DD139870A1

DD139870A1 - VERFAHREN ZUR MIKROBIELLEN KONVERTIERUNG VON SUBSTR&TKOMBINATIONEN

Info

Publication number: DD139870A1
Application number: DD20956378A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Babel; Rudolf Scholz; Franz Glombitza; Uwe Iske; Erhard Feiler; Ursula Hilger; Joerg Schneider; Christine Gwenner; Klaus Richter
Original assignee: Wolfgang Babel; Rudolf Scholz; Franz Glombitza; Uwe Iske; Erhard Feiler; Ursula Hilger; Joerg Schneider; Christine Gwenner; Klaus Richter
Priority date: 1978-12-07
Filing date: 1978-12-07
Publication date: 1980-01-23

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen Industrie und hat zum Ziel, durch Steigerung der Substratausnutzung und spezifischen Wachstumsrate bzw. Produktbildungsrate den Ertrag an Biomasse bzw. Produkt zu erhöhen. Gemessen an der Verbrennungsenthalpie der mikrobiellen Biomasse können die Substrate für das Wachstum bzw. für die Produktbildung eingeteilt werden in: 1. Substrate mit Energieüberschuß, 2. mit einem nahezu ausgewogenen Kohlenstoff/Energie-Verhältnis und 3. mit Energiemangel.

Description

Titel · . .

Verfahren zur mikr-obiellen Kovertierung von Substratkombinationen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen Industrie, speziell Verfahren zur Erzeugung von mikrobiellen Biomassen, und Produkten,,

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Die bekannten technischen Lösungen für die Biomasseproduktion und Produktsynthese sind dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoff- und Energiequelle ein Substrat eingesetzt wird, z,B. für Biomasse: Methanol·- 76,26.280 Japan, Cl. C 12 C 11/08 (1976, Glucose - 76.48.489 Japan Cl. C 12 D 13/06 . (1976), n-Alkane - 2.348.753 BRD, C 12 C 11-18 (1973), 1.442.070 Großbritannien, C 12 B₁-OO (1975), Äthanol bzw. Essigsäure - 77.105.275 Japan, Cl. C 12 C 11/08 (1977); ' für ProduktSynthesen: Glucose - 1,812.710 Japan und 3.622.455 US (1976), n-Alkane - Tabuchi et al. (1970) Nippon Nogei Kogaku Kaishi 44, 562. .

Durch phänotypische Optimierung der Fermentationsprozesse werden Ertragskoeffizienten (Biomasseproduktion) erreicht, die im allgemeinen um 45% liegen und die 50%-nicht übersteigen. Bei Einsatz von Mischsubstraten erfolgt die Auswahl und Kombination der Substrate auf empirischer Grundlage .(z.B.

Sulfitablaugen/Äthanol - 2506149 BRD, C 12 D 13/06 (1976), Glucose/Lactose - Baidya et al. (1967) Biotechnol. Bioeng. IX, 195).

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Ziel der- Erfindung

Die Erfindung hat zum Ziel, durch Steigerung der Substratausnutzung und spezifischen Wachstumsrate bzw·· Produktbildungsrate den Ertrag an Biomasse bzw· Produkt zu erhöhen 5und damit wesentlich die Ökonomie der Verfahren zur Erzeugung von Biomasse und mikrobiellen Produkten zu verbessern.

Darlegung des Weseng der Erfindung .

Substrate für das mikobielle Wachstum, die Kohlenstoff- und Energiequelle zugleich sind, unterscheiden sich im Kohlenstoff/Energie-Verhältnis· Gemessen an dem Energieinhalt der erzeugten Zellsubstanz können die in Präge kommenden Substrate inbezug auf ihre Ausgewogenheit im Kohlenstoff/Energie-Verhältnis bewertet werden. Dabei lassen sich die Substrate in drei Gruppen einteilen (s· Tabelle 1).:

1· Substrate mit Energieüberschuß (E > C)

