CH665220A5

CH665220A5 - Verfahren zur erzeugung von d-ribose.

Info

Publication number: CH665220A5
Application number: CH301285A
Authority: CH
Inventors: Kazuhiko Kintaka; Yasushi Sekitani; Takamasa Yamaguchi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1984-07-12
Filing date: 1985-07-11
Publication date: 1988-04-29
Also published as: DK293485D0; DE3524549A1; DK293485A; JPS6135792A

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose.

D-Ribosé in sämtlicher lebender Materie als Bestandteil der Ribonucleinsäuren enthalten, und ihr Derivat in reduzier-60 ter Form, Ribit, kommt als Komponente des Vitamins B2 und als Ribitteichonat vor, das eine Komponente der Zellwand ist. Dementsprechend sind beide Substanzen von grosser Bedeutung, sei es bereits allein unter physiologischen ist. Gesichtspunkten.

65 D-Ribose wird auch als Ausgangsstoff für die Synthese von Vitamin B2 eingesetzt, und in neuerer Zeit erregt seine Verwendung als Rohstoff für Nucleotid-Würzmittel grosse Aufmerksamkeit. Unter diesen Umständen ist es industriell

3

665 220

von hoher Bedeutung, die Substanz zu niedrigem Preis und in grossem Produktionsmassstab zu erzeugen.

Die bisher bekannten Verfahren zur Erzeugung von D-Ri-bose umfassen das Verfahren, bei dem D-Ribose aus Naturstoffen extrahiert wird, das Verfahren, bei dem sie aus Furan, Glucose usw. synthetisiert wird, und das Fermentationsverfahren unter Einsatz von Mikroorganismen.

Die vorgenannten Verfahren haben Nachteile dahingehend, dass sie eine komplizierte Serie von Produktionsschritten oder die Verwendung teurer Materialien erfordern oder aber nur geringe Ausbeuten an D-Ribose liefern, was zur Folge hat, dass keines von ihnen als wirtschaftlich-technisches Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose voll befriedigend ist.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eingehende Untersuchungen mit dem Ziel durch, ein fermentatives Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose in guter Ausbeute mit Hilfe eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus zu entwik-keln. Dabei wurde gefunden, dass sich D-Ribose in grossen Mengen durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Bacillus in einem zuckerhaltigen Fermentationsmedium erzeugen lässt, das durch eine Substanz ergänzt ist, die die Bildung von Gluconsäure hemmt, das Wachstum des Stammes jedoch nicht beeinflusst. Dieser Befund zog weitere Forschungen nach sich, aus denen die Entwicklung der vorliegenden Erfindung resultiert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose durch Kultivieren eines zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium befähigt ist, das durch eine Verbindung der Formel

R-X-COOH [I],

in der

R H- oder eine Ci-C4-Alkyl-Gruppe ist, die durch 1 oder 2 Gruppen der Formel HO-, HS-, CH3S-

?H2 r'

I '

HOOC-CH-CH2-S-S- oder

(R'ist H-oder NH2-)

substituiert sein kann, und X eine Gruppe der Formel

1 2

-C- oder -CH-

ist, oder ein Salz derselben ergänzt ist, und Ernten der dadurch erzeugten und angereicherten D-Ribose aus der Kulturbrühe.

Zu den zur Gattung Bacillus gehörenden und zur Bildung von D-Ribose befähigten Mikroorganismen gehören beispielsweise Stämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis. Speziell seien die folgenden Stämme genannt:

Bacillus pumilus

Nr. 503 (IFO 12600, ATCC 21356)

Nr. 537 (IFO 12601, ATCC 21357)

Nr. 558 (IFO 12602, ATCC 21358)

Nr. 716 [IFO 13322 (eingereicht am 3. Juni 1972), FERM

BP-812, ATCC 21951 (eingereicht am 4. Juni 1973)] Nr. 911 (IFO 13566, FERM-P 2260, ATCC 31095)

Nr. 1027 (IFO 13585, FERM-P 2466, ATCC 31098)

Nr. 1083 (IFO 13620, FERM-P 2832, ATCC 31093)

Bacillus subtilis

Nr. 429 (IFO 12603, ATCC 21359)

Nr. 483 (IFO 12604, ATCC 21360)

Nr. 608 (IFO 13323, FERM-P 1490, ATCC 21952) Nr. 957 (IFO 13565, FERM-P 2259, ATCC 31096) Nr. 941 (IFO 13573, FERM-P 2360, ATCC 31097)

Nr. 1054 (IFO 13586, FERM-P 2467, ATCC 31091)

Nr. 1067 (IFO 13588, FERM-P 2468, ATCC 31092)

Nr. 1097 (IFO 13621, FERM-P 2833, ATCC 31094)

Die oben angegebenen IFO-Nummern sind Hinterlegungsbezeichnungen des «Institute for Fermentation, Osaka» (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku,

Osaka 532, Japan, die FERM-Nummern sind diejenigen des «Fermentation Research Institute» (FRI), Agency of Industriai Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-Ken 305, Japan, und die ATCC-Nummern sind diejenigen von «The American Type Culture Collection» (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

Die oben genannten Stämme von Bacillus pumilus und Bacillus subtilis sind bereits bekannt und der Öffentlichkeit zugänglich.

