DE60121335T2

DE60121335T2 - Verfahren zur steigerung der ethanolproduktion bei der mikrobiellen fermentation

Info

Publication number: DE60121335T2
Application number: DE60121335T
Authority: DE
Inventors: L. James Fayetteville GADDY; K. Dinesh Fayetteville ARORA; Ching-Whan Fayetteville KO; Randall John Fayetteville PHILLIPS; Rahul Basu; V. Carl Fayetteville WIKSTROM; C. Edgar Fayetteville CLAUSEN
Original assignee: Emmaus Foundation Inc Fayetteville; Emmaus Foundation Inc
Current assignee: Emmaus Foundation Inc Fayetteville; Emmaus Foundation Inc
Priority date: 2000-07-25
Filing date: 2001-07-23
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2021-07-24
Also published as: KR100879577B1; US20120088283A1; US8574879B2; US8642301B2; BR0112251A; CA2416500A1; US8647851B2; ZA200300325B; HU226975B1; EP1303629A2; EA200300158A1; IL153876A0; WO2002008438A2; US7285402B2; US8642302B2; WO2002008438A3; HUP0301388A3; JP2004504058A; CN1444658A; MXPA03000711A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verbesserungen bei mikrobiellen Fermentationsverfahren zur Herstellung von Ethanol aus einem gasförmigen, Kohlenmonoxid umfassenden Substrat unter Verwendung eines anaeroben (oder fakultativen) acetogenen Bakteriums.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurden Verfahren zur Herstellung von Ethanol unter anderen organischen Säuren, Alkoholen, Wasserstoff und Salzen organischer Säuren aus der mikrobiellen Fermentation gasförmiger Substrate in geeignete Nährstoffe sowie Spurenmineralien enthaltenden Medien unter Verwendung bestimmter anaerober Bakterien offenbart. So wurde beispielsweise von den Erfindern bereits offenbart, daß verdünnte Gasgemische in einen einen oder mehrere anaerobe Bakterienstämme, die die Abgaskomponenten über einen direkten Weg zur Herstellung einer gewünschten Verbindung nutzen, enthaltenden Bioreaktor eingeführt werden. Die Verbindung wird dabei aus der wäßrigen Phase in einem getrennten Gefäß bzw. getrennten Gefäßen unter Nutzung eines geeigneten Gewinnungsverfahrens für die hergestellte Verbindung gewonnen. Zu den Gewinnungsverfahren gehören beispielsweise die Extraktion, Destillation oder Kombinationen daraus sowie andere effiziente Gewinnungsverfahren. Die Bakterien lassen sich aus der wäßrigen Phase abtrennen und in den Bioreaktor zurückführen, so daß hohe Zellkonzentrationen beibehalten und die Produktivität somit maximiert wird. Die Abtrennung der Zellen, falls gewünscht, erfolgt mittels Zentrifugation, Membranfiltration oder anderen Techniken. Siehe z.B. internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/00558, veröffentlicht am 8. Januar 1998; US-Patent Nr. 5,807,722; US-Patent Nr. 5,593,886 und US-Patent Nr. 5,821,111.
Stämme des anaeroben Bakteriums Clostridium ljungdahlii sind in der Lage, neben ihrem Hauptprodukt Essigsäure auch Ethanol als Produkt bei der Umsetzung von Kohlenmonoxid (CO), Wasserstoff (H₂) und Kohlendioxid (CO₂) zu produzieren. Die Produktion von Essigsäure (CH₃COOH) und Ethanol (C₂H₅OH) aus CO, CO₂ und H₂ wird mit den folgenden gesamtstöchiometrischen Gleichungen dargestellt: 4CO + 2H₂O → CH₃COOH + 2CO₂ (1) 4H₂ + 2CO₂ → CH₃COOH + 2H₂O (2) 6CO + 3H₂O → C₂H₅OH + 4CO₂ (3) 6H₂ + 2CO₂ → C₂H₅OH + 3H₂O (4)
Zu mehreren beispielhaften Stämmen von C. ljungdahlii gehören der Stamm PETC (US-Patent Nr. 5,173,429), der Stamm ERI2 (US-Patent Nr. 5,593,886) und die Stämme C-01 und O-52 (US-Patent Nr. 6,136,577). Diese Stämme sind jeweils bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 unter Accession Nr. 55383 (vormals ATCC Nr. 49587), 55380, 55988 bzw. 55989 hinterlegt. Bei den Stämmen von C. ljungdahlii handelt es sich jeweils um ein anaerobes, gram-positives Bakterium mit einem Gehalt an Guanin und Cytosin (G + C) von etwa 22 Mol-%. Diese Bakterien verwenden zum Wachstum verschiedene Substrate, jedoch nicht Methanol oder Lactat. Die genannten Stämme unterscheiden sich durch ihre CO-Toleranz, spezifische Gasaufnahmegeschwindigkeiten und spezifische Produktivitäten. Bei den in der Natur angetroffenen "Wild"stämmen wird nur eine sehr geringe Ethanolproduktion festgestellt. C. ljungdahlii-Stämme arbeiten idealerweise bei 37°C und produzieren typischerweise ein Produktverhältnis von Ethanol zu Acetyl (d.h. das sich sowohl auf freie oder molekulare Essigsäure als auch Acetatsalze bezieht) von etwa 1:20 (ein Teil Ethanol auf 20 Teile Acetyl) im "Wild"zustand. Die Ethanolkonzentrationen liegen typischerweise lediglich bei 1–2 g/l. Obgleich diese Fähigkeit zur Ethanolproduktion interessant ist, können die "Wild"bakterien wegen der geringen Ethanolproduktivität nicht zur ökonomischen Produktion von Ethanol auf kommerzieller Grundlage verwendet werden.
Bei einer geringfügigen Manipulation der Nährstoffe wurden die oben erwähnten C. ljungdahlii-Stämme zur Produktion von Ethanol und Acetyl mit einem Produktverhältnis von 1:1 (gleiche Anteile Ethanol und Acetyl) verwendet, doch beträgt die Ethanolkonzentration weniger als 10 g/l, ein Niveau, das zu geringer Produktivität, und zwar weniger als 10 g/l pro Tag, führt. Darüber hinaus ist die Kulturstabilität ein Problem, hauptsächlich aufgrund der relativ hohen (8–10 g/l) Konzentration von Acetyl (2,5–3 g/l molekulare Essigsäure) zusammen mit dem Vorhandensein von Ethanol. Weiterhin wird bei einer Erhöhung der Gasgeschwindigkeit in einem Versuch zur Herstellung von mehr Ethanol die Kultur gehemmt, zunächst durch molekulare Essigsäure und dann durch CO. Dadurch wird die Kultur instabil und kann kein Gas aufnehmen und zusätzliches Produkt produzieren. Ferner konnte von den Erfindern in frühen Arbeiten gezeigt werden, daß es schwierig ist, ein Verhältnis von Ethanol zu Acetyl von mehr als 2:1 im Steady-State-Betrieb zu produzieren. Siehe z.B. unter anderem Klasson et al., 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 11th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25: 857; Phillips et al. 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14th Symposium of Biotechnology from Fuels and Chemicals, 39/40; 559.
In einer großen Anzahl von Dokumenten wird die Verwendung von C. ljungdahlii verschiedenen anaeroben Bakterien, die kein CO, CO₂ und H₂ verbrauchen, bei der Fermentation von Zucker zur Herstellung von Lösungsmitteln beschrieben. In einem Versuch, hohe Ausbeuten an Ethanol zu erzielen, wurden verschiedene Parameter geändert, zu denen Nährstoffarten, der Mikroorganismus, die spezifische Zugabe von Reduktionsmitteln, pH-Variationen sowie die Zugabe exogener Gase gehören. Siehe z.B. Rothstein et al., 1986 J. Bacteriol, 165 (1): 319–320, Lovitt et al., 1988 J. Bacteriol, 170 (6): 2809; Taherzadeh et al., 1996 Appl. Microbiol. Biotechnol., 46–176.
Auf dem Gebiet der Handhabung großtechnischer gasförmiger Substrate besteht weiterhin ein Bedarf an der Fähigkeit, Wertstoffe aus solchen Gasen, insbesondere Abgasen, wie z.B. H₂, CO und CO₂, zu extrahieren. Es besteht ein Bedarf zur Verbesserung der Produktion von Ethanol relativ zur Produktion der anderen, normalerweise durch die Fermentation solcher Gase durch acetogene Bakterien erzeugten Produkte.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Als Antwort auf den Bedarf im Fachgebiet wird von der vorliegenden Erfindung ein kontinuierliches Steady-State-Verfahren bereitgestellt, mit dem in bevorzugten Ausführungsformen Ethanolkonzentrationen von mehr als 10 g/l und Acetatkonzentrationen von weniger als etwa 8–10 g/l erhalten werden können, während weiterhin das Wachstum der Kultur sowie eine gute Kulturstabilität ermöglicht werden.
Erfindungsgemäß wird ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus der anaeroben bakteriellen Fermentation eines gasförmigen, Kohlenmonoxid umfassenden Substrats bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren in einem Fermentationsbioreaktor ein Clostridium ljungdahlii-Bakterium kultiviert, das zur Produktion von Ethanol in einem flüssigen Nährmedium, das Calciumpantothenat enthält und einen pH-Wert von weniger als 5,5 aufweist, wobei die Konzentration an freier Essigsäure im Fermentationsbioreaktor weniger als 5 g/l beträgt und das Verhältnis von Ethanol zu Acetat in der Fermentationsbrühe im Bioreaktor 1:1 bis 20:1 beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciumpantothenat dem Fermentationsbioreaktor in einer Menge von 0,5 bis 50 μg pro g im Bioreaktor produzierte trockene Bakterienzellen zugeführt wird und eine spezifische Geschwindigkeit der Kohlenmonoxidaufnahme von wenigstens 0,5 mmol pro g Bakterienzelltrockengewicht pro Minute im Bioreaktor aufrechterhalten wird, wodurch in einem stabilen Zustand Ethanol bei einer Produktivität von mehr als 10 g/l/Tag produziert wird.
Bei einer Betrachtungsweise der Erfindung wird das Bakterium im Bioreaktor durch Verringerung des Redoxpotentials oder Erhöhung des Verhältnisses von NAD(P)H zu NAD(P) in der Fermentationsbrühe manipuliert, nachdem das Bakterium einen "Steadystate", z.B. eine stabile Zellkonzentration, im Bioreaktor erreicht hat. Die Kultivierungs- und Manipulierungsschritte führen dazu, daß das Bakterium im Bioreaktor Ethanol in einer Fermentationsbrühe mit einer Produktivität von mehr als 10 g/l pro Tag produziert. Dabei werden sowohl Ethanol als auch Acetat in der Fermentationsbrühe in einem von 1:1 bis 20:1 reichenden Verhältnis von Ethanol zu Acetat produziert.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens beinhaltet der Manipulierungsschritt einen oder mehrere der folgenden Schritte: Verändern wenigstens eines Parameters, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nährmediuminhalt, Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit, wäßriger Zufuhrgeschwindigkeit, Betriebsdruck, Betriebs-pH-Wert, Gehalt an gasförmigen Substraten, Gaszufuhrgeschwindigkeit, Fermentationsbrühenrührgeschwindigkeit, Produktkonzentration, Zelldichte und Substrathemmung.
Das das Reduktionsgas CO enthaltende gasförmige Substrat wird dem Bioreaktor bei einer gewünschten Aufnahmegeschwindigkeit von mindestens 0,05 und wünschenswerterweise bis zu 2 mmol CO/g trockene Bakterienzellen im Bioreaktor/Minute zugeleitet.
In einer weiteren Ausführungsform der Verfahrens wird überschüssiges H₂-Reduktionsgas vor Bereitstellung der limitierenden Menge an Calciumpantothenat dem Bioreaktor zugeleitet.
In noch einem weiteren Aspekt wird durch die Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, bei dem man im Manipulierungsschritt des Verfahrens das eine limitierende Menge an Cobalt enthaltene Nährmedium in den Fermentationsbioreaktor einleitet. Wünschenswerterweise liegt dabei die Cobaltmenge im Bereich von 5–100 μg Cobalt pro Gramm im Bioreaktor produzierte trockene Bakterienzellen.
In einer weiteren Ausführungsform wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Akklimatisierung des Bakteriums im Bioreaktor an die Menge an Cobalt durch Aufrechterhalten einer konstanten Cobaltkonzentration und Anpassen eines oder mehrerer Parameter, wie etwa Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit und gegebenenfalls H₂-Gaspartialdruck, verhindert.
In zusätzlichen optionalen Schritten dieser Verfahren wird eine Probe der Brühe einer Zentrifugation zur Entfernung der Zellen sowie einer Gaschromatographie zur Überwachung der Aufrechterhaltung des Verhältnisses und/oder von Produktivitätswerten unterzogen.
In einer weiteren Ausführungsform wird in dem Verfahren als Teil des gasförmigen Substrats eine Menge an H₂ in leichtem Überschuß gegenüber der stöchiometrischen Menge für die Ethanolproduktion zugeführt. In noch einer weiteren Ausführungsform liegt die verwendete CO- Menge in leichtem Überschuß gegenüber den vom Bakterium benötigten Mengen vor, wobei die Aufnahme von H₂ durch das Bakterium gehemmt und das Verhältnis von NAD(P)H zu NAD(P) in der Brühe erhöht wird.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird ein Schritt bereitgestellt, bei dem die Hemmung durch molekulare Essigsäure durch Erhöhen der wäßrigen Zufuhrgeschwindigkeit reduziert wird, wenn die in der Fermentationsbrühe vorhandene molekulare Essigsäure 2 g/l erreicht oder überschreitet.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann der Manipulierungsschritt das Rühren des Mediums, des Bakteriums und des gasförmigen Substrats bei einer ausgewählten Rührgeschwindigkeit beinhalten. So wird beispielsweise durch die Verringerung der Rührgeschwindigkeit die in die Fermentationsbrühe eingebrachte Menge an CO reduziert. Durch diese Reduktion in der Geschwindigkeit der CO-Eintragung wird eine Erhöhung der H₂-Umwandlung verursacht, so daß das Reduktionsgas H₂ im Bioreaktor im Überschuß zu den Wachstumserfordernissen des Bakteriums vorliegen kann. Die Gasgeschwindigkeit kann ebenso in ähnlicher Weise zur Verringerung der eingetragenen CO-Menge reduziert werden, wodurch die H₂-Umwandlung erhöht wird, so daß das Reduktionsgas H₂ im Fermentationsbioreaktor im Überschuß zu den Wachstumserfordernissen des Bakteriums vorliegen kann.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann die Bakterienkultur zunächst auf die gewünschte Zellkonzentration im Bioreaktor gebracht werden, bevor die Calciumpantothenat- oder Cobaltkonzentration des Nährmediums limitiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein Zweistufen-CSTR (Bioreaktor) verwendet, der aus einem Wachstumsreaktor besteht, der die Fermentationsbrühe einem Produktionsreaktor zuleitet, in dem der Großteil des Ethanols produziert wird.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt beinhaltet das oben beschriebene Verfahren die folgenden optionalen Schritte: Gewinnung von Ethanol durch Abtrennen der Fermentationsbrühe aus dem Bioreaktor; Abdestillieren von Ethanol aus der Brühe; sowie Wiedergewinnung des Ethanols. Zusätzlich oder vorzugsweise wird eine Probe der Brühe einer Zentrifugation zur Abtrennung von Zellen ausgesetzt und das Aufrechterhalten des Verhältnisses mittels Gaschromatographie überwacht.
In noch einem weiteren Aspekt kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren ferner ein zusätzlicher Schritt der Rückführung von Wasser (mit bis zu 5 g/l Acetyl) aus der Ethanolproduktion zurück zum Reaktor, so daß ein Gleichgewicht zwischen dem Ethanol und dem Acetyl im Reaktor eingestellt wird, zum Einsatz kommen. Dadurch führt ein größerer Teil des dem Reaktor zugeführten und zu Produkten umgesetzten CO, CO₂ und H₂ zur Produktion von Ethanol.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bei 1 handelt es sich um ein schematisches Diagramm, das ein kontinuierliches Fermentationsverfahren mit Produktgewinnung gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Dabei werden das gasförmige Substrat 1 sowie das in der Flüssigphase befindliche Nährmedium 2 dem die gegenständliche Bakterienkultur enthaltenden Bioreaktor 3 zugeführt. Die Umsetzung des gasförmigen Substrats zu Ethanol und Essigsäure findet in Bioreaktor 3 statt. Das andere Gase als CO, CO₂ und H₂ enthaltende Austrittsgas 4 sowie nicht umgesetztes CO, CO₂ und H₂ aus dem Bioreaktor 3 werden abgelassen, als Brennstoff verbrannt oder abgefackelt. Beim Zellrückführungskreislauf wird der Flüssigkeitsabfluß 5 zum Zellseparator 6 geschickt, wo die Zellen 7 sowie zellfreies Permeat 8 getrennt werden. Die Zellen 7 werden zurück zum Bioreaktor 3 und das Permeat 8 zur Produktgewinnung geschickt. Aus dem Permeat 8 (oder alternativ aus dem Abfluß 5, falls keine Zelltrennung eingesetzt wird) läßt sich Ethanol gewinnen. Das Permeat 8 wird auf einer Destillationskolonne 9 getrennt, so daß als Kopfprodukt 95% Ethanol 10 sowie Wasser 11 zur Rückführung im Kreislauf zurück zum Bioreaktor 3 produziert wird. Das Kopfprodukt 95% Ethanol 10 wird zu einem Molekularsieb 12 geschickt, wo wasserfreies Ethanol 13, das gewünschte Endprodukt, von verdünntem Ethanol 14 getrennt wird, welches zurück zur Destillationskolonne 9 geschickt wird.
Bei 2 handelt es sich um ein schematisches Diagramm eines zweistufigen CSTR (continuously stirred reactor)-Systems für eine verbesserte Kulturstabilität. Dem Wachstumsstufe-CSTR 1 wird Flüssigmedium 2 zugeführt. Nicht umgesetztes Gas 3 aus dem Produktionsstufe-CSTR wird dem Wachstumsstufe-CSTR 1 zugeführt. Dem Produktionsstufe-CSTR 4 wird eine Frischgaszufuhr 5 und eine Frischmediumzufuhr 6 ebenso wie eine Kulturzufuhr 7 aus dem Wachstumsstufe-CSTR 1 zugeführt. Der Zellrückführungskreislauf 8 wird verwendet, um die meiste Produktion von den zum Produktionsstufe-CSTR 4 geschickten Zellen 9 zu erhalten. Die Zellen 9 werden nicht im Kreislauf zum Wachstumsstufe-CSTR zurückgeführt. Das aus verdünntem Ethanol in der Fermentationsbrühe bestehende Flüssigprodukt 10 wird als Destillationsendprodukt produziert und als wasserfreies Ethanol wie in 1 gewonnen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zur anaeroben Fermentation gasförmiger, wenigstens Kohlenmonoxid als Reduktionsgas enthaltender Substrate, insbesondere der gasförmigen Bestandteile großtechnischer Abgase und Synthesegase (z.B. CO, CO₂ und H₂) zu Ethanol. Diese Verfahren ergeben Ethanolproduktivitäten von mehr als 10 g/l pro Tag, indem die biologischen Wege des gegenständlichen Bakteriums manipuliert werden. Dabei führt ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Anreicherung von NAD(P)H über NAD(P). Die Oxidation von NAD(P)H zu NAD(P) führt zur Reduktion der von der Kultur produzierten Essigsäure zu Ethanol. Als Alternative beinhalten andere Verfahren zur Herstellung hoher Konzentrationen an Ethanol in einer anaeroben Fermentation der vorliegenden Erfindung die Reduktion des Redoxpotentials der Fermentationsbrühe und damit die Reduktion von Essigsäure zu Ethanol. Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung können in bevorzugten Ausführungsformen hohe Ethanolkonzentrationen (d.h. höher als etwa 10 g/l und vorzugsweise höher als etwa 15 g/l) sowie niedrige Acetatkonzentrationen (d.h. weniger als etwa 5 g/l freie Essigsäure im Bioreaktor) produziert werden. Mit diesem Verfahren werden auch Verfahrensbedingungen zur kontinuierlichen Ethanol- und Essigsäureproduktion aufrechterhalten und gesteuert, um das System bei der raschen Erholung von Verfahrensstörungen zu unterstützen. Ferner helfen die Verfahren der vorliegenden Erfindung beim Verhindern der Akklimatisierung der Kultur an eine geringe Nährstoffkonzentration, was der Kulturleistung abträglich sein kann. Mit der vorliegenden Erfindung wird ein realisierbares kommerzielles Verfahren zur Ethanolproduktion bereitgestellt.
I. Definitionen
Falls nicht anders angegeben, besitzen die folgenden Begriffe, wie sie in der gesamten vorliegenden Beschreibung verwendet werden, die folgenden Bedeutungen.