2. Substrate mit einem ausgewogenen Kohlenstoff:Energie-Verhältnis (E ^ C)

3. Substrate mit Energiemangel (E ^ C).

Tabelle 1	%	E Äi c	%	E^ C	%
20 E > C	74	Glycerin	96,5	Saccharose	113 _:
Methanol	78	Arabit	103	Xylose	113
Äthanol	80	Manni t	105	Ribose	113
Pentadecan	80			Glucose	114
Hexadecan	86			Milchsäure	118
25 Palmitinsäure				Essigsäure	122
				Brenztrau	137
				bensäure
				Bernstein	143
				säure
30				Äpfelsäure	159
				Fumarsäure	160
				Citronen	161
				säure
				Ameisen	208
				säure
				Oxalsäure	435
					— "3 —

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Zahlenwerte bedeuten: % der verbrauchten Energie bei 100%-Kohlenstoff-Einbau und einem C-Gehalt der Biomasse von 47%

Das Wesen der· Erfindung besteht darin, für mikrobielle Biomasseproduktionen sowie für Produktsynthesen Substratmischungen einzusetzen, die so zu kombinieren sind, daß ein ausbalanciertes Kohlenstoff/Energieverhältnis entsteht, so daß Ertragskoeffizienten erreicht v/erden, die dem theoretischen Optimum nahe kommen (bei der Biomasseproduktion ca.

67%, bezogen auf den Kohlenstoff), Dies hat entscheidende Auswirkungen auf die Ökonomie der Verfahren durch Erhöhung der Substratausbeute und durch Senkung de'r Abwärme. Bedingungen für die erfolgreiche Anwendung dieses Prinzips sind Mikroorganismen, die in der Lage sind, einerseits auf jedem Substrat der gewählten Kombination zu v/achsen und andererseits die Substrate kombiniert simultan aufzunehmen, und daß in der Kombination ein Substrat nicht die Verwertung eines anderen Substrates inhibiert und/oder reprimier-t. Die simultane Verwertung der Substrate führt gleichzeitig zu einer Steigerung der spezifischen Wachstumsrate, v/as für die Dimensionier-ung der Anlage und die biologische Stabilität im ungeschützten Fermentationsprozeß vorteilhaft ist.

Beispiel 1:

Der methanolutilisierende Hefestamm Hansenula polymorpha wurde im diskontinuierlichen Prozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert: T = 38 ⁰C pH = 4,5

Zusammensetzung der Nährlösung: Komponente M£2S^e (2^ro

H₃PO₄ 1 ml

KCl 0,5 g

NaCl . 0,1 g

209 56 3

MgSO₄ , 0,182 g

PeSO. 30 mg

MnSO₄ , 5H₂O 24 mg ·

ZnSO₄ 4 mg

CuSO₄ 1 mg

CoSO₄ 2 mg

₂₄ 10 mg

Biotin 15 mg

Thiamin 800 mg

-]0 UH-a~N-Eintrag kontinuierlich über pH-Regelung Permentor =2,51 Laborfermentor (LKB, Schweden) Als C-Quelle diente eine Kombination von Methanol und Xylose (Konzentration = 50 mM Methanol

+12 mM Xylose),

-I5 Dabei konnten die folgenden Werte für die spezifische Wachstumsrate (/u) und den Ertragskoeffizienten (Yc) aus dem simultanen Substratverbrauch und dem Biomasseertrag errechnet werden: .

^Substrat /U (h-¹) Yc (gTS/gC)

Methanol - '

+ Xylose . 0,210 1,2

Wurden dagegen Methanol und Xylose getrennt als C-Quellen eingesetzt (Konzentration an Methanol =25 mM konstant überdenke samt en Versuch; Konzentration an Xylose = 12 mlvl), so betrugen die Ertragskoeffizienten und die spezifischen Wachstumsr-aten nur: "

Substrat ,u (h~¹) Yc (gTS/gC)

Methanol 0,110 0,89

Xylose 0,070 1,0 ·

Unter der Bedingung der kombinierten Substratzugabe ist demnach eine Steigerung der spezifischen Wachstumsrate um nahezu 100% und eine Signifikate Erhöhung des Ertrqg skoeffizienten zu verzeichnen.