Der Stamm Bacillus pumilus Nr. 716 wurde am 17. Juni 1972 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japan, unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM P-1491 hinterlegt und wird nach der Umwandlung der Hinterlegung in eine solche nach dem Budapester Vertrag beim FRI unter der Hinterlegungsbezeichnung FERM BP-812 aufbewahrt.

Für die im vorstehenden angeführten Mikroorganismen sind die bakteriologischen kennzeichnenden Eigenschaften des Bacillus pumilus und des Bacillus subtilis die gleichen wie diejenigen, die in Bergey's «Manual of Determinative Bacteriology», 8. Auflage, Seite 529-534, beschrieben sind, mit der Massgabe, dass Stämme, bei denen durch mutagene Behandlung Defekte in bezug auf die Fähigkeit zur Sporenbildung (Sporulation) erzeugt wurden, eingeschlossen sind.

Die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismen sind Stämme der Gattung Bacillus, die zum Wachstum aromatische Aminosäuren (L-Tyrosin, L-Tryopto-phan und Phenylalanin) benötigen, Stämme der Gattung Bacillus, die in bezug auf wenigstens entweder Transketolase oder D-Ribulose-5-phosphatase-3-epimerase fehlerhaft sind, Stämme der genannten Bacillus-Organismen, die in bezug auf die Fähigkeit zur Sporulation fehlerhaft sind, sowie diejenigen Stämme der genannten Bacillus-Stämme oder Organismen, die eine Aktivität zur Oxidation von 2-Desoxy-D-glu-cose besitzen. Wenn diese Mikroorganismen in einem die für ihr Wachstum notwendigen Nährstoffe enthaltenden Medium kultiviert werden, erzeugen sie D-Ribose und reichern sie in den Brühen in grossen Mengen an, jedoch liefern sie gleichzeitig Gluconsäure als Nebenprodukt. Bei der Durchführung der Kultur hemmt der Zusatz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) die Erzeugung von Gluconsäure und ergibt eine höhere Ausbeute an D-Ribose.

Beispiele für die Ci-C4-Alkyl-Gruppe in der Verbindung (I) umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, N-Butyl, Iso-butyl, sec-Butyl und tert-Butyl.

Zu Beispielen für die Gruppe

R'

fV

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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4

(in der R' die im vorstehenden angegebenen Bedeutungen hat), die gegebenenfalls die Ci-Gi-Alkyl-Gruppe substituieren kann, zählen Phenyl und p-Aminophenyl.

Zu Beispielen für die Verbindung (I) zählen L-Valin, L-, D- oder DL-Leucin, L-Isoleucin, L-Methionin, L-Cystein, L-Cystin, Phenylalanin, DL-a-Amino-n-buttersäure, p-Amino-DL-phenylalanin, DL-3-Phenylserin, Glyoxylsäure und a-Ketoisocapronsäure.

Zu Beispielen für das Salz der Verbindung (I) zählen Natrium-, Kalium-, Lysin-hydrochlorid- oder andere Salze der DL-a-Aminobuttersäure, Glyoxylsäure und a-Ketoisocapronsäure.

Die Werte der Zusätze der Verbindung (I), bezogen auf das verwendete Medium, betragen allgemein etwa 0,2 g/1, vorzugsweise etwa 0,2 bis 2 g/1, und besonders bevorzugt etwa 0,2 bis 0,6 g/1. Der genannte Wert des Zusatzes bezeichnet die pro Kultur zugegebene Gesamtmenge.

Hinsichtlich des Zeitplans der Zugabe der Verbindung (I) kann die Verbindung dem Ausgangsmedium oder dem Medium in einem frühen Zwischenstadium der Kultur zugesetzt werden.

Als Kulturmethoden kommen verschiedene routinemässig eingesetzte Kulturmethoden für Mikroorganismen in Betracht, von denen die aerobe Submerskultur die vorteilhafteste ist.

