DE3044969C2

DE3044969C2 - Herstellung von Coproporphyrin III

Info

Publication number: DE3044969C2
Application number: DE3044969A
Authority: DE
Inventors: Yasuo Tokyo Fujiwara; Ichiro Yokosuka Kojima; Kenji Yokohama Maruhashi
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1979-11-29
Filing date: 1980-11-28
Publication date: 1983-07-28
Also published as: FR2470797B1; US4334021A; JPS6319156B2; JPS5678595A; DE3044969A1; FR2470797A1

Description

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Es ist bekannt, daß Protoporphyrin IX mit einer Porphyrinstruktur bei pharmazeutischen Anwendungen nützlich ist Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III. welches eine Porphyrinstruktur aufweist und welches auf vielen Gebieten nützlich ist wie bei Pharmazeutika, Zwischenprodukten für Pharmazeutika oder roten Farbstoffen für Getränke und Nahrungsmittel.

Die Erfindung ist im Patentanspruch angegeben.

In der JP-OS 7492/77 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Mikroorganismus, der Coproporphyrin III der folgenden Formel:

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CH₂CH₂COOH

CH₃

H₃C

CH₂CH₂COOH

CH₃

CH₂CHjCOOH

J5

40

45

erzeugen kann, gezüchtet wird, der ausgewählt wird ^Μ unter Mikroorganismen der Arten Arthrobacter und Brevibacterium, und bei dem Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe isoliert wird. Gemäß diesem Verfahren kann Coproporphyrin III in wesentlich höhere Ausbeute erhalten werden, als bei den Verfahren, bei denen Coproporphyrin III liefernden Mikroorganismen anderer Arten verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin IH mit verbesserter Ausbeute bei niedrigen kosten zur Verfugung zu stellen, weiches industriell leicht durchführbar ist.

Die Anmelderin hat Untersuchungen unternommen, um ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Coproporphyrin III in verbesserten Ausbeuten zu entwickeln. Es wurde gefunden, daß Coproporphyrin III in wesentlich verbesserten Ausbeuten mit guter ReDroduzierbarkeit erhalten werden kann, wenn man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt welches 0,1 bis 5 g L-Cystin pro 1 Kulturmedium enthält welches als Bestandteil des Kulturmediums in der oben erwähnten JP-OS 7492/77 nicht spezifisch beschrieben wird.

Es wurde weiterhin gefunden, daß Coproporphyrin III in wesentlich verbesserter Ausbeute mit guter Reproduzierbarkeit gebildet wird, wenn man die Züchtung in einem Kulturmedium durchführt welches Mg⁺+ in einer Menge von 0,5 bis 10 g pro 1 Kulturmedium enthält Hinweise zur Gestaltung dieses Verfahrens sind der genannten japanischen Offenlegungsschrift ebenfalls nicht zu entnehmen.

Spezifische Beispiele von Coproporphyrin III liefernden bekannten Stämmen des Genus Arthrobacter, die bei der Erfindung verwendet werden können, werden im folgenden angeführt:

(1) Arthrobacter hyalinus DSM 867

(2) Arthrobacter globiformis DSM 1935 und

(3) Arthrobacter pascens DSM 1934.

Die mikrobiologischen Eigenschaften der obigen bekannten Stämme (1) bis (3) werden in Einzelheiten beispielsweise in der JP-OS 7492/77 beschrieben.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können nicht nur diese Coproporphyrin III liefernden Stämme des Genus Arthrobacter, sondern ebenfalls ihre nach bekannten Verfahren erhältlichen Mutanten oder Varianten verwendet werden.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die obigen, als Beispiele aufgeführten Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismen des Genus Arthrobacter in dem bestimmten Kulturmedium gezüchtet und Coproporphyrin III wird aus der Kulturbrühe direkt oder indirekt gewonnen.

Das bei der Erfindung verwendete Kulturmedium enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Mineralquelle, Vitamine, ein Antischaummittel usw. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, Alkohole, Kohlenwasserstoffe und Kleie. Beispiele für Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Ammoniumsalze, Proteinzersetzungsprodukte, Aminosäuren (insbesondere L-Cystin), Nitratsalze und Harnstoff. Beispiele für anorganische Salze sind Phosphate, Mg⁺+-erzeugende Magnesiumverbindungen, wie Magnesiumsalze, Zinksalze, Calciumsalze, Mangansalze, Molybdänsalze und Kupfersalze.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann auf geeignete Weise geändert werden und während der Züchtung können die verschiedenen oben erwähnten Bestandteile zusätzlich zu dem Kulturmedium zugegeben werden. Beispielsweise kann man, wenn ein Alkohol als Kohlenstoffquelle verwendet wird, zusätzlich zu dem Kulturmedium, wenn die Konzentration des verbleibenden Alkohols über einen vorher bestimmten Wert abnimmt, noch Alkohol zufügen oder man kann zu Beginn der Coproporphyrin-IIl-Erzeugung Alkohol zugeben. Dadurch kann die Erzeugung von Coproporphyrin III erhöht werden. Günstige Ergebnisse werden erhalten, wenn Eisensalze in dem Kulturmedium abwesend sind.

