 3H2O→C2H5OH + 4CO2
그러나, H2의 존재 하에, 전체 전환은 하기 식과 같을 수 있다:
6CO + 12H2→3C2H5OH + 3H2O
따라서, 높은 CO 함유량의 스트림은 CO 및 H2를 포함하는 개질된 기질 스트림과 혼합될 수 있어 CO:H2 비율을 증가시킴으로써 발효 효율을 최적화시키게 된다. 예를 들면, 제강소로부터의 오프-가스와 같은 산업 폐기물 스트림은 높은 CO 함유량을 가지지만, H2를 최소한으로 포함하거나 전혀 포함하지 않는다. 이와 같이, 혼합된 기질 스트림을 발효기에 제공하기 전에, CO 및 H2를 포함하는 하나 이상의 스트림을, CO를 포함하는 폐기물 스트림과 혼합하는 것이 바람직할 수 있다. 발효의 전체 효율, 알코올 제조 및/또는 전체 탄소 포획은 혼합된 스트림 중의 CO 및 H2의 화학양론에 좌우될 것이다. 그러나, 특정한 실시태양들에 있어서, 혼합된 스트림은 CO 및 H2를 다음과 같은 몰비로 실질적으로 포함할 수 있다: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 또는 1:2.
또한, 발효의 상이한 스테이지들에서 CO 및 H2를 특정한 비율로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를들면, (1:2CO:H2와 같은) 상대적으로 높은 H2 함유량을 갖는 기질 스트림은 개시(start up)기 및/또는 급속한 미생물 성장기(growth phase) 동안에 발효 스테이지에 제공될 수 있다. 그러나, 배양체가 실질적으로 정상 상태의 미생물 밀도로 유지되도록 성장 상이 지연되는 경우, 상기 CO 함유량은 증가될 수 있다(예컨대, 적어도 1:1 또는 2:1 이상으로, 여기서 H2 농도가 0 이상일 수 있다).
스트림들의 혼합은 또한, 특히 CO 함유 폐기물 스트림이 성질상 간헐적인 경우, 추가적인 장점들을 가질 수 있다. 예를 들면, CO를 함유하는 간헐적인 폐기물 스트림이 CO 및 H2를 포함하는 실질적으로 연속적인 개질된 기질 스트림과 혼합되어 발효기에 제공될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시태양들에 있어서, 상기 실질적으로 연속적인 혼합된 스트림의 조성 및 유량은 발효기에 실질적으로 연속적인 조성 및 유량의 기질 스트림의 제공을 유지하기 위하여 간헐적인 스트림에 따라 변할 수 있다.
배지
하나 이상의 미생물 성장 및 기질에서 에탄올 및/또는 아세테이트로의 발효가 일어나도록 하기 위하여, 기질 외에도, 적당한 영양 배지가 생물반응기에 공급될 필요가 있다는 것을 이해하여야 한다. 영양 배지는 사용된 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 무기질 등의 성분을 함유할 것이다. 클로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum)의 성장에 적합한 혐기성 배지는 이 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대, 문헌 [Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide; Arch. Microbiol., 161: 345-351 (1994))] 에 기재된 것이 있다. 이하에 제공되는 "실시예" 란에서 적당한 배지의 추가의 예시가 제공된다.
발효
가스성 기질로부터 에탄올 및 다른 알코올의 제조 공정은 알려져 있다. 예시적인 공정으로는 예를들면, 본원에 각각 참고 인용되어 있는 WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925, WO2009/064200, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722및 US 5,821,111에 기재된 것들을 포함한다.
발효 조건들
발효는 기질에서 에탄올 및/또는 아세테이트로의 발효가 일어나기에 적절한 조건 하에서 바람직하게 수행되어야 한다. 고려되어야 할 반응 조건은 온도, 배지 유량, pH, 배지 산화환원 전위, (연속 교반 탱크 반응기를 이용하는 경우) 교반 속도, 접종 수준, 기질 수준이 제한적이 되지 않도록 보장하기 위한 최대 가스 기질 농도 및 생물반응기로의 기질 도입 속도, 및 생성물 억제를 회피하는 최대 생성물 농도를 포함한다.
최적 반응 조건은 이용된 특정한 미생물에 부분적으로 의존할 것이다. 그러나, 일반적으로, 발효는 주변 압력보다 더 높은 압력에서 수행되는 것이 바람직하다. 증가된 압력에서의 작동은 기체 상으로부터, 탄화수소 생성물의 제조를 위한 탄소원으로서 CO가 미생물에 의하여 흡수될 수 있는 액체 상으로의 CO 이동의 속도에서의 현저한 증가를 허용한다. 이는 결국 (입력 가스 유량으로 나눈 생물반응기 내의 액체 부피로서 정의된) 체류 시간이 생물반응기를 주변 압력보다 오히려 상승된 압력에서 유지할 경우 감소될 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 주어진 CO-대-탄화수소 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고, 원하는 체류 시간을 달성하는 것은 결국 생물반응기의 필요한 부피에 영향을 주기 때문에, 가압된 시스템을 이용하면 필요한 생물반응기의 부피를 현저히 감소시켜서, 결국에는 발효 장비의 자본 비용을 현저히 감소시킬 수 있다. 미국 특허 번호 제5,593,886호에서 주어진 실시예들에 따라, 반응기 부피는 반응기 작동 압력 증가에 따라 직선 비례하여 감소될 수 있고, 즉, 10 기압의 압력에서 작동되는 생물반응기는 1 기압의 압력에서 작동되는 것의 부피의 10분의 1만을 필요로 한다.
상승된 압력에서 가스-대-생성물 발효를 수행하는 이점이 또한 다른 곳에 기재되어 있다. 예를들면, WO 02/08438에는 30 psig 및 75 psig의 압력 하에 수행된 가스-대-에탄올 발효가 기재되어 있고, 이것은 각각 150g/l/일 및 369 g/l/일의 에탄올 생산성을 부여한다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 입력 가스 조성물을 이용하여 수행된 예시적인 발효는 1일 리터당 10 내지 20 배 미만의 에탄올을 생성하는 것으로 밝혀졌다.