Das Medium besteht aus verschiedenen Nährstoffen, darunter Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen. Kohlenstoff-Quellen sind beispielsweise D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Sorbit, D-Mannit, Sucrose, Melasse, Stärke-Hydrolysat, Stärke, Essigsäure, Ethanol usw. Zu den Stickstoff-Quellen zählen verschiedene stickstoffhaltige organische Quellen wie Maisquellflüssigkeit, Baumwollsamenöl, Hefeextrakt, Trok-kenhefe, Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure usw., anorganische Stickstoff-Verbindungen wie wässriges Ammoniak, gasförmiges Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat usw. und organische Stickstoff-Verbindungen wie Harnstoff, Aminosäuren usw. Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen kann das Medium geeignete Mengen verschiedener Metalle, Vitamine, Aminosäuren usw. enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sein können.

Wenngleich die Kulturbedingungen, d.h. Inkubationstemperatur, pH des Mediums, Inkubationszeit usw. nicht besonders kritisch sind, betragen die Inkubationstemperatur im allgemeinen etwa 18 °C bis 45 °C, vorzugsweise etwa 25 °C bis 40 °C, der pH des Mediums allgemein etwa 4,5 bis 9, vorzugsweise etwa 5,5 bis 8 und die Inkubationszeit allgemein etwa 18 bis 180 h, vorzugsweise etwa 36 bis 120 h.

Die D-Ribose kann aus der Kulturbrühe mittels der herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von D-Ribose geerntet werden, d.h. durch die Schritte des Entfernens der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation, des Behandeins des Filtrats oder des Überstands mit Aktivkohle und Ionenaustausch-Harzen zur Entfärbung und Entsalzung, des Einengens desselben und schliesslich des Zugebens eines organischen Lösungsmittels wie Ethylalkohol zu dem Konzentrat zum Zwecke der Kristallisation. Falls irgendein anderes Kohlenhydrat als D-Ribose ebenfalls in der Brühe enthalten ist, lässt es sich durch Behandeln mit Glucose-oxidase oder mit einer Hefe oder einem Bakterienstamm, der D-Ribose nicht verwertet, das spezielle Kohlenhydrat jedoch verwertet, entfernen.

Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure, die in den mit Verbindungen der Formel (I) ergänzten Kulturen gewonnen wurden, sind im folgenden angegeben. In diesen Kulturen waren der Stamm und das Medium die gleichen, die auch in dem nachfolgenden Beispiel 1 verwendet wurden, und die

Kulturbedingungen sowie die anderen Arbeitsweisen waren ebenfalls die gleichen wie in Beispiel 1.

Die Erträge an D-Ribose und Gluconsäure in den Brühen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Zusatzstoff

Menge

(g/1)

D-Ribose-Gluconsäure-Ausbeute Menge (mg/ml) (mg/ml)

Kontrolle

65,1

40,5

L-Valin

0,25

80,5

5,1

L-, D-, DL-Leucin

0,25

82,3

4,8

L-Isoleucin

0,25

74,4

8,3

L-Methonin

0,25

73,4

15,5

Cystin

0,25

71,3

4,8

Cystein

0,25

70,2

6,2

Phenylalanin

0,25

74,5

6,0

DL-a-Amino-n-buttersäure

0,25

77,1

9,1

p-Amino-DL-phenylalanin

0,25

78,3

4,8

DL-3-Phenylserin

0,25

79,0

4,6

Glyoxylsäure

0,25

75,4

20,5

a-Ketoisocapronsäure

0,25

76,3

10,1

Es ist zu erkennen, dass die Kultur mit dem Zusatzstoff der Formel (I) Gluconsäure nur in einer Menge von 4 bis 20 mg/ ml erzeugt, während die herkömmliche Kultivierung 30 bis 50 mg/ml Gluconsäure liefert. Dementsprechend unterdrückt die vorliegende Erfindung die Nebenproduktion von Gluconsäure und steigert die Ausbeute an D-Ribose.

Die Kultivierung eines zu der Gattung Bacillus gehörenden und zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium, das durch eine Verbindung (I), einschliesslich eines Salzes derselben, gemäss der vorliegenden Erfindung ergänzt ist, befähigten Mikroorganismus ergibt eine unterdrückte Bildung des Nebenprodukts Gluconsäure und eine erhöhte Ausbeute an D-Ribose. Da die Menge des Nebenprodukts Gluconsäure klein ist, wird der Arbeitsgang des Abtrennens und Entfernens der Gluconsäure erleichtert.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

Beispiel 1

Der Mutanten-Stamm Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951) von Bacillus pumilus, die von dem Ursprungsstamm durch wiederholte Ultraviolett-Bestrahlung abgeleitet ist, wurde in ein Medium (101) geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikaliumphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 36 °C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 18% D-Glucose, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, 0,005% L-Tryptophan und 0,025% L-Valin enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 38 °C. Als Ergebnis wurde D-Ribose erzeugt und angereichert in einer Menge von 80,1 mg/ ml. Der Ertrag an D-Ribose wurde nach der Orcin-Methode bestimmt. Diese Methode ist beschrieben in «Methods in Carbohydrate Chemistry», Vol. 1, Seite 484 (1962).