Der Begriff "kontinuierliches Verfahren", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Fermentationsverfahren, das eine kontinuierliche Nährstoffzufuhr, Substratzufuhr, Zellproduktion im Bioreaktor, Abtrennung (bzw. Entfernung) von Zellen aus dem Bioreaktor und Produktabtrennung umfaßt. Diese kontinuierlichen Zufuhren, Abtrennungen oder Zellproduktion können dabei im gleichen oder in unterschiedlichen Strömen stattfinden. Ein kontinuierlicher Prozeß führt zur Erreichung eines "Steadystate" im Bioreaktor. Unter "Steadystate" versteht man, daß alle diese meßbaren Variablen (d.h. Zufuhrgeschwindigkeiten, im Bioreaktor aufrechterhaltene Substrat- und Nährstoffkonzentrationen, die Zellkonzentration im Bioreaktor sowie die Abtrennung von Zellen aus dem Bioreaktor, die Produktabtrennung aus dem Bioreaktor ebenso wie Zustandsvariablen, wie z.B. Temperaturen und Drücke) im zeitlichen Verlauf konstant sind.
Die verwendeten gasförmigen Substrate umfassen Kohlenmonoxid. Somit kann es sich dabei um CO allein, CO und H₂ oder CO, CO₂ und H₂, gegebenenfalls im Gemisch mit anderen Elementen oder Verbindungen, einschließlich Stickstoff und Methan, in einem gasförmigen Zustand handeln. Zu solchen gasförmigen Substraten gehören Gase oder Ströme, die typischerweise entweder direkt oder durch Verbrennung in die Atmosphäre entlassen oder ausgestoßen werden. In einigen Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens umfaßt das gasförmige Substrat CO. In anderen Ausführungsformen umfaßt das gasförmige Substrat CO und H₂. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das gasförmige Substrat CO, CO₂ und H₂. Noch weitere erfindungsgemäße Substrate können jene oben erwähnten Bestandteile sowie wenigstens eines der Gase Stickstoff, CO₂, Ethan und Methan enthalten. Somit gehört zu solchen Substraten, was herkömm licherweise als "Syngas" bzw. Synthesegas aus der Vergasung von Kohleprodukten (einschließlich Methan) ebenso wie als Abgase aus verschiedenen großtechnischen Verfahren bezeichnet wird.
Unter der Wendung "eine größere Menge an Reduktionsgas als für das Wachstums des Bakteriums erforderlich ist" versteht man eine Menge an Reduktionsgas (CO oder CO + H₂), die über die Menge hinausgeht, die von dem Bakterium für Wachstum oder Stoffwechsel mit den gegebenen Nährmediuminhaltsstoffen verbraucht werden kann. Diese Menge läßt sich erzielen, indem man die Nettomenge an Reduktionsgas erhöht oder Schlüsselinhaltsstoffe des Nährmediums reduziert, so daß der Gasüberschuß ohne Zunahme des Gases erreicht wird, oder die Geschwindigkeit der Gaszuführung an das Bakterium erhöht. Wird das Bakterium einer größeren Menge an Reduktionsgas als für das Wachstum erforderlich ist ausgesetzt, so reagiert das Bakterium mit einer Erhöhung der Ethanolproduktion.
Bei dem verwendeten Bakterium handelt es sich um das acetogene anaerobe (oder fakultative) Bakterium Clostridium ljungdahlii, das in der Lage ist, CO und Wasser zu Ethanol und Essigsäureprodukten umzusetzen. Dabei lassen sich verschiedene Stämme dieses Bakteriums verwenden, beispielsweise C. ljungdahlii PETC, C. ljungdahlii ER, C. ljungdahlii C-01 und C. ljungdahlii O-52.
Die Begriffe "Bioreaktor", "Reaktor" bzw. "Fermentationsbioreaktor" umfassen eine Fermentationsvorrichtung, die aus einem oder mehreren Gefäßen und/oder Türmen oder Röhrenanordnungen besteht, wobei der CSTR (Continuous Stirred Tank Reactor), ICR (Immobilized Cell Reactor), TBR (Trickle Bed Reactor), die Blasensäule, der Gaslift-Fermentor, der statische Mischer sowie eine andere für den Gas-Flüssigkeitskontakt geeignete Vorrichtung umfaßt sind. Vorzugsweise umfaßt bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung der Fermentationsbioreaktor einen Wachstumsreaktor, der die Fermentationsbrühe einem zweiten Fermentationsbioreaktor zuführt, in dem der Großteil des Produkts Ethanol produziert wird.
"Nährmedium" wird im allgemeinen zur Beschreibung herkömmlicher Bakterienwachstumsmedien verwendet, die ausreichend Vitamine und Mineralien enthalten, um das Wachstum des ausgewählten gegenständlichen Bakteriums zu gestatten. Diese Medien enthalten keine Zucker. Bestandteile verschiedener, für die Verwendung der vorliegenden Erfindung geeigneter Nährmedien sind bekannt und in früheren Veröffentlichungen, einschließlich denen der Erfinder, angegeben. Siehe z.B. die in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/00558, dem US-Patent Nr. 5,807,722, dem US-Patent Nr. 5,593,886 und dem US-Patent Nr. 5,821,111 ebenso wie in den oben angeführten Veröffentlichungen beschriebenen Nährmedienformeln. Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält ein typisches Labornährmedium für die Acetatproduktion aus CO, CO₂ und H₂ 0,9 mg/l Calciumpantothenat. Dagegen enthält ein typisches Labornährmedium für die Ethanolproduktion aus CO, CO₂ und H₂ 0,02 mg/l Calciumpantothenat.
Die Begriffe "limitierendes Substrat" bzw. "limitierender Nährstoff" bedeuten eine Substanz im Nährmedium oder gasförmigen Substrat, die während des Bakterienkulturwachstums im Bioreaktor durch die Kultur auf ein Niveau abgereichert wird, durch das der Steadystate oder das stabile Bakterienwachstum im Bioreaktor nicht mehr gestützt wird. Alle anderen Substanzen im Nährmedium oder Gassubstrat sind somit im Überschuß vorhanden und "nicht limitierend". Eine Limitierung ist daran ersichtlich, daß eine Erhöhung der Zugabegeschwindigkeit des limitierenden Substrats, d.h. der Nährzustoffzufuhrgeschwindigkeit bzw. Gaszufuhrgeschwindigkeit, zur Kultur zu einem entsprechenden Anstieg der Gasaufnahmegeschwindigkeit (mmol/min Gas) aufgrund des Anstiegs der Zelldichte führt.
Falls nicht anders angegeben, wird der Begriff "Acetat" zur Beschreibung des in der Fermentationsbrühe vorhandenen Gemischs aus molekularer oder freier Essigsäure und Acetatsalz verwendet. Das Verhältnis von molekularer Essigsäure zu Acetat hängt vom pH-Wert des Systems ab, d.h. bei einer konstanten "Acetat"-Konzentration ist der pH-Wert um so niedriger, je höher die Konzentration der molekularen Essigsäure relativ zum Acetatsalz ist.
In der vorliegenden Beschreibung wird "Zellkonzentration" auf das Bakterientrockengewicht pro Liter Probe bezogen. Die Zellkonzentration wird entweder direkt oder durch Kalibrierung auf eine Korrelation der optischen Dichte gemesen.
Der Begriff "natürlicher Zustand" beschreibt eine beliebige Verbindung, ein beliebiges Element oder einen beliebigen Weg mit keinen zusätzlichen Elektronen oder Protonen, die normalerweise vorhanden sind. Umgekehrt beschreibt der Begriff "Reduktionszustand" eine beliebige Verbindung, ein beliebiges Element oder einen beliebigen Weg mit einem Überschuß an einem oder mehreren Elektronen. Der "Reduktionszustand" läßt sich durch Zugabe eines oder mehrerer Elektronen zum "natürlichen Zustand" erreichen, d.h. durch Absenken des Redoxpotentials der Fermentationsbrühe.
"Ethanolproduktivität" bedeutet die volumetrische Produktivität von Ethanol, berechnet als Verhältnis der Steady-State-Ethanolkonzentration und der Flüssigkeitsretentionszeit (liquid retention time, LRT) in kontinuierlichen Systemen oder als Verhältnis der Ethanolkonzentration und der zur Erzeugung dieser Konzentration in Batch-Systemen benötigten Zeit. Die Formulierung "hohe Ethanolproduktivität" beschreibt eine volumetrische Ethanolproduktivität von mehr als 10 g/l pro Tag.
Die Formulierung "hohe Konzentration an Ethanol" bedeutet mehr als 10 g/l, vorzugsweise mehr als 15 g/l, Ethanol in der Fermentationsbrühe oder ein Produktverhältnis von Ethanol zu Acetat von 5:1 oder höher.
"Überschüssiges H₂" steht für die Ethanolproduktion zur Verfügung, wenn das Verhältnis der Mole H₂ im Zufuhrgas zur Summe aus den Molen umgesetztes CO mal 2 und den Molen umgesetztes CO₂ mal 3 größer als 1,0 ist. Ist dieses Verhältnis kleiner als 1,0, so ist überschüssiges H₂ nicht verfügbar, und Ethanol läßt sich nur über einen anderen Kontrollmechanismus produzieren.
II. Im Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzte biologische Wege
Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird von den Erfindern die Theorie aufgestellt, daß die Verfahren zur Erhöhung der anaeroben Produktion von Ethanol von den hier beschriebenen Verfahren auf den die Umwandlung von NAD(P)H zu NAD(P) beinhaltenden biologischen Wegen in den grundlegenden Stoffwechselzyklen des acetogenen Wegs für autotrophes Wachstum beruhen. Bei der Erfindung werden diese Wege manipuliert, um eine kontinuierliche Produktion und Aufrechterhaltung hoher Konzentrationen an Ethanol bei geringen Acetatkonzentrationen unter stabilen Betriebsbedingungen zu ermöglichen, wodurch kommerziell geeignete Verfahren zur Ethanolproduktion aus großtechnischen Gasen bereitgestellt werden.
Die essentielle Beteiligung von NAD(P)H zu NAD(P) an den biologischen Wegen läßt sich wie folgt beschreiben: Die Produktion von Ethanol aus gasförmigen Bestandteilen, wie z.B. CO, CO₂ und H₂, erfolgt in einem aus drei Schritten bestehenden biologischen Verfahren. Im ersten Schritt werden dabei die Substrate CO und H₂ oxidiert, wobei NAD(P)H freigesetzt wird: NAD(P) → NAD(P)H CO + H₂ + H₂O → CO₂ + 4H⁺
Die Produkte aus Schritt 1 werden dann zu Essigsäure umgesetzt, ein Schritt, der NAD(P)H erfordert: NAD(P)H → NAD(P) CO + CO₂ + 6H⁺ → CH₃COOH + H₂O
Schließlich wird, falls ein Überschuß an NAD(P)H aufgrund der Tatsache, daß die Reaktion in Schritt 1 mit einer höheren Geschwindigkeit als die Reaktion in Schritt 2 abläuft, zur Verfügung steht, Essigsäure zu Ethanol reduziert. NAD(P)H → NAD(P) CH₃COOH + 4H⁺ → C₂H₅OH + H₂O
Somit führt die Tatsche, daß ein Überschuß an NAD(P)H aus Substratoxidation zur Verfügung steht, zur Produktion von Ethanol aus Essigsäure.
Es gibt zwei bekannte grundlegende Stoffwechselzyklen im acetogenen Weg: (1) den Acetyl-CoA-Zyklus und (2) den THF-Zyklus, in dem CO₂ zu einer Methylgruppe reduziert wird. Die Abfolge für die Erzeugung von Ethanol und Essigsäure daraus ist in R. Phillips et al., 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145 hergestellt. Der Acetyl-CoA-Zyklus weist einen inneren Zyklus auf, der hier als CO-Zyklus bezeichnet wird. Da der CO-Zyklus üblicherweise einen Reaktionsablauf im Uhrzeigersinn aufweist, wird Ferredoxin reduziert. Ferredoxin kann auch durch H₂ reduziert werden, wenn dieses am Enzym Hydrogenase oxidiert wird. Dadurch erfolgt der Reaktionsablauf im Acetyl-CoA-Zyklus ebenso im Uhrzeigersinn, wobei Ferredoxin oxidiert wird. Erfolgen die Reaktionsabläufe des inneren CO-Zyklus und des Acetyl-CoA-Zyklus mit den gleichen Geschwindigkeiten, so befindet sich Ferredoxin im Redoxzustandsgleichgewicht. Finden allerdings diese beiden Zyklen nicht mit der gleichen Geschwindigkeit statt, d.h. erfolgt der Reaktionsablauf des CO-Zyklus mit einer höheren Geschwindigkeit als der des Acetyl-CoA-Zyklus, so wird reduziertes Ferredoxin angereichert. Ebenso kann bei überschüssigem H₂ reduziertes Ferredoxin auch im Überschuß produziert werden. Dieses überschüssige reduzierte Ferredoxin führt zur Regenerierung (Reduktion) von NAD(P) zu NAD(P)H, wodurch ein Überschuß aufgebaut wird, der zum Gleichgewicht abgebaut werden muß, wobei Essigsäure zu Ethanol reduziert wird.
Die Funktion des THF-Zyklus liegt im Zellwachstum, wobei dieser Zyklus für eine kontinuierliche Kultur notwendig ist; daher kann er nicht vollständig gestoppt werden. Eine Verringerung der THF-Zyklusgeschwindigkeit dient auch dazu, ein höheres Verhältnis von NAD(P)H zu NAD(P) herbeizuführen. Dabei wird NAD(P)H an zwei Orten oxidiert. Durch Limitieren dieser Oxidation, wodurch das gesamtzelluläre Verhältnis von NAD(P)H zu NAD(P) im Gleichgewicht gehalten würde, wird das NAD(P)H zur Reduktion von Essigsäure zu Ethanol verwendet.
Ein zweites grundlegendes Verfahren, mit dem Essigsäure zu Ethanol reduziert wird, besteht im direkten Absenken des Redoxpotentials der Fermentationsbrühe. Ein hinreichend niedrigerer Reduktionszustand als der natürliche Zustand der Kultur führt zu einem Überfluß von NAD(P)H und fördert die Reduktion von Essigsäure zu Ethanol.
III. Erfindungsgemäße Verfahren
Die grundlegenden Schritte des Verfahrens umfassen das folgende: ein kontinuierliches Fermentationsverfahren mit Produktgewinnung wird mit Bezug auf 1 beschrieben und beispielhaft in Beispiel 1 unten dargestellt. Ein kontinuierlicher Strom von wenigstens ein Reduktionsgas, z.B. CO oder CO und H₂, umfassendem gasförmigem Substrat 1 wird mit einer ausgewählten Gaszufuhrgeschwindigkeit und einem kontinuierlichen Fluß von in der Flüssigphase befindlichem Nährmedium 2 mit einer ausgewählten Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit einem Fermentationsbioreaktor 3 zugeleitet, der das gegenständliche Bakterium enthält. Im Bioreaktor 3 werden das Medium und das gasförmige Substrat vom Bakterium unter Bildung von Ethanol und Essigsäure fermentiert. Sobald eine stabile Zellkonzentration unter Steady-State-Bedingungen erreicht wird, werden die Bestandteile des kontinuierlichen Systems zur Herabsetzung des Redoxpotentials oder Erhöhung des Verhältnisses von NAD(P)H zu NAD(P) in der Fermentationsbrühe manipuliert, während die Konzentration an freier Essigsäure im Bioreaktor unterhalb 5 g/l gehalten wird. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind dafür vorgesehen, die Produktion von Ethanol und Acetat in der Fermentationsbrühe zu gestatten und aufrechtzuerhalten, so daß die Ethanolproduktivität höher als 10 g/l pro Tag bei einem Verhältnis von Ethanol zu Acetat zwischen 1:1 und 20:1 ist. In einer Ausführungsform ist das Verhältnis größer als 3:1. In einer weiteren Ausführungsform ist das Verhältnis größer als 5:1. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Verhältnis größer als 10:1. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Verhältnis größer als 15:1. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist andererseits bei der Verbesserung der stabilen kontinuierlichen (Steadystate) Produktion hoher Ethanolkonzentrationen (15–35 g/l Ethanol) und niedriger Acetatkonzentrationen (0–5 g/l Acetat), d.h. eines Produktverhältnisses von Ethanol zu Acetat von 3:1 oder höher, aus CO, CO₂ und H₂ bei guter Verfahrensstabilität wirksam.
Während der Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung werden regelmäßig Proben der Brühe entnommen, um das Verhältnis mit einem herkömmlichen Testverfahren zu bestimmen. So werden beispielsweise die Zellen von der Probe z.B. durch Zentrifugation getrennt, wonach die zellfreie Probe einem Testverfahren wie etwa dem bevorzugten Verfahren der Gaschromatographie, unterzogen wird. Allerdings kann der Fachmann auch andere herkömmliche Testverfahren auswählen. Zur Erreichung und/oder Aufrechterhaltung des Verhältnisses werden die zusätzlichen optionalen Schritte des Verfahrens hinzugefügt. Beispiel 2 zeigt ein solches Testverfahren.
Zu den zur Manipulation der Systembestandteile und zur Aufrechterhaltung und/oder Erzielung der gewünschten Ethanolproduktivität oder des Verhältnisses von Ethanol zu Acetat verwendeten Schritten gehören wenigstens einer der und wünschenswerterweise Kombinationen aus den folgenden Schritten: Verändern des Nährmediuminhalts, der Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit, der wäßrigen Zufuhrgeschwindigkeit, des Betriebsdrucks, des Betriebs-pH-Werts, des Gehalts an gasförmigen Substraten, der Gaszufuhrgeschwindigkeit, der Fermentationsbrühenrührgeschwindigkeit, das Vermeiden einer Produkthemmung, das Absenken der Zelldichte im Bioreaktor oder das Verhindern einer Substrathemmung. Zu einigen bevorzugten Manipulationen gehören das Versorgen des Bioreaktors mit einer Nährstoff(Cobalt)-Limitierung in flüssiger Phase unter Verwendung eines leichten Überschusses an CO und H₂ im Zufuhrgas, das Minimieren der Acetatkonzentration, das Vermeiden einer Akklimatisierung der Kultur an niedrige Flüssigphase-Nährstoffkonzentrationen, das Einstellen der Kultur auf eine geeignete Zellkonzentration mit einer relativ schnellen Geschwindigkeit, das Erhöhen des pH-Werts der Kultur auf einen Wert oberhalb von 4,5, das Entfernen von Bakterienzellen aus dem Bioreaktor bis auf eine Zellkonzentration, die niedriger als die stabile Steady-State-Konzentration ist, bei der die gesamten Reduktionsgas- oder Nährstoffsubstrate im Bioreaktor genutzt werden, und Erhöhen der wäßrigen Zufuhrgeschwindigkeit, wenn der Anteil an freier Essigsäure des in der Fermentationsbioreaktorbrühe vorhandenen Acetats 2 g/l überschreitet, wodurch jeglicher unerwünschter Anstieg der Konzentration an freier Essigsäure inhibiert wird. Alle diese Schritte sind unten ausführlich beschrieben.
Andere Gase als CO, CO₂ und H₂ enthaltendes Austrittsgas 4 sowie nicht umgesetztes CO, CO₂ und H₂ aus dem Reaktor werden aus dem Reaktor abgelassen und aufgrund ihres Brennstoffwerts verwendet. Falls überschüssiges H₂ als Kontrollmechanismus eingesetzt wird, werden der H₂-Partialdruck im Auslaßgas sowie das Verhältnis des H₂-Partialdrucks zum CO₂-Partialdruck im Abgangsgas zur Identifizierung der Kontrolle des Verhältnisses von Ethanol zu Acetat mit diesem Schritt verwendet. Ein Zellenrückführungskreislauf wird verwendet (ist jedoch nicht erforderlich), um die Konzentration von Zellen im Bioreaktor zu erhöhen und somit mehr Biokatalysator für die Umwandlung von CO, CO₂ und H₂ bereitzustellen. Beim Zellrückführungskreislauf wird der Flüssigkeitsausfluß aus dem Reaktor 5 an einen Zellseparator 6 geschickt, wo die Zellen 7 und das Permeat (zellfreie Flüssigkeit) 8 getrennt werden. Die Zellen 7 werden zum Bioreaktor zurückgeschickt, und das Permeat 8 wird zur Produktgewinnung geschickt.
Die Zellabtrennung wird unter Verwendung einer Durchflußzentrifuge, eines Hohlfaser- oder Spiralwindungsfiltrationssystems, eines keramischen Filtersystems oder eines anderen Feststoff/Flüssigkeit-Separators bewerkstelligt. Ethanol läßt sich aus dem Permeat (oder alternativ dem Ausfluß aus dem Reaktor 5, falls keine Zellabtrennung eingesetzt wird) mit verschiedenen Techniken, einschließlich Destillation und Adsorption, gewinnen. Das Permeat 8 wird auf einer Destillationskolonne unter Erhalt von 95% Ethanol als Kopfprodukt 10 sowie Wasser 11 zur Kreisführung zurück zum Reaktor 3 getrennt. Das zurückgeführte Wasser 11 enthält in der Fermentation nicht verwertete überschüssige Nährstoffe, doch sind durch die thermische Destillation alle überschüssigen Vitamine aus der Fermentation oder Zellyse zerstört. Das Kopfprodukt 95% Ethanol 10 wird zu einem Molekularsieb 12 geschickt, wo wasserfreies Ethanol 13, das gewünschte Endprodukt, von verdünntem Ethanol 14 getrennt wird, welches zurück zur Destillationskolonne 9 geschickt wird.