CO를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 적합한 발효 조건의 예는 WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 및 WO2009/064200에 상세히 기재되어 있다. 여기에 보고되어 있는 발효 조건은 본 발명의 방법에 맞게 용이하게 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
미생물
다양한 실시태양들에서, 발효는 일산화탄소영양 세균의 하나 이상의 균주의 배양체를 이용하여 수행된다. 다양한 실시태양들에서, 상기 일산화탄소영양 세균은 모어렐라(Moorella), 클로스트리듐(Clostridium), 루미노코커스(Ruminococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 부티리박테리움(Butyribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 메타노사르시나(Methanosarcina) 및 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum)으로부터 선택된다. 다수의 혐기성 세균이 CO에서 n-부탄올 및 에탄올을 포함하는 알코올 및 아세트산으로의 발효를 수행할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 본 발명의 공정에 이용하기에 적합하다. 본 발명에서 이용에 적합한 그러한 세균의 예로는 WO 00/68407, EP 117309, 미국 특허 번호 제5,173,429호, 제5,593,886호, 및 제6,368,819호, WO 98/00558 및 WO 02/08438에 기재된 것들을 포함하는 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 카르복시디보란스(Liou 등, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), 클로스트리듐 라그스달레이(WO/2008/028055) 및 클로스트리듐 오토에타노게눔(Abrini 등, Archives of Microbiology 161: pp 345-351)의 균주와 같은 클로스트리듐 속의 것들이 포함된다. 다른 적당한 세균으로는 모어렐라 종 HUC22-1를 포함하는 모어렐라 속(Sakai 등, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612)의 것들 및 카르복시도써무스(Carboxydothermus) 속(Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. 등(1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260)의 것들이 포함된다. 추가 예로는 모어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 모어렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica), 루미노코커스 프로덕투스(Ruminococcus productus), 아세토박테리움 우디이, 유박테리움 리모숨, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 옥소박터 페닝기 (Oxobacter pfennigii), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비(Desulfotomaculum kuznetsovii)가 포함된다(Simpa 등, Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. Pp41-65). 또한, 다른 아세트산 생성 염기성 세균은 당업자가 이해하는 바와 같이 본 발명에 적용 가능할 수 있다는 것을 알아야 할 것이다. 또한, 본 발명은 2이상의 세균의 혼합된 배양체에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일 실시태양에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카르복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카토로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 아세토박테리움 우디이, 알칼리바큘룸 박키이, 모어렐라 써모아세티카, 스포로무사 오베이트, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 블라우티아 프로덕타, 유박테리움 리모숨, 써모아내로박터 키우비 종을 포함하는 아세트산 생성 일산화탄소영양 유기체의 군으로부터 선택된다.
이러한 일산화탄소영양 아세트산 생성균은 아세틸-CoA, 아세테이트 및 다른 생성물을 형성하는 혐기성 조건 하에 에너지원으로서 일산화탄소(CO) 및 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H2)를 지닌 이산화탄소(CO2)와 같은 가스성 일-탄소(C1)원을 이용하여 화학독립영양적으로 성장하는 그의 성능에 의하여 정의된다. 그것은 동일한 발효 모드, 우즈-륭달 또는 환원성 아세틸-CoA 경로를 공유하며, 일산화탄소 탈수소효소(CODH), 수소화효소, 포름산 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로폴레이트 합성효소(Formyl-tetrahydrofolate synthetase), 메틸렌-테트라히드로폴레이트 탈수소효소(Methylene-tetrahydrofolate dehydrogenase), 포르밀-테트라히드로폴레이트 시클로히드롤레이즈(Formyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase), 메틸렌-테트라히드로폴레이트 환원효소(Methylene-tetrahydrofolate reductase), 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소(CODH/ACS)(이 조합은 그러한 유형의 세균에 특징적이고 독특한 것임)로 이루어진 효소 세트의 존재에 의하여 정의된다(Drake, Kusel, Matthies, Wood, ＆ Ljungdahl, 2006).
아세트산 생성균에서 그 기질을 바이오매스, 이차 대사산물, 및 생성물이 (아세틸-CoA를 통해 또는 직접적으로) 형성되는 피루베이트로 전환시키는 당-발효 세균의 화학종속영양 성장과는 달리, 그 기질은 생성물, 바이오매스 및 이차 대사산물이 형성되는 아세틸-CoA로 직접적으로 전달된다.
추가 실시태양에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 륭달리 및 "클로스트리듐 라그스달레이" 종 및 관련된 단리균(isolate)을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리디아의 클러스터(cluster)로부터 선택된다.
이들은 균주 C. 오토에타노게눔 JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, ＆ Nyns, 1994), C. 오토에타노게눔 LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. 오토에타노게눔 LBS1561 (DSM23693), C. 륭달리 PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, ＆ Yang, 1993), C. 륭달리 ERI-2(ATCC 55380) (미국특허 5,593,886), C. 륭달리 C-01 (ATCC 55988) (미국특허 6,368,819), C. 륭달리 O-52(ATCC 55989) (미국특허 6,368,819), 또는 “C. 라그스달레이 P11T“ (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), 및 관련된 단리균 예컨대 “C. 코스카티이” (미국특허 2011/0229947), “클로스트리듐 sp. MT351” (Tyurin ＆ Kiriukhin, 2012), “클로스트리듐 sp. MT 653”(Berzin, Kiriukhin, ＆ Tyurin, 2012a), “클로스트리듐 종 MT683” (Berzin, 2012), “클로스트리듐 종 MT962” (Berzin, Kiriukhin, ＆ Tyurin, 2013) “클로스트리듐 종 MT1121” (Berzin, Kiriukhin, ＆ Tyurin, 2012b), “클로스트리듐 종 MT1230” (Kiriukhin ＆ Tyurin, 2013), 또는 “클로스트리듐 종 MT1962” (Berzin, Tyurin, ＆ Kiriukhin, 2013), 및 이의 돌연변이 균주 예컨대 C. 륭달리 OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010) 또는 “클로스트리듐 종 MT896” (Berzin, Kiriukhin, ＆ Tyurin, 2012c)를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
이들 균주는, DNA-DNA 재회합 및 DNA 지문 실험(WO 2008/028055, 미국 특허 번호 제2011/0229947호)에 의하여 측정된 바와 같이 전혀 다른 종이라고 하더라도, 16S rRNA 유전자 수준에서 적어도 99% 동일성을 갖는, 클로스트리디아 rRNA 클러스터 I(Collins 등, 1994) 내에 있는 하위 클러스터(subcluster)를 형성한다.