Aus dieser D-Ribose-Fermentationsbrühe wurden die Zellen abfiltiert, und das Filtrat wurde auf etwa die Hälfte seines Volumens eingeengt, und anschliessend wurde etwa ein Viertel seines Volumens Ethanol zugesetzt. Nach dem Abfiltireren des erhaltenen Niederschlags wurde das Filtrat an einem Kationenaustausch-Harz und einem Anionenaustausch-Harz entsalzt und an einer Aktivkohle-Säule entfärbt. Die entfärbte Flüssigkeit wurde konzentriert und etwa mit dem 4fachen Volumen Ethanol versetzt, wonach 7,4 kg kristalline D-Ribose erhalten wurden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

665 220

Beispiel 2

Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde in ein Medium (101) geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikali-umphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 37 °C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 20% D-Glucose, 2,2% Maisquell-flüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, 0,05% Mangansulfat, 0,05% Leucin und 0,005% L-Tryptophan enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 37 °C. Am Ende der Inkubationszeit waren 90,6 mg/ml D-Ribose angereichert worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch 8,3 kg kristalline D-Ribose isoliert wurden.

Beispiel 3

Derselbe Mutanten-Stamm von Bacillus pumilus, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, d.h. Nr. 716 (IFO 13322, FERM P-1491, ATCC 21951), wurde in ein Medium (101) 5 geimpft, das 2% Sorbit, 2% Maisquellflüssigkeit, 0,3% Dikali-umphosphat und 0,1% Monokaliumphosphat enthielt, und 24 h bei 37 ° C inkubiert. Mit der erhaltenen Kultur wurde ein Medium (1001) beimpft, das 18% D-Glucose, 2,2% Maisquellflüssigkeit, 0,5% Ammoniumsulfat, 1,6% Calciumcarbonat, io 0,005% L-Tryptophan und 0,025% a-Aminobuttersäure enthielt; die Inkubation erfolgte mittels aerober Submers-Kultur 72 h bei 37 °C. Am Ende der Inkubationszeit waren 78,2 mg/ ml D-Ribose angereichert worden. Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wodurch 7,2 kg 15 kristalline D-Ribose isoliert wurden.

G

Claims

665 220

1 2

-CH-

45

ist und R HS-CH2 ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

NH,

I

X -CH- ist und R HOOC-CH-CH2-S-S-CH2- ist.

55

-CH-

ist und R

<y

.CH-

dass

1 2

-CH-

ist.

2 W 2 .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zugesetzte Menge der Verbindung, bezogen auf das Medium, 0,2 bis 2 g/1 beträgt.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Erzeugung von D-Ribose durch Kultivieren eines zur Gaiiung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der zur Erzeugung von D-Ribose in einem Medium befähigt ist, das durch eine Verbindung der Formel

R-X-COOH

(I)

NH,

HOOC-CH-CH2-S-S-

oder

R'

//k,

R' X

in welcher

H- oder NH2- bedeutet, substituiert sein kann, und eine Gruppe der Formel 0

NH,

-C- oder -CH-

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Bacillus pumilus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Bacillus pumilus Nr. 716, FERM BP-812 ist.

5 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass

X

in der

R H- oder eine Ci-C4-Alkyl-Grappe ist, die durch 1 oder 2 Gruppen der Formel HO-, HS-, CH3S-

NH_

i 2

-CH-

NH,

l

HO.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

NH_

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

O

II

-C-

ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R (CH3>CHCH2- ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nü2

X -CH-

ist und R (CH3)2CHCH2- ist.

9 CH^

U rj ^CH-CH,- ist

15 X -C- ist und CH^ z

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 0

20

X -C-

ist und R H- ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

NH_

I 2

X -CH-

ist und R Q-CH9- ist.

30

dass

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

NH,

CH.

X -CH- ist und R C2H5-CH-

ist.

35 17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

d3SS NH,

I 2

X

-CH-

40 ist und R CH3S-CH2-CH2 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

X

NH_

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass NH

I 2

X -CH-

ist und R (CH3>CH- ist.

10 ist und R CH3CH2- ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass f2

Ï -011- ist uncl R jjh

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,