Durch die kontinuierliche Kombination von Wachstum, Tod und Zellentfernung wird eine konstante Zellkonzentration aufrechterhalten, so daß ein bei der Produktion von Ethanol (und geringen Mengen an Essigsäure) verwendetes kontinuierliches Verfahren mehrere Monate lang durch Zufuhr von CO, CO₂ und H₂ zusammen mit Nährstoffen ohne zusätzliche Kulturergänzung betrieben werden kann. Durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Bedingungen für die kontinuierliche Ethanol- und Essigsäureproduktion aufrechterhalten und gesteuert und Verfahrensstörungen verhindert oder schnell korrigiert. Ebenso helfen die Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Verhinderung der Akklimatisierung der Kultur an eine geringe Nährstoffkonzentration, die der Kulturleistung abträglich sein kann. In den nachfolgenden Beschreibungen sowie in den Beispielen handelt es sich bei dem verwendeten Druck, falls nicht anders angegeben, um eine Atmosphäre, und die verwendete Temperatur liegt zwischen 36–41°C. Wünschenswerte Temperaturen und Drücke können vom Fachmann je nach dem zur Verwendung im Bioreaktor ausgewählten Mikroorganismus bestimmt werden.
Verschiedene, unten ausführlich beschriebene Manipulationen zusätzlich zu den grundlegenden Schritten der vorliegenden Erfindung gestatten die verbesserte Produktion von Ethanol. Die Limitierung des Flüssig phase-Nährstoffs Pantothenat und vorzugsweise die Limitierung des Flüssigphase-Nährstoffs Cobalt oder die Verwendung von überschüssigem H₂ oder CO sind die unten ausführlich beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrensschritte, die zur Erzielung und Aufrechterhaltung der gewünschten Ethanolproduktivität und Gestatten der Produktion stabiler Konzentrationen und Verhältnisse von Ethanol zu Acetat in der Fermentationsbrühe verwendet werden. Diese Bedingungen gestatten die Erzeugung stabiler Konzentrationen an Ethanol und Acetat in der Fermentationsbrühe. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das in der Fermentationsbrühe produzierte Produktverhältnis von Ethanol zu Acetat mehr als 10:1, wobei die Ethanolkonzentration höher als 15 g/l ist.
A. Limitierung von Calciumpantothenat
Die Manipulation der biologischen Wege zur Begünstigung der Ethanolproduktion und Limitierung der Essigsäureproduktion beinhaltet das Limitieren der Menge an Calciumpantothenat im Nährstoffmedium auf eine Menge, die weniger als die zur Aufrechterhaltung des Bakteriums bei einer stabilen, Steady-State-Konzentration, bei der das bereitgestellte Calciumpantothenat vollständig verwertet würde, erforderliche Menge beträgt. Pantothenat ist ein Bestandteil von Acetyl-CoA, und daher wird durch Limitieren des Calciumpantothenats im Nährmedium die Acetyl-CoA-Zyklusgeschwindigkeit relativ zur CO-Zyklusgeschwindigkeit reduziert. Dadurch wird reduziertes Ferrodoxin angereichert und NAD(P) zu NAD(P)H reduziert, wodurch die Produktion von Ethanol als Endprodukt erhöht wird.
Eine Pantothenatlimitierung wird beobachtet, wenn Calciumpantothenat im Bereich von 0,5 bis 50 Mikrogramm (μg) pro Gramm (g) im Reaktor produzierte Zellen (Trockengewicht) dem Reaktor zugeführt wird. Eine wünschenswertere Pantothenatlimitierung liegt im Bereich von 2 bis 50 μg Calciumpantothenat pro Gramm (g) im Reaktor produzierte trockene Zellen. Eine weitere Ausführungsform dieser Limitierung liegt bei etwa 1–25 μg Calciumpantothenat pro Gramm (g) im Reaktor produzierte trockene Zellen. Eine weitere Ausführungsform dieser Limitierung liegt bei etwa 10–30 μg Calciumpantothenat pro Gramm (g) im Reaktor produzierte Zellen. Durch diese Menge des Nährstoffs wird die Ethanolproduktion gegenüber der Acetatproduktion bevorzugt unterhalten. Eine Ausführungsform dieses Verfahrens ist in Beispiel 4 dargestellt.
In einem weiteren Aspekt dieses Verfahrens wird die Akklimatisierung des Bakteriums in Fermentationsbioreaktor an eine geringe limitierende Calciumpantothenatkonzentration vermieden, indem die Fermentationsparameter reguliert oder angepaßt werden, so daß eine konstante Calciumpantothenatkonzentration aufrechterhalten wird, während wenigstens einer und manchmal mehr als einer der Parameter Gaszufuhrgeschwindigkeit, Flüssigkeitszufuhrgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit bzw. H₂-Partialdruck angepaßt wird. Größere Änderungen der Nährstoffe werden vermieden, doch wird eine relativ konstante Nährstoffzufuhrkonzentration aufrechterhalten. Läßt man die Kultur an geringe limitierende Nährstoffe in der Flüssigphase akklimatisieren, so werden in einem irreversiblen Verfahren schlechte Produktverhältnisse von 1,0 g Ethanol/g Acetat oder weniger erhalten. Somit ist ein Herunterfahren des Reaktors und eine Neuanimpfung notwendig. Vorzugsweise wird der biologische Weg zur Begünstigung der Ethanolproduktion und Limitierung der Essigsäureproduktion gesteuert, indem zunächst überschüssiges H₂ in Zufuhrgas dem Bioreaktor zugeliefert und anschließend Calciumpantothenat im Nährmedium wie oben beschrieben limitiert wird.
Beim Hochfahren wird tatsächlich der normalerweise limitierende Flüssigphasennährstoff Calciumpantothenat im Überschuß gehalten, um eine Akklimatisierung an niedrige Nährstoffkonzentrationen zu vermeiden, ein Zustand, der zu einer sehr schwachen Leistung und dem Verlust der Fähigkeit der Kultur, hohe Ethanolproduktivitäten von mehr als 10 g/l pro Tag zu erzielen, falls überschüssiges H₂ nicht eingesetzt wird, führen kann. Ein Beispiel für eine derartige Regulierung der Fermentationsparameter für eine bestimmte Bakterienkultur ist in Beispiel 17 dargestellt.
B. Limitierung von Cobalt
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Menge an Cobalt im Nährmedium auf eine Menge limitiert, die weniger als die zur Aufrechterhaltung des Bakteriums bei einer stabilen Steady-State-Konzentration, bei der das bereitgestellte Calciumpantothenat vollständig verwertet würde, erforderliche Menge beträgt, wodurch eine weitere Manipulation der biologischen Wege zur Begünstigung der Ethanolproduktion und Limitierung der Essigsäureproduktion erfolgt. Eine Cobaltlimitierung wird dabei beobachtet, wenn Cobalt im Bereich von 5 bis 100 Mikrogramm (μg) pro Gramm (g) im Bioreaktor produzierte Zellen (Trockengewicht) dem Reaktor zugeführt wird. Vorzugsweise wird bei einer Cobaltlimitierung der Reaktor mit zwischen etwa 20 und 50 μg Cobalt pro Gramm im Reaktor produzierten Zellen versorgt. Durch diese Menge an Cobalt wird die Ethanolproduktion bevorzugt zum Acetat im Prozeß unterhalten. In Beispiel 18 ist eine Ausführungsform des Verfahrens der Limitierung von Cobalt an den Reaktor gemäß dem vorliegenden Verfahren dargestellt.
Die Limitierung von Cobalt in der Fermentationsbrühe kann auch die Acetyl-CoA-Zyklusgeschwindigkeit reduzieren. Da Cobalt zur Übertragung einer Methylgruppe aus dem THF-Zyklus in den Acetyl-CoA-Zyklus verwendet wird, wird durch die Limitierung der Menge an Cobalt in der Fermentationsbrühe auch die Funktion des THF-Zyklus reduziert, indem die Übertragung nicht gestattet wird. Eine Cobaltlimitierung reduziert die Geschwindigkeit des THF-Zyklus, was auch zu einem höheren Verhältnis von NAD(P)H zu NAD(P) und damit zur Produktion von Ethanol führt.
Das Verfahren wird ferner dahingehend manipultiert, daß man eine Akklimatisierung an eine niedrige limitierende Cobaltkonzentration verhindert. Auf weitgehend ähnliche Weise, wie die Akklimatisierung auf niedrige Pantothenatkonzentrationen vermieden wird, wird eine konstante Cobaltkonzentration aufrechterhalten, während einer oder mehrere der Fermentationsparameter (Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, CO₂-Gehalt und H₂-Gaspartialdruck) angepaßt werden. Größere Änderungen der Nährstoffe werden vermieden, doch wird statt dessen eine relativ konstante Nährstoffzufuhrkonzentration aufrecht erhalten. Ein Beispiel für eine solche Regulierung der Fermentationsparameter für eine bestimmte Bakterienkultur ist in Beispiel 19 dargestellt.
Vorzugsweise wird der biologische Weg zur Begünstigung der Ethanolproduktion und Limitierung der Essigsäureproduktion gesteuert, indem zunächst dem Reaktor überschüssiges H₂ zugeführt und anschließend Cobalt im Nährmedium wie oben beschrieben limitiert wird. Beim Hochfahren wird der limitierende Flüssigphase-Nährstoff Cobalt im Überschuß gehalten, um eine Akklimatisierung an eine niedrige Nährstoffkonzentration zu vermeiden, einen Zustand, der zu einer sehr schlechten Kulturleistung sowie dem Verlust der Fähigkeit der Kultur, Produktverhältnisse größer als 1:1 zu erzeugen, führen kann.
C. Überversorgung mit Wasserstoff
In einer weiteren Ausführungsform beinhaltet die Manipulation der biologischen Wege zur Begünstigung der Ethanolproduktion und Limitierung der Essigsäureproduktion ferner die Zufuhr von überschüssigem H₂ im Zufuhrgas oder die Limitierung von gasförmigem Kohlenstoff, was zu überschüssigem H₂ führt, das anschließend im biologischen Weg verbraucht wird. Vorzugsweise befindet sich das H₂-Reduktionsgas gegenüber CO im Überschuß, wobei das überschüssige H₂ das Bakterium dazu veranlaßt, ein hohes Verhältnis von Ethanol zu Acetat in der Fermentationsbrühe zu produzieren. Falls das Verhältnis des H₂ (Mole zugeführtes Gas) zur Summe des umgesetzten CO (in Molen Gas) mal 2 und dem umgesetzten CO₂ (in Molen Gas) mal 3 größer als 1 ist, so ist der Fermenter kohlenstofflimitiert. Dabei ist der im Abgangsgas vorhandene H₂-Partialdruck vorzugsweise höher als 0,4 atm. Schließlich muß das Verhältnis von H₂-Partialdruck zu CO₂-Partialdruck größer als 3,0 sein, um sicherzustellen, daß ausreichend H₂ zur Verwertung des gesamten CO₂ zu Verfügung steht. Ist der CO₂-Partialdruck größer als 0,1 atm, so ist es wahrscheinlich, daß das Wachstum sonstwie limitiert wurde. Siehe Beispiel 20 bezüglich einer Darstellung dieses Verfahrensschritts.
Während des Hochfahrens ist die Verwendung von überschüssigem H₂ gegenüber der Nährstofflimitierung bevorzugt, hauptsächlich deswegen, weil dies leichter zu steuern ist. Die Vorteile eines Einsatzes von überschüssigem H₂ bestehen darin, daß eine Produktion von überschüssiger Essigsäure vermieden wird, was zu schlechten Produktverhältnissen und einer möglichen Essigsäurehemmung ebenso wie einer Anpassung an niedrige Nährstoffkonzentrationen führen kann.
D. Überversorgung mit Kohlenmonoxid
Eine weitere Manipulation der Komponenten des Verfahrens wird durch Überversorgung mit dem Reduktionsgas CO im gasförmigen Substrat zur Verwendung in dem Weg erzielt, was einer direkten Erniedrigung des Redoxpotentials in der Fermentationsbrühe dient. Somit wird gemäß dieser Ausführungsform der Bioreaktor mit CO₂ umfassendem gasförmigem Substrat versorgt, wobei die Menge an im Bioreaktor vorhandenem CO größer ist als die Menge, die zur Aufrechterhaltung des Bakteriums bei einer stabilen Steady-State-Konzentration, bei der das bereitgestellte CO vollständig verbraucht würde, erforderlich ist. Eine CO-Überversorgung als Verfahren zur Begünstigung der Ethanolproduktion gegenüber der Essigsäureproduktion erfolgt, wenn die spezifische Geschwindigkeit der CO-Aufnahme (Millimol CO pro Gramm Zellen (Trockengewicht) im Reaktor pro Minute bzw. mmol/g Zellen·min) größer als 0,5 ist. Dies bedeutet, daß jede Zelle im Durchschnitt in ihrem Stoffwechsel CO mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 0,5 mmol/g·min verwertet. Das CO wird vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit bereitgestellt, bei der die CO-Aufnahme 0,5 bis 2 mmol CO/Gramm Bakterienzellen (Trockengewicht) pro Minute beträgt. In einer weiteren Ausführungsform wird das CO mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 1,5 mmol CO/Gramm Bakterienzellen (Trockengewicht) pro Minute bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird das CO mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 mmol CO/Gramm Bakterienzellen (Trockengewicht) pro Minute bereitgestellt. Eine Ausführungsform dieses Verfahrensschritts ist in Beispiel 24 dargestellt.
Bei dieser Geschwindigkeit der CO-Aufnahme wird die Ethanolproduktion gegenüber der Acetatproduktion bevorzugt unterhalten. Wird CO so zugeleitet, daß das gelöste CO in der Fermentationsbrühe aufgrund des Gasdrucks oder eines extrem guten Stoffübergangs signifikant ist, wird die Fermentationsbrühe stärker reduziert. Eine Überversorgung mit CO hat zwei weitere Vorteile. Überschüssiges CO kann dazu führen, daß der CO-Zyklus mit einer höheren Geschwindigkeit abläuft und, falls der Acetyl-CO-Zyklus sonstwie limitiert ist und mit dem CO-Zyklus nicht schritthalten kann, reduziertes Ferridoxin angereichert wird. CO kann auch Schritt 2 (Produktion der Zwischenstufe Essigsäure) im insgesamt aus drei Schritten bestehenden Verfahren über Substrathemmung verlangsamen. Diese geringere Geschwindigkeit von Schritt 2 im Verhältnis zu Schritt 1 führt zu einem Überschuß an NAD(P)H, was eine Begünstigung der Ethanolproduktion gegenüber Essigsäure ergibt.
Zwar kann überschüssiges CO durch direkte Reduzierung des Redoxpotentials der Fermentationsbrühe zu einer erhöhten Ethanolproduktion führen, doch hemmt das Vorhandensein von überschüssigem CO auch das Wachstum durch Hemmung der CO-Dehydrogenase und daher die Aufnahme von H₂. Das Vorhandensein von überschüssigem CO führt unglücklicherweise auch zu einer schlechten H₂-Umsetzung, was ökonomisch ungünstig sein kann. Die Folge eines längeren Betriebs unter Substrathemmung ist eine schlechte H₂-Aufnahme. Dies verursacht letztendlich Zellyse und macht den Neustart des Reaktors notwendig. Falls als unbeabsichtigtes Ergebnis dieses Verfahrens eine CO-Substrathemmung (das Vorhandensein von zu viel CO für die verfügbaren Zellen) bei Beginn des Wachstums der Kultur oder danach vorliegt, wird die Gaszufuhrgeschwindigkeit und/oder Rührgeschwindigkeit reduziert, bis die Substrathemmung aufgehoben ist. Eine Veranschaulichung davon, wie man die Gasgeschwindigkeit oder Rührgeschwindigkeit anpaßt, um diese Wirkung zu erzielen, ist in Beispiel 21 dargestellt.
E. Zusätzliche Manipulierungsschritte
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Hauptschritten zur Verbesserung des Verfahrens sind mehrere Verfahrensschritte wünschenswerterweise im Ethanolproduktionsverfahren mit enthalten.
1. Erhöhung des Stoffübergangs
Bei einer solchen zusätzlichen Ausführungsform wird sichergestellt, daß der Stoffübergang des CO oder CO und H₂ aus der Gaszufuhr zur flüssigen Fermentationsbrühe schneller erfolgt als die Fähigkeit des Bakteriums, die gelösten Gase zu verwerten. Wird beispielsweise einem C. ljungdahlii enthaltendem Bioreaktor CO, CO₂ und H₂ zugeführt und dieser Bioreaktor ohne Limitierung von Nährstoffen (wie z.B. Pantothenat oder Cobalt) oder das Vorhandensein von überschüssigem H₂ betrieben, so ist das Zellwachstum durch die Menge an in die Flüssigphase übergegangenem Gas limitiert, und das System produziert Essigsäure als Produkt. Wird der Kultur ein geringer Überschuß an CO oder Co und H₂ gegenüber der für das Kulturwachstum benötigten Menge zugeführt, so produziert sie Ethanol. Geht jedoch zu viel Gas für den Verbrauch durch die Kultur in die Flüssigphase über, so erfolgt eine Substrathemmung, die zur Störung der Kultur und zum Zelltod führen kann. Somit besteht beim Stoffübergang im Überschuß ein sehr enger Betriebsbereich. In Beispiel 22 ist dieses Verfahren dargestelt.
In bezug auf den Acetyl-CoA-Zyklus muß für eine Überschußproduktion des reduzierten Ferridoxins der CO-Zyklus oder die Reduktion des Ferridoxins durch Hydrogenase schneller ablaufen als der Acetyl-CoA-Zyklus. Durch die hier beschriebenen Verfahren wird die Geschwindigkeit, mit der die Organismen die gelösten Gase verwerten können, limitiert, indem die Geschwindigkeit, mit der essentielle Nährstoffe, z.B. Calciumpantothenat oder Cobalt oder andere Substrate wie z.B. CO₂-Gas, dem Bakterium zur Verfügung gestellt werden, beschränkt oder die Kultur mit überschüssigem Substrat, H₂ oder CO versorgt wird.
Eine theoretische Stoffübergangsgeschwindigkeit, die schneller ist als die Geschwindigkeit, mit der das Bakterium Substrat verbrauchen kann, selbst ohne weitere Limitierung, läßt sich berechnen. Bei Erreichen dieser Geschwindigkeit wird diese durch die natürliche Wachstumsgeschwindigkeit des Organismus limitiert. Daher ist diejenige Ausführungsform am produktivsten, bei der die Stoffübertragung (Gasstromgeschwindigkeit oder Rührgeschwindigkeit) schneller ist als die Geschwindigkeit mit der die größtmögliche Konzentration an Zellen das Substrat ohne jede Limitierung verwerten kann. Dabei würde ein sehr enger Betriebsbereich vorliegen, da eine Substrathemmung schnell zum Zelltod und einer Nebenproduktkonzentration, die für die Kultur toxisch ist, führen könnte.
2. Zuleitung von überschüssigem CO und H₂
In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine Stabilität der Produktion von hoher Ethanolkonzentration/limitierter Essigsäure in denjenigen Verfahren erzielt, bei denen Cobalt oder Calciumpantothenat limitiert ist oder ein Überfluß an CO oder Co und H₂ bereitgestellt wird. Da die Kultur die gasförmigen Substrate CO, H₂ und CO₂ als Kohlenstoff- und Energiequellen verwendet, werden gemäß diesem Schritt CO und H₂ in leichtem Überschuß zugeleitet. Ein leichter Überschuß an CO und H₂ läßt sich erzielen, indem man einen gleichmäßigen Betrieb erreicht und dann allmählich die Gaszufuhrgeschwindigkeit und/oder Rührgeschwindigkeit (in Schritten von 10% oder weniger) erhöht, bis die CO- und H₂-Umsetzungen gerade abzufallen beginnen. Dies ist ein Mittel zur Vermeidung einer Stoffübergangslimitierung, die die Essigsäureproduktion begünstigt, und zur Zuleitung von überschüssigem reduziertem Ferridoxin, um NAD(P) zu NAD(P)H zu reduzieren und Ethanol zu produzieren. Falls CO und H₂ nicht in leichtem Überschuß zugeleitet werden, findet eine Stoffübergangslimitierung statt, wobei der Weg im Gleichgewicht vorliegt. Dies führt zu schlechten Produktverhältnissen von Ethanol zu Acetat (hohe Acetatkonzentrationen). Hohe Acetatkonzentrationen können letztendlich zu einer Essigsäurehemmung führen, die die Fähigkeit des Bakteriums zur Aufnahme von H₂ einschränkt und schließlich ein Versagen der Kultur herbeiführen kann.
Schritte zur Vermeidung einer Stoffübergangslimitierung umfassen eine Erhöhung der Rührgeschwindigkeit oder Gasgeschwindigkeit, damit mehr CO und H₂ in die Flüssigphase übergehen kann und somit wieder ein leichter Überschuß an CO und H₂ vorhanden ist. Falls eine Produkthemmung als Ergebnis der Stoffübergangslimitierung auftritt, ist es notwendig, die Flüssigkeitszufuhrgeschwindigkeit zur Entfernung der Essigsäurehemmung zu erhöhen, indem auf eine niedrigere sich ergebende Acetatkonzentration verdünnt wird. Da die Erhöhung der Mediumzufuhrgeschwindigkeit die μg an produziertem Pantothenat oder Cobalt pro g Zelle erhöhen würde, darf dies nur kurzzeitig durchgeführt werden, oder das überschüssige Pantothenat bzw. Cobalt muß durch Anpassen der Mediumkonzentration oder Erhöhen der Wasserzufuhrgeschwindigkeit entfernt werden.