이러한 클러스터의 균주들은 공통의 특성들에 의하여 유사한 유전자형 및 표현형을 둘 다 갖는 것으로 정의되며, 이들은 모두 동일한 모드의 에너지 보존 및 발효 대사를 공유한다. 이러한 클러스터의 균주들은 시토크롬이 결여되어 있으며, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다.
이러한 클러스터의 모든 균주들은 4.2MBp 정도의 게놈 크기(Koepke 등, 2010) 및 32%몰 정도의 GC 조성(Abrini 등, 1994; Koepke 등, 2010; Tanner 등, 1993), 및 우즈-륭달 경로의 효소(일산화탄소 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 탈수소효소, 포르밀-테트라히드로 시클로히드롤레이즈, 메틸렌-테트라히드로폴레이트 환원효소, 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소), 수소화효소, 포르메이트 탈수소효소, Rnf 복합체(rnfCDGEAB), 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 알데히드:페레독신 산화환원효소를 인코딩하는 보존된 필수적인 핵심 유전자 오페론(Kopke 등, 2010, 2011)을 갖는다. 가스 흡수의 원인이 되는 우즈-륭달 경로 유전자의 조직화 및 개수는 핵 및 아미노산 서열에 있어서 차이가 있음에도 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(Kopke 등, 2011).
그 균주들은 모두 유사한 형상 및 크기(대수 성장 세균은 0.5 내지 0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm)를 가지며, 중온성 (30 내지 37℃의 최적 성장 온도)이고 엄밀하게는 혐기성 세균(Abrini 등, 1994; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055)이다. 또한, 그들은 모두 동일한 pH 범위(pH 4 내지 7.5로서, 5.5 내지 6의 최적의 초기 pH), 유사한 성장 속도에 의한 CO 함유 가스에 대해 강력한 독립영양 성장, 및 특정한 조건 하에 형성된 소량의 2,3-부탄디올 및 젖산을 지닌 주요 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산과의 대사 프로파일과 같은 동일한 대다수의 계통발생적 특질들을 공유한다(Abrini 등, 1994; Kopke 등, 2011; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055). 인돌 생성은 모든 종에서 관찰된다. 그러나, 종들은 다양한 당(예컨대, 람노오스, 아라비노오스), 산(예컨대, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예컨대, 아르기닌, 히스티딘) 또는 다른 기질(예컨대, 베타인, 부탄올)의 기질 이용에서 구별된다. 일부 종들은 특정한 비타민(예컨대, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구체(autotroph)인 것으로 밝혀진 반면에, 다른 종들은 그렇지 않았다. 또한 카르복실산의 해당 알코올로의 환원은 이러한 유기체들의 범위에서 보여졌다 (Perez, Richter, Loftus, ＆ Angenent, 2012). 그러므로, 상기 기재된 특질들은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 륭달리와 같은 하나의 유기체에 특이적이지 않지만, 일산화탄소영양의 에탄올-합성 클로스트리디아에 대하여 일반적인 특질이므로, 성능상 차이점이 있을 수 있음에도, 이들 균주에 걸쳐 작용할 것으로 예상할 수 있다 (Perez 등, 2012).
본 발명에서 사용에 적합한 예시적인 하나의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 일 실시태양에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 독일 생물학적 물질 자원 센터(DSMZ)에 식별 기탁 번호 19630하에 기탁된 클로스트리듐 오토에타노게눔 균주의 식별 특성을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 다른 실시태양들에 있어서, 상기 클로스트리듐 오토에타노게눔은 기탁 번호 DSMZ 10061하에서 DSMZ의 식별 특성을 갖는 클로스트리듐 오토에타노게눔이다. 이들 균주는, 특히 H2 및 CO의 기질 조성에서의 변화에 특별한 내성을 가지며, 그 자체로 스팀 개질 공정과의 조합으로 사용하기에 매우 적합하다.
본 발명에 따라 CO2 및 H2를 포함한 기질에서 아세테이트를 생산하는데 적합한 일 예시적 미생물은 아세토박테리움 우디이이다.
본 발명의 방법에 이용된 세균의 배양은 혐기성 세균을 이용하여 기질을 배양하고 발효하기 위한 해당 기술 분야에 알려진 임의의 수의 공정들을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 발효에 가스성 기질을 이용하는 하기 문헌들에 일반적으로 기재된 이들 공정이 이용될 수 있다:{(i) K. T. Klasson, 등(1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, 등(1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K. T. Klasson, 등(1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, 등(1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, 등(1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, 등. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; 이들 모두는 본원에 참고 인용된다}.
발효 생성물
본 발명의 방법은 다양한 탄화수소 생성물들 중 어느 하나를 생성하는데 이용될 수 있다. 이는 알코올, 산 및/또는 디올을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 부티레이트, 프로피오네이트, 카프로에이트, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 2,3-부탄디올, 이소프로판올, 프로필렌, 부타디엔, 이소-부틸렌 및 에틸렌을 생성하는 발효에 적용 가능할 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 발명은 제한되지는 않지만 프로판올 및 부탄올을 포함한 알코올 생산에 이용된다. 이후 알코올(들)은 아세테이트와 반응하여 프로필 아세테이트 또는 부틸 아세테이트를 포함한 생성물(들)을 생산할 수 있다. 기술자들은 본 발명이 알코올 및 언급된 생성물에 국한되지 않는다는 것을 이해할 것이고, 임의의 적합한 알코올 및 또는 산이 생성물 생산에 사용될 수 있다.