— 5 —

Beispiel 2:

Der methanolutilisierende Stamm Hansenula polymorpha sp. wurde unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen kultiviert» Die Fermentation erfolgte kontinuierlich. Als Substrat wurde die Kombination von Methanol mit Xylose (Mischungsverhältnis wie im Beispiel 1; Konzentration von Methanol < 12 mM) eingesetzt.

Durch Verwendung der Substratkombination konnte ein stabiler

_1 Prozeß mit D . . = 0,138 h erzielt v/erden, der Ertrags-

1.0 koeffizient betrug Yc = 1,5 gTS/gC.

Bei Einsatz von Methanol als einziger C-Quelle und Energiequelle (Konzentration < 12 mM) konnte dagegen eine maximale Durchflußrate von nur D ., = 0,07 h ,realisiert werden, der Ertragskoeffizient betrug Yc = 1,18 gTS/gC.

Mit GiIfe der Substratkombination erhöhte sich gegenüber dem alleinigen Substrat Methanol die kritische Dürchflußrate um ca.'100% und der Ertragskoeffizient um 27%.

Beispiel 3:

Die Hefe Candida utiis würde mit einer Mischung von Äthanol und Saccharose im Gewichtsverhältnis 3 : 1. in einem Rührfermentor mit 5 kg Arbeitsinhalt unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Fermentationstemperatur: 35 ⁰C

pH-Wert: 4,0

Verweilzeit: 3,0 h .

Gelöst-Op-Konzentration: ^ 2 ppm 0

Zusammensetzung der Nährlösung: .

Äthanol 12,0 g/l

Saccharose 4,0 g/l.

H₃PO₄ (85%-ig) 0,8 ml/1

0,76 g/l 0,28 g/l 26,0 mg/1 8,8 mg/1 8,8 mg/1

1,6 mg/1

- 6 -

H₂SO₄	. 7	H₂O
MgSO₄	♦ 7	H₂O
PeSO₄	. 7	H₂O
ZnSO	. 5	H₂O
MnSO₄	. 5	H₂O
CuSO₄

9

Die StickstoffVersorgung der Hefe erfolgte mit Ammoniakwasser über die pH-Regelung. Beide Substrate wurden vollständig verwertet. Es wurde eine Hefekonzentration von 11,0 g HTS/1 erhalten. Das entspricht einem Ertragskoeffizienten von 0,68 g HTS/g Substrat bzw. 1,38 g HTS/g C.

Wurden dagegen Äthanol und Saccharose unter den o.g. Bedingungen einzeln als C-Quelle eingesetzt, so wurden folgende Ertragskoeffizienten erhalten:

Substrat Ys (gHTS/g Substrat) Yc (gHTS/gKohlenstoff

Äthanol 1,5 1 ,28

Saccharose 2,0 1,19

Für das verwendete Äthanol/Saccharose-Gemisch mit dem Gewichtsverhältnis 3 : 1 läßt sich daraus ein Ertragskoeffizient Ys von 0,63 gHTS/g Substrat bzw. Yc von 1,26 gHTS/g Kohlenstoff berechnen.

Bei kombinierter Substratzugabe ist demnach eine Erhöhung des Ertragskoeffizienten um 9,5% zu verzeichnen.

Beispiel 4:

Der paraffinutilisier-ende Hefestamm Candida guilliermondii D wurde im diskontinuierlichen Prozeß in einem 40-1-Laborrührfermentor unter folgenden Bedingungen kultiviert:

Temperatur: 33 ⁰C

' pH: 4,2

pH-Regelung: mit 10%-iger NaOH

Begasung: 100 1 Luft/kg.h

Zusammensetzung der Nährlösung:

1 1 enthält: 13,4 g (NHj₀SO,

3,5	g	KH₂PO₄	7 H₂O
0,84	g	H₃PO₄	¹V XJ Γ} ( -Tl₂VJ
0,53	g	MgSO₄ .	f"7 TT r\ I -HpVJ
42,0	mg	PeSO₄ .	5 H₂O
33,0	mg	MnSO₄ .
21,0	mg	CuSO₄ .
20,0	mg	ZnCl₂

-⁷ - 20 9 563

C-Quelle: Gemisch aus 140g Erdöldestillat/kg Nährlösung (Siedegrenzen 240 - 360 ⁰C mit 18,5 Ma.% n-Alkanen) und 20 g Glukose/kg Nährlösung

Unter diesen Kultivierungsbedingungen wurde eine spezifische —1 Wachstumsrate Ai von 0,41 h erreicht.