3. Kontrolle der Essigsäureprodukthemmung
Dort, wo in den oben beschriebenen Verfahren eine Essigsäureprodukthemmung stattfinden kann, falls zu viel molekulare Essigsäure, d.h. > 2 g/l im Bioreaktor angereichert wird, um Zellwachstum zu gestatten und die Ethanolproduktion zu fördern. Ein weiterer Manipulierungsschritt wird zur Vermeidung eines Versagens der Kultur verwendet. Dabei beinhaltet eine Modifikation kurz gesagt die Erhöhung der Flüssigkeits- oder wäßrigen Zufuhrgeschwindigkeit, um die Flüssigphasenkonzentration der hemmenden Essigsäure auf weniger 2 g/l zu reduzieren. Eine Veranschaulichung dieses Schritts für eine bestimmte Kultur in einem Reaktor ist in Beispiel 23 gezeigt.
4. Wasserrückführungsschritt
Noch ein weiterer optionaler Verfahrensschritt zur Aufrechterhaltung einer stabilen Kultur, die Ethanol als einziges Produkt bei keiner Nettoproduktion von Essigsäure in den Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert, beinhaltet das Hinzufügen einer Wasserrückführung im Kreislauf aus der Destillation zurück zum Fermentationsreaktor (siehe z.B. Beispiel 15). Wie zuvor angemerkt wurde, weist die Rückführung von Wasser (mit bis zu 5 g/l Acetat) den Vorteil auf, daß das produzierte Acetat im Kreislauf zurück zum Reaktor geführt wird, so daß keine Essigsäure netto produziert wird. Somit wird ein Gleichgewicht zwischen dem Ethanol und dem Acetat im Reaktor hergestellt. Als Ergebnis führt das gesamte dem Reaktor zugeführte und zu Produkten umgesetzte CO, CO₂ und H₂ zur Produktion von Ethanol, mit Ausnahme des für die Aufrechterhaltung der Kultur verwendeten Anteils.
5. Verringerung der Zelldichte
Ein weiterer im Verfahren geeigneter Manipulierungsschritt besteht in der Durchführung eines in regelmäßigen Abständen erfolgenden oder kontinuierlichen Entfernens von Bakterienzellen aus dem Bioreaktor, um die Zellkonzentration im Bioreaktor zu verringern. Diese Manipulation dient der Verringerung der Zellkonzentration auf unterhalb einer stabilen, Steady-State-Zellkonzentration, bei der das gesamte Reduktionsgas bzw. die gesamten Nährsubstrate im Bioreaktor verwertet werden. Indem auf diese Weise die Zelldichte verändert wird, wird die Produktion von Ethanol gegenüber der Produktion von Acetat im Bioreaktor begünstigt. Siehe z.B. Beispiel 25.
6. Zwei-Stufen-CSTR
Eines der mit der Ethanolproduktion mit Mediumlimitierung verbundenen Probleme besteht in der Fähigkeit oder Neigung der Kultur, sich letztendlich an die limitierenden Bedingungen anzupassen und nach mehreren Monaten Betrieb Ethanol nicht länger zu produzieren. Statt dessen wird schließlich Acetat zum dominierenden Produkt. Diese Akklimatisierung an limitierende Nährstoffkonzentrationen führt zu einer Kultur, die mehr Essigsäure als Ethanol produziert (Produktverhältnis von Ethanol zu Acetat von 1,0 oder weniger) und geringe Ethanolkonzentrationen (manchmal bis hinab zu 1 g/l) ergibt. Eine Anpassung findet am wahrscheinlichsten dann statt, wenn die Kultur nicht mit ausreichend Nährstoffen während des Hochfahrens versorgt wird, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit wichtiger ist als die Ethanolproduktionsgeschwindigkeit. Darüber hinaus besteht die Gefahr, daß die Kultur während des Steady-State-Betriebs sich an die niedrigen limitierenden Nährstoffkonzentrationen akklimatisieren kann, insbesondere da die limitierenden Nährstoffkonzentrationen auf niedrigere Werte eingestellt werden, um das Reaktionssystem von Acetat zu befreien.
Zur Vermeidung dieser Anpassung bei der Verwendung der obigen Pantothenat- oder Cobalt-limitierenden Schritte, statt der Kultur das Wachstum mit den verfügbaren Nährstoffen zu gestatten, sowie der oben erwähnten Gefahr kann eine weitere Modifikation des Verfahrens eingesetzt werden. Bei einem Zwei-Stufen-CSTR-System, bei dem ein gutes Kulturwachstum vorwiegend in der ersten Stufe bei einem leichten Überschuß an limitierenden Nährstoffen (möglicherweise mit einer begleitenden Essigsäureproduktion) stattfindet, gefolgt von einer Produktionsstufe, bei der die Kultur aus der ersten Stufe nun durch den limitierenden Nährstoff limitiert ist und zur Produktion hoher Konzentrationen von Ethanol verwendet wird, handelt es sich um eine weitere Modifikation des Verfahrens. Diese Modifikation ermöglicht die Aufrechterhaltung einer stabilen Kultur, die sich nicht an reduzierte Pantothenat- oder Cobaltkonzentrationen akklimatisiert. Diese Modifikation beinhaltet den Betrieb eines Zwei-Stufen-CSTR, bei dem ein Wachstumsreaktor (Stufe 1) zur Zufuhr an einen Produktionsreaktor (Stufe 2), wo der Hauptteil der Ethanolproduktion stattfindet. Der Wachstumsreaktor wird nicht mit den oben beschriebenen Nährstofflimitierungsschritten betrieben, so daß die Kultur nicht so anfällig für eine Akklimatisierung an einen limitierten Zustand ist.
Ein schematisches Diagramm dieses Zwei-Stufen-CSTR-Systems ist in 2 gezeigt, wobei sich die folgende Beschreibung auf diese Abbildung bezieht. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Wachstumsstufe bei einer Flüssigkeitsretentionszeit (liquid retention time, LRT) von etwa 24 Stunden betrieben. Dem Wachstumsstufe-CSTR 1 wird Pantothenat oder Cobalt im Medium 2 zugeführt, so daß eine gesunde Kultur erhalten wird (wobei ebenso etwas Essigsäure produziert werden kann). Somit wird im Reaktor ein Überschuß an Essigsäure produziert, jedoch bei erhöhter Stabilität. Diese Pantothenat- bzw. Cobaltkonzentration liegt im Überschuß gegenüber dem, was normalerweise einem einzigen zur Produktion von Ethanol verwendeten CSTR zugeführt würde, vor. Bei der Gaszufuhr zu diesem Reaktor handelt es sich um nicht umgesetztes Gas 3 aus der Produktionsstufe 4 und bei der Flüssigkeitszufuhr um frisches Medium 2. Der Wachstumsstufe-CSTR wird ohne Zellrückführung betrieben. Der Zweck dieses Wachstumsstufe-Reaktors besteht darin, eine gesunde Kultur für die spätere Ethanolproduktion bereitzustellen, die sich nicht an niedrige Pantothenatkonzentrationen akklimatisiert.
Der Produktionsstufe-Reaktor 4 wird bei einer nominalen LRT von weniger als 20 Stunden betrieben. Diesem CSTR mit Zellrückführung wird eine frische Gaszufuhr 5 zugeführt, wobei er geringe Umsetzungen aufweisen kann.
Dabei wird ihm frische Mediumzufuhr 6 ebenso wie Kulturzufuhr 7 aus der Wachstumsstufe zugeführt. Diesem Reaktor wird eine Minimalmenge an Pantothenat bzw. Cobalt zugeführt, da der Überschuß aus der Wachstumsstufe zur Verfügung steht. In diesem Reaktor wird die Zellrückführung 8 verwendet, um die beste Produktion von den zum Reaktor 9 zurückgeschickten Zellen zu erhalten. Die Abgangsethanolkonzentration im flüssigen Produkt 10 sollte mehr als 20 g/l betragen. Zu den Merkmalen des Zwei-Stufen-CSTR-Systems gehören wenig Änderung hinsichtlich Akklimatisierung an niedrige Pantothenat- oder Cobaltkonzentrationen; eine Gesamt-LRT von 30 Stunden oder weniger; eine erweiterte höhere Ethanolproduktivität und höhere Ethanolkonzentration als von einem Einzel-CSTR der gleichen Größe.
7. Hochfahrmodifikationen
Noch weitere Verfahrensschritte, die vorzugsweise bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beinhalten die Zellproduktion beim Hochfahren der Fermentationskultur zu Beginn. Das Hochfahren eines Bioreaktors, dem CO, CO₂ und H₂ zur Produktion von Ethanol und Essigsäure zugeführt werden, wird durch eine Batch-Animpfung von einer Stammkultur (Beispiel 11) oder durch den Einsatz einer kontinuierlichen Animpfkultur aus einem bestehenden Reaktor als Kulturzufuhr (Beispiel 12) bewerkstelligt. Wie zuvor bei der Erörterung zur Vermeidung einer Akklimatisierung der Kultur an geringe Pantothenat- oder Cobalt-Konzentrationen angemerkt wurde, wird die Kultur in höchst wünschenswerter Weise auf eine hohe Zellkonzentration vor der Limitierung der Nährstoffe gebracht, wobei jedoch der Kultur H₂ im Überschuß zugeleitet wird. Durch dieses schnelle Hochfahren vermeidet man eine Akklimatisierung der Kultur und erzielt gute Produktverhältnisse (hohe Ethanol- und niedrige Acetatkonzentrationen). Falls das schnelle Hochfahren nicht zum Einsatz kommt, können schlechte Produktverhältnisse auftreten, und die Kultur kann sich an geringe Flüssigphase-Nährstoffkonzentrationen akklimatisieren und eine Neuanimpfung des Reaktors erfordern.
Der Reaktor wird mit einer Batch-Flüssigphase (Flüssigmedium wird zunächst nicht kontinuierlich dem Reaktor zugeführt) bei niedrigen Rührgeschwindigkeiten (etwa 400–600 UpM in einem Bioflo^®-Laborreaktor von New Brunswick Scientific) und dem gewünschten pH-Wert gestartet. Die Flüssigphase im Reaktor besteht somit aus einer Charge Nährmedium mit Vitaminen und Salzen und einer nominalen Konzentration an limitierendem Nährstoff, entweder Calciumpantothenat- oder Cobalt (beispielsweise 20 μg/l Pantothenat oder 75 ppb Cobalt). Falls eine kontinuierliche Animpfkultur aus einem bestehenden Reaktor zum Einsatz kommt, ist der Betrieb mit einer Batch-Flüssigphase wahrscheinlich nicht notwendig. In diesem Fall wird Gas dem Reaktor während des Hochfahrens zu Beginn mit einer langsamen Geschwindigkeit kontinuierlich zugeführt. Dabei wäre die Gasphase idealerweise beim Hochfahren CO₂-frei, reich an H₂, wobei die Gasgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeit auf niedrigem Niveau gehalten würden, um eine CO-Substrathemmung zu vermeiden.
Eine beispielhafte allgemeine Vorschrift zum Hochfahren für die Erzeugung und Aufrechterhaltung kommerziell realisierbarer Ethanolkonzentrationen aus CO, CO₂ und H₂ besteht aus drei unterschiedlichen Phasen: (a) Hochfahren zu Beginn, wobei die Zellproduktion kritisch ist; (b) Hochfahren, wobei die Produktionsgeschwindigkeit zum kritischen Faktor wird; und (c) Steady-State-Betrieb. Dabei ist das Hochfahren zu Beginn im wesentlichen durch die Animpfung einer Batch-Flüssigkeit mit einem nominalen limitierenden Nährstoff, ausgewählt aus Cobalt (75 ppb) oder Calciumpantothenat (20 μg/l), bei einem gewünschten pH- Wert (typischerweise 4,5–5,5) gekennzeichnet. Um das Hochfahren zu erleichtern, werden die Gaszufuhr und die Rührgeschwindigkeit vorzugsweise niedrig gehalten, während H₂ im Überschuß zugeführt wird. Der Grund für eine Ethanolproduktion während des Hochfahrens ist überschüssiges H₂; die Nährstofflimitierung tritt später auf. Somit sind überschüssige Flüssignährstoffe tatsächlich während des Hochfahrens vorhanden, um eine unerwünschte Akklimatisierung der Kultur an geringe Nährstoffe zu vermeiden. Mit Fortschreiten der Fermentation über einen Zeitraum von mehreren Stunden nach der Animpfung wird CO₂ produziert und H₂ verbraucht. Die Änderungen dieser Geschwindigkeiten deuteten an, daß die Rührgeschwindigkeit nominal langsam ansteigen sollte (etwa um 200–300 UpM in einem Laborreaktor über einen Zeitraum von 2–3 Tagen), um eine Stoffübergangslimitierung zu vermeiden.
Dieser Beginn der CO₂-Produktion erfolgt wesentlich rascher in Systemen, bei denen eine kontinuierliche Animpfung im Gegensatz zu einer Batch-Animpfung aus einer Stammlösung eingesetzt wird. Wird die Rührgeschwindigkeit allerdings zu schnell erhöht, findet eine CO-Substrathemmung statt. Dieses Vorgehen einer Beobachtung der H₂-Umsetzung (oder CO₂-Produktion) bei einer nominalen Erhöhung der Rührgeschwindigkeit erfolgt mit einer relativ schnellen Geschwindigkeit, bis die Zielrührgeschwindigkeit erreicht ist. Während dieser Periode der Erhöhung der Rührgeschwindigkeit in der Batch-Flüssigkultur ist die Zellproduktion und nicht die Produktbildung von äußerster Wichtigkeit.
Sobald die Zielrührgeschwindigkeit erreicht ist (800–1000 UpM im Bioflo^®-Reaktor von New Brunswick Scientific), läßt man die Kultur stabil werden, um die H₂-Aufnahme zu bestätigen. Dabei geht die Hochfahrphase in einen Modus über, bei dem die Produktionsgeschwindigkeit wichtig wird. Dabei ist es wünschenswert, daß CO-Umsetzungen von mehr als 80% sowie ein hoher H₂- Partialdruck im Abgangsgas (wenigstens 0,55 atm) vorliegen, um die Ethanolproduktion bei Limitierung von Acetat und der Konzentration an freier molekularer Essigsäure zu gewährleisten. Anschließend wird die Flüssigmediumzufuhrgeschwindigkeit hochgefahren (für Systeme mit Batch-Animpfung aus einer Stammlösung), um die kontinuierliche Flüssigkeitszufuhr zu starten, und die Gasgeschwindigkeit wird in Schritten von jeweils 10% auf die Zielströmungsgeschwindigkeit erhöht. Dabei verbleibt H₂ im Überschuß, um eine Produktion überschüssiger Essigsäure zu vermeiden. Mit Erhöhung der Gasgeschwindigkeit werden die Flüssigphase-Nährstoffe limitiert (Calciumpantothenat oder Cobalt), wobei der Effekt einer solchen Limitierung in einem leichten Abfall der H₂-Umsetzung bei der Zielproduktion besteht.
Beim Steady-State-Betrieb wird eine Produktion von 15–35 g/l Ethanol und 0–5 g/l Acetat erreicht. Auf dieser Stufe müssen geringe Anpassungen der limitierenden Nährstoffe, der Flüssigkeitszufuhrgeschwindigkeiten und der Gaszufuhrgeschwindigkeiten vorgenommen werden, die vom Fachmann unter Zurückgreifen auf Fachwissen ebenso wie auf die Lehren der vorliegenden Erfindung gewählt werden. Falls eine Zellrückführung dem Verfahren zur Ethanolproduktion hinzugefügt werden soll, so erfolgt dies zu diesem Zeitpunkt zusammen mit einer Anpassung der Gasgeschwindigkeit (Erhöhung) und der Nährstoffkonzentration (Reduzierung).
Mit den oben beschriebenen Verfahren zur kontinuierlichen Produktion und Aufrechterhaltung hoher Konzentrationen an Ethanol mit geringen Konzentrationen des Nebenprodukts Acetat unter stabilen Bedingungen wird die Verwendung der gegenständlichen Bakterien im großtechnischen Maßstab zur Ethanolproduktion verbessert. Mit den bei den obigen Verfahren gezeigten Schritten werden die Beschränkungen einer Nutzung der gegenständlichen Bakterien für die kommerzielle Ethanolproduktion aus CO, CO₂ und H₂ überwunden. Vorzugsweise wird beim Verfahren ein kontinuierlicher Bioreaktor eingesetzt, obwohl Batch- und Fed-Batch-Fermentationsverfahren auch verwendet werden, jedoch wahrscheinlich für eine Ethanolproduktion im großen Maßstab ökonomisch nicht realisierbar sind.
In den folgenden Beispielen werden verschiedene Aspekte, Verfahren und Verfahrensschritte gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt. Diese Beispiele stellen keine Beschränkung der Erfindung dar, deren Umfang in den beigefügten Ansprüchen umfaßt ist, wobei diejenigen Beispiele, wie z.B. Beispiel 3, in denen Vorgehensweisen außerhalb von Anspruch 1 verwendet werden (überschüssiges Pantothenat bei Beispiel 3), lediglich zu Vergleichszwecken angeführt sind.
BEISPIEL 1. BEISPIELHAFTES VERFAHREN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Ein CO mit oder ohne CO₂/H₂ enthaltendes Synthese- oder Abgas wird kontinuierlich in einen Rührkessel-Bioreaktor, der einen C. ljungdahlii-Stamm enthält, zusammen mit einem herkömmlichen Flüssigmedium mit Vitaminen, Spurenmetallen und Salzen eingeführt. Ein wünschenswertes Nährmedium ist in Tabelle 1 unten angegeben.
Während des Hochfahrens des Verfahrens unter Verwendung einer Animpfkultur von 10% oder weniger wird der Reaktor mit einer Batch-Flüssigphase betrieben, wobei das Flüssigmedium dem Reaktor nicht kontinuierlich zugeführt wird. Die Flüssigphase im Reaktor besteht somit aus einer Charge Nährmedium mit einer nominalen Konzentration des limitierenden Nährstoffs, entweder Calciumpantothenat oder Cobalt. Als Alternative läßt sich auch ein Vollmedium mit Hefeextrakt, Trypticase oder anderen komplexen Nährstoffen einsetzen.
Idealerweise ist die Gasphase beim Hochfahren CO₂-frei und enthält überschüssiges H₂. Die Gasgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeit werden auf niedrigem Niveau gehalten (weniger als 500 UpM in einem Bioflo^®-Fermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific), so daß CO und H₂ in leichtem Überschuß, jedoch gleichzeitig unter Vermeidung einer CO-Substrathemmung erhalten werden. Beispielsweise beträgt in einem Ein-Liter-Bioflo^®-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific, bei dem die Zufuhrgaszusammensetzung 63% H₂, 32% CO und 5% CH₄ ist, die Rührgeschwindigkeit des Hochfahrens 400 UpM und die Gasgeschwindigkeit 20 ml/min. Der Grund für eine Ethanolproduktion während des Hochfahrens ist überschüssiges H₂; die Limitierung an Nährstoffen erfolgt später. Somit sind Flüssignährstoffe (Pantothenat, Cobalt) tatsächlich während des Hochfahrens im Überschuß vorhanden, um eine unerwünschte Akklimatisierung der Kultur an geringe Nährstoffe zu vermeiden.
Mit dem Fortschreiten der Fermentation über einen Zeitraum von mehreren Stunden nach der Animpfung wird CO₂ aus der Umsetzung von CO produziert, wobei H₂ zusammen mit dem CO₂ verbraucht wird, was ein Signal für eine nominale Erhöhung der Rührgeschwindigkeit zur Vermeidung einer Gasstoffübergangslimitierung darstellt. Im Bioflo^®-CSTR von New Brunswick Scientific handelt es sich bei dem Abgangsgas um 25% CO, 67% H₂, 2% CO₂ und 6% CH₄. Wird die Rührgeschwindigkeit zu schnell erhöht, so erfolgt eine CO-Substrathemmung, die sich an einer Verringerung der Methankonzentration nach Zunahme des Rührens zeigt. So könnte die Rührgeschwindigkeit typischerweise um 200 UpM in 24 Stunden erhöht werden. Dieses Vorgehen einer Überwachung der CO₂-Produktion (oder H₂-Umsetzung) bei einer nominalen Erhöhung der Rührgeschwindigkeit erfolgt bei einer relativ schnellen Geschwindigkeit, bis die Zielrührgeschwindigkeit erreicht ist. Eine typische Zielrührgeschwindigkeit im Bioflo^®-Fermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific beträgt 900 UpM. Während dieser Zeit einer Erhöhung der Rührgeschwindigkeit in der Batch-Flüssigkultur ist anstelle der Produktbildung die Zellproduktion von größter Wichtigkeit. Somit werden Zellkonzentrationen von etwa 1,5 g/l erzielt, während als Produktkonzentrationen 10 g/l Ethanol und 2 g/l Acetat aus der Batch-Kultur typisch sind.