이들 생성물 및 다른 생성물은 플라스틱, 약제 및 농약의 제조와 같은 다수의 다른 공정에 유효할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 발효 생성물은 휘발유 범위 탄화수소(약 8 개 탄소), 디젤 탄화수소(약 12개 탄소) 또는 제트 연료 탄화수소(약 12개 탄소)를 제조하는데 이용된다.
본 발명의 방법은 제한되지는 않지만 이소프로판올을 포함한 다른 생성물의 호기성 발효, 혐기성 또는 호기성 발효들에 더욱 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 제한되지는 않지만 이소프로판올을 포함한 다른 생성물의 호기성 발효, 혐기성 또는 호기성 발효들에 더욱 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 발효에 의하여 생성된 탄화수소 생성물의 적어도 일부가 스팀 개질 공정에서 재사용되는 것을 제공한다. 이는 CH4 이외의 탄화수소가 촉매 위에서 스팀과 반응하여 H2 및 CO를 생성할 수 있기 때문에 수행될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 에탄올은 재순환되어 스팀 개질 공정에 대한 공급원료로서 사용된다. 추가 실시태양에 있어서, 상기 탄화수소 공급원료 및/또는 생성물은 스팀 개질 공정에 사용되기 전에 예비개질기를 통과하게 된다. 예비개질기를 통과하는 것은 수소 생성의 효율을 증가시키고 스팀 개질 퍼니스 (furnace)의 요구되는 용량을 감소시킬 수 있는 스팀 개질 공정의 스팀 개질 단계를 부분적으로 완성하게 된다.
본 발명의 방법은 호기성 발효에도 적용될 수 있고, 국한되지 않지만 이소프로판올을 포함하는 다른 생성물의 혐기성 또는 호기성 발효에도 적용될 수 있다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 에탄올 및/또는 아세테이트로의 발효에 적용될 수 있다. 이들 생성물은 이후 함께 반응되어 에스테르를 포함한 화학 생성물을 생성한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서 발효에 의해 생성된 에탄올 및 아세테이트는 함께 반응되어 에틸 아세테이트를 제조한다. 에틸 아세테이트는 다수의 공정 예컨대 표면 코팅제 포함 용제 및 희석제 생산뿐 아니라 약제 및 향료 및 에센스 제조에 있어서 유용하다.
생성물 회수
발효 반응의 생성물은 알려진 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 예시적인 방법으로는 WO07/117157, WO08/115080, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722및 US 5,821,111에 기재된 것들을 포함한다. 그러나, 간략하게 예를 들면, 에탄올은 분별증류 또는 증발 및 추출성 발효와 같은 방법에 의하여 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
발효 브로쓰로부터 에탄올을 증류하면 에탄올과 물의 공비 혼합물(즉, 95% 에탄올 및 5% 물)이 산출된다. 이어서, 무수 에탄올이 또한, 해당 기술 분야에 주지되어 있는 분자체 에탄올 탈수 기술의 이용을 통하여 얻어질 수 있다.
추출성 발효 절차는 에탄올을 희석 발효 브로쓰로부터 회수하기 위하여 발효 유기체에 낮은 독성 위험성을 제공하는 수-혼합성 용매의 사용을 수반한다. 예를 들면, 올레일 알코올이 이러한 유형의 추출 공정에 이용될 수 있는 용매이다. 올레일 알코올이 발효기에 연속적으로 도입되고, 그 결과 원심 분리기를 통해 연속적으로 추출되고 공급되는 그 용매가 상승하여 발효기의 상단에 층을 형성하게 된다. 이어서, 물과 세포가 그 올레일 알코올로부터 용이하게 분리되어 발효기에 복귀되고, 에탄올이 함유된 용매가 플래쉬 기화 유닛(flash vaporization unit)으로 공급된다. 대부분의 에탄올이 기화되고 응축되는 반면에, 올레일 알코올이 비휘발성이어서 발효에 재사용하기 위해 회수된다.
발효 반응에서 부산물로서 생성될 수 있는 아세테이트도 해당 기술 분야에 알려진 방법을 이용하여 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다.
예를들면, 활성탄 필터를 수반하는 흡착 시스템이 이용될 수 있다. 이 경우, 미생물 세포가 우선 적당한 분리 유닛을 이용하여 발효 브로쓰로부터 제거되는 것이 바람직하다. 생성물 회수를 위한 세포 무함유 발효 브로쓰를 발생시키는 다수의 여과 기반 방법은 해당 기술 분야에 알려져 있다. 이후, 세포 무함유 에탄올- 및 아세테이트-함유 투과물이 활성탄을 함유하는 칼럼을 통과하게 되어 아세테이트를 흡착하게 된다. 염(아세테이트) 형태라기 보다는 산 형태(아세트산)의 아세테이트가 활성탄에 의하여 더 용이하게 흡착된다. 그러므로, 발효 브로쓰의 pH는 발효 브로쓰가 활성탄 칼럼을 통과하기 전에 약 3 미만으로 감소되어 아세테이트의 대부분을 아세트산 형태로 전환시키는 것이 바람직하다.
활성탄에 흡착된 아세트산은 해당 기술 분야에 알려진 방법을 이용한 용리에 의하여 회수될 수 있다. 예를 들면, 에탄올이 결합된 아세테이트를 용리하는데 사용될 수 있다. 특정한 실시태양들에 있어서, 발효 공정 자체에 의하여 생성된 에탄올이 상기 아세테이트를 용리하는데 사용될 수 있다. 에탄올의 비등점이 70.8℃이고, 아세트산의 비등점이 107℃이기 때문에, 에탄올과 아세테이트는 증류와 같은 휘발성 기반 방법을 이용하여 서로 용이하게 분리될 수 있다.