Bei der Züchtung der oben als Beispiele aufgeführten Coproporphyrin III erzeugenden Stämme des Genus Arthrobacter werden 0,1 bis 5 g L-Cystin pro I Kulturmedium und/oder 0,5 bis 10 g Mg⁺⁺ pro 1 Kulturmedium, zweckmäßig 1 bis 10 g Mg⁺⁺ und am

besten 3 bis 5 g Mg^{+ +} in dem Kulturmedium verwendet.

Bei der Ausübung des verbesserten erfindungsgemiäßen Verfahrens kann Coproporphyrin III in wesentlich verbesserter Ausbeute erhalten werden, die mindestens etwa das Zweifache und häufig etwa das Dreifache der Ausbeute beträgt, die m der oben erwähnten JP-OS 7492/77 beschrieben wird.

Die Züchtung erfolgt bei aeroben Bedingungen durch Schütteln oder durch Bewegen oder Rühren durch Luftzufuhr; es ist günstig, Luft so durchfließen zu lassen, daß die Menge an gelöstem Sauerstoff in dem Züchtungssystem bei einem so niedrigen Wert wie möglich gehalten wird. Die Züchtungstemperatur beträgt im allgemeinen etwa 20 bis etwa 40⁰C und deir pH-Wert des Kulturmediums wird bei etwa 4 bis etwa >5 9,5 gehalten. Die Züchtungszeit beträgt üblicherweise etwa 2 bis 30 Tage und sie kann in Abhängigkeit von den anderen Züchtungsbedingungen variiert werden.

Da sich Coproporphyrin III in höherer Menge in dem entsprechenden Züchtungsprodukt ansammelt, beispielsweise in der Kulturbrühe, kann es in guter Ausbeute aus dem Züchtungsprodukt, beispielsweise unter Verwendung eines geeigneten Extraktionsmittels, wie Äthylacetat, das mit Essigsäure in an sich bekannter Weise angesäuert wurde, extrahiert werden. Die Extraktion erfolgt normalerweise, nachdem die Mikrobenzellen und anderen Feststoffe vor, dem Züchtungsprodukt abgetrennt worden sind. Das Extraktionsmittel wird mit HCl/Methanol behandelt, um das Coproporphyrin methylzuverestern, und gegebenenfalls wird der Ester durch Säulenchromatographie an einer Aluminiumoxidsäule gereinigt, um Coproporphyrin III in Form des Methylesters zu gewinnen.

Bei dem erfindungsgemäßen ^erfahren kann Coproporphyrin III ebenfalls aus dem Reaktior -produkt eines Coproporphyrin III erzeugenden Substrats mit Mikrobenzellen, das von dem Züchtungsprodukt abgetrennt wurden, isoliert werden. Zweckmäßig werden die Mikrobenzellen von dem Züchtungsprodukt abgetrennt, welches man erhält, indem man einen Coproporphyrin III erzeugenden Stamm des Genus Arthrobacter bei Coproporphyrin III bildenden Bedingungen züchtet, die für das Wachstum der Mikrobenzellen geeignet sind.

Beispiele für Coproporphyrin III bildende Substrate sind Glycin, Fumarsäure, «-Ketoglutarsäure, Bernsteinsäure, <5-Aminolävulinsäure, Salze dieser Säuren und Substanzen, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele für Salze sind die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze.

Die Reaktion der Mikrobenzellen mit dem Copropor- so phyrin HI bildenden Substrat wird beispielsweise durchgeführt, indem man. das Reaktionsgemisch schüttelt oder rührt oder stehen läßt, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9,5 während etwa 5 h bis etwa 5 Tagen.

Die Abtrennung des Coproporphyrin III aus dem Reaktionsprodukt kann auf gleiche Weise erfolgen wie bei dem Verfahren, bei dem Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe gewonnen wird. Erfindungsgemäß kann Coproporphyrin III in hoher Ausbeute aus der Kulturbrühe entweder direkt oder indirekt, nachdem eine bestimmte Zeit vergangen ist, gewonnen werden.