Sobald die Zielrührgeschwindigkeit erreicht ist, läßt man das System bis zur maximalen H₂-Aufnahme wachsen. Dabei ist es wünschenswert, daß sehr hohe H₂-Abgangskonzentrationen (typischerweise > 60%) vorliegen, um die Ethanolproduktion bei Limitierung der Essigsäureproduktion zu gewährleisten. Anschließend wird die Flüssigmediumzufuhr eingeschaltet (für Systeme mit Batch-Animpfung aus einer Stammkultur) um die kontinuierliche Flüssigkeitszufuhr zu starten, und die Gaszufuhrgeschwindigkeit wird auf die Zielströmungsgeschwindigkeit erhöht. Im Bioflo^®-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific beträgt die Flüssigkeitszufuhrgeschwindigkeit typischerweise 0,5 ml/min, während die Gasstromgeschwindigkeit alle 24 Stunden um 10–15% auf eine Zielgeschwindigkeit von 125 ml/min erhöht wird.
Es ist wichtig, im Zufuhrgas für einen Überschuß an H₂ zu sorgen, um eine Überschußproduktion von Essigsäure zu vermeiden. Mit Erhöhung der Gasstromgeschwindigkeit erhöht sich die Zellproduktion, bis der Reaktor schließlich an Flüssigphase-Nährstoffen (Calciumpantothenat oder Cobalt) limitiert ist, wie sich an einem geringen Abfall der H₂-Umsetzung bei der Zielproduktivität zeigt. Im Bioflo^®-CSTR von New Brunswick Scientific ist dies an einem 10%igen Abfall der H₂-Umsetzung bei einer Zielproduktivität von 20 g/l pro Tag zu erkennen.
Anschließend werden das Produktionsverfahren und das Reaktorsystem auf einem Steady-State gehalten, wobei 15 bis 35 g/l Ethanol sowie 0 bis 5 g/l Acetat als Produkte bei nur gelegentlichen geringen Anpassungen der Limitierung von Nährstoffen, Flüssigkeitsgeschwindigkeit und Gasgeschwindigkeit produziert werden. Typisch für Steady-State-Bedingungen im Bioflo^®-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific ohne Zellrückführung sind eine Gasretentionszeit (Gasstromgeschwindigkeit/Reaktorflüssigkeitsvolumen) von 20 Minuten, eine Flüssigkeitsretentionszeit (Füssigkeitsfließgeschwindigkeit/Reaktorflüssigkeitsvolumen) von 30 Stunden sowie eine Rührgeschwindigkeit von 900 UpM, was CO-Umsetzungen von 92% sowie H₂-Umsetzungen von 60% bei Pantothenatlimitierung ergibt.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens, in der dem Reaktorsystem eine Zellrückführung zugefügt wird, wird diese zu diesem Zeitpunkt zusammen mit einer Anpassung der Gasgeschwindigkeit (Erhöhung) und Nährstoffkonzentration (Abnahme) hinzugefügt. Mit der Zellrückführung im Bioflo^®-CSTR von New Brunswick Scientific beträgt die Gasretentionszeit typischerweise 8 Minuten, die Flüssigkeitsretentionszeit 12 Stunden, die Zellretentionszeit 40 Stunden sowie die Rührgeschwindigkeit 900 UpM. Diese Bedingungen ergeben typischerweise eine CO-Umsetzung von 92% sowie eine H₂-Umsetzung von 50% bei Pantothenatlimitierung.
BEISPIEL 2. PROBENANALYSE MITTELS GASCHROMATOGRAPHIE
Zur Erzielung und/oder Aufrechterhaltung der korrekten Produktivität und des korrekten Verhältnisses muß in regelmäßigen Abständen eine Probe der Fermentationsbrühe im Fermentationsbioreaktor entnommen werden. Eine Probe von mehr als 1,5 ml Kultur wird der Kultur im Bioreaktor entnommen. Die Probe wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, und dieses wird mit dem notwendigen Gegengewicht in eine Micro-14- Zentrifuge von Fisher Scientific gegeben. Die Probe wird 1,5 Minuten bei 8000 UpM zentrifugiert. Eine Probe von 0,500 ml Überstand wird in ein 1,5 ml großes, zur Verwendung in einem automatischen Gaschromatographie-Probennahmegerät vorgesehenes Fläschchen gegeben. Eine Probe von 0,500 ml einer internen Standardlösung mit 5 g/l n-Propanol und 5% (v/v) 85%iger Phosphorsäure in entionisiertem Wasser. Durch die Phosphorsäure wird sichergestellt, daß das gesamte Acetat zu Essigsäure umgesetzt und in der Gaschromatographie nachgewiesen wird.
Ein μl der vorbereiteten Probe wird dann mittels automatischer Probennahme in einen mit einer 007 FFA Quadrex 25 m × 0,53 mm ID "fused silica"-Kapillarsäule ausgestatteten Hewlett-Packard 5890 Series II Gas Chromatograph injiziert. Die Analyse wird mit einem Heliumträgergas im "Split-Flow"-Modus mit 66 ml/min split-flow und 7,93 ml/min "injector purge" ausgeführt. Der Säulenkopfdruck wird auf 4 psig eingestellt, was einen Säulenträgerstrom von 7 ml/min ergibt. Das Temperaturprogramm besteht aus 0,2 Minuten bei 75°C, einem Aufheizen auf 190°C mit einer Geschwindigkeit von 30°C/Minute sowie eine Haltezeit von 5,17 Minuten bei 190°C. Die sich daraus ergebende Laufzeit beträgt 8 Minuten. Das Instrument wird für Ethanol (0–25 g/l), Essigsäure (0–25 g/l), n-Butanol (0–5 g/l) und Buttersäure (0–5 g/l) kalibriert. Für die Kalibrierung werden fünf Standards, hergestellt aus Materialien mit Reagensqualität, verwendet. Liegt die Probe außerhalb des Kalibrierungsbereichs der Konzentration (z.B. > 25 g/l Ethanol), so gibt man 0,250 ml Probe sowie 0,250 ml entionisiertes Wasser in das Fläschchen mit 0,500 ml internem Standard, wobei der Verdünnungsfaktor in der Analyse berücksichtigt wird.
BEISPIEL 3. SÄUREPRODUKTION IN EINEM LABOR-CSTR MIT ZELLRÜCKFÜHRUNG
Ein Bioflo^®-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific wurde mit Zellrückführung unter Verwendung von Clostridium ljungdahlii Stamm ERI2, ATCC 55380, zur Produktion von Essigsäure aus CO, CO₂ und H₂ betrieben. Die Gaszufuhr enthielt 40% H₂, 50% CO und 10% N₂, wobei die Gasretentionszeit zum Ein-Liter-Reaktor 7,7 bis 8,6 Minuten betrug. Flüssigmedium mit Vitaminen, Salzen und Spurenelementen wurde mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 2,6 bis 2,9 Stunden zugeführt. Der pH-Wert betrug 5,1 bis 5,2, die Rührgeschwindigkeit 1000 UpM und die Zellretentionszeit etwa 40 Stunden. Unter diesen Bedingungen der Stoffübergangslimitierung (und keiner Nährstofflimitierung) betrug die CO-Umsetzung 94–98% und die H₂-Umsetzung 80–97%. Die Zellkonzentration betrug 4 bis 8 g/l, und Acetat wurde mit 10 bis 13 g/l produziert. Es wurde kein Ethanol produziert. Obwohl der Reaktor unter Stoffübergangslimitierung (limitiert durch die Fähigkeit zur Eintragung von Gas in die Kultur) betrieben wurde und somit lediglich Essigsäure als Produkt produzierte, wurden die Parameter für die Ethanolproduktion über Pantothenatlimitierung, Cobaltlimitierung oder das Vorhandensein von überschüssigem H₂ oder CO verfolgt, um als Vergleich für den Fall, daß Alkohol als dominantes Produkt produziert wird, zu dienen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, betrug die Menge an zugeführtem Ca-d-Pantothenat pro Einheit produzierter Zellen 1575 bis 3150 Mikrogramm pro Gramm produzierte Zellen (μg/g produzierte Zellen). Analog betrug die Menge an zugeführtem Cobalt pro Gramm produzierte Zellen 1734 bis 3468 (μg/g produzierte Zellen). Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 0,35 bis 0,61 mmol/g Zellen pro Minute. Das Verhältnis der Mole zugeführtes H₂ zur Summe aus den Molen umgesetztes CO mal 2 und den Molen umgesetztes CO₂ mal 3 betrug weniger als 0,46. Somit befand sich keiner der Parameter im gewünschten Betriebsbereich für die Ethanolproduktion durch die Kultur.
Man erkennt, daß Pantothenat und Cobalt im großen Überschuß dem obigen Reaktor bei der Herstellung von Essigsäure als Produkt unter Stoffübergangslimitierung zugeführt wurden. Das heißt, daß die Pantothenat- und/oder Cobaltspiegel signifikant reduziert werden könnten und immer noch oberhalb des Niveaus für eine Pantothenat- bzw. Cobaltlimitierung liegen würden. Um dies zu veranschaulichen, wurde das dem Ein-Liter-Bioflo^®-Fermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific zugeführte Medium so modifiziert, daß die Cobaltzugabe in signifikanter Weise auf ein Niveau reduziert wurde, das gerade oberhalb der Cobaltkonzentration für eine Cobaltlimitierung lag. Dabei enthielt der Reaktor wiederum den Stamm C. ljungdahlii ERI2 für die Produktion von Essigsäure aus CO, CO₂ und H₂. Die Gaszufuhr enthielt 55% H₂, 25% CO, 15% CO₂ und 5% CH₄ (Referenzgas), und die Gasretentionszeit betrug 7,5 bis 8,0 Minuten. Flüssigmedium mit Salzen, Vitaminen und Spurenelementen wurde mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 3,0 bis 3,5 Stunden zugeführt, wobei die Zellretentionszeit 40 Stunden betrug. Der pH-Wert lag bei 5,0 bis 5,3, und die Rührgeschwindigkeit bei 900 bis 1000 UpM. Unter diesen Bedingungen betrug die CO-Umsetzung 95 bis 99% und die H₂-Umsetzung 94 bis 98%. Die Zellkonzentration betrug 2,5 bis 4,0 g/l, wobei Acetat das einzige Produkt bei 10 bis 14 g/l war.
Die Menge an dem Reaktor pro Gramm Zellen zugeführten Ca-d-Pantothenat betrug 2250 bis 3600 μg Pantothenat/g produzierte Zellen. Die Menge an pro Einheit produzierter Zellen zugeführtem Cobalt wurde auf einen Bereich von 62,0 bis 99,2 μg Cobalt/g produzierte Zellen reduziert. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 0,325 bis 0,4 mmol/g Zellen pro Minute. Das Verhältnis von zugeführtem H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 0,875.
BEISPIEL 4. ETHANOLPRODUKTION IM LABOR-CSTR MIT PANTOTHENATLIMITIERUNG
Ein Bioflo^®II-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific wurde als Direktweg ("straight through")-CSTR (ohne Zellrückführung) unter Verwendung des C. ljungdahlii-Stamms C-01, ATCC 55988, zur Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ an Pantothenat limitiert betrieben. Die Gaszufuhr zum Reaktor enthielt 63,3% H₂, 31,4 CO und 5,3% C₂H₆ (Referenzgas) und wurde mit einer Gasretentionszeit von 27 Minuten zugeführt. Das Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen und Spurenelementen sowie mit limitiertem Pantothenat wurde dem 1,55-Liter-Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 31,4 Stunden zugeführt. Der pH-Wert betrug 4,6 bis 4,7 und die Rührgeschwindigkeit 650 UpM. Unter diesen Betriebsbedingungen betrug die CO-Umsetzung 98%, die H₂-Umsetzung 83% sowie die Zellkonzentration 1,5 bis 2,0 g/l. Ethanol wurde mit einer Konzentration von 15 bis 19 g/l und Acetat mit 1,5 g/l produziert. Die Ethanolproduktivität reichte von 11,5 bis 14,5 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion wurde eine Pantothenatlimitierung bei Betrieb mit einem Verhältnis von Pantothenatzufuhr zu Zellproduktion von 17,7 bis 23,6 μg Pantothenat/g produzierte Zellen festgestellt. Man vergleiche dieses Verhältnis mit den 2250 bis 3600 μg Pantothenat/g produzierten Zellen sowie den 1575–3150 μg Pantothenat/g produzierte Zellen in Beispiel 3 zur Säureproduktion. Die Menge an pro Einheit produzierter Zellen zugeführtem Cobalt betrug 5000 bis 6000 μg Cobalt/g produzierten Zellen, ein Niveau, das sogar höher liegt als in Beispiel 3 und sicherstellt, daß keine Cobaltlimitierung erfolgt. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 0,23 bis 0,30 mmol/g Zellen pro Minute. Das Verhältnis von zugeführtem H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 1,03, wobei der H₂-Partialdruck im Abgangsgas bei 0,55–0,64 atm lag. Es besteht die Möglichkeit, daß entweder überschüssiges H₂ oder limitiertes Pantothenat zur Ethanolproduktion führte.
Die Pantothenatlimitierung für die Ethanolproduktion wurde ebenso in einem anderen, mit Zellrückführung betriebenen Bioflo^®II-Laborreaktor von New Brunswick Scientific unter Verwendung des C. ljungdahlii-Stamms C-01 ATCC 55988 angegangen. In diesem Reaktor wurde Gas, das 61,7% H₂, 30,6% CO und 5,2% C₂H₆ (Referenzgas) enthielt, mit einer Gasretentionszeit von 12,3 Minuten zugeführt. Flüssigmedium mit einer limitierten Menge Pantothenat zusammen mit überschüssigen Salzen und Spurenelementen wurde dem 2,4-Liter-Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 24,8 Stunden zugeführt. Für die Zellrückführung wurde mittels Einsatz einer 0,2 μm-Hohlfasermembran gesorgt, wobei die Zellretentionszeit 69 Stunden betrug. Der pH-Wert lag bei 4,6 und die Rührgeschwindigkeit bei 650 UpM. Unter diesen Bedingungen betrug die CO-Umsetzung 90%, die H₂-Umsetzung 53% und die Zellkonzentration 2,5 g/l. Die Ethanolkonzentration lag bei 18 g/l und die Acetatkonzentration bei 3 g/l. Die Ethanolproduktivität betrug 17,4 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion (Tabelle 2) betrug das Verhältnis von zugeführtem Pantothenat pro Einheit produzierter Zellen 8,08 μg Pantothenat/g produzierte Zellen. Wiederum wurde die Pantothenatlimitierung durch den Betrieb auf einem Niveau, das wesentlich niedriger lag als das für die Acetatproduktion benötigte Niveau, sichergestellt. Die Menge an pro Einheit produzierter Zellen zugeführtem Cobalt betrug 3960 μg Cobalt/g produzierte Zellen. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 0,33 mmol/g Zellen pro Minute. Das Verhältnis von zugeführtem H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 1,14, wobei der H₂-Partialdruck im Abgangsgas bei 0,60–0,65 atm lag. Überschüssiges H₂ könnte ein möglicher Grund für die Ethanolproduktion sein; allerdings zeigt der hohe CO₂-Gehalt im Abgangsgas (0,14 atm), daß das Wachstum durch Pantothenat limitiert wurde.
In einem weiteren Experiment wurde dem Stamm C. ljungdahlii ERI2 1500 bis 3600 μg Pantothenat/g produzierte Zellen während der Essigsäureproduktion aus CO, CO₂ und H₂ zugeführt, ein Zustand, in dem der Reaktor nicht an Pantothenat limitiert war (oder jede andere Limitierung, außer die Fähigkeit zur Eintragung von Gas in die Kultur), wobei im Produktstrom kein Ethanol gefunden wurde.
Während der Limitierung an Pantothenat für die Ethanolproduktion aus CO, CO₂ und H₂ wurden dem Stamm C. ljungdahlii C-01 8 bis 24 μg Pantothenat/g produzierte Zellen zugeführt, während alle anderen Nährstoffe im Überschuß gehalten wurden. Unter diesen Bedingungen produzierte der Stamm C-01 15 bis 19 g/l Ethanol sowie 1,5 bis 3,0 g/l Acetat.
BEISPIEL 5. ETHANOLPRODUKTION IM LABOR-CSTRS MIT COBALTLIMITIERUNG
Ein Bioflo^®II-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific wurde als "straight through"-CSTR (ohne Zellrückführung) unter Verwendung des C. ljungdahlii-Stamms C-01, ATCC 55988 zur Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ mit Cobaltlimitierung betrieben. Das dem Reaktor zugefügte Gas enthielt 60% H₂, 35% CO und 5% CH₄ (Referenzgas) und wurde bei einer Gasretentionszeit von 14 Minuten zugeführt. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenmetallen (außer Cobalt, das limitierend war) wurde dem 2,5-l-Reaktor mit einer Flüssigkeits retentionszeit von 40 Stunden zugeführt. Der pH-Wert betrug 4,9 und die Rührgeschwindigkeit 650 UpM. Unter diesen Bedingungen betrug die CO-Umsetzung 91%, während die H₂-Umsetzung von 20 bis 80% variierte, nominal jedoch bei 55% lag. Ethanol wurde mit 26 g/l und Acetat mit 4 g/l produziert, wobei die Zellkonzentration bei 2,5 g/l lag. Die Ethanolproduktivität betrug 15,6 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion betrug das Verhältnis des zugeführten Pantothenats zur Zellproduktion 15,2 μg Pantothenat/g produzierte Zellen. Dieses Niveau lag recht niedrig, so daß die Begünstigung einer Cobaltlimitierung gegenüber einer Pantothenatlimitierung nicht gewährleistet sein konnte. Eine Cobaltlimitierung konnte bei einem Betrieb mit 33,3 μg Cobalt/g produzierten Zellen beobachtet werden, einem Niveau, das 100 mal niedriger liegt als das in Reaktoren ohne Cobaltlimitierung verwendete Niveau. Das Verhältnis des zugeführten H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 0,94. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit lag bei 0,37 mmol/g Zellen pro Minute.
Die Cobaltlimitierung für die Ethanolproduktion wurde ebenso in einem CSTR mit Zellrückführung unter Verwendung des C. ljungdahlii-Stamms C-01 ATCC 55988 demonstriert. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Cobaltlimitierung in Gegenwart von überschüssigem Pantothenat zu demonstrieren, im Gegensatz zu dem vorherigen Reaktor in diesem Beispiel. Dem Bioflo^®2000-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific mit einer 0,2-μm-Hohlfasermembran für die Zellrückführung wurde 60% H₂, 35% CO und 5% CH₄ (Referenzgas) enthaltendes Gas mit einer Gasretentionszeit von 5 Minuten zugeführt. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenmetallen (wiederum mit Ausnahme von Cobalt, das limitierend ist) wurde dem 1,2-Liter-Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 16 Stunden zugeführt. Der pH-Wert lag bei 5,1 und die Rührgeschwindigkeit bei 825 UpM. Die Zellretentionszeit in diesem CSTR mit Hohlfaser für die Zellrückführung betrug 40 Stunden. Unter diesen Bedingungen betrug die CO-Umsetzung 83%, die H₂-Umsetzung 50% und die Zellkonzentration 4,2 g/l. Die Ethanolkonzentration lag bei 18 g/l und die Acetatkonzentration bei 4 g/l. Die Ethanolproduktivität betrug 27 g/l pro Tag.
Mit Bezug auf die Parameter für die Ethanolproduktion in diesem Reaktor (Tabelle 2) betrug das Verhältnis von zugeführtem Pantothenat zur Zellproduktion 85,7 μg Pantothenat/g produzierte Zellen, ein Niveau, das 5,5 mal höher liegt als im vorherigen Reaktor in diesem Beispiel. Eine Cobaltlimitierung konnte bei Betrieb mit 47,6 μg Cobalt/g produzierte Zellen beobachtet werden. Das Verhältnis von zugeführtem H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 1,03, wobei der H₂-Partialdruck im Abgangsgas bei 0,60 atm lag. Wiederum könnte überschüssiges H₂ ein möglicher Grund für die Ethanolproduktion sein; allerdings zeigt der hohe CO₂-Gehalt im Abgangsgas (0,1–0,15 atm), daß das Wachstum durch Cobalt limitiert war. Die spezifische CO-Aufnahme betrug 0,50 mmol/g Zellen pro Minute.