발효 브로쓰로부터 아세테이트를 회수하는 다른 방법도 해당 기술 분야에 알려져 있으며 이용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,368,819호 및 제6,753,170호에는 발효 브로쓰로부터 아세트산을 추출하는데 이용될 수 있는 용매 및 공용매 시스템이 기술되어 있다. 에탄올의 추출성 발효를 위해 기재된 올레일 알코올 기반 시스템의 예에 관하여, 미국 특허 번호 제6,368,819호 및 제6,753,170호에 기재된 시스템은 아세트산 생성물을 추출하기 위하여 발효된 미생물의 존재 또는 부재 하에 발효 브로쓰와 혼합될 수 있는 수-비혼합성 용매/공용매를 설명하고 있다. 이어서, 상기 아세트산 생성물을 함유하는 용매/공용매는 증류에 의하여 브로쓰로부터 분리된다. 이어서, 제2증류 단계가 상기 용매/공용매 시스템으로부터 아세트산을 정제하는데 이용될 수 있다.
발효 반응의 생성물(예를 들면, 에탄올 및 아세테이트)은 발효 생물반응기로부터 브로쓰의 일부를 연속적으로 제거하고, (간편하게는 여과에 의하여) 브로쓰로부터 미생물 세포를 분리하며, 브로쓰로부터 하나 이상의 생성물을 동시적으로 또는 순차적으로 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수될 수 있다. 상기 기재된 방법들을 이용하여, 에탄올의 경우, 에탄올은 증류에 의하여 간편하게 회수될 수 있고, 아세테이트는 활성탄 상에 흡착에 의하여 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀된다. 에탄올 및 아세테이트가 제거된 이후에 잔류하는 세포 무함유 투과물도 바람직하게는 발효 생물반응기로 복귀된다. (비타민 B와 같은) 추가적인 영양분이 상기 세포 무함유 투과물 첨가될 수 있어 상기 투과물이 생물반응기로 복귀되기 전에 영양 배지를 보충하게 된다. 또한, 브로쓰의 pH가 상기 기재된 바와 같이 조절되어 아세트산의 활성탄으로의 흡착을 향상시킨 후, 그 pH는 생물반응기로 복귀되기 전에 발효 생물반응기 내의 브로쓰의 pH와 유사한 pH로 재-조절되어야 한다.
생물반응기로부터 회수된 바이오매스는 소화기 (digestion)에서 혐기성 소화를 수행할 수 있어 바이오매스 생성물, 바람직하게는 메탄을 생성하게 된다. 이 바이오매스 생성물은 스팀 개질 공정을 위한 공급원료로서 사용될 수 있거나 본원에 정의된 반응들 중 하나 이상을 수행하는 보충 열을 생성하는데 이용될 수 있다.
실시예들
본 발명은 하기 실시예들에 의해 더욱 설명될 것이다.
실시예 1: 마이크로어레이 실험
발효
하기와 같이 37°C의1.5L 생물반응기에서 유일한 에너지 및 탄소공급원으로써 CO를 이용하여 C. 오토에타노게눔 DSM23693으로 발효하였다. 배양체 성장에 리터 당: MgCl, CaCl2 (2mM), KCl (25mM), H3PO4 (5mM), Fe (100μM), Ni, Zn (5μM), Mn, B, W, Mo, Se(2μM)를 함유하는 액체 배지를 이용하였다. 배지를 생물반응기에 옮기고 비타민 B 용액으로 보충하고 0.2mM Cr (II) 용액으로 저하시켰다 (reduced). 혐기성을 달성하기 위하여 반응기 용기를 질소로 살포하였다. 접종에 앞서, 가스를 30 % CO 및 70% N2 함유 가스 혼합물로 바꾸고, 연속하여 반응기에 공급하였다. 가스 흐름을 초기에는 100 ml/min로 설정하고 교반속도를 300 rpm으로 설정하였다. Na2S를 생물반응기에 0.3 ml/hr로 투입하였다. 발효 성장기에서50 rpm 간격으로900 rpm까지 교반속도를 높였다. 회분 방식에서0.8 일 후에, 생물반응기를 액체 속도 1.8 ml/min (희석율 1.7 d-1)의 연속 방식으로 전환하였다. 이어 CO 흡수가 4 mol/L/d에 도달되도록 가스 흐름을 조정하였다. 최대 가스 유량은 발효기 부피 당435 ml/L이었다. 정상 상태에 도달한 후 CO2 농도를 0 %에서 25 %로 변경시키면서 실험을 개시하였다. CO 흡수에서의 임의의 변화를 피하기 위하여, CO 유량 및 총 가스 유량을 일정하게 유지하면서 CO2 및 N2 유량을 서로 조정하였다. 이전 공급 방식에 의한 대사산물 95%가 세척되고 새로운 수준에서 적어도 이틀 동안 분석 데이터를 취할 수 있을 정도로 대사산물이 안정화된 후 가스 조성이 변경되었다. 바이오매스 및 대사산물 측정을 위해 배지 샘플들을 취하고 유입- 및 유출 가스의 헤드스페이스 분석은 정기적으로 수행되었다.
샘플링 절차
예비-냉각 튜브를 이용하여 생물반응기에서 샘플들을 채취하였다; 채취된 샘플 양은 600nm에서 측정되는 OD 2에 해당되었다. 가스 조성 및 상이한 EtOH:BDO 비율에 관한 유전자 발현 프로파일에 대한 시간 효과를 비교하기 위한 마이크로어레이 분석용으로3종의 샘플들을 생물반응기에서 채취하였다. 제1 샘플은 반응기 중 가스 믹스 CO 30% 및 N2 70% 및 EtOH:BDO 비율 23:1에서 채취하였다. 제2샘플은 가스 믹스 CO 30%, N2 40% 및 CO2 30% 및 EtOH:BDO 비율 13:1에서 채취하였고, 본 샘플은 가스 조성이 변경되고 7 시간 후에 채취된 것이다. 제3 샘플은 제2샘플과 동일한 가스 믹스에서 채취되되, EtOH:BDO 비율은 4:1이고, 본 샘플은 가스 조성에 CO2 추가되고 3일 후에 채취된 것이다. 채취 후, 샘플들을 10 분 동안 4°C에서 4000 RPM으로 원심분리하고 상층액을 제거하고 이어 펠릿을 N2 액체에서 순간 냉각시키고 사용될 때까지 -80°C에서 보관하였다.