Das Coproporphyrin III wird in der Kulturbrühe wie folgt bestimmt. 0,5 ml Kulturbrühe oder ihrer Verdünnung werden mit 10 ml 0,1 N-Acetatpuffer (pH 4,7) und 10 ml Äthylacetat extrahiert. Coproporphyrin III wird in die Äthylacetatschicht extrahiert und in 10 ml einer 5%igen Chlorwasserstoffsäure gelöst. Die Absorption der Chlorwasserstoffsäure bei 401,5 nm wird gemessen. Die Konzentration an Coproporphyrin III in dem Kultivierungsprodukt wird aus einer getrennt hergestellten Eichkurve bestimmt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

15 ml eines sterilisierten Kulturmediums, welches pro 1 entionisiertem Wasser 10 ml Isopropylalkohol, 1,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3,frg Ammoniumsulfat, 0,4 g Monokaliumphosphat, 1,5 g Dinatriumphosphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 mg Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 200 μg Kupfersulfat, 10 ^g Molybdäntrioxid, 5,0 g Caldumcarbonat und 0,2 g L-Cystin enthält, werden in einem Reagenzglas mit einem Durchmesser von 21 mm mit Arthrobacter hyalinus (DSM 867) inokuliert. Dann wird unter Schütteln bei 30⁰C während 3 Tagen kultiviert Alle 2 bis 3 Tage danach wird Isopropylalkohol zugegeben und insgesamt werden 85 ml Isopropanol pro 1 Kulturbrühe im Verlauf von 17 Tagen zugegeben.

Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 330 mg/1.

41 der entstehenden Kulturbrühe werden während 10 min bei 10 000 G zur Entfernung der unlöslichen Materialien, wie der Mik^obenzellen, zentrifugiert Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wird auf 3,6 eingestellt und dann wird während 10 min bei 1000 G zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert Methanol und Schwefelsäure werden zu dem Präzipitat zugegeben und das Gemisch wird über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen und dann mit Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschicht wird wiederholt mit Wasser gewaschen, bis die Schwefelsäure daraus entfernt ist. Die Dichlormethanschicht wird dann konzentriert und dann wird durch Chromatographieren auf einer Aluminiumoxidsäule gereinigt. Man erhält 1000 mg Coproporphyrin III, -tetramelhylester, als Kristalle.

Beispiel 2

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium kein L-Cystin enthält. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 230 mg/1.

Beispiel 3

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß die Menge an Magnesiumsulfat in dem Kulturmedium auf 0,5 g pro 1 Kulturmedium abgenommen hat. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 220 mg/1.

Vergleichsbeispiel 1

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß das Kulturmedium nicht L-Cystin enthält. Die Menge an Magnesiumsulfat wurde auf 0,5 g erniedrigt. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, beträgt 150 mg/1.

Beispiel 4

Die gleiche Züchtung wie im Beispiel 1 beschrieben, wird während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der 5-methyl-DL-tryptophan-resistente Stamm von Arthrobacter hyalinus (DSM 1932) als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wird. Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe angesammelt hat, beträgt zu diesem Zeitpunkt 420 mg/L

Beispiel 5

Die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 1 beschrieben, wird während 17 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der coproporphyrin-III-resistente Stamm (DSM 1933) von Arthrobacter hyalinus als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwendet wird. Die Konzentration von Coproporphyrin III, die sich in der Kuiturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 450 mg/L

Beispie! 6

Der L-tryptophan-resüstente Stamm (PSM 1935) von Arthrobacter globiformis wird in einem Reagenzglas mit einem Außendurchmesser von 21 mm inokuliert. Das Reagenzglas enthält 15 ml sterilisiertes Kulturmedium, welches pro Liter entionisiertem reinem Wasser 10 g Glucose, 1,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 3,0 g Ammoniumnitrat, 0,4 g Monokaliumphosphat, 1,5 g Dinatriumphosphat, 5,0 g Magnesiumsulfat, 10 mg Mangansulfat, 10 mg Zinksulfat, 200 μg Kupfersulfat, 10 μg Molybdäntrioxid, 5,0 g Calciumcarbonat und 0,2 g L-Cystin enthält. Dann wird bei 30⁰C während 3 Tagen unter Schütteln gezüchtet. Eine 50%ige wäßrige Glticoselösung wird alle 2 bis 3 Tage danach zugegeben, so daß insgesamt 75 g Glucose pro Liter Kuiturbrühe im Verlauf der Züchtungszeit von 15 Tagen zugegeben werden.

Beispiel 7

Es wird die gleiche Züchtung, wie im Beispiel 6 beschrieben, während 15 Tagen durchgeführt, ausgenommen, daß der L-tryptophan-resistente Stamm (DSM 1934) von Arthrobacter pascens als Coproporphyrin III erzeugender Mikroorganismus verwende; wird Die Konzentration an Coproporphyrin III, die sich in der Kulturbrühe zu diesem Zeitpunkt angesammelt hat, beträgt 260 mg/1

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Coproporphyrin III durch Züchten eines Coproporphyrin III erzeugenden Mikroorganismus des Genus Arthrobacter in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein Mineral enthaltenden Kulturmedium und Gewinnung des Coproporphyrin III aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Kulturme- "> dium züchtet, das 0,1 bis 5 g L-Cystin pro I Kulturmedium und/oder 0,5 bis 10 g Mg⁺+ pro 1 Kulturbrühe enthält