BEISPIEL 6. ETHANOLPRODUKTION IN LABOR-CSTRS BEI BETRIEB MIT VORHANDENEM ÜBERSCHÜSSIGEM CO
Ein Hochdruckreaktor AUTOKLAV^TM (Buchi) wurde als CSTR mit Kulturkreislauf und Zellrückführung unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii C-01 für die Produktion aus CO, CO₂ und H₂ in Gegenwart von überflüssigem CO über einen Zeitraum von 50 Stunden betrieben. Der Reaktor wurde dabei bei 25 psig betrieben und mit 57% H₂, 36% CO und 6% C₂H₆ enthaltendem Gas beschickt. Die Gasretentionszeit variierte, lag jedoch nominal bei 3,0 Minuten. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen (einschließlich Pantothenat) und Spurenmetallen wurde dem 600-ml-Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 8,2 Stunden zugeführt. Die durch Hindurchleiten des Reaktorausflusses durch ein Keramikhohlfaserfilter erhaltene Zellretentionszeit betrug 18,5 Stunden. Der pH-Wert betrug 4,5, die Rührgeschwindigkeit lag bei 450 UpM und die Flüssigkeitskreislaufrückführungsgeschwindigkeit bei 0,4 bis 0,5 gpm. Unter diesen Bedingungen waren die Gasumsetzungen variabel, doch betrug die CO-Umsetzung nominal 72% und die H₂-Umsetzung nominal 12%. Die Zellkonzentration lag bei 2,7 g/l. Ethanol wurde mit 9,9 g/l und Acetat mit 2,6 g/l produziert. Die Ethanolproduktivität betrug 29,0 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion betrug das Verhältnis des zugeführten Pantothenats zur Zellproduktion 97 μg Pantothenat/g produzierte Zellen. Dieses Niveau liegt ausreichend hoch, um sicherzustellen, daß Pantothenat nicht limitierend war. Das Verhältnis von zugeführtem Cobalt zur Zellproduktion betrug 836 μg Cobalt/produzierte Zellen, wiederum ein Niveau, das sicherstellt, daß Cobalt nicht limitierend war. Das Verhältnis des zugeführten H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 1,09, wobei der H₂-Partialdruck bei 1,6 atm lag. Der hohe CO₂-Gehalt im Abgangsgas (0,5 atm) stellt sicher, daß überschüssiges H₂ nicht der Grund für die Ethanolproduktion war. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 1,34 mmol/g Zellen pro Minute, ein Niveau, das überschüssiges CO als Verfahren zur Herstellung von Ethanol sicherstellt.
Die Technik der Verwendung von überschüssigem CO für die Ethanolproduktion wurde ebenso in einem weiteren Experiment mit dem C. ljungdahlii-Stamm C-01 im System mit dem AUTOKLAV^TM-Reaktor (Buchi), wiederum mit Zellrückführung und Kulturkreislauf, über einen Zeitraum von 24 Stunden demonstriert. In diesem Experiment wurde dem 600-ml-Reaktor 15,8% H₂, 36,5% CO, 38,4 N₂ und 9,3% CO₂ enthaltendes Gas mit einer Gasretentionszeit von 1,4 Minuten zugeführt. Der Reaktordruck wurde dabei bei 40 psig gehalten. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenmetallen wurde mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 4,8 Stunden zugeführt, wobei die durch Hindurchleiten des Ausflusses durch ein Keramikhohlfaserfilter erhaltene Zellretentionszeit 19,2 Stunden betrug. Der pH-Wert lag bei 4,5, die Rührgeschwindigkeit bei 1000 UpM und die Flüssigkeitskreislaufrückführungsgeschwindigkeit bei 0,4 bis 0,5 gpm. Unter diesen Bedingungen lag die CO-Umsetzung bei 71,6 und die H₂-Umsetzung bei 11,8%. Die Zellkonzentration betrug 7,1 g/l, Ethanol wurde mit 12,0 g/l und Acetat mit 2,7 g/l produziert. Die Ethanolproduktivität betrug 60 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion (Tabelle 2) betrug das Verhältnis von zugeführtem Pantothenat zur Zellproduktion 294 μg Pantothenat/g produzierte Zellen. Dieses Niveau liegt weit oberhalb des zur Herbeiführung einer Ethanolproduktion aufgrund Pantothenatlimitierung benötigten Minimalniveaus. Die Geschwindigkeit von zugeführtem Cobalt zur Zellproduktion betrug 735 μg Cobalt/g Zellen, wiederum ein Niveau, das gewährleistet, daß Cobalt im Überschuß zugeführt wurde. Das Verhältnis von zugeführtem H₂ zur Summe aus dem umgesetzten CO mal 2 sowie dem umgesetzten CO₂ mal 3 betrug 0,3. Die CO-Aufnahmegeschwindigkeit lag bei 0,67 mmol/g Zellen pro Minute, ein Niveau, das wiederum sicherstellt, daß überschüssiges CO als Verfahren zur Herbeiführung der Ethanolproduktion zur Verfügung steht.
BEISPIEL 7. ETHANOLPROUKTION MIT VORHANDENEM H₂-ÜBERSCHUSS
Ein Bioflo^®-Laborfermentationsbioreaktor von New Brunswick Scientific wurde als "straight through"-CSTR (ohne Zellrückführung) unter Verwendung des C. ljungdahlii-Stamms C-01, ATCC 55988 zur Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ in Gegenwart von überschüssigem H₂ betrieben. Das dem Reaktor zugeführte Gas enthielt 77% H₂, 19% CO und 4% CH₄ (Referenzgas) und wurde mit einer Gasretentionszeit von 30 Minuten zugeführt. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen wurde dem Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 36 Stunden zugeführt. Der pH-Wert lag bei 5,0 und die Rührgeschwindigkeit bei 1000 UpM. Unter diesen Betriebsbedingungen betrug die CO-Umsetzung 97–99% und die H₂-Umsetzung 60–80%. Die Zellkonzentration lag bei 0,8–1,0 g/l, die Ethanolkonzentration bei 10 g/l und die Acetatkonzentration bei 3,3 g/l. Die Ethanolproduktivität betrug 6,7 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion betrug das Verhältnis von Pantothenatzufuhr zur Zellproduktion 900–1125 μg Pantothenat/g produzierte Zellen, womit sichergestellt wurde, daß ein Überschuß an Pantothenat vorhanden war. Analog betrug das Verhältnis der Cobaltzufuhr zu Zellproduktion 991–1239 μg Cobalt/g produzierte Zellen, was wiederum sicherstellte, daß Cobalt im Überschuß vorhanden war. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit betrug 0,28–0,35 mmol/g Zellen pro Minute, ein Niveau, so daß überschüssiges CO nicht zur Ethanolproduktion führte. Das Verhältnis der Mole zugeführtes H₂ zur Summe aus den Molen umgesetztes CO mal 2 sowie den Molen umgesetztes CO₂ mal 3 betrug 1,96, ein Verhältnis, das oberhalb von 1,0 liegt, dem Niveau, bei dem H₂ im Überschuß vorliegt und somit die Ethanolproduktion kontrollieren könnte. Der H₂-Partialdruck im Abgangsgas lag bei 0,70–0,87 atm, wobei das Verhältnis des H₂-Partialdrucks zum CO₂-Partialdruck im Abgangsgas 65 betrug. Somit produzierte der Reaktor aufgrund des Vorhandenseins von überschüssigem H₂ Ethanol.
In einem zweiten Experiment wurde ein Hochdruckreaktor AUTOKLAV^TM (Buchi) als CSTR mit Kulturkreislauf und Zellrückführung unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii C-01 für die Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ in Gegenwart von überflüssigem H₂ betrieben. Das dem Reaktor zugeführte Gas enthielt 81% H₂, 16% CO und 3% CH₄ (Referenzgas) und wurde mit einer Gasretentionszeit von 2,21 Minuten zugeführt. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen wurden dem Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 8,97 Stunden zugeführt. Die Zellretentionszeit lag bei 22,7 Stunden, der pH-Wert bei 4,5 und die Rührgeschwindigkeit bei 800 UpM. Unter diesen Betriebsbedingungen betrug die CO-Umsetzung 91,5% und die H₂-Umsetzung 43,4%. Die Zellkonzentration lag bei 5,5 g/l und die Acetatkonzentration bei 2,85 g/l. Die Ethanolproduktivität im Reaktor betrug 215–240 g/l pro Tag.
Bei der Analyse der Parameter für die Ethanolproduktion betrug die Pantothenatzufuhr zur Zellproduktionsgeschwindigkeit 46 μg Pantothenat/g produzierte Zellen, ein Niveau, das auf eine Pantothenatlimitierung hindeuten kann. Das Verhältnis der Cobaltzufuhr zur Zellproduktion betrug 460 μg Cobalt/g produzierte Zellen, ein Niveau, das sicherstellt, daß Cobalt nicht limitierend war. Die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit lag bei 1,68 mmol/g Zellen pro Minute, ein Niveau, das darauf hinweisen könnte, daß CO im Überschuß vorhanden wäre, gäbe es nicht die hohe H₂-Aufnahmegeschwindigkeit von 4,14 mmol/g Zellen pro Minute, die darauf hindeutet, daß eine Substrathemmung der H₂-Umsetzung nicht auftrat. Das Verhältnis der Mole zugeführtes H₂ zur Summe aus den Molen umgesetztes CO mal 2 sowie den Molen umgesetztes CO₂ mal 3 betrug 5,67, eine Rate, die weit oberhalb des für das Vorhandensein eines H₂-Überschusses erforderlichen Verhältnisses von 1,0 liegt. Der H₂-Partialdruck im Abgangsgas betrug 2,61 atm. und die Rate des H₂-Partialdrucks zum CO₂-Partialdruck im Abgangsgas 10,9. Der Reaktor produzierte somit Ethanol als Ergebnis des Vorhandenseins von überschüssigem H₂.
Ein zusammenfassender Vergleich von Verfahrensparametern und Ergebnissen für die Beispiele 3 bis 7 ist in Tabelle 2 unten gezeigt.
BEISPIEL 8. PRODUKTUMSTELLUNG IN DEN STÄMMEN C. LJUNGDAHLII ERI2, C-01 UND PETC MITTELS MEDIUMFORMULIERUNGEN
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung lassen sich auf alle C. ljungdahlii-Stämme anwenden. Ergebnisse der Mediummanipulationsexperimente, bei denen die Stämme ERI2, C-01 und PETC eingesetzt wurden, sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Der Zweck dieser Experimente bestand darin, zu demonstrieren, daß sich die Stämme jeweils von Essigsäureproduktion auf Ethanolproduktion lediglich durch Manipulierung des Mediums umstellen lassen. So wurden einer Kultur Nährstoffe "einschließlich Pantothenat und Cobalt" im Überschuß zugeführt, um Essigsäure als dominantes Produkt zu produzieren, und danach an Pantothenat oder Cobalt limitiert, um Ethanol als dominantes Produkt zu produzieren. Dabei sollte betont werden, daß der einzige Zweck dieser Experimente darin bestand, zu demonstrieren, daß eine Manipulation des Mediums bei den Stämmen jeweils zu einer Produktumstellung führen kann. Somit stand das Erzielen hoher Produktkonzentrationen und Produktivitäten nicht im Mittelpunkt dieser Experimente.
Der Reaktor wurde als "straight through"-CSTR (ohne Zellrückführung) für jedes der Kulturexperimente betrieben. Die Gasretentionszeit wurde nominal auf 50 Minuten angesetzt, die Flüssigkeitsretentionszeit wurde nominal auf 40 Stunden angesetzt, und die Rührgeschwindigkeit wurde nominal auf 1000 UpM eingestellt. Diese Bedingungen wurden gewählt, um Vergleiche zwischen den Stämmen zu gestatten, jedoch nicht, um hohe Produktivitäten zu erreichen.
Wie in Tabelle 3 angemerkt, wurde der Stamm ERI2 5 Mediumwechseln ausgesetzt, wodurch die Produkte von Essigsäure als dominantes Produkt auf Ethanol als dominantes Produkt und umgekehrt umgestellt wurden. Dabei wurde sowohl Pantothenatlimitierung als auch Cobaltlimitierung für die Ethanolproduktion durch diesen Stamm demonstriert. Der Stamm C-01 wurde dreimal mittels Mediummanipulation umgestellt, wobei wiederum sowohl Pantothenatlimitierung als auch Cobaltlimitierung als Mechanismus für die Ethanolproduktion demonstriert wurde. Der Stamm PETC wurde lediglich einmal umgestellt, und zwar bei Ethanolproduktion aufgrund von Cobaltlimitierung. Die Stämme zeigten jeweils höhere H₂-Umsetzungen, wenn Essigsäure statt Ethanol als dominantes Produkt produziert wurde. Dies erfolgt, da Essigsäure unter Stoffübergangslimitierung (Limitieren der Menge an Gas für die Kultur) produziert wird, wohingegen Ethanol bei Limitierung von Nährstoffen produziert wird, und somit Gas im Überschuß zugeliefert wird, was die Gasumsetzung negativ beeinflussen kann. Geringe Mengen an Acetat sind dabei immer im Produktstrom vorhanden, wenn es sich bei dem dominanten Produkt um Ethanol handelt. Ist jedoch Essigsäure das dominante Produkt, so ist Ethanol üblicherweise nicht in meßbaren Konzentrationen vorhanden. Mit der Umstellung dominanter Produkte von Ethanol auf Essigsäure durch Nährstoffmanipulation konnte gezeigt werden, daß das Entfernen aller Spuren von Ethanol sehr schwierig war. Eine vollständige Abtrennung von Ethanol erfolgte nur nach mehreren Wochen Dauerbetrieb auf Essigsäure verstärkendem Medium.
BEISPIEL 9. STEADY-STATE-BETRIEB MIT UND OHNE ZELLRÜCKFÜHRUNG
Das letztendliche kommerzielle Ziel der Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ besteht darin, hohe Steady-State-Konzentrationen an Ethanol zu erzielen, wobei gleichzeitig hohe Produktverhältnisse von Ethanol zu Acetat sowie eine hohe Produktivität erhalten werden. Steady-State-Daten zur Produktion von Ethanol aus CO-reichem Gas, das 20% H₂, 65% CO, 10% CO₂ und 5% CH₄ enthält, unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii C-01 in einem "straight through"-CSTR (ohne Zellrückführung) sind in Tabelle 4 gezeigt. In der Tabelle bezieht sich GRT auf die Gasretentionszeit (Verhältnis des Flüssigkeitsvolumens zur Einlaß-Gasströmungsgeschwindigkeit), LRT auf die Flüssigkeitsretentionszeit (Verhältnis des Flüssigkeitsvolumens zur Flüssigkeitsfließgeschwindigkeit) sowie XRT auf die Zellretentionszeit (durchschnittliche Zeitspanne, die die Zellen im Reaktor verbringen). Wie in Tabelle 4 angemerkt, wurden Ethanolkonzentrationen von 17,5 bis 33 g/l erhalten, wobei die Ethanolproduktivität im Bereich von 14,4 bis 21,1 g/l pro Tag lag.
Ähnliche Ergebnisse sind für die Ethanolproduktion aus Gas, das nicht so reich an CO ist, gezeigt. Das im Experiment unter Verwendung von C. ljungdahlii C-01 ohne Rückführung, dessen Ergebnisse in Tabelle 5 angegeben sind, verwendete Gas enthält 16% H₂, 27% CO, 6% CO₂ und 51% N₂. Ethanolkonzentrationen im Bereich von 11 bis 26 g/l wurden mit diesem Gas erhalten, wobei 2,0 bis 5,0 g/l Acetat als Nebenprodukt vorhanden waren. Die Ethanolproduktivität lag im Bereich von 11,1–20,1 g/l pro Tag.* Die Zellkonzentration ruht auf dem Zelltrockengewicht in Tabelle 5.
Schließlich sind Steady-State-Daten für die Umsetzung von 50% H₂, 45% CO und 5% CH₄ enthaltendem Gas in einem CSTR mit Zellrückführung unter Verwendung von C. ljungdahlii O-52 (ATCC Accession No. 55989) in Tabelle 6 unten gezeigt. Dabei wurden Ethanolkonzentrationen von 18 bis 23,5 g/l sowie Acetatkonzentrationen von 3,0 bis 5,7 g/l erzielt. Die Ethanolproduktivität lag im Bereich von 21,1 bis 39,0 g/l pro Tag.
BEISPIEL 10. HOHE ETHANOLPRODUKTIVITÄT IN EINEM CSTR MIT ZELLRÜCKFÜHRUNG UND DRUCK
Ein Hochdruckreaktor AUTOKLAV^TM (Buchi) wurde als CSTR mit Kulturkreislauf und Zellrückführung unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii C-01 für die Produktion von Ethanol aus CO, CO₂ und H₂ betrieben. Dabei wurde der Reaktor bei 30 psig betrieben, wobei ihm 62% H₂, 31% CO und 5% C₂H₆ enthaltendes Gas zugeführt wurde. Die Gasretentionszeit betrug 1,14 min (bezogen auf Normaldruck) bei einer tatsächlichen Gasretentionszeit von 3,5 min. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenmetallen wurden dem 600-ml-Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 3,6 Stunden zugeführt. Der pH-Wert lag bei 4,5 und die Rührgeschwindigkeit bei 825 UpM. Unter diesen Bedingungen betrug die Zellkonzentration 8 g/l, die CO-Umsetzung 90% und die H₂-Umsetzung 40%. Der Produktstrom enthielt 20 g/l Ethanol und 2,75 g/l Acetat. Die Ethanolproduktivität betrug 150 g/l pro Tag.
In einem weiteren als CSTR mit Kulturkreislauf und Zellrückführung unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii C-01 betriebenen Hochdruckreaktor AUTOKLAV^TM (Buchi) wurde dieser bei 6 atm (75 psig) betrieben, wobei ihm 55% H₂, 30% CO, 5% CH₄ und 10% CO₂ enthaltendes Syngas zugeführt wurde. Die Gasretentionszeit betrug 1 min (bezogen auf Normaldruck) bei einer tatsächlichen Gasretentionszeit von 6,0 min. Flüssigmedium mit überschüssigen Salzen, Vitaminen und Spurenmetallen wurde dem Reaktor mit einer Flüssigkeitsretentionszeit von 1,62 Std. zugeführt. Die Zellretentionszeit betrug 24 Std., der pH-Wert lag bei 4,5 und die Rührgeschwindigkeit bei 800 UpM. Unter diesen Bedingungen betrug die Zellkonzentration 2,0 g/l, die CO-Umsetzung 95% und die H₂-Umsetzung 60%. Der Produktstrom enthielt 25 g/l Ethanol sowie 3 g/l Acetat. Die Ethanolproduktivität betrug 369 g/l·d.
BEISPIEL 11. HOCHFAHREN AUS EINER STAMMKULTUR BEI VORLIEGEN EINES H₂-ÜBERSCHUSSES
Das Hochfahren unter Verwendung einer Batch-Animpfkultur aus einer Stammlösung gewährleistet eine gesunde Animpfkultur ohne Verunreinigungen, ist jedoch nicht immer als Animpfverfahren erfolgreich, und zwar aufgrund der relativ geringen verwendeten Zelldichte, vor allem wenn die Verfahrensparameter, wie z.B. Gasgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeit, unmittelbar nach der Animpfung zu schnell erhöht werden.
In diesem Beispiel wird das Hochfahren unter Verwendung einer Batch-Animpfkultur aus einer Stammkultur behandelt. Zur Herstellung der Stammkulturen für die Animpfung des Reaktors wurden Kulturen des Stamms C. ljungdahlii C-01 ATCC Accession No. 55988) in 150-ml-Serum Flaschen auf CO, CO₂ und H₂ in einem Vollmedium mit 1 g/l Hefeextrakt und 1 g/l Trypticase mit Salzen und Vitaminen angezogen. Dabei betrug die verwendete Vitaminkonzentration 0,4 ml/l Medium einer wäßrigen Lösung mit 50,5 mg/l Calciumpantothenat, 20,6 mg/l d-Biotin und 50,6 mg/l Thiamin-HCl. Die Flaschen wurden bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Die Kulturen wurden bis zur exponentiellen Wachstumsphase angezogen, wie durch Sichtung bestimmt wurde. Bei jeder Animpfung wurden jeweils ungefähr 90 ml Stammkultur aus den Serumflaschen in 1 Liter Medium überführt, was einer Animpfung mit 9 Vol.-% entsprach. Nachfolgend ist eine erfolgreiche Animpfung beschrieben. Das skizzierte Verfahren läßt sich mehrere Male wiederholen, um eine erfolgreiche Animpfung zu erhalten.
Zum Erhalten einer erfolgreichen Animpfung wurden 90 ml/l Animpfkultur in einem 1-Liter-Ansatz Basalmedium (in Tabelle 1 gezeigt) mit 0,4 ml/l Vitaminen und Salzen gegeben (t = 0). Die Rührgeschwindigkeit betrug 240 UpM, der pH-Wert 5,3, die Temperatur 38,5°C sowie die Gasretentionszeit (kontinuierlicher Gasstrom) 110 min. Die Gaszufuhr enthielt 62% H₂, 31% CO und 7% C₂H₆. Nach 13 Std. (t = 13 Std.) wurde etwas CO-Umsetzung festgestellt, und bei t = 23 Std. wurde die Rührgeschwindigkeit von 240 UpM auf 300 UpM erhöht. Die Gasretentionszeit wurde bei t = 27 Std. auf 100 Minuten verkürzt, wobei eine weitere Verkürzung der Gasretentionszeit bei t = 46 Std. vorgenommen wurde. Die Rührgeschwindigkeit wurde ebenso in Schritten von 100 UpM bei t = 28 Std., 59 Std., 72 Std. und 85 Std. erhöht.