RNA 추출
-80°C로부터 샘플들을 회복시킨 후, 샘플들을 RiboPure™-Bacteria Kit (Ambion, Part Number AM1925)을 이용하여 추출하였다.
마이크로어레이 분석
표준 기술을 이용하여 Roche에 의해 마이크로어레이 분석하였다.
실시예 2: 발효에 대한 압력 효과
도 2, 도 3 및 도 4는 저압 및 고압 모두에서 수행된 발효 결과이고, 발효 브로쓰에 존재하는 CO2 용해량, 및 발효에 의한 대사산물 농도에 대한 영향을 보인다. 이들 각각의 실험에서 액체 영양 배지를 포함하는 생물반응기에 클로스트리듐 오토에타노게눔 배양체를 접종하였다. CO 및 CO2를 포함하는 가스성 기질을 생물반응기에 제공하였다.
도 2는 CO2 용해량 및 반응기에서 생산되는 2,3-부탄디올 (2,3-BDO) 농도에 대한 압력 영향을 결정하기 위하여 상이한 압력들에서 발효가 진행되는 제1 실험 결과를 보인다.
도 2는 0-6 일 동안 고압 (반응기의 헤드스페이스에서320 kPag 및 반응기의 바닥에서 약 420 kPag)에서 발효 브로쓰 중의 CO2 용해량, 및 생산된 2,3-BDO 농도는 모두 증가한다는 것을 보인다. 발효가 6-22일 동안 저압 (헤드스페이스에서 50 kPag 및 바닥에서 약 150 kPag)에서 운전되면 발효 브로쓰 중의 CO2 용해량 및 2,3-BDO 농도는 모두 감소된다.
도 3은 명백히 발효 브로쓰 중의 CO2 용해량 및 2,3-부탄디올 농도 간의 상관성을 보인다.
도 4는 발효에 대한 CO의 CO2로의 전환 영향을 보인다. 세균에 의한 CO 소비량이 증가하도록 발효가 진행되면, 발효 부산물로서 CO2가 생산된다. CODH (이산화탄소 탈수소효소)에 의한 CO의 CO2로의 전환으로 환원형 페레독신이 생성된다. 높은 수준의 환원형 페레독신은 아세틸 CoA를 피루베이트로 전환시키는데 필요하고, 이에 따라 2,3-부탄디올 생산이 증가되고 피루베이트에서 유래되는 다른 생성물 생산이 증가된다.
실시예 3: 용해 CO 2 농도 증가.
발효 중 용해 CO2 수준이 2,3-부탄디올 생산 증가를 보이는 일련의 실험을 진행하였다.
3A: 2, 3 BDO 생산 증가 방식으로 CO 2 입구 농도 변화
본 실험에서 발효 브로쓰에 유입되는 입구 가스의 CO2 농도를 28 일 운전 후 일 단계로 0 %에서 25 %로 전환하였다. 전체 실험에 걸쳐 CO 흡수를 일정하게 유지하였고 입구 가스에서 CO 농도를 30 %로 유지하였다. 도 5에 도시된 바와 같이 CO2 가 0%에서 25%로 전환되면 2, 3 부탄디올 생산이 상당히 증가하였다.
도 6은25-31 일 사이 발효 브로쓰 중의 CO2 농도 변화를 보인다. 25 일에 발효에 제공되는 입구 스트림 중의 CO2 양은 0%이었다. 28 일에 입구 스트림의 CO2 농도는 25%로 증가하였다. 도 6은 명백히 CO2 증가 후 CO 흡수는 동일하게 유지된다는 것을 보이고, 이는 더욱 상세히 하기되는 BDO 생산 증가는 시스템에 유입되는 더욱 많은 탄소로는 설명될 수 없다는 것을 의미한다. 또한, 증가 후 CO2 생산은 동일하게 유지되었다. 도 5는 명백하게 상응하는 발효에 따른 대사산물 생산 변화를 보인다. CO2가 발효 브로쓰에 첨가되면 2,3-BDO 농도는 28 일에 약 0.6g/L에서 31 일에 2.0 g/L로 증가되었다. 에탄올 농도는 감소되었고, 에탄올 대 2,3-BDO 비율은 20 일에 대략 20:1에서 31 일에 대략 5:1으로 낮아졌다.
3B: 개시 초기에 높은 CO 2 입구 농도
본 실험은 발효 개시에CO2 가 존재할 때 2,3-BDO 생산에 대한 높은 CO2 농도의 효과를 보이도록 설계되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 일단 안정한 운전 조건들이 달성되면 에탄올: 2,3-BDO 비율이 2:1로 상당한 2,3-BDO 생산을 보였다. 평균 입구 CO2 농도는 42%이고 평균 출구 CO2 농도는 67.4 %이었다. 실험에서 50 % CO가 사용되었고 에탄올 및 2,3-BDO 생산이 최대가 되도록 가스 유량 및 CO 흡수를 조정하였다. 수일에 걸친 유출 가스 스트림 중의 CO, CO2 및 H2 농도는 도 8에 도시된다.
3C: CO 2 입구 농도의 점차적 증가
발효의 대사산물 생산 프로파일에 대한CO2 영향을 결정하기 위하여 본 실험이 진행되는 동안 발효 브로쓰에 도입되는 입구 가스 스트림 중의 CO2 농도를 점차 증가시켰다. 도 10은 대사산물 농도에 대한 입구 스트림 중 CO2 증가 효과를 보인다. CO2 농도는 6 일에 0%에서 10%로 증가되었고; 9 일에 10%에서 15%로 증가되었고, 13 일에 15%에서 20%로 증가되었다. 입구 스트림에서 CO2 농도 증가에 따라 상응하는 2,3-BDO 농도 증가가 관찰되었다. 도 9는 실험이 진행되는 동안 미생물 배양체의 CO, CO2 및 H2 흡수를 보인다.