Bei der getrennten Kultivierung auf Erdöldestillat (140 g/kg Nährlösung) und Glukose (20 g/kg Nährlösung) bei. einem Inertölanteil von 140 g/kg Nährlösung wurden hingegen nur spezifische Viiachstumsgeschwindigkeiten von

0,28 h"¹ für ED und

0,24 h"¹ für Glukose erreicht.

. Unter den Bedingungen des kombinierten Substratangebotes ergab sich eine Steigerung der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit gegenüber Erdöldestillat als alleiniger Kohlenstoffquelle von 45% und gegenüber Glukose als einziger Kohlenstoffquelle von 70%.

Bei der kontinuierlichen Fermentation unter den o.g. Bedingungen konnte bei einer Verweilzeit von 5 Stunden durch die Substratkombination Erdöldestillat (200 g/kg Nährlösung) und Glukose (10 g/kg Nährlösung) gegenüber einer Fermentation mit Erdöldestillat als einziger Kohlenstoffquelle eine Steigerung der Produktivität χ von 2,94 auf 3,99 (gTS/kgh) und eine Verringerung des SauerstoffVerbrauches von 2,71 auf 1,86 g 0_?/g TS

2.5 erreicht werden.

Beispiel 5:

Unter Zugrundelegung folgender Fermentationsbedingungen

- Temperatur: 32 ⁰C . - pH: 4,2

- Belüftungsrate: 15% gelöst O₂

- Rührerdrehzahl: 2400 U/min

- Reaktor: 12 ILaborrührfermentor mit Bodenantrie

- Zellkonzentration: 20 g HTSAg

- Verweilzeit: 50 h (einstufige Prozeßführung) -Nährlösungszusammensetzung · .

pro 1 (20 g HTS)

KH₂PO₄ MoSO₄ 4	7	H₂O
CuSO₄ , ZnCl₂	5	H₂O
CoSO₄ V	7	H₂O
MnSO₄ ♦	4	H₂O
H₃BO₃
CaCl₂ ♦	6	H₂O

0,042 g

0,114 g

0,007 g FeCl₂ 50 g Glucose · 10 ml 0,01%-ige Thiaminlösung

wird unter Verwendung des Hefestammes IMET H 134 (hinterlegt in der IMET-Sammlung des ZIMET Jena) bei Zufuhr von 1,5 ml/min der angeführten Nährlösung sowie 0,25 ml/rnin eines Paraffingemisches des Kettenlängenbereiches C_1? - C₁□ eine Produktivi-^ tat von 1,6 g Zitronensäure/kg.h bzw, eine spezifische Pro-

_ -1 duktbildungsrate hp = 0,08 h erreicht, ?/enn nur Paraffine als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, wird bei gleichen Zufuhrgeschwindigkeiten nach Erreichen eines stabilen stationären Zustandes (kontinuierliche Fermentationsdauer etwa 150 h) eine maximale Produktivität von 1,2 g Zitronensäure/kg.h, entsprechend einer spezifischen Produktbildungsrate von 0,06 h"~ , erreicht.

Claims

Patentanspruch

Verfahren zur mikrobiellen Konvertierung von Substratkombinationen, dadurch gekennzeichnet, daß simultan verwertbare Substrate, entsprechend ihrem Kohlenstoff /Energie-.. Verhältnis, so kombiniert werden, daß Ausgewogenheit hergestellt wird und somit die Substratmischung von dem eingesetzten Mikroorganismenstamm mit erhöhter Geschwindigkeit verlustarm, d.h. mit dem sowohl stofflichen wie energetischoptimalen Wirkungsgrad in Zellsubstanz bzw. mikrobielle Produkte umgewandelt v/erden.