Nach t = 110 Std. wurde das System mit einer Gasretentionszeit von 80 Minuten sowie einer Rührgeschwindigkeit von 600 UpM betrieben. Die Zellkonzentration lag bei 0,5 g/l und die CO-Umsetzung bei 35%. Es lag noch keine H₂-Umsetzung vor, doch hatten sich geringe Mengen an Ethanol und Acetat (jeweils ~1 g/l) in der Batch-Kulturbrühe angesammelt. Bei den Arbeiten bis zu diesem Zeitpunkt lag die Betonung auf Zellwachstum im Reaktor.
Der Mediumfluß unter Verwendung der gleichen Konzentrationen wie beim Basalmedium wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/min bei t = 120 Std. gestartet. Anschließend wurde ein Programm mit nominalen Erhöhungen der Gasgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit und Mediumgeschwindigkeit begonnen, während dafür gesorgt wurde, daß das System unter H₂-Überschuß gehalten wurde. Nach t = 210 Std. betrug die Ethanolkonzentration 17 g/l, die Acetatkonzentration 1 g/l, die Zellkonzentration 1,6 g/l, die CO-Umsetzung nahezu 100% und die H₂-Umsetzung 90%. Die Ethanolproduktivität erreichte 11,4 g/l pro Tag.
Wiederum wurde ein Programm der stufenweisen Erhöhung der Gasgeschwindigkeit gestartet. Gleichzeitig wurde Vitamin (siehe Tabelle 1) erhöht, so daß die Zugabegeschwindigkeit auf 0,7 ml/l Medium gebracht wurde. Nach t = 610 Std. produzierte der Reaktor 20 g/l Ethanol und etwa 2 g/l Acetat. Die CO-Umsetzung betrug nahezu 100% und die H₂-Umsetzung 85%. Die Ethanolproduktivität erreichte 14 g/l pro Tag.
BEISPIEL 12. HOCHFAHREN MIT EINER ANIMPFKULTUR AUS EINEM EXISTIERENDEN CSTR
Das Hochfahren eines CSTR unter Verwendung einer kontinuierlichen Animpfkultur aus einem existierenden CSTR ist wesentlich schneller und zuverlässiger als ein Hochfahren von Flaschen mit Stammkulturansätzen. Ein CSTR mit dem Isolat C. ljungdahlii Stamm C-01 (ATCC Accession No. 55988), bei dem die Ethanolproduktion fast aufgehört hatte und der 2–3 g/l Ethanol, 7–8 g/l Acetat und etwa 0,3 g/l Butanol als Flüssigphaseprodukte produzierte, wurde mit einer kontinuierlichen Animpfkultur aus einem existierenden CSTR neu gestartet.
Der CSTR, dem die Animpfkultur entnommen wurde, produzierte etwa 17 g/l Ethanol und 1–2 g/l Acetat unter Betrieb mit einer Gasretentionszeit von 25 Minuten, einer Flüssigkeitsretentionszeit von 32 Stunden, einer Rührgeschwindigkeit von 650 UpM, einer Temperatur von 38,5°C sowie pH 4,66. Die Zellkonzentration betrug 1,7 g/l, die CO-Umsetzung praktisch 100% und die H₂-Umsetzung 85%.
Die kontinuierliche Zugabe der Animpfkultur wurde gestartet (t = 0), wobei zu diesem Zeitpunkt die Rührgeschwindigkeit auf 500 UpM verringert und die Gasretentionszeit auf 38 Minuten angesetzt wurde. Der Ausfluß aus dem produktiven Reaktor (0,5 ml/min) diente als kontinuierliche Animpfkultur für den angeimpften CSTR, wobei die kontinuierliche Animpfung über einen Zeitraum von mehreren Stunden erfolgte. Nach t = 5 Std. (5 Std. nach Beginn der kontinuierlichen Animpfung) wurde eine Gasumsetzung festgestellt, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 700 UpM erhöht. Die kontinuierliche Animpfkultur wurde bei t = 28 Std. abgeschaltet. Die Gasumsetzungen verbesserten sich stetig, was die stetige Erhöhung der Gasgeschwindigkeit (verkürzte Gasretentionszeiten) und einen Anstieg der Rührgeschwingigkeit auf 750 UpM gestattete. Nach t = 30 Std. betrug die CO-Umsetzung 95% und die H₂-Umsetzung 80%. Die Ethanolkonzentration betrug 13 g/l und die Acetatkonzentration 1,5 g/l, wobei sich diese über weit mehr als 100 Stunden auf 1,4 g/l stabilisierte. Während dieses Zeitraums betrug die Ethanolproduktivität 10 bis 15 g/l pro Tag.
BEISPIEL 13. WIEDERHERSTELLUNG VON EINER STARKEN VERFAHRENSSTÖRUNG
Ein den Stamm C. ljungdahlii C-01, dem kontinuierlich Gas und Flüssignährstoffe zugeführt werden und der 15–35 g/l Ethanol und 0–5 g/l Acetat unter Steady-State produziert, enthaltender CSTR mit Zellrückführung (z.B. Beispiel 1) wird durch unvorhergesehene Änderungen der Verfahrensbedingungen, z.B. mechanische Probleme im Reaktor, gestört. Die Störung des Reaktorsystems kann entweder gering sein, wie z.B. eine kurzzeitige Erhöhung der Gasgeschwindigkeit, die zu einer kurzzeitigen Substrathemmung führt, oder es kann sich dabei um eine größere Störung handeln, wie z.B. eine langfristigere Erhöhung der Gasgeschwindigkeit, die letztendlich zu einer erhöhten Essigsäureproduktion und einer stärkeren Produkthemmung durch molekulare Essigsäure führt.
Kurzfristige Störungen lassen sich leicht korrigieren, indem lediglich die gestörten Parameter neu angepaßt werden (beispielsweise Reduzieren der Gasgeschwindigkeit auf ihr ursprüngliches Niveau) und der Lauf des Reaktors verfolgt wird, um sicherzustellen, daß die Störung nicht zu einem längerfristigen Problem geführt hat.
Eine Essigsäureprodukthemmung stellt allerdings ein ernsteres Problem dar. Wird molekulare Essigsäure von der Kultur als Ergebnis einer langfristigen Substrathemmung, der Zugabe von Nährstoffen im Überschuß, einer CO₂-Anreicherung oder vielerlei mechanischer Probleme im Überschuß produziert, so muß zunächst das Problem, das den Essigsäureüberschuß verursachte, korrigiert werden. Anschließend wird die überschüssige Essigsäure, die schnell zur Produkthemmung führt, aus dem System entfernt, indem man die Flüssigkeitsgeschwindigkeit erhöht, um die Essigsäure (und unglücklicherweise Ethanol) aus dem System zu waschen. Sobald das Acetatniveau unterhalb von 3–5 g/l liegt, wird die Flüssigkeitsgeschwindigkeit auf den alten Wert eingestellt und der Reaktor entweder unter Zufuhr mit H₂-Überschuß oder Vitamin- oder Cobaltlimitierung (mit oder ohne Zellrückführung) zurückgestellt. Beim Zurückbringen des Reaktors wird die Gasgeschwindigkeit zur Vermeidung einer Substrathemmung und/oder die Rührgeschwindigkeit reduziert, bevor die Zellen ausgewaschen werden und eine Lyse stattfindet. Anschließend wird die Rührgeschwindigkeit bzw. Gasgeschwindigkeit erhöht, wie im Beispiel 1 beschrieben.
In einem spezifischen Beispiel begann ein den Stamm C. ljungdahlii C-01, der Ethanol und Essigsäure aus CO, CO₂ und H₂ produzierte, enthaltender CSTR mit Zellrückführung mit der Produktion von Essigsäure als Reaktion auf ein mechanisches Problem. Dem 2100-ml-Reaktor wurde 62% H₂, 31% CO und 7% C₂H₆ enthaltendes Gas mit einer Gasretentionszeit von 15 Minuten zugeführt, wobei er mit einer Rührgeschwindigkeit von 600 UpM und einem pH-Wert von 4,86 betrieben wurde. Die Flüssigkeitsretentionszeit betrug 23 Stunden und die Zellretentionszeit 68 Stunden. Eine Lösung von B-Vitaminen (wäßriges Gemisch aus 50,5 mg/l Calciumpantothenat, 20,6 mg/l d-Biotin und 50,6 mg/l Thiamin-HCl) war im flüssigen Medium mit Salzen und Vitaminen bei einer Konzentration von 0,4 ml Vitaminlösung pro Liter Medium enthalten (siehe Tabelle 2). Die Ethanolkonzentration fiel auf 7 g/l, während die Acetatkonzentration auf 7 g/l anstieg, Bedingungen, die weder stabil für den Betrieb des Reaktors noch ökonomisch für die Ethanolproduktion sind. Die Zellkonzentration betrug 2,4 g/l, die CO-Umsetzung 85% und die H₂-Umsetzung 25%.
Die zur Wiederherstellung des Reaktors verwendete Strategie bestand darin, zunächst die Gaszufuhrgeschwindigkeit zum Reaktor dramatisch zu reduzieren und anschließend den Reaktor in Gegenwart von überschüssigem H₂ wiederherzustellen. Die Flüssigkeitsgeschwindigkeit zum Reaktor wurde zur Beseitigung der Produkthemmung in diesem Beispiel nicht reduziert, da die Acetatkonzentration nicht außergewöhnlich hoch war. Statt dessen ließ man die Acetatkonzentration allmählicher auf nichthemmende Niveaus bei Reduzierung der Gasstromgeschwindigkeit und anschließendem Betrieb in Gegenwart von überschüssigem H₂ fallen. Die spezifische Vorgehensweise bei der Wiederherstellung des Reaktors wird nachfolgend erörtert.
Die Zellrückführung wurde abgeschaltet und die Gasgeschwindigkeit dramatisch um 70% auf eine Gasretentionszeit von 62 Minuten reduziert, während die Flüssigkeitsretentionszeit nur leicht von 23 auf 30 Stunden angepaßt wurde (t = 0). Die Vitamin konzentration im Medium wurde nicht verändert. Mit dieser Veränderung der Gasgeschwindigkeit stieg die CO-Umsetzung auf 98% und die H₂-Umsetzung auf 80% an. Insbesondere war im System überschüssiges H₂ vorhanden, wie sich an der Abnahme des CO₂ im Auslaßgas von 19 auf 5% zeigte. Sobald H₂ im Überschuß vorlag, fiel die Acetatkonzentration, während die Ethanolkonzentration anstieg. So war beispielsweise bei t = 66 Std. (66 Std. nach Abschalten der Zellrückführung) die Acetatkonzentration auf 4 g/l gefallen und die Ethanolkonzentration leicht auf 7,5 g/l gestiegen.
Das Vorhandensein von überschüssigem H₂ (und der geringeren Acetatkonzentration) gestattete nachfolgende Erhöhungen der Gasgeschwindigkeit, zunächst langsam und danach mit einer schnelleren Geschwindigkeit. Nach t = 215 Std. betrug die Gasretention 29 Minuten, die Ethanolkonzentration 12 g/l und die Acetatkonzentration 3 g/l. Die Ethanolproduktivität betrug 8 g/l pro Tag. CO₂ war im Auslaßgas mit 6% vorhanden, die CO-Umsetzung lag bei 98% und die H₂-Umsetzung bei 80%. Nach t = 315 Std. betrug die Ethanolkonzentration 16 g/l und die Acetatkonzentration 4 g/l, wiederum bei guten Gasumsetzungen sowie einer Gasretentionszeit von 20 Minuten. Die Ethanolproduktivität betrug 11 g/l pro Tag. Nach t = 465 Std. hatte die Ethanolkonzentration 20 g/l erreicht, wobei 3,5–4 g/l Acetat ebenso vorhanden waren. Die Ethanolproduktivität betrug 16 g/l pro Tag. Die Gasretentionszeit war auf 16 Minuten gesunken, bei CO- bzw. H₂-Umsetzungen von 95 bzw. 73%. Diese Bedingungen wurden über fast 200 Stunden Dauerbetrieb aufrechterhalten, was zeigt, daß das Reaktorsystem seine Fähigkeit zur Produktion von Ethanol wiedergewonnen und im wesentlichen die vorherigen Betriebsbedingungen beibehalten hat.
BEISPIEL 14. ETHANOLPRODUKTIONSVERFAHREN MIT ÜBERVERSORGUNG MIT CO
Ein einfaches Experiment wurde in einem kontinuierlichen Hochdruck-Rührkesselreaktor mit Zellrückführung durchgeführt, um die Umstellung von Essigsäureproduktion auf Ethanolproduktion aufgrund des Vorhandenseins hoher CO-Konzentrationen zu demonstrieren. Vor diesem Experiment wurde der den Stamm C. ljungdahlii C-01 enthaltende Reaktor bei einem Druck von 20–25 psig betrieben, wobei ihm 57% H₂, 36% CO und 7% C₂H₆ enthaltendes Gas zugeführt wurde. Die Gasretentionszeit betrug weniger als 2 Minuten, die Flüssigkeitsretentionszeit 38 Stunden, die Zellretentionszeit 28 Stunden, die Rührgeschwindigkeit 600 UpM und die Temperatur 38°C. Unter diesen Bedingungen variierte die CO-Umsetzung und betrug im Mittel 85%, wobei die H₂-Umsetzung variierte und im Durchschnitt 20% betrug. Die Zellkonzentration lag bei etwa 2,5 g/l, und der Produktstrom enthielt 9 g/l Ethanol sowie 3 g/l Acetat.
Als erster Schritt bei der Vorbereitung für den Test wurde die Gasretentionszeit erhöht, um sicherzustellen, daß kein überschüssiges CO vorhanden war. Der Druck wurde bei 23–24 psig gehalten. Der pH-Wert wurde lange genug verfolgt, um sicherzustellen, daß er im normalen Betriebsbereich von 4,5–4,6 stabil war. Anschließend wurde reines CO mit dem regulären Zufuhrgas vermischt, so daß sich eine Gaszufuhr von 47% H₂, 47% CO und 6% C₂H₆ bei einer Gasretentionszeit von 2,3 Minuten ergab. Anschließend wurden der pH-Wert des Reaktors, die Zusammensetzung des Abgangsgases sowie der Produktstrom zeitlich verfolgt.
In Tabelle 7 sind die pH-Änderungen und Produktzusammensetzungen im zeitlichen Verlauf nach Zugabe des zusätzlichen CO zum System gezeigt. 30 Minuten nach der CO-Zugabe war der Reaktor-pH-Wert auf 5,25 angestiegen, und die Kultur hatte sich von 1,54 g/l (0,0257 mol/l) Acetat auf 1,12 g/l (0,0243 mol/l) Ethanol umgestellt. Der pH-Anstieg erfolgte als Ergebnis der Umsetzung freier Essigsäure zu Ethanol. Diese Änderung wurde von einer Abnahme der CO-Umsetzung von 91% auf 71% begleitet. Mit der Reduzierung der Kulturkreislaufgeschwindigkeit von 0,4 gpm auf 0,15 gpm fiel der Reaktor-pH-Wert, doch blieben die Ethanol- und Acetatkonzentrationen konstant.
50 Minuten nach dem Einleiten von CO betrug die Ethanolkonzentration 11,29 g/l und die Acetatkonzentration 1,75 g/l. Zu diesem Zeitpunkt wurde der CO-Überschuß abgeschaltet, und die Ethanolkonzentration sowie der pH-Wert fingen an zu fallen, wobei die Acetatkonzentration zu steigen begann. Die Abnahme des pH-Werts lag an der Umsetzung von Ethanol zu molekularer Essigsäure. Die Ethanol-Essigsäure-Umstellung über eine Überversorgung von CO ist somit reversibel.
BEISPIEL 15. WASSERRÜCKFÜHRUNG ZUR MINIMIERUNG DER ACETATPRODUKTION
Die Rückführung des Verfahrenswassers zurück zum Fermentationsbioreaktor nach der Destillation zur Gewinnung des Ethanols ist essentiell für die Minimierung der Ausflußproduktion sowie für die Maximierung der Ausbeute an Ethanol aus dem Reaktor und für die Limitierung der Essigsäureproduktion. Für die Konzentration der aus dem Reaktor erhaltenen 15–35 g/l Ethanol zu 95% Ethanol stellte sich die Destillation als das wirtschaftlichste Verfahren heraus. Die Adsorption mit Molekularsieben wird dann zur weiteren Aufkonzentrierung des Ethanols bis zur gewünschten Konzentration verwendet. Bei der Durchführung der Destillation wird als Kopfprodukt 95% Ethanol in Wasser produziert. Wasser wird während der Destillation als Sumpfprodukt erzeugt. Das Sumpfprodukt enthält Essigsäure aus dem Reaktor, die während der Fermentation produziert wurde (3–5 g/l Acetat), sowie jegliche Nährstoffe, die während der Fermentation nicht verbraucht oder durch die Destillationswärme zerstört wurden, wie z.B. Spurenmetalle und andere Mineralien. Die Rückführung der Nährstoffe minimiert die Menge an Ausfluß, die ebenso wie die Menge an Nährstoffen, die anschließend in den Fermentationsbioreaktor gegeben werden muß, behandelt werden muß. Die Rückführung des Acetats verhindert die Bildung weiterer Essigsäure durch Etablierung eines Gleichgewichts zwischen dem Ethanol und der Essigsäure. Somit wird keine Netto-Essigsäure bei der Wasserrückführung produziert. Die Rückführung von mehr als 3–5 g/l Acetat kann zu einer Essigsäurehemmung im Reaktor führen. Somit lassen sich als Ergebnis der Rückführung von acetathaltigem Wasser die Substrate CO, CO₂ und H₂ zu Ethanol als einzigem Produkt umsetzen.
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse für die Fermentation von 50% CO, 45% H₂ und 5% CH₄ enthaltendem Gas unter Verwendung des Stamms C. ljungdahlii O-52 mit Wasserrückführung dargestellt. In diesen Experimenten wurde das Permeat aus der für die Zellrückführung verwendeten Hohlfaserfiltration zur Destillation geschickt. Nach Abtrennung des Ethanols wurde das Wasser mit einem 0,2-Mikrometer-Filter zur Abtrennung eventueller ausgefallener Nebenprodukte filtriert. Der rückgeführte Wasseranteil lag im Vergleich mit dem gesamten, dem Reaktor in diesen Experimenten zugeführtem Wasser (als Medium) im Bereich von 25–100%. Das Experiment mit 100% Wasserrückführung dauerte fast 500 Stunden bzw. etwa 20 Flüssigkeitsretentionszeiten. Wie in den Ergebnissen mit 100 Wasserrückführung angemerkt wurde keine Netto-Essigsäure produziert. In der Tat wurde letztendlich eine geringe Menge an Essigsäure verbraucht. Die Ethanolproduktivität lag im Bereich von 12–27 g/l pro Tag.
BEISPIEL 16. ZWEI-STUFEN-CSTR-SYSTEM MIT PANTOTHENATZUFUHR ZUR WACHSTUMSSTUFE
Bei der korrekten Pantothenatzufuhr zur Wachstumsstufe handelt es sich um eine Variable, die optimiert werden muß. Typische Ergebnisse eines Wachstumsstufe-Reaktors unter Verwendung von C. ljungdahlii C-01 wurden in Beispielen 11 und 12 beschrieben, mit der Ausnahme, daß etwas mehr Essigsäure in diesem Reaktor produziert werden würde, da der Wachstumsstufe zusätzliches Pantothenat oder Cobalt zugeführt wird, um eine gesunde und stabile Kultur zu gewährleisten. Die eingesetzte Vitaminkonzentration betrug 0,7–0,8 ml/l Medium einer wäßrigen Lösung mit 50,5 mg/l Calciumpantothenat, 20,6 mg/l d-Biotin und 50,6 mg/l Thiamin-HCl. Dem Produktionsstufe-CSTR mit Zellrückführung wird Ausfluß aus dem Wachstumsstufe-Reaktor zugeführt, wobei ersterer Ethanol als Hauptprodukt produziert. Die diesem Reaktor zugeführte Pantothenatkonzentration ist wesentlich geringer als die in der Wachstumsstufe, und zwar lediglich 0,1–0,2 ml Gesamtvitamine/1 Medium der wäßrigen Lösung mit 50,5 mg/l Calciumpantothenat, 20,6 mg/l d-Biotin und 50,6 mg/l Thiamin-HCl. Die Gasretentionszeit in dieser Produktionsstufe betrug 11–30 min, die Flüssigkeitsretentionszeit etwa 20 Stunden, die Zellretentionszeit 30–50 Stunden und die Rührgeschwindigkeit 800–900 UpM. Der pH-Wert lag bei 5,0 und die Temperatur bei 38°C. Sobald der Reaktor den Steady-State erreicht hatte, wurde die Gasretentionszeit konstant auf 11 Min. gehalten, die Flüssigkeitsretentionszeit wurde mit 19 Stunden angesetzt, die Zellretentionszeit betrug konstante 37 Stunden und die Rührgeschwindigkeit 900 UpM. Die CO-Umsetzung lag im Mittel bei 96% und die H₂-Umsetzung bei im Mittel 60%. Die Ethanolkonzentration stabilisierte sich bei 25–30 g/l, wobei ebenso etwa 3 g/l Acetat vorhanden waren. Die Ethanolproduktivität betrug 31,6–37,9 g/l pro Tag.