3D: CO 2 주기적 변화
본 실험은 CO2 입구 농도의 주기적 변화 영향을 결정하기 위하여 진행되었다. 입구 스트림 중의 CO2 양이 0% 및 20% 사이에서 매 시간마다 주기적으로 변하도록 발효 조건을 설정하였다. 도 11은 실험 과정에서 대사산물 생산을 보인다. CO2 입구 농도의 주기적 변화는 농도가 약간 증가되고 2,3-BDO 생산을 유지하는 효과를 보였다. 도 12는 실험 과정에서 미생물 배양체에 의한 입구 가스의 다양한 성분들 흡수를 보인다.
3E: 두 반응기 시스템 중 제2반응기로의 CO 2 농도 증가.
본 실험은 제1 생물반응기로부터의 유출 가스 스트림을 제2생물반응기의 입구 스트림으로 통과시켜 이에 따라 CO2 농도를 증가시키는 영향을 결정하기 위하여 설계되었다. 도 13은 발효 공정14 일과 20 일 사이에 두 반응기 시스템의 제2생물반응기에서 대사산물 농도를 보인다. 14 일에 제2생물반응기에서 총 CO2 양이 17.8%에서 43.8%가 되도록 제1 생물반응기에서 제2생물반응기로 제공되는 CO2 양은 증가되었다. 14 일과 21일 사이에, 반응기에서 2,3-BDO 농도는 약 8g/L에서 약 14g/L로 증가되었다. 에탄올 대 2,3-BDO 비율은 14 일에4:1에서 20 일 경에 2:1로 감소하고 실험 나머지 구간에서는 상대적으로 일정하게 유지되었다. 도 14는 발효 과정에서 미생물 배양체에 대한 CO, CO2 및 H2 흡수를 보인다.
실시예 4: CO 이용률 조절에 의한2,3-BDO 생산 증가.
대사산물 생산에 대한 가스 유량 및 교반 효과.
본 실험은 미생물 배양체의 대사산물 생산에 대한 물질 이동 변화 영향을 보이기 위하여 설계되었다. 실험이 진행되는 동안, 교반 속도 및 가스 유량을 변경시켜 반응기에서 유출되는 가스, 및 발효의 대사산물 프로파일을 변화시켰다.
도 15를 참조하면, 6 일에서 8 일에2,3-BDO 농도가 증가되었고, 이는 생물반응기에서 교반 속도 및 반응기로의 가스 유량 감소에 따른 것이다. 도 18에 도시된 바와 같이, 5.6 일에서 CO 흡수는 일정하게 유지되지만 CO 이용률은 개선되었고, 따라서 출구 가스에서 CO2가 증가되었다. 이는 교반 속도 (rpm) 증가, 및 가스 유량 감소에 의한 것이고 출구 가스에서 CO는 26 %에서 12.5 %로 감소되었다. 가스 유량이 240ml/min/L에서 160 ml/min/L로 감소될 때 CO 흡수는 동일하게 유지되었다. 출구 스트림에서 CO2는 37 %에서 48 %로 증가하였다. CO 이용률은 53 %에서 79 %로 증가하였다. 이러한 증가 결과 CO 흡수의 임의의 증가 없이 용해 CO2가 증가하였다. 더 높은 CO 이용률은 더 많은 용해 CO2를 보이므로 CO 이용률 증가는 2,3-BDO 생산 증가와 정적 상관성을 보인다.
2,3-부탄디올 생산율에 대한발효 브로쓰 중의 용해 CO 2 영향.
2,3-부탄디올 생산에 대한 발효 브로쓰에서의 용해 CO2 의 관계식을 보이기 위하여 상이한 헤드스페이스 압력에서 상이한 출구 CO2 농도들로 운전되는 다수의 실험들의 조합 데이터들을 도시하였다. 도 16은 용해 CO2 대 2,3-BDO 생산율의 플롯이다. 본 도표는 발효 브로쓰에서 CO2 용해량이 증가하면 2,3-부탄디올의 생산율이 증가된다는 것을 보인다.
다음 표는 용해 CO2 및 2,3-BDO 농도 및 생산성 사이 상관성을 보이는 다수의 실험들로부터 얻어진 결과를 제시한다.
운전 # 이론 용해 CO2 mM* CO2 출구 % BDO g/L 입구 CO2 % CO 흡수 mM/L/일 데이터 지점들 정규화 BDO g/L (4 mol CO 흡수) 생산율 g/L/일 정규화 생산율 (4 mol CO 흡수)
1 2.39 10.62 0.5 0 -4280 평균 ~ 3 일 0.47 0.92 0.86
2 4.58 20.3 0.88 10 -4201 평균 ~ 3 일 0.84 1.6 1.52
3 5.76 25.5 0.96 15 -4234 평균 ~ 3 일 0.91 1.71 1.62
4 7 31.1 1.37 20 -4071 평균 ~ 3 일 1.35 2.58 2.54
5 8.5 37 0.86 18.5 -3597 평균 ~ 3 일 0.96 1.36 1.51
6 11.05 49 1.38 18.8 -3595 평균 ~ 3 일 1.54 2.18 2.43
7 14.89 66 2.22 50 -4055 충격 전 2.19 3.89 3.84
8 26.1 50 5.3 19.2 -5000 평균 9 -12일 4.24 8 6.40
9 39.7 49.8 10.38 20.5 -5051 평균 4.3 - 6.0 일 8.22 13.3 10.53
10 40.9 48 6.48 18.5 -6500 평균 7-8 일 3.99 13.75 8.46
11 41.1 46 10.38 22.3 -5319 평균 6.3 - 9.3 일 7.81 13.4 10.08
본 발명은 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명을 실시할 수 있게 하기 위하여, 특정 양호한 실시양태들을 참고하여 설명하였다. 본 기술 분야의 숙련자는 본 발명에는 변형 및 변경도 가능하고 본 발명은 이러한 변형 및 변화도 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 본 문헌을 독자가 이해하기 쉽도록 하기 위하여 제목, 표제 등을 제공하는데, 이것이 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
전술한 모든 출원, 특허 및 공개의 내용은 모두 참고 문헌으로서 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 포함된 임의의 선행 기술에 대한 내용은 미국 또는 전 세계 어느 나라에서 통용되는 일반적인 지식의 일부로서 인식되거나 추측되는 것이 아니고, 또한 그렇게 받아들여져서는 아니된다.