BEISPIEL 17. REGULATION DER FERMENTATIONSPARAMETER ZUR VERMEIDUNG EINER AKKLIMATISIERUNG AN NIEDRIGES LIMITIERENDES CALCIUMPANTOTHENAT
Die Akklimatisierung der Kultur im Fermentationsbioreaktor an eine niedrige limitierende Calciumpantothenatkonzentration wird durch die Regulation der Fermentationsparameter (Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, H₂-Partialdruck) vermieden, während größere Änderungen der Nährstoffe vermieden werden, statt dessen jedoch eine relativ konstante Nährstoffzufuhrkonzentration aufrecht erhalten wird, und zwar wie folgt.
Während des Hochfahrens eines Bioflo^®-Labor-CSTR von New Brunswick Scientific wurde der Stamm C. ljungdahlii C-01 einem Flüssigkeitsnährstoffstrom mit Vitaminen, Spurenmineralien und Salzen, die zur Nahrungsversorgung der Kultur notwendig sind, zugeführt. Dabei betrug die Pantothenatkonzentration im Nährmedium 20 μg/l, eine Konzentration, die in Verbindung mit der langsamen Geschwindigkeit der Mediumzufuhr gewährleistet, daß mehr als 100 μg zugeführtes Calciumpantothenat pro Gramm produzierte Zellen (Überschuß an Pantothenat) aufgrund der geringen Zellproduktion im Bioreaktor vorliegt. Analog betrug die Cobaltkonzentration im Medium 1 ppm, eine Konzentration, die gewährleistet, daß Cobalt ebenso im Überschuß vorliegt. Dagegen wurde der H₂-Partialdruck im Abgangsgas oberhalb von 0,55 Atmosphären gehalten, indem ein kein CO₂, 63,3 H₂, 31,4 CO und 5,3% C₂H₆ enthaltendes Gas zugeführt wurde, womit sich ein Verhältnis von H₂ _zugeführt/(2CO _umgesetzt und 3CO₂ _umgesetzt) von mehr als 1 ergab, und indem die Gaszufuhrgeschwindigkeit und Rührgeschwindigkeiten vorsichtig reguliert wurden, so daß mehr als 95% CO-Umsetzung und mehr als 80% H₂-Umsetzung erzielt wurden. Da diese hohen Umsetzungen mit der Zeit erreicht werden, baut sich die Zellkonzentration von einem Anfangsniveau nahe 0 g/l bis auf etwa 1,5 g/l auf.
Da die Pantothenatkonzentration während dieses Hochfahrens konstant gehalten wird, nimmt die Anzahl μg Pantothenat pro Gramm produzierte Zellen allmählich ab, bis sie weniger als 15 μg Pantothenat/g produzierte Zellen beträgt, ein Zustand, der dann Pantothenat-limitiert ist. Das System wächst somit in eine Pantothenatlimitierung hinein. Hohe Ethanol:Acetat-Produktverhältnisse werden während des gesamten Hochfahrens durch überschüssiges H₂ erreicht. Alternativ gestattet man dem Reaktor, während der frühen Stufen des Hochfahrens Essigsäure zu produzieren, wobei das Produktverhältnis später über Pantothenatlimitierung unter Kontrolle gebracht wird.
BEISPIEL 18. LIMITIERUNG VON COBALT AN DEN REAKTOR
Dem Stamm C. ljungdahlii ERI2 wurden 62 bis 3500 μg Cobalt/g produzierte Zellen während der Essigsäureproduktion aus CO, CO₂ und H₂ zugeführt, ein Zustand, bei dem der Reaktor nicht an Cobalt (oder hinsichtlich einer anderen Limitierung, außer der Fähigkeit zur Eintragung von Gas in die Kultur) limitiert war, wobei kein Ethanol im Produktstrom gefunden wurde. Während der Limitierung an Cobalt für die Ethanolproduktion aus CO, CO₂ und H₂ wurden dem Stamm C. ljungdahlii C-01 33 bis 48 μg Cobalt/g produzierte Zellen zugeführt, während alle anderen Nährstoffe im Überschuß gehalten wurden. Unter diesen Bedingungen produzierte der Stamm C-01 18 bis 26 g/l Ethanol und etwa 4 g/l Acetat.
BEISPIEL 19. VERMEIDUNG EINER AKKLIMATISIERUNG AN EINE NIEDRIGE LIMITIERENDE COBALTKONZENTRATION
Eine Akklimatisierung an eine niedrige limitierende Cobaltkonzentration wird durch Regulieren der Fermentationsparameter (Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, CO₂-Gehalt) vermieden, während größere Änderungen bei den Nährstoffen vermieden werden, statt dessen jedoch eine relativ konstante Nährstoffzufuhrkonzentration aufrecht erhalten wird, und zwar wie folgt.
Während des Hochfahrens eines Bioflo^®-Labor-CSTR von New Brunswick Scientific wurde dem Stamm C. ljungdahlii C-01 ein Flüssigkeitsnährstoffstrom mit Vitaminen, Spurenmineralien und Salzen, die zur Nahrungsversorgung der Kultur notwendig sind, zugeführt. Die Cobaltkonzentration im Nährmedium betrug 75 ppb, eine Konzentration, die in Verbindung mit der langsamen Geschwindigkeit der Mediumzufuhr gewährleistet, daß mehr als 50 μg zugeführtes Cobalt pro g produzierte Zellen (Cobaltüberschuß) wegen der geringen Zellproduktion im Bioreaktor vorliegt. Analog betrug die Pantothenatkonzentration im Medium 20 μg/l, eine Konzentration, die gewährleistet, daß Pantothenat ebenso im Überschuß vorliegt. Dagegen wurde der H₂-Partialdruck im Abgangsgas oberhalb von 0,55 Atmosphären gehalten, indem ein große Mengen an H₂ und kein CO₂ enthaltendes Gas zugeführt wurde und die Gaszufuhrgeschwindigkeit sowie die Rührgeschwindigkeiten vorsichtig reguliert wurden, so daß mehr als 95% CO-Umsetzung und mehr als 80% H₂-Umsetzung erzielt wurden. Da diese hohen Umsetzungen mit der Zeit erreicht werden, baut sich die Zellkonzentration von einem Anfangsniveau nahe 0 g/l auf etwa 1,5 g/l auf. Da die Cobaltkonzentration während dieses Hochfahrens konstant gehalten wird, nimmt die Anzahl μg Cobalt pro g produzierte Zellen allmählich ab, bis sie weniger als 50 μg Cobalt/g produzierte Zellen beträgt, ein Zustand, der dann Cobalt-limitiert ist. Das System wächst somit in eine Cobaltlimitierung hinein. Während des gesamten Hochfahrens werden hohe Ethanolausbeuten erzielt, indem in der Zufuhr ein Überschuß an H₂ eingesetzt wird. Alternativ läßt man den Reaktor während der frühen Stufen des Hochfahrens Essigsäure produzieren, wobei das Produktverhältnis später über Cobaltlimitierung unter Kontrolle gebracht wird.
BEISPIEL 20. ÜBERVERSORGUNG MIT WASSERSTOFF
Während des Betriebs eines Laborreaktors AUTOKLAV^TM (Buchi), der als CSTR mit Flüssigkeitskreislaufrückführung und Zellrückführung betrieben wurde, wurde C. ljungdahlii mit überschüssigen Vitaminen, Spurenmineralien und Salzen, die für die Nahrungsversorgung der Kultur notwendig sind, betrieben. Der Reaktor wurde dabei mit einem im Zufuhrgas vorhandenen Überschuß an H₂ betrieben, so daß das Verhältnis der Mole zugeführtes H₂ zur Summe aus den Molen umgesetztes CO mal zwei sowie den Molen umgesetztes CO₂ mal drei 5,67 betrug. Wäre dieses Verhältnis nicht größer als 1,0, so kann im Reaktor kein H₂-Überschuß vorliegen, und eine Ethanolproduktion aufgrund des Vorhandenseins eines H₂-Überschusses kann nicht stattfinden. Weiterhin betrug der H₂-Partialdruck im Abgangsgas 2,61 atm, ein Niveau, das die für eine Ethanolproduktion aufgrund von überschüssigem H₂ benötigten 0,4 atm überstieg. Schließlich betrug das Verhältnis von H₂-Partialdruck zum CO₂-Partialdruck im Abgangsgas 10,88, ein Niveau, das größer als 3,0 ist und sicherstellt, daß genügend H₂ vorliegt, um den gesamten verfügbaren Kohlenstoff zu verwerten. Unter diesen Bedingungen produzierte der Reaktor fast 26 g/l Ethanol und weniger als 3 g/l Acetat. Die Ethanolproduktivität betrug mehr als 200 g/l pro Tag. Falls eines dieser obigen Kriterien nicht erfüllt wird, kann der Reaktor kein Ethanol aufgrund des Vorhandenseins eines H₂-Überschusses produzieren. Ein weiterer Aspekt eines Überflusses an H₂ liegt darin, daß letzterer zu zusätzlichem reduziertem Ferredoxin durch Oxidation über Hydrogenase führt.
BEISPIEL 21. ABSCHWÄCHUNG EINER CO-SUBSTRATHEMMUNG
Ein mit einer Rührgeschwindigkeit von 800 UpM betriebener Bioflo^®-Labor-CSTR von New Brunswick Scientific zeigt eine CO-Auslaßkonzentration von 10%, wenn er zuvor mit lediglich 5% CO im Gasauslaß betrieben worden war. Durch Reduzierung der Rührgeschwindigkeit auf 600 UpM wurde die CO-Hemmung aufgehoben, und die CO-Auslaßkonzentration stellte sich wieder auf 5% ein. Dies führt zu einer erhöhten H₂-Aufnahme, einer notwendigen Bedingung, um das gesamte dem Reaktor zugeführte Gas effizient zu verwerten.
BEISPIEL 22. STOFFÜBERGANG
Als Beispiel für einen Stoffübergang im Überschuß, der zur Ethanolproduktion führt, wird ein Labor-CSTR mit Zellrückführung, der den ohne Nährstofflimitierung oder überschüssiges H₂ oder CO im Zufuhrgas arbeitenden Stamm C. ljungdahlii ERI2 enthält, vorgeschlagen. Das heißt, Pantothenat wird mit einer Geschwindigkeit von mehr als 100 μg Calciumpantothenat pro Gramm produzierte Zellen und Cobalt mit einer Geschwindigkeit von mehr als 100 μg pro Gramm produzierte Zellen zugeführt. H₂ ist im Abgangsgas mit etwa 0,2 atm vorhanden, wobei die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit weniger als 0,3 mmol CO/g Zellen pro Minute beträgt. Die Rührgeschwindigkeit liegt bei 800 UpM. Unter diesen Bedingungen produziert die Kultur lediglich Essigsäure (kein Ethanol im Produktstrom vorhanden). Wird die Rührgeschwindigkeit schnell auf 900 UpM bzw. die Gasgeschwindigkeit um etwa 10% erhöht, so kann man Ethanol im Produktstrom beobachten, bis die Zellkonzentration zur Aufnahme des Gases ansteigt oder bis die Kultur aufgrund einer Substrathemmung abstirbt.
BEISPIEL 23. KONTROLLE DER ESSIGSÄUREPRODUKTHEMMUNG
In einem Labor-CSTR, der 8 g/l Essigsäure sowie 10 g/l Ethanol produziert, wird die Flüssigkeitsretentionszeit von 24 Stunden auf 12 Stunden über einen Zeitraum von 36 Stunden reduziert, und zwar in einem Versuch, die überschüssige Essigsäure, die die Fähigkeit der Kultur, mehr Ethanol zu produzieren, limitiert, aus dem Reaktor auszuwaschen. Alle anderen Reaktorbetriebs- und Nährstoffbedingungen werden konstant gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wird die Flüssigkeitsretentionszeit wieder auf 24 Stunden gebracht, was zu einem Produktstrom mit 3 g/l Acetat und 15 bis 25 g/l Ethanol führt. Dabei werden mehrere Versuche zur Reduzierung der Flüssigkeitsretentionszeit benötigt, um die Produkthemmung zu beseitigen. Alternativ wird die Gaszufuhr mit H₂ versetzt, um eine Kontrolle mit überschüssigem H₂ zu gestatten, da überschüssiges CO₂ ebenso zu einer gegenüber Ethanol bevorzugten Essigsäureproduktion führen kann. Diese Modifikationen verhindern die Produktion überschüssiger Essigsäure und somit ein schlechtes Produktverhältnis sowie eine geringe Ethanolproduktivität. Anschließend wird die Verwendung von überschüssigem H₂ im Zufuhrgas oder der limitierenden Flüssigphase-Nährstoffkonzentration fortgesetzt.
BEISPIEL 24. ÜBERVERSORGUNG MIT KOHLENMONOXID
Der Stamm C. ljungdahlii ERI2 wies bei Zufuhr eines Überschusses an Nährstoffen (Pantothenat und Cobalt im Überschuß) und ohne H₂-Überfluß im Zufuhrgas eine spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit von 0,23 bis 0,48 mmol/g pro Minute auf, wobei kein Ethanol im Produktstrom gefunden wurde. Wurde jedoch dem Stamm C. ljungdahlii C-01 in ähnlicher Weise ein Überschuß an Nährstoffen ohne H₂-Überfluß im Zufuhrgas zugeführt, jedoch unter einer Bedingung, bei der eine Überversorgung mit CO zur Ethanolproduktion führte, so betrug die spezifische CO-Aufnahmegeschwindigkeit 0,67 bis 1,34 mmol/g pro Minute. Unter diesen Bedingungen produzierte die Kultur 9,9 bis 12,0 g/l Ethanol und 2,6 bis 2,7 g/l Acetat.
BEISPIEL 25: KONTROLLE DER PRODUKTVERHÄLTNISSE MIT ZELLENTFERNUNG
Eine Fermentation von gasförmigem Substrat (30% CO, 15% H₂, 10% CO₂, 45% N₂) findet in einem CSTR (pH = 5,0, Temperatur = 38°C, Druck = 20 psig) unter Nutzung des Stamms C. ljungdahlii C-01 mit Zellrückführung (Zellretentionszeit = 40 Stunden und Flüssigkeitsretentionszeit = 6 Stunden) statt, wobei das Wachstum der Kultur nicht durch Cobalt, Calciumpantothenat oder einen anderen Nährstoff limitiert ist. Beim Wachsen der Kultur wird eine solche Zelldichte erreicht, daß die spezifische Aufnahme (mmol CO pro Gramm trockene Zellen pro Minute) unterhalb 0,5 liegt und Essigsäure gegenüber Ethanol bevorzugt produziert wird. Um dies zu verhindern, wird die Zellentfernungsgeschwindigkeit erhöht, um einen Anstieg der Zelldichte zu verhindern, so daß die stabile Zellkonzentration niedrig genug für die Aufrechterhaltung einer spezifischen Aufnahme von mehr als 0,5 mmol CO pro Gramm trockene Zellen pro Minute gehalten wird. Dabei wird die Zellretentionszeit auf einen Wert zwischen 6 und 25 Stunden reduziert. Tabelle 1. Ethanolproduktionsmedium

^a Die MPFN-Spurenmetallösung (MPFN Trace Metals) enthält (pro Liter Lösung): 10 ml 85% H₃PO₄, 0,10 g ZnSO₄·7H₂O, 0,03 g MnCl₂·4H₂O, 0,3 g H₃BO₃, 0,20 g CoCl₂·6H₂O, 0,02 g CuCl₂·H₂O, 0,04 g NiCl₂·6H₂O, 0,03 g NaMoO₄·2H₂O, 2,00 g FeCl₂·4H₂O, 0,01 g Na₂SeO₃ und 0,10 g Na₂WO₄·2H₂O
^b Die Vitaminlösung enthält 20,6 mg/l d-Biotin, 50,6 mg/l Thiamin-HCl und 50,5 mg/l d-Pantothensäure, Calciumsalz
^c Variiert beträchtlich von den 0,3–0,5 ml bei der Animpfung bis zu 0,7–0,8 ml bei hohen Gasgeschwindigkeiten

Claims

Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus der anaeroben bakteriellen Fermentation eines gasförmigen, Kohlenmonoxid umfassenden Substrats, wobei man in dem Verfahren in einem Fermentationsbioreaktor ein Clostridium ljungdahlii-Bakterium kultiviert, das zur Produktion von Ethanol in einem flüssigen Nährmedium, das Calciumpantothenat enthält und einen pH-Wert von weniger als 5,5 aufweist, wobei die Konzentration an freier Essigsäure im Fermentationsbioreaktor weniger als 5 g/l beträgt und das Verhältnis von Ethanol zu Acetat in der Fermentationsbrühe im Bioreaktor 1:1 bis 20:1 beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß das Calciumpantothenat dem Fermentationsbioreaktor in einer Menge von 0,5 bis 50 μg pro g im Bioreaktor produzierte trockene Bakterienzellen zugeführt wird und eine spezifische Geschwindigkeit der Kohlenmonoxidaufnahme von wenigstens 0,5 mmol pro g Bakterienzelltrockengewicht pro Minute im Bioreaktor aufrechterhalten wird, wodurch in einem stabilen Zustand Ethanol bei einer Produktivität von mehr als 10 g/l/Tag produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Fermentationsbioreaktor einen Wachstumsreaktor enthält, der die erhaltene Fermentationsbrühe einem zweiten Bioreaktor zuführt, in dem der größte Teil des Ethanols produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man ferner Fermentationsbrühe aus dem Bioreaktor entfernt, Ethanol aus der Brühe destilliert und das Ethanol gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem man ferner acetathaltiges Wasser im Kreislauf vom Destillationsschritt in den Bioreaktor zurückführt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Clostridium ljungdahlii-Bakterium ausgewählt ist aus den Stämmen PETC, ERI2, O-52 und C-01.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gasförmige Substrat ausgewählt ist aus (a) Kohlenmonoxid, (b) Kohlenmonoxid und Wasserstoff, (c) Kohlenmonoxid, Kohlendioxid und Wasserstoff und (d) einem der Substrate (a) bis (c) mit Stickstoff oder Methan.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem man ferner einen Schritt durchführt, der ausgewählt ist aus: (a) Verändern wenigstens eines Parameters, ausgewählt aus Nährmediuminhalt, Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit, wäßriger Zufuhrgeschwindigkeit, Betriebsdruck, Betriebs-pH-Wert, Gehalt an gasförmigen Substraten, Gaszufuhrgeschwindigkeit, Fermentationsbrühenrührgeschwindigkeit, Produktkonzentration, Zelldichte, Substrathemmung und Kombinationen daraus; (b) regelmäßiges Entfernen von Bakterienzellen aus dem Fermentationsbioreaktor auf eine niedrigere Zellkonzentration als die stabile Konzentration, bei der alle reduzierenden Gas- oder Nährstoffsubstrate im Bioreaktor genutzt werden; (c) Erhöhen der wäßrigen Zufuhrgeschwindigkeit, wenn der Anteil der freien Essigsäure am in der Fermentationsbrühe vorhandenen Acetat 2 g/l überschreitet, wodurch eine eventuelle unerwünschte Erhöhung der Konzentration an freier Essigsäure verringert wird; (d) Reduzieren der Zufuhrgeschwindigkeit des gasförmigen Substrats zur Verringerung der Substrathemmung und Aufrechterhaltung der Produktivität; (e) Reduzieren der Rührgeschwindigkeit zur Verringerung der Substrathemmung und Aufrechterhaltung der Produktivität; (f) Zuleiten des gasförmigen Substrats zum Fermentationsbioreaktor mit einer Geschwindigkeit von 0,3 bis 2 mmol CO pro Gramm trockene Bakterienzellen im Bioreaktor pro Minute; (g) Erhöhen der Menge an im Fermentationsbioreaktor vorhandenem CO, so daß die Menge an CO größer ist als die zum Halten des Bakteriums auf einer stabilen Bakterienkonzentration, bei der das bereitgestellte CO vollständig genutzt würde, erforderliche Menge; (h) Aufrechterhalten einer im Fermentationsbioreaktor vorhandenen CO-Menge, mit der Ethanolproduktion gegenüber Acetatproduktion bevorzugt unterhalten wird; (i) Einleiten des ferner Cobalt enthaltenden Nährmediums in den Fermentationsbioreaktor, wobei die Menge an Cobalt im Bioreaktor auf 5 bis 100 μg Cobalt pro Gramm produzierte trockene Bakterienzellen gehalten wird; und (j) Anheben des pH-Werts der Kultur auf einen Wert oberhalb von 4,5.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem man in einem weiteren Schritt die Akklimatisierung des Bakteriums im Fermentationsbioreaktor an die Menge an Calciumpantothenat durch Anpassen der Parameter, ausgewählt aus Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit und Wasserstoffgaspartialdruck, verhindert.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man ferner überschüssiges Wasserstoffreduktionsgas zum Fermentationsbioreaktor leitet.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der in Anspruch 7 definierte Schritt (i) durchgeführt und die Akklimatisierung des Bakteriums im Fermentationsbioreaktor an das Cobalt durch Aufrechterhalten einer konstanten Cobaltkonzentration und Anpassen der Parameter, ausgewählt aus Gasgeschwindigkeit, Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Rührgeschwindigkeit, Nährstoffzufuhrgeschwindigkeit und Wasserstoffgaspartialdruck, verhindert wird.