본 명세서 및 첨부된 특허 청구 범위에서, 별도로 언급하지 않은 한, "포함하다", "포함하는"이라는 등의 용어는 배타적인 의미와는 반대의 뜻을 포함하는 것으로서, 즉 "~을 포함하나, 이에 한정되지는 않는"으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성(carboxydotrophic acetogenic) 미생물을 포함하는 발효 배양체의 대사 프로파일을 조절하는 방법으로서,
    아세틸 CoA에서 유래되는 적어도 하나의 생성물 및 피루베이트에서 유래되는 적어도 하나의 생성물을 생산하기 위하여 액체 영양 배지 중에 상기 미생물의 배양체를 포함하는 생물반응기에 CO 및 CO2를 포함하는 가스성 기질을 유동시키는 단계; 및
    액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 조정하는 단계로서, 피루베이트에서 유래되는 생성물의 생산을 증가시킴으로써 아세틸 CoA에서 유래되는 생성물에 대한 피루베이트에서 유래되는 생성물의 비율을 증가시키기 위해 액체 영양 배치 중에 용해되는 CO2 양을 증가시키거나, 피루베이트에서 유래되는 생성물의 생산을 감소시킴으로써 아세틸 CoA에서 유래되는 생성물에 대한 피루베이트에서 유래되는 생성물의 비율을 감소시키기 위해 액체 영양 배치 중에 용해되는 CO2 양을 감소시키고, 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양은 (i) 생물반응기로의 CO2 유동을 조절하는 것; (ii) 입구 가스 중의 CO2 농도를 조절하는 것; 및 (iii) 생물반응기 내 압력을 조절하는 것으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 방법에 의해 조절되는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 농도가 증가되도록 발효는 250 kPag 초과의 압력에서 수행되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 농도가 감소되도록 발효는 200 kPag 미만의 압력에서 수행되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기에 제공되는 상기 가스성 기질 중의 CO2 농도는 약 15% 내지 약 65%인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기에 제공되는 상기 가스성 기질 중의 CO2 농도는 시간 경과에 따라 점차적으로 증가되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트에서 유래되는 적어도 하나의 생성물은 2,3-부탄디올, 락테이트, 숙시네이트, 메틸 에틸 케톤(MEK), 2-부탄올, 프로판디올, 2-프로판올, 이소프로판올, 아세토인, 이소부탄올, 시트라말레이트, 부타디엔 및 폴리락트산(PLA)으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생물반응기에서 상기 배양체에 의해 이용되는 CO2 양을 감시하기 위하여 상기 생물반응기에서 유출되는 유출 스트림 중의 CO2 농도를 감시하는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 액체 영양 배지 중에 용해되는 CO2 양을 조정하여 아세틸 CoA 유래 생성물에 대한 피루베이트 유래 생성물의 비율을 조절하는, 방법.
  9. 가스성 기질의 미생물 발효에 의해 하나 이상의 생성물을 생산하는 방법으로서,
    a. 액체 영양 배지에 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물의 배양체를 포함하는 제1 생물반응기에서, CO를 포함하는 가스성 기질을 수용하는 단계;
    b. 하나 이상의 액체 생성물 및 CO2를 포함하는 유출 가스를 생산하기 위하여 상기 CO를 포함하는 가스성 기질을 발효시키는 단계;
    c. 상기 CO2를 포함하는 유출 가스를 상기 제1 생물반응기로 다시 통과시키거나 또는 제2 생물반응기에 통과시키는 단계로서, 상기 제2 생물반응기는 액체 영양 배지에 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물의 배양체를 포함하는, 상기 통과시키는 단계; 및
    d. 적어도 하나의 생성물을 생산하기 위하여 상기 제1 생물반응기 또는 제2 생물반응기에서 상기 CO2를 포함하는 유출 가스를 발효시키는 단계로서, 제1 생물반응기는 아세틸 CoA 유래 생성물 및 피루베이트 유래 생성물을 생산하고, 피루베이트 유래 생성물에 대한 아세틸 CoA 유래 생성물의 비율은 약 30:1 내지 약 20:1이고, 제2 생물반응기는 상기 제1 생물반응기보다 더 낮은 피루베이트 유래 생성물에 대한 아세틸 CoA 유래 생성물의 비율을 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 CO2 를 포함하는 유출 가스는 상기 제2 생물반응기에 공급되기 전에 적어도 하나의 가스성 기질과 혼합되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 발효에서 기질로 사용되기 위하여 적어도 하나의 추가 가스성 기질이 상기 제2 생물반응기에 공급되는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 피루베이트에서 유래되는 적어도 하나의 생성물은 2,3-부탄디올, 락테이트, 숙시네이트, 메틸 에틸 케톤(MEK), 2-부탄올, 프로판디올, 2-프로판올, 이소프로판올, 아세토인, 이소부탄올, 시트라말레이트, 부타디엔 및 폴리락트산(PLA)으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제2 생물반응기에서 생산되는 유출 가스 스트림을 취하는 단계 및 기질로서 사용하기 위하여 상기 유출 가스 스트림을 상기 제1 생물반응기에 통과시키는 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  14. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 일산화탄소영양 아세트산 생성 미생물은 모어렐라(Moorella), 클로스트리듐(Clostridium), 루미노코커스(Ruminococcus), 아세토박테리움(Acetobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 부티리박테리움(Butyribacterium), 옥소박터(Oxobacter), 메타노사르시나(Methanosarcina) 및 데술포토마쿨룸(Desulfotomaculum)으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  15. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리듐 륭달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리듐 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리듐 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) 및 클로스트리듐 코스카티이(Clostridium coskatii)